Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehittyvät tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA osallistuvat kehittymistä ja etenemistä syövän. Täällä olemme huomanneet, että miR-202-3p oli usein alassäädetty mahasyövän kudoksissa. Yli-ilmentymisen miR-202-3p mahalaukun syöpäsoluissa MKN-28 ja BGC-823, merkittävästi tukahdutti solujen lisääntymisen ja indusoi apoptoosin sekä

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi Gli1 ilme oli usein positiivinen mahasyövän kudoksissa ja korreloi käänteisesti miR-133B ilme. Osoitamme, että transkriptiotekijä Gli1 oli tavoite miR-202-3p ja keskeinen rooli välittäjänä biologisista vaikutuksista miR-202-3p mahasyövän. MiR-202-3p esti myös ilmentymisen γ-kateniinin ja BCL-2. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-202-3p voi toimia uutena tuumorisuppressori mahasyövän ja sen tuumorin vastaista aktiivisuutta, voivat jakaa suoraan kohdentamista ja inhibitio Gli1.

Citation: Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J., et ai. (2013) vähennys miR-202-3p Expression, Novel kasvain vaimennin, mahasyövän. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 28 helmikuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 25 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Avustukset National Natural Science Foundation of China (nro. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 ja 81272749), Science and Technology komission Shanghai kunta (nro. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 ja 12PJ1406300), kärkihankkeet National Science and Technology pilarin ohjelma Kiina (nro 2011BA203191), Research Fund Tohtorikoulutuskeskus of Higher Education of China (nro 20110073110071), Key Project Shanghai Koulutuskomitea (nro. 12ZZ102, 12ZZ105) ja Innovation Foundation for PhD Tutkinnon Shanghai Jiao Tong-yliopiston School of Medicine (BXJ201213). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Vaikka kehitys hoidossa, eloonjäämisaste potilaiden GC on pettymys, tämä johtuu pääasiassa vähäisyys erityistä terapeuttista tavoitteita. Näin ollen on tärkeää tunnistaa molekyylitason mekanismeja taustalla mahasyövän.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieni (18-25 nukleotidia), ei-koodaava, yksijuosteinen endogeenisen RNA: t. He tukahduttaa proteiinin ilmentyminen vuorovaikutuksessa täydellinen tai epätäydellinen komplementaariset sekvenssit sijaitsevat 3’untranslated alueilla (3’UTRs) kohdegeenien. Tutkimukset viime vuodet ovat osoittaneet, että säädeltyyn miRNA tärkeä rooli erilaisten syöpien [1] – [4], mukaan lukien GC [5] – [13]. Tiedot tutkimuksen miRNA ja tavoitteensa geenit voivat tarjota mielenkiintoisia terapeuttisia mahdollisuuksia [3].

Olemme äskettäin tunnistaneet useita miRNA vapautettiin GC, kuten downregulation miR-126 [14], miR-409-3p [15], miR-625 [16], ja säätelyä miR-21 [17], miR-301a [18]. Vaikka monet miRNA on tunnistettu kanssaan GC, mekanismin näiden miRNA mahalaukun kasvainten synnyssä on vielä tutkittava. Meidän edellinen työ, lukuisat otaksuttu miRNA joka osoitti differentiaalikaavojen välillä GC kudosten ja niiden vieressä ei-tuumorikudoksista 28 potilasta todettiin [19]. Niistä miR-202-3p oli yksi merkittävästi vähentynyt miRNA. Kuitenkin rooli miR-202-3p GC on harvoin tutkittu.

MiR-202-3p, edellinen nimi HSA-miR-202, joka sijaitsee kromosomaalinen hauras sivusto 10q26. Poistaminen hauras sivusto on liitetty kohdun limakalvon [20], aivokasvaimet [21], [22]. MiR-202 on raportoitu vapautettiin rintasyövän [23], [24], kohdunkaulan levyepiteelisyöpä [25], paksusuolen ja peräsuolen syövän [26] ja follikulaarinen lymfooma [27]. Petrocca et ai. havaitsi, että miR-202 oli säädellä vähentävästi krooninen gastriitti [28]. MiR-202 on osoitettu olevan alas-säädellä 4-hydroxynoneal (HNE) HL-60 leukemiasolujen [29]. Tuore tutkimus osoitti myös, että miR-202 suoraan suunnattu esikasvaintekijän MYCN, jolloin eston neuroblastoomasolu- lisääntymistä [30].

Tässä osoitamme yleinen lasku miR-202-3p ekspressiotaso 150 GC kudoksiin verrattuna ei-kasvain kudosten ja löytää että miR-202-3p arvot liittyvät kasvaimen koon ja potilaiden iästä. Lisäksi olemme havainneet, ensimmäistä kertaa, että miR-202-3p voi estää kasvua ja indusoivat apoptoosia GC-solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

suoraan kohdistamalla transkriptiotekijä Gli1 ja estämällä ilmentymistä Gli1 kohdegeenien γ-kateniinin ja BCL-2.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kirjallinen tietoon perustuva suostumus on saatu kaikille osallistujille. Tutkimuksen hyväksyi Human Research Ethics komitean Ruijin sairaala, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston (HREC 08-028), laboratorio eläinten eettisen komitean Ruijin Hospital (elektrolyyttikondensaattorityyppien 11-062). Eläinten menetelmät suoritettiin protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Shanghai Jiao Tong-yliopiston, Shanghai, Kiina.

Cell Culture

Ihmisen GC solulinjat SGC -7901 ja BGC-823 ostettiin Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). MKN-45 ja MKN-28 solulinjat saatiin Japani Cancer Research Resources Bank (Tokio, Japani). NCI-N87, AGS, KATO III ja SNU-1-solulinjoja on alun perin hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ihmisen alkion munuaisen 293T (HEK-293T) on säilynyt meidän instituutti. Solut varastoitiin toipunut kylmäsäilöntä nestemäisessä typessä ja käytettiin varhain kohtia. Kaikki solut ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa plus 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja viljeltiin 5% CO2 kosteutetussa ilmakehässä. Eksponentiaalisesti kasvavat solut käytettiin kokeita varten.

Patient Kudokset

Ensisijainen GC kudosten ja sovitettu ei-kasvain kudokset saatiin 150 GC potilailla, joille tehtiin radikaali gastrectomy laitoksella Kirurgian Ruijin sairaala, koulu of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Näytteet olivat snap-jäädytetty suoraan leikkauksen jälkeen. Kaikki näytteet, jotka riippumattomat patologinen tutkimus. Kukaan potilaista ei saanut ennen leikkausta hoitoa. Kaikille potilaille, kliinis tiedot olivat saatavilla. Kasvaimen luokittelu mukaan International Union Against Cancer (2009).

RNA: n eristäminen ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA uutettiin solulinjoista ja kudosnäytteiden avulla Trizol -reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuudet ja puhtaus RNA-näytteet mitattiin elektroforeesilla ja spektrofotometrisillä menetelmillä. Ilmentymistasojen miR-202-3p ja pieni nukleaarinen U6-RNA (RNU6B) analysoitiin kolmena kappaleena, jonka varsi-silmukka-RT-PCR-menetelmällä käyttäen Hiuspinni-it ™ miRNA qPCR: n kvantitointi Kit (GenePharma, Shanghai, Kiina) ja spesifisten alukkeiden formiR-202-3p ja U6 pieni ydin- RNA (RNU6B). Suhteellinen miRNA ilmentyminen miR-202-3p normalisoitui vastaan ​​endogeeninen kontrolli, U6 käyttäen DDCt menetelmällä. MRNA-tasot on Gli1 ja GAPDH mitattiin kolmena kappaleena käyttämällä SYBR Green reaaliaikainen PCR (Applied Biosystems, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Kvantifiointi tehtiin käyttäen DDCt suhteellinen kvantifiointimenetelmän Human GAPDH sisäisenä kontrollina. Seuraavia alukkeita käytettiin: Gli1 (sense: 5′-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 ’; antisense: 5′-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3′) [31] ja GAPDH (sense: 5’-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 ’; antisense: 5′-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3’).

Ohimenevä transfektio miRNA Mimics

asennuspalveli- 202-3p jäljittelee (dsRNA oligonukleotidit) ja negatiivinen kontrolli mimics1 (NC) (sense: 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ’, antisense: 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’) hankittiin alkaen GenePharma (Shanghai, Kiina). Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille päivää ennen transfektiota varmistaa 40% cell yhtymäkohdassa hetkellä transfektion. Transfektio miRNA jäljittelee soluihin suoritettiin Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan menettelyn. Mirna jäljittelee käytettiin lopullisena pitoisuutena 100 nM.

proliferaatiomääritystä

24 h transfektion jälkeen, jossa miRNA jäljittelee soluja (2 x 10

3 solua /kuoppa ) ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 72 tuntia. Proliferaatiota arvioitiin kolmena kappaleena by vesiliukoista tetratsoliumsuolaa (WST) määritys käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) ja mitattiin seuraavat valmistajan ohjeiden.

Soft Agar pesäkemuodostusta

miRNA jäljittelee transfektoidut solut suspendoitiin uudelleen 0,3% pehmeässä agaroosissa (A9045, alhainen lämpötilassa hyy-, Sigma-Aldrich, USA) RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää ja kerrostettiin 0,4% kiinteytyi agar RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: 6-kuoppalevyille (1 x 10

3 solua /kuoppa) 24 tuntia transfektion jälkeen. Levyjä inkuboitiin 2 viikkoa. Pesäkkeet, jotka sisältävät vähintään 50 solut laskettiin.

Apoptosis Analyysi

Yksi päivä ennen transfektiota miRNA jäljittelee, 1 x 10

6 solua ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja värjättiin anneksiiniV /PI kahden -värjäyspakkausta (BD Biosciences, USA) valmistajan protokollan. Apoptoottisia soluja arvioitiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa itsenäisesti virtaussytometrialla FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

Retroviral transfektio ja stabiilien solulinjojen

genominen alue, joka sisälsi ensisijainen transkriptio miR-202-3p kloonattiin EcoRI-Xhol-modifioidun pMSCV-GW-RfA-PGK-EGFP retrovirusvektorilla. Negatiivinen kontrollivektoreihin ollut insertti. HEK 293T-solut (1 x 10

6 /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille päivää ennen transfektiota. Kymmenen ug Retrovirusrakennelma sisälsi joko miR-202-3p tai ei lisätä, 2 ug gag /pol- ja 2 ug VSVG kotransfektoitiin HEK 293T-soluihin käyttäen Lipofectamine ™ 2000-reagenssia ja Opti-MEM I vähensi seerumin viljelynestettä levy. Virukset kerättiin 48 h ja 72 h transfektion jälkeen viruksen keräämistä (RPMI-1640, jossa on 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää + 1% glutamiinia +20 mM Hepes). Infektiot MKN-28-soluja suoritettiin, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevylle. Solut spin infektoitiin 1500 rpm 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Virus sisältävä supernatantti poistettiin 2 tunnin kuluttua. Positiiviset solut valittiin GFP ekspression FACS-lajittelu ja nimetty RV-miR-202-3p ja RV-miR-ohjaus vastaavasti. MiR-202-3p ilmentyminen varmistettiin qRT-PCR.

kasvaimen kasvua nude-hiirissä

Male BALB /c nu /nu hiirille, kello kuuden viikon iästä (Institute of Zoology Kiinan Academy of Sciences), pidettiin häkeissä tietyllä patogeenittomassa ympäristön Animal Laboratory yksikkö, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kiina. Hiiret saivat inhimillinen hoito ja tutkimus protokollat ​​tehtiin protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Shanghai Jiao Tong-yliopiston, Shanghai, Kiina. Soluja (100 ui, 2 x 10

6 solua) vakaista transfektoiduista linjat RV-miR-202-3p tai RV-miR-ohjaus kerättiin ja istutettiin ihonalaisesti hiiriin. Kuusi hiirtä käytettiin kullekin ryhmälle. Hiiret tarkistaa viikoittain, ja kasvaimen kyhmyjä mitattiin paksuus. Kasvaimen tilavuus (V) arvioitiin käyttämällä yhtälöä V = 4 /3π x L /2 x (W /2)

2, jossa L on keskiakseli pituus, ja W on keskiakseli width.The kasvainsoluja annettiin kasvu 5 viikkoa ja kasvaimen kasvukäyriä ja inhiboimaan laskettiin. Sen jälkeen, kun hiiret tapettiin, kaikki kasvaimen siirteet leikattiin, punnittiin, otettiin talteen, kiinnitettiin ja upotettu. Kukin koe suoritettiin kahdesti.

TUNEL Analysis

Päätelaite nucleotidyl välittämällä nick end merkintöjä määritys (TUNEL) suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita DeadEnd ™ Kolorimetrinen TUNEL System Kit (Promega, USA). Kudokset kiinnitettiin 10% neutraloitua formaliinia ja upotettiin parafiiniin lohkoja. Osiot (4 pm) valmistettiin sitten tutkittavaksi. Jälkeen deparaffinization, leikkeet käsiteltiin 20 g /ml: lla proteinaasi K: ta 10 minuutin ajan, 0,3% H

2O

2 metanolissa 10 minuutin ajan ja 0,1% Triton X-100 0,1% natriumsitraattia 2 min jäällä. Sitten leikkeitä inkuboitiin TUNEL reaktioseosta 60 minuuttia 37 ° C: ssa. Inkuboida edelleen peroksidaasilla konjugoitu vasta-aine tehtiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Leikkeet värjättiin diaminobentsidiinillä liuoksessa 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten vastavärjättiin hematoksyliinillä.

immunohistokemia

pääluokat (6 mm paksu), formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kasvaimen specimenswere parafiini vuonna ksyleeni ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Endogeeninen peroksidaasi estettiin käyttämällä 3% H

2O

2 10 minuuttia. Seuraavat antigeenin haku sitraattipuskurissa (pH 6,0), kudoksen leikkeitä inkuboitiin vuohen normaalia seerumia estämään ei-spesifinen vasta-aineen sitoutuminen (20 min huoneenlämpötilassa). Sitten leikkeitä inkuboitiin Gli1 vasta-aineita (01:50, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) 37 ° C: ssa humidchambers 2 tuntia. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, leikkeitä inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua anti-kani-IgG: tä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi leikkeet huuhdeltiin PBS: llä ja inkuboitiin 5 minuutin ajan DAB-substraatti alle 30 min. Hematoksyliiniä käytettiin counterstaining.

Plasmidien ja Luciferase Activity Assay

203 bp: n koko pituudelta villityypin (WT) Gli1-3’UTR tai mutantin Gli1-3 ” UTR (mut), joka sisältää oletetun miR-202-3p sitoutumiskohta syntetisoitiin (Sangon, Shanghai, Kiina). Sen jälkeen, kun digestio SpeI ja HindIII, fragmentit villityypin ja mutantti-Gli1-3’UTR kloonattiin Spel ja Hindlll pMIR-Report sivektorissa (Applied Biosystems) ja nimetty pMIR /Gli1 ja pMIR /Gli1 /mut, vastaavasti. DNA: n sekvensointi käytettiin tarkistaa konstruktioita.

HEK-293T-solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen määritystä suorituskykyä. Kuhunkin kuoppaan, 100 ng pMIR /Gli1 tai pMIR /Gli1 /mut, 2 ng PRL-TK (Promega, Madison, WI, USA), joka sisälsi Renilla lusiferaasi ja 100 nM miRNA jäljittelee kotransfektoitiin käyttäen Lipofectamine ™ 2000-reagenssia ja Opti-memi alennetaan seerumiväliaineessa. Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus laskettiin 48 tunnin kuluttua kotransfektoimalla käyttämällä Dual-Glo lusiferaasianalyysissä (Promega, USA) valmistajan menettelyn. Tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Western blot -analyysi

Solut ja kasvaimen hajotettiin käyttämällä M-PER reagenssit ja Pysäytetään Protease Inhibitor Cocktail sarjat (Pierce, USA). Proteiinipitoisuus solulysaateista kvantitoitiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Proteiini erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja blotattiin 0,22 um: n polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, MA, USA). Seuraavia erityisiä vasta-aineita käytettiin: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-kateniini (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA), ja GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Proteiini tasot normalisoitiin yhteensä GAPDH.

rakentaminen Gli1 ekspressioplasmidin ja transfektio

Amplifioimalla cDNA MKN-28 käyttäen seuraavia alukkeita: sense (5’AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ’) ja antisense (5’ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3’), täyspitkä Gli1 saatiin, pilkottiin EcoRI- V ja Not I ja kloonattiin pcDNA3.1-vektoriin (Invitrogen) ja nimettiin pcDNA3 0,1-Gli1. DNA: n sekvensointi käytettiin tarkistaa konstruktioita.

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille päivää ennen transfektiota varmistaa 80-90% solun yhtymäkohdassa hetkellä transfektion. Kuhunkin kuoppaan, solut transfektoitiin 250 pmol miR-202-3p jäljittelee tai valvontaa, yhdessä 4 ug: lla pcDNA3.1-Gli1 tai pcDNA3.1 tyhjän vektorin, käyttämällä Lipofectamine 2000 WST-määritys suoritettiin 24 h transfektion, kun apoptoosin analyysi suoritettiin 48 tunnin transfektion jälkeen.

tilastollinen analyysi

Jatkuva muuttujia verrattiin Studentin

t

testissä normaalisti jakautunut muuttujien ja Wilcoxonin-summa testi nonnormally jaettu muuttujia. Suhde miR-202-3p ekspressiotasot ja ennusteeseen viittaavia parametreja analysoitiin käyttämällä Pearsonin Chi-square testi. Kaikki arvot esitetään keskiarvoina ± SDS. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen PASW Statistics 18.0 ohjelmisto (IBM, USA). Kahden pyrstö arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentyminen miR-202-3p vähenee GC ja korreloi ennusteeseen viittaavia parametrit

ilmaisujen miR-202-3p tutkittiin qRT-PCR kasvainkudoksissa ja vastaavan ei-tuumorikudoksista 150 GC potilaista (Fig. 1A). Tulokset osoittavat, että ekspressio miR-202-3p oli merkittävästi vaimentua kasvainkudoksissa verrattuna täsmäsi ei-tuumorikudoksissa 68% (102/150), GC-potilailla (p 0,001; Fig. 1A, B).

(A) Suhteellinen ilmentyminen miR-202-3p 150 GC potilaan kudoksiin verrattuna sen viereisen ei-kasvainkudoksia. qRT-PCR tulokset on esitetty -ΔΔCT arvoja. (B) Laatikot edustavat 25 kautta 75 persentiilit. Vaakasuorat viivat edustavat mediaanit. Viikset ovat 10. ja 90. prosenttipisteet. ***,

P

0,001.

Selventämään lisäksi korrelaation ekspressiotason miR-202-3p ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä ihmisen GC, 150 tapaukset olivat edelleen analysoitu (taulukko 1). Perustuen suhteelliseen miR-202-3p ilmaisu, 150 tapausta stratifioitiin 3 ryhmään: miR-202-3p heikkoa ilmentymistä (kasvain /ei-kasvain suhde 0,66, n = 85), miR-202-3p kohtalainen ilmentyminen (kasvain /ei-kasvain suhde 0,66-1,5, n = 34) ja miR-202-3p korkea ilmentyminen (kasvain /ei-kasvain suhde 1,5, n = 31). MIR-202-3p ekspressiotasot negatiivisesti korreloivat kasvaimen koon ja korreloivat positiivisesti ikään näillä potilailla, jossa miR-202-3p heikkoa ilmentymistä ryhmä osoitti merkittävästi suurempi kasvaimen kokoa (p = 0,013) ja vanhin ikä verrattuna kohtalainen tai korkea ilmentyminen ryhmät (p = 0,028). Kuitenkin miR-202-3p ekspressiotasot eivät osoittaneet mitään suhdetta sukupuoleen, erilaistuminen, kasvaimen sijainti, kasvaimen paikallinen invaasio, imusolmuke etäpesäke tai TNM.

yli-ilmentyminen miR-202-3p Estää GC Cell Proliferation

koska miR-202-3p on merkittävästi vähentynyt GC, se voi toimia kasvaimia estävä. Siksi me tutki yli-ilmentymisen miR-202-3p GC soluissa vaikutti solun kasvua. MKN-28 ja BGC-823 solulinjat, joiden ilmentyminen miR-202-3p olivat alhaisimmat kahdeksan testattu GC solulinjoissa (Fig. 1 C), valittiin myöhempää expreiments. Synteettinen miR-202-3p matkii ja negatiivinen kontrolli matkivat molekyylejä (NC) transfektoitiin MKN-28 ja BGC-823-soluissa. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-202-3p soluissa varmistettiin qRT-PCR.

WST solujen kasvun määrityksessä osoitti merkittävää solujen kasvua estoja MKN-28 transfektoitujen solujen miR-202-3p (Fig. 2.A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin BGC-823-solut (Fig. 2 B). Edelleen karakterisoimiseksi vaikutus miR-202-3p solun kasvuun, teimme pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys transfektoiduissa soluissa. Huomasimme, että määrä pesäkettä MKN-28-solut transfektoitu miR-202-3p matkii oli lähes puolet ohjaus- ja vanhempien ryhmässä (Fig. 2C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin BGC-823-solut (Fig. 2.D). Nämä tulokset osoittavat, että miR-202-3p voi estää solujen lisääntymisen GC-solujen

in vitro

.

Soluproliferaatio arvioitiin WST määritys MKN-28-soluja (A) ja BGC -823-solut (B). Solut transfektoitiin miR-202-3p jäljittelee tai NC 24 h transfektion alistettiin WST määritystä yhdessä vanhempien soluja. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05. Vaikutus miR-202-3p soluproliferaatioon arvionsa pesäkemuodostusta in MKN-28-solut (C) ja BGC-823-solut (D). Solut transfektoidaan 100 nM miR-202-3pmimics tai ohjaus ympättiin 6-kuoppaisille levyille yhdessä vanhempien soluja. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin 14. päivänä sen jälkeen, kun kylvö. Edustavia valokuvia pesäkkeiden näkyvät vasemmassa paneelit. Merkitykselliset määrällisesti tulokset esitetään Pylväiden (oikea paneeli). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05.

yli-ilmentyminen miR-202-3p indusoi GC Cells Apoptosis

Koska kasvun estämistä saattaa johtua tukossa solusyklin etenemisen tai lisääntynyt apoptoosi, me seuraavaksi muotoon solunjakautumisen sykli määritys ja apoptoosin virtaussytometrialla. Meidän tuloksemme osoittivat, että apoptoottisen hinnat sekä MKN-28 ja BGC-823-solut, jotka on transfektoitu miR-202-3p jäljittelee merkittävästi voimistunut (Fig. 3A, B). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa solusyklin välillä eri käsiteltyjen ryhmien (tietoja ei näytetä). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-202-3p indusoi apoptoosia GC solut voivat edistää kasvua estäviä ominaisuuksia Mir-202-3p.

(A) edustaja histogrammit esittävät apoptoosin MKN-28-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti 100 nM miR-202-3p jäljittelee tai NC ja vanhempien soluja (vasen paneeli). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen kolmen riippumattoman kokeen ± S.D. näkyvät Pylväiden (oikea paneeli). (B) edustaja histogrammit esittävät apoptoosin BGC-823-solut transfektoitiin väliaikaisesti 100 nM miR-202-3p jäljittelee tai NC ja vanhempien soluja (vasen paneeli). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen kolmen riippumattoman kokeen ± S.D. näkyvät Pylväiden (oikea paneeli).

yli-ilmentyminen miR-202-3p Estää tuumorigeenisyyteen ja Lisäykset apoptoosi

in vivo

Koska asennuspalveli- 202-3p estää GC solujen kasvun ja indusoi apoptoosin

in vitro

, me seuraavaksi tutkittava, onko miR-202-3p voi tukahduttaa kasvaimen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin

in vivo

. Solut MKN-28, RV-miR-202-3p (MKN-28-solujen kanssa retrovirusvälitteinen miR-202-3p stabiilia ekspressiota) tai RV-miR-ohjaus (MKN-28-solujen kanssa, tyhjä vektori) saatiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Solut injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin. Kasvaimen muodostumista seurattiin. Kasvain latenssiaika oli merkitsevä ero hiiriä, joihin injektoitiin RV-miR-NC-solujen ja RV-miR-202-3p solut (Fig. 4A). Se on huomattavan edun, että kasvaimissa, jotka ovat peräisin RV-miR-202-3p solut kasvoivat merkittävästi hitaammin kuin RV-miR-kontrolliryhmään koko kasvaimen kasvua (Fig. 4B). Keskimääräinen paino kasvaimia, jotka johtuvat RV-miR-202-3p oli merkittävästi pienempi kuin tuumorit, jotka ovat peräisin RV-miR-ohjaus (Fig. 4C, D).

(A) kasvaimeen latenssi oli määrä päivää puhkeamista kas- vaimesta ja arvot ilmoitetaan keskiarvona ± SD *,

P

0,05. (B) Kasvaimen kasvukäyrät mitattiin injektion jälkeen. Kasvaimen halkaisijat mitattiin 7 päivän välein. (C) Kasvaimen paino; arvot on annettu keskiarvo ± S.D. *,

P

0,05. (D) Kuvassa edustavaa piirrettä tuumoriksenograftien 35 päivää inokulaation jälkeen. (E) edustaja kuvia TUNEL määrityksen tuumoriksenograftien hiirten (vasen paneeli). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin (oikea paneeli). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05.

Lisäksi TUNEL määrityksiä kasvainkudosnäytteet tehtiin. Kuten on esitetty kuviossa. 5E, RV-miR-202-3p solut osoittivat entistä kasvainsolun positiivista värjäytymistä ja huomattavasti suurempi apoptoottisten indeksi kuin RV-miR-ohjaus solut (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-202-3p inhibition kasvaimien johtuu lisääntynyttä apoptoosia

in vivo

.

(A) Suhteellinen ilmentyminen miR-202-3p ja Gli1 kahdeksan GC solulinjoissa suoritettiin qRT-PCR. Tulokset ovat keskiarvoja kolmen riippumattoman kokeen ± S.D. (B) sekvenssi on Gli1 3’UTR osoittaa miR-202-3p sitoutumiskohta ja mutaatio Gli1 3’UTR sitoutumiskohdan luoda Gli1-mut. (C) miR-202-3p jäljittelee alassäädetty lusiferaasiaktiivisuudet ohjataan villityypin Gli1 3’UTR (

P

0,01), mutta ei vaikuttanut lusiferaasiaktiivisuutta ohjataan mutantti Gli1 3’UTR. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta independentexperiments ± S.D. (D) Gli1 mRNA MKN-28-soluissa analysoitiin qRT-PCR 48 h transfektion kanssa miR-202-3p matkii ja NC. (E) edustaja Western blottaus kuvia näyttämän proteiinin MKN-28-solut (vasemmanpuoleiset paneelit), asiaa määrällisesti (oikea paneeli). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05. (F) Gli1 proteiinia ei havaittu RV-miR-ohjaus tai RV-miR-202-3p soluja ihonalainen kasvain nude-hiirissä (vasemmanpuoleiset paneelit), asiaa määrällisesti (oikea paneeli). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05.

MiR-202-3p Suoraan Target Gli1

Ymmärtää taustalla oleva mekanismi kasvainta estäviä ominaisuuksia miR-202 -3p GC etsittiin oletetun kohdegeenien mahdollisten pro-onkogeenisiä toimintoja käyttämällä online hakuvälineet (RNAhybrid ja Miranda algoritmit), ja geenit ennustaa molemmat bioinformatiikan välineitä valittiin ehdokas kohdegeenien miR-202 -3p. Niistä satoja kandidaattigeeneihin ennusti, transkription aktivaattori Gli1 on erityisen kiinnostava (kuva S1). Oletetun sekundaarinen rakenne RNA-hybridiä, ihmisen miR-202-3p ja Gli1 on esitetty kuviossa S2. Gli1 on raportoitu erittäin ilmaistu GC [32], [33]. Siinä ehdotettiin, että vähentämällä ilmentymistä Gli1 johti GC solulinjoissa kasvun esto ja apoptoosin [33].

Toinen vihje mahdollisesta roolista miR-202-3p säätelyssä Gli1 ilmentymisen tuli analyysiin kahdeksaa eri mahasyövän solulinjoissa (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 ja MKN-28). Tilastollinen analyysi osoitti merkittävää ylösalaisin kuvioita ilmaisu välillä miR-202-3p ja Gli1 ((r = -0,345,

P

0,001, Fig. 5A).

arvioimiseksi kliinistä merkitystä näiden havaintojen selvitimme korrelaatio ilmentymiä Gli1 kanssa miR-202-3p ilmentymisen GC kudoksissa. Huomasimme, että Gli1 ja miR-202-3p näytteille käänteinen ilmentämiskuviota GC kudoksissa (taulukko 2). Nämä tulokset tukevat oletukseen, että downregulation miR-202-3p lisää tason Gli1 geenin mahasyövässä.

lusiferaasireporttiterilla analyysit suoritettiin sen varmistamiseksi, välillä on suora vuorovaikutus miR-202-3p ja 3’UTR Gli1. Luciferase toimittajat konstruoitiin, joka sisältää joko villityyppisen Gli1 3’UTR-sekvenssi, mukaan lukien miR-202-3p sitoutumiskohta (pMIR /Gli1) tai mutatoidun Gli1 3’UTR (pMIR /Gli1 /mut) (Fig. 5B ). pMIR /Gli1 ja pMIR /Gli1 /mut lusiferaasireportteri- rakenteet transfektoitiin HEK-293T-soluihin, sekä miR-202-3p tai NC jäljittelee. suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus pMIR /Gli1 toimittaja suppressoitui merkittävästi verrattuna of pMIR /Gli1 /mut on miR-202-3p-riippuvaisella tavalla (Kuva. 5C). Tämä tulos osoittaa vahvasti, että 3’UTR Gli1 kuljettaa suoraan sitova sivustoja miR-202-3p.

Voit selvittää mRNA tasolla tai proteiinin taso miR-202-3p alassäädetty Gli1, havaitsimme Gli1 ilme by qRT-PCR ja Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 5E Gli1 proteiini taso aleni miR-202-3p jäljittelee transfektoiduissa MKN-28-soluissa verrattuna NC jäljittelee transfektoiduissa ja vanhempien MKN-28 soluihin. Samaan aikaan, ei ollut mitään vaikutusta miR-202-3p on Gli1 mRNA tasolla (Kuva. 5D). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että miR-202-3p säätelee negatiivisesti Gli1 ilmaisu translaatiotutkimukseen tasolla.

Niistä geenit raportoitu estävän apoptoosin GC, γ-kateniinin (Plakoglobin) ja BCL-2 ovat suoria transkription tavoitteita of Gli1 [34], [35]. Kuten on esitetty kuviossa. 5E, proteiini tasot γ-kateniinin ja BCL-2 olivat merkittävästi pienentyneet MKN-28-soluja, jotka on transfektoitu miR-202-3p jäljittelee.

Lisäksi tutkimme ilmentymisen Gli1 proteiinin ihonalainen kasvaimia peräisin mistä RV-miR-ohjaus ja RV-miR-202-3p nude-hiirissä western blot -analyysillä. Gli1 proteiini tasolla kasvaimia RV-miR-202-3p osoitti downregulation verrattuna, että RV-miR-ohjaus (Kuva. 5F). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että miR-202-3p säätelee negatiivisesti Gli1 ilmaisu transkription jälkeen.

yli-ilmentyminen Gli1 Rescues vaikutus miR-202-3p GC Solut

Koska miR-202-3p vaimentua Gli1 estävän solujen lisääntymisen ja apoptoosin, on perusteltu, että yliekspressio Gli1 voisi kääntää tämän ilmiön ainakin osittain. Todellakin, kun Gli1 yli-ilmentäviä plasmidi (pcDNA3.1-Gli1) vietiin MKN-28 tai BGC-823-soluja transfektoitiin väliaikaisesti miR-202-3p jäljittelee, inhiboiva vaikutus miR-202-3p solun kasvuun kumottiin osittain joka havaittiin WST solukasvumäärityksessä (Fig. 6A, B). Lisäksi etenemistä kohti apoptoosin vaikeutti myös kun Gli1 yliekspressoitiin MKN-28 tai BGC-823-solut transfektoitiin väliaikaisesti miR-202-3p matkii (Fig. 6C, D) .Nämä tiedot todisteita siitä, että kasvun esto ja solun indusoiman apoptoosin miR-202-3p on ainakin osittain liittyä sen vaikutusta Gli1 ilmentymisen.

Kun transfektoitiin Gli1 ekspressiovektorilla (pcDNA3.1-Gli1), MKN-28-soluja (A) ja BGC-823-soluja ( B) on osittain pelastettiin miR-202-3p kasvua estäviä ominaisuuksia. Solut transfektoitiin miR-202-3p jäljittelee tai valvontaa, yhdessä pcDNA3.1-Gli1or pcDNA3.1 tyhjän vektorin (pcDNA3.1) 24 h transfektion jälkeen tehtiin WST-määritys. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± S.D. *,

P

0,05. Edustaja histogrammit kuvaa apoptoosin MKN-28-solut (C) ja BGC-823-soluja (D) transfektoitiin miR-202-3p jäljittelee tai valvontaa, yhdessä pcDNA3.1- Gli1) tai pcDNA3.1 virtaussytometrialla (vasemmanpuoleiset paneelit). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen kolmen riippumattoman kokeen ± S.D.