Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on merkittävä terveysongelma miesten länsimaisten. Täällä raportoivat Eturauhassyöpä-Specific Targeting Gene-Viro-Therapy (CTGVT-PCA), jossa PTEN insertoitiin DD3-ohjattu onkolyyttinen virusvektori (OV) muodostamaan Ad.DD3.E1A.E1B (Δ55) – ( PTEN) tai lyhyesti, Ad.DD3.D55-PTEN. Metsämurmeli post-transkriptionaalisen elementin (WPRE) otettiin käyttöön myös alavirtaan E1A koodaavan sekvenssin, mikä johtaa paljon runsaampaan ekspressioon E1A geenin. DD3 on yksi eturauhasen syöpä-geenejä ja sitä on käytetty kliinisissä bio-diagnostisen markkerin. PTEN usein inaktivoituu ensisijainen eturauhasen syöpiä, joka on ratkaiseva eturauhassyövän etenemiseen. Siksi Ad.DD3.D55-PTEN on eturauhassyöpä erityinen ja voimakas antituumorivaikutus. Kasvaimen kasvu oli lähes kokonaan esti lopullinen kasvaimen tilavuus jälkeen Ad.DD3.D55-PTEN hoidon vähemmän kuin alkuperäinen tilavuus alussa Ad.DD3.D55-PTEN hoitoa, joka osoittaa voimakas kasvainten vastainen vaikutus Ad.DD3 .D55-PTEN eturauhassyöpään kasvaimen kasvua. CTGVT-PCa-konstrukti raportoitu tässä tappoi kaikki eturauhassyövän testatuissa solulinjoissa, kuten DU145, 22RV1 ja CL1, mutta oli pienempi tai ei tappava vaikutus kaikkia ei-eturauhassyöpäsolulinjoissa testattu. Vaikutusmekanismi on Ad.DD3.D55-PTEN johtui apoptoosin induktion, kuten havaitaan TUNEL määrityksiä ja virtaussytometrialla. Apoptoosi välittämä mitokondrioiden riippuvaisia ​​ja riippumattaman kulkuväylillä määritettynä kaspaasi määrityksiä ja mitokondrion kalvon potentiaalia.

Citation: Ding M, Cao X, Xu Hn, Tuuletin Jk, Huang Hl, Yang Dq, et al. (2012) Eturauhassyöpä-Specific ja Voimakkaat Antituumorivaikutus on

DD3

-kontrolloidussa Onkolyyttiset Virus kätkeminen

PTEN

Gene. PLoS ONE 7 (4): e35153. doi: 10,1371 /journal.pone.0035153

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu 13 syyskuuta 2011; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2012 Julkaistu: 11 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Ding et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (973 Pro_ram) (nro 2010CB529901) (X. Liu), Tärkeää National Science Teknologia Erityisiä projekti hepatiitti ja hepatooma Related Program (2008ZX10002-023) (X. Liu), uusi keksintö ohjelma (2009-ZX-09102-246) (X. Liu), Zhejiang Sci-Tech University apurahan (1016834-Y) , National Basic Research Program of China (2009CB941704) (R. Li), Shanghai Municipal komitean Science and Technology (09140903200, 09DJ1400400, 08140901700 ja 06ZR14072) (R. Li). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on merkittävä terveysongelma miesten länsimaisten. Vuosittain noin 230000 Amerikan urokset diagnosoidaan eturauhassyöpä ja lähes 30000 kuolee tähän tautiin [1], [2]. Paras käytettävissä oleva hoito potilailla, joilla on pitkälle tauti on androgeeniablaatio hoito, joka perustuu havaintoihin Huggins ja Hodges [3], että kliininen eturauhasen syöpä on alle myrkkyjen vaikutuksen mies hormoneja. Kasvaimen regressio ja parantaminen kliinisten oireiden ovat väliaikaisia ​​ja taudin väistämättä etenee androgeenista itsenäinen valtio. Tällä hetkellä ei ole parantavaa hoitoa on saatavilla androgeeni-riippumaton eturauhasen syöpiä.

Bio-hoito tarjoaa houkuttelevan mahdollisuuden kohdistaa androgeenista riippumaton eturauhasen syöpiä. Toisin kuin perinteiset kemoterapia, se voidaan suunnitella ja räätälöidä nimenomaan kohdistaa syövät mukaan ymmärrystämme taudin molekyylitasolla. Adenovirusvektori on käytetty siirtää ajoneuvon käyttöön geenien syöpäsoluihin, koska se on tehokkaampi kuin ei-viraalisia geeninsiirto menetelmillä [4], [5]. Adenovirusvektori on vakaa

in vivo

, tehokkaasti toimittaa geenejä sekä jako- ja ei-jakautuvat solut ja aiheuttaa harvoin mitään merkittävää sairautta itse [6], [7]. Kuitenkin perinteinen adenovirus käyttää geeniterapiaan on replikaatiodefisientti yksi alhaisen ekspressiotason terapeuttisen geenin. Syöpää erityisiä replikaation onkolyyttisten vektori, siis, on ehdottomasti tarvitaan estämään näitä ongelmia. Kaksi suurta strategioita on käytetty rakentaa replikatiivista ja syöpää erityisiä onkolyyttistä adenovirus. Ensimmäinen on poistaa viruksen elementti, joka on välttämätön viruksen replikaatiolle normaaleissa soluissa, jota ei tarvita tuumorisoluissa. Esimerkiksi E1B-55K-geeni, joka poistettiin onkolyyttisten virusten ONYX-015 ja ZD55 [8], [9], [10], tarvitaan viruksen replikaatioon normaaleissa soluissa, mutta on tarpeeton syöpäsoluissa johtuu korvaavista mekanismeja. Toinen strategia on korvata promoottori keskeinen geenin adenoviruksen replikaatioon, kuten E1A tai E1B-geeniä, joiden kasvain spesifisen promoottorin [11], [12]. Siten onkolyyttisten virus on erittäin replikoituu, kun promoottori on aktiivinen.

rajoitusten voittamiseksi perinteisen geeniterapian, jossa replikaatiopuutteiset adenovirusvektori, Cancer kohdistaminen Gene-Viro-Therapy (CTGVT) konstruoitiin lisäämällä anti-kasvain geenin kaksinkertainen kohdistetun onkolyyttisten virus (OV) vektori. Se on itse asiassa OV-geenin, ja on paljon parempi antituumorivaikutusta kuin joko geeniterapiaan yksinään tai virotherapy yksin. Onkolyyttisten virus itse on tuumorin vastaista tehoa ja replikoituu selektiivisesti monisatakertaiseksi tuumorisoluissa ja siten terapeuttisten geenien tulisi myös olla selektiivisesti monistaa monisatakertaiseksi tuumorisoluissa [11]. Innovatiivisesti integroimalla geeniterapian ja viro-hoidon jälkeen kasvaimen vastainen vaikutus CTGVT on yleensä paljon suurempi kuin kummankaan menetelmän yksin. 27. tammikuuta 2011 Amgen käytti 1 miljardia dollaria ostaa OncoHSV-GM-CSF (an onkolyyttisten viruksen herpes simplex virus-1), joka on vaiheen III pitkälle melanooman [13], [14], jossa korostetaan ja potentiaalia CTGVT strategiaa.

tässä tutkimuksessa ensin syntyy kaksinkertaisen säännelty adenovirus, Ad.DD3.D55, jossa E1A geeni on valvonnassa

DD3

promoottori ja E1B-55K-geeni oli tuhoutunut.

DD3

on yksi eturauhasen syöpä-geenejä ja sitä on käytetty kliinisissä biomarkkeri eturauhassyövän [15]. On kiinnostavaa, että 214 bp: n fragmentti DD3 ytimen promoottori on korkea promoottorin aktiivisuus [16], ja sen vuoksi sitä käytetään ohjaamaan E1A ilmentymisen onkolyyttisten adenovirus. Koska DD3 ilmentyminen on erittäin rajoitettu eturauhassyövän, olemme aiemmin käytetty minimaalinen DD3-promoottorin E1A ilmentymisen generoimaan onkolyyttisten virus [17]. Taso DD3 promoottoriajetun E1A ilmentymisen oli riittämätön, siis WPRE otettiin parantaa ekspressiota E1A geenin tässä tutkimuksessa. WPRE edistää geenin ilmentymistä promoottori- ja solu-line-riippuvaisella tavalla [18]. WPRE on hyödynnetty tehostajan transgeeniekspression lisäämällä tumasta olevan poikkeavasti säilytetään lähetti-RNA: tumasta sytoplasmaan [19]. Lisäksi,

PTEN

on tunnettu tuumorisuppressorigeenin, joka koodaa proteiinia, fosfataasi [20]. Sen poistaminen on havaittu korkea-asteen eturauhassyövän ja on erittäin tärkeää, että eturauhassyövän etenemisen [21]. Tässä tutkimuksessa,

PTEN

CMV-promoottori insertoitiin Ad.DD3.D55 muodostamiseksi Ad.DD3.D55-PTEN, joka on eturauhasen syöpä replikaation spesifisyys ja antitumor geenin spesifisyyden. Ad.DD3.D55-PTEN efficaciously indusoi apoptoosia eturauhassyövän soluissa, poistamalla eturauhassyöpäksenografteista suuremmalla antituumorivaikutuksen hyötysuhde.

Tulokset

Eturauhassyöpä-Specific Transcriptional aktiivisuus DD3 Järjestäjä ja solutuhovaikutus ja Ad.DD3.D55

minimaalinen DD3 promoottorin aktiivisuuden puuttuessa WPRE mitattiin lusiferaasin-reportterin ilmentymisen, joka osoitti minimaalista DD3 promoottorin tyypillisesti osoitti paljon enemmän aktiivisuutta eturauhassyövän solulinjoissa kuin muilla solulinjat. PGL3-kontrolli, joka sisältää SV40-promoottori ja tehostaja, käytettiin positiivisena kontrollina (aktiivisuus = 1000). Kuten kuviossa 1A on esitetty, ilmentymistä ohjaa

DD3

promoottorin WPRE oli paljon suurempi LNCaP ja 22RV1 kuin muissa soluissa, mukaan lukien eturauhasen syöpäsolulinjoissa DU-145, PC3 ja CL1. Vaikka oli eroja ekspressiotasot näissä eturauhasen solulinjoissa, nämä tulokset osoittavat, että WPRE voisi välittää parantamiseksi geenin ilmentymisen ja ylläpitää suhteellisen rajoitettua aktiivisuutta DD3 promoottorin eturauhasen solulinjoissa.

. Lusiferaasin aktiivisuus DD3 promoottorin läsnä ollessa WPRE ilmaistaan ​​verrattuna pGL3-kontrolli (aktiivisuus = 1000). Solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia infektion jälkeen reportteri plasmidit pGL3-kontrolli tai pGL3-DD3-WPRE, solut otettiin talteen ja lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin. Aktiivisuutta pGL3-DD3-WPRE suhteessa pGL3-kontrolli on esitetty keskiarvo ± standardipoikkeama (SD) kolmesta transfektioiden. B. E1A ilmentymisen mukaan Ad.DD3.D55 (ilman WPRE) ja Ad.DD3.D55 erilaisissa solulinjoissa arvioitiin. a-Tubulin arvioitiin latauskontrollina. C. Kristalliviolettiliuos määrityksessä. Soluja 24-kuoppalevyillä infektoitiin eri virusten on osoitettu MÕIS. Sytotoksisuus havaittiin kristalliviolettivärjäys- värjäys viisi päivää infektion jälkeen.

rakensi uuden onkolyyttisten virus, Ad.DD3-E1A.E1B (Δ55), lyhyesti Ad.DD3.D55 (Fig. 2A ), joka on kaksinkertainen säännelty adenovirus, jossa natiivi promoottori E1A on korvattu pienin

DD3

promoottorin ja E1B-55K-geeni on poistettu. Sytopaattisen vaikutuksen Ad.DD3.D55 arvioitiin normaaleissa ja tuumorisoluissa kristallivioletilla värjäämällä (Fig. 1 B). Vuonna eturauhassyöpäsolulinjoissa 22RV1 ja DU145 The sytotoksisuusmekanismin on Ad.DD3.D55 oli verrattavissa yhden säännelty adenovirus Ad.DD3 ja Ad.D55. Sitä vastoin ei eturauhasen syöpäsolu BEL-7404 ja T24, sytopaattisen vaikutuksen Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3 oli paljon pienempi, mikä osoittaa, että eturauhassyövän-spesifisyys sytotoksisuuden kohdistaman Ad.DD3.D55 oli paljon enemmän parantunut.

. Kaavakuva Ad.DD3.D55-PTEN. Endogeeninen promoottori E1A korvattiin DD3 promoottorin ja E1B-55K-geeni oli tuhoutunut.

PTEN

ekspressiokasetti insertoitiin Ad.DD3.D55 rakentaa Ad.DD3.D55-PTEN. ITR, käänteinen terminal repeat. B. Karakterisointi Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN ilmentymisen Western blot -analyysillä. Ilmaisu PTEN, E1A ja E1B-55K Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 tai Ad.DD3.D55-PTEN in CL1 soluissa arvioitiin. Ad.WT käytettiin positiivisena kontrollina. a-Tubulin arvioitiin latauskontrollina. C. Suhteellinen mRNA tasot

PTEN

ja E1A in 22RV1 soluissa tartunnan Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN. GAPDH arvioitiin sisäisenä viitteenä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. D. Western blot-analyysi koko ja fosforyloidun Akt proteiinin tasot CL1 soluissa tartunnan Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN. E. Analyysi tuumorisektioiden peräisin kasvaimista käsitelty PBS: ää tai yksi lukuisista adenovirusten hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys ja heksoniin ja PTEN immunovärjäys. Mittakaava, 100 pm.

Sitten mittasimme ekspressiotasot E1A eri soluissa tartunnan Ad.DD3.D55 (jossa WPRE) tai Ad.DD3.D55 (ilman WPRE) (Fig. 1C), vastaavasti. E1A ilmentymisen oli voimakkainta 22RV1 soluissa kaikkien testattuihin solulinjoihin, ja ei muuttunut merkittävästi, kun läsnä on WPRE. Kuitenkin käyttöönotto WPRE todellakin nosti ekspressiotasot E1A useissa eturauhassyöpäsolulinja lukien CL1, LNCaP, PC3 ja DU-145. Sitä paitsi se, tiedot osoittivat, että käyttöönotto WPRE ei merkittävästi vaikuta rajoitettu E1A ilmentymisen ohjaa DD3 promoottori eturauhasen syöpäsolujen, joka tarjoaa vahvan todistetta tukemaan kyseistä WPRE on lupaava ehdokas rakentamiseen onkolyyttistä adenoviruksen kohdistaa eturauhassyövän soluja.

Rakentaminen ja karakterisointi Ad.DD3.D55-PTEN

PTEN

ekspressiokasetti tuotiin DD3 ohjaamiseksi kaksinkertainen säännelty-adenovirus Ad.DD3.D55 tuottaa Ad.DD3.D55-PTEN (Fig. 2.A). Ilmentymistasojen PTEN ja E1A eri CTGVT virusten infektoimissa soluissa määritettiin Western-blottauksella jälkeen infektoimaan ihmisen eturauhassyövän solulinja CL1 (Fig. 2B). Replikaatiovialliset adenoviruksen Ad-PTEN kanssa E1-alue poistetaan ja kaksois-säännelty adenovirus Ad.DD3.D55 käytettiin verrokkeina. Kuten odotettua, kaksois-säänneltyjen virukset Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN ilmaisi E1A-proteiinia suunnilleen samalla tasolla kuin teki Ad.WT ja jättänyt ilmaista E1B-55K-proteiinin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun proteiinin ekspressio mitattiin mRNA-tasolla reaaliaikaisella PCR: llä (Fig. 2C). Luonnehtia toiminto PTENin in Ad.DD3.D55-PTEN vaikutukset sen ilme fosforylaatioon tilasta Akt tutkittiin Western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, infektion onkolyyttisten virus lisäsi fosfo-Akt-ekspressio, joka oli havaittavissa jo 24 h infektion jälkeen. Lisäksi PTEN ilmaus estivät fosforylaatiota Akt sen aktivoiva jäännös (Ser473) heikentämättä yhteensä Akt-proteiinia tasoa verrattuna vektorin Ad.DD3.D55. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​PTEN: n lipidejä fosfataasiaktiivisuus. Edelleen karakterisoimiseksi virukset

in vivo

, tasoja viruksen proteiinin heksoni ja terapeuttisen geenin

PTEN

mitattiin Tuumorinäytteet 7 päivää injektion jälkeen virukset. Kuten on esitetty kuviossa 2E, korkea heksonin havaittiin Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN ryhmiä. Ilmaus terapeuttisen geenin

PTEN

mitattiin myös näiden Tuumorinäytteet. Näytteet tartunnan Ad-PTEN ja Ad.DD3.D55-PTEN näkyy korkea PTEN ekspressiotasot, mutta

PTEN

ilmentymistä ei havaittu Ad.DD3.D55 hoidetussa ryhmässä.

eturauhassyöpä-spesifisen sytotoksisuuden Ad.DD3.D55-PTEN

in vitro

sytotoksisuus Ad.DD3.D55-PTEN arvioitiin MTT: llä kolme eturauhassyövän solulinjoissa CL1, LNCaP, DU145, 22RV1, PC3 ja kaksi ei-eturauhassyöpäsolulinjoissa T24 (ihmisen virtsarakon karsinooma solulinja) ja BEL-7404 (ihmisen maksasyöpä-solulinja). Tulokset osoittivat, että kasvun tartunnan eturauhasen syöpäsolujen olivat paljon inhiboi eri määrin, kun taas korkein tehokkuutta inhibition Ad.DD3.D55-PTEN havaittiin LNCaP-soluissa ja CL1 solut (Fig. 3A). Nämä tiedot osoittivat myös, että sytotoksisuus Ad.DD3.D55-PTEN on huomattavasti korkeampi kuin Ad.DD3.D55. Kuitenkin sekä viruksen on osoitettu olevan kykenemätön inhiboimaan kasvua ei-eturauhasen syöpäsolujen merkittävästi (Fig. 3A).

. MTT-analyysi. Kuusi solulinjoja edellä mainittiin ympättiin 96-kuoppalevyille ja infektoitiin erilaisilla viruksilla MOI 10. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksissä on 0, 24, 48, 72, 96 ja 120 tuntia infektion jälkeen. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD viiden erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​prosentteina suhteessa valehoidettujen kontrollisoluihin. B. Kristalliviolettiliuos määrityksessä. Soluja 24-kuoppalevyillä infektoitiin eri virusten on osoitettu MÕIS. Sytotoksisuus havaittiin kristallivioletilla värjäämällä viisi päivää infektion jälkeen.

sytotoksisuus Ad.DD3.D55-PTEN analysoitiin myös värjäämällä kristallivioletilla, kuten on esitetty kuviossa 3B. Ad.DD3.D55-PTEN oli voimakas sytotoksinen vaikutus syöpäsolujen. LNCaP-solujen ja CL1 solut olivat herkempiä sytotoksisuuden kohdistama Ad.DD3.D55-PTEN kuin oli DU-145 ja 22RV1 soluja. Kuitenkin vähän tai ei lainkaan sytotoksisuutta ei havaittu ei-eturauhassyöpäsolulinjoissa, kuten T-24, BEL-7404, ja normaali solulinjat, HFL-I ja BEAS-2B. Nämä tulokset osoittavat, että sytotoksisuus Ad.DD3.D55-PTEN oli paitsi paljon vahvempi kuin Ad.DD3.D55 ilmentymisen vuoksi on

PTEN

, mutta myös erittäin rajoitettu eturauhasen syöpäsoluja.

Ad.DD3.D55-PTEN indusoi apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa

in vitro

värjätyistä soluista Hoechst33258 edelleen analysoida apoptoosin-asiakkuutta kapasiteetti Ad.DD3 .D55-PTEN

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa 4A, Ad.DD3.D55-PTEN indusoi merkittävän apoptoosin CL1 ja 22RV1 soluja. Kuitenkin replikaatiokyvyttömäksi Ad-PTEN ja kaksinkertainen säädelty Ad.DD3.D55 osoittivat marginaalinen kyky aiheuttaa apoptoosia. Virtaussytometria suoritettiin joka kuolleet solut edustaa osa solujen osa-G1 vaiheeseen. Infektio Ad.DD3.D55-PTEN lisäsi solujen osa-G1 vaiheeseen testattu eturauhasen solulinjoissa (CL1, DU145, 22RV1, PC3) ja korkeamman apoptoottisten indeksin todettiin 22RV1 soluissa (43,135%) kuin in DU145, PC3 tai CL1 soluja, sopusoinnussa korkeamman E1A ilmentymisen että 22RV1 solulinjassa (Fig. 4B).

. CL1 ja 22RV1 solut värjättiin Hoechst 33258 48 tuntia virusinfektion jälkeen. Nuolet osoittavat apoptoottisia soluja. Asteikko bar, 10 mikrometriä. B. virtaussytometrinen analyysi propidiumjodidilla värjättyjen solujen suoritettiin 48 tuntia infektion jälkeen. Prosenttiosuudet Saharan G1 solut näkyvät. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta (** osoittaa

P

0,01; * tarkoittaa

P

0,05; N /S osoittaa

P

0,05).

Ad.DD3.D55-PTEN indusoi apoptoosia kautta sisäiseen ja ulkoiseen signalointireitteihin

mekanismia Ad.DD3.D55-PTEN indusoiman apoptoosin tutkittiin. Kuten kuviossa 5B on esitetty, pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk estivät indusoimaa solukuolemaa Ad.DD3.D55-PTEN in CL1 soluissa. Tämä tulos osoittaa, että solukuoleman aiheuttama Ad.DD3.D55-PTEN on kaspaasiriippuvaisen. Lisäksi, useita kaspaasi-riippuvaista apoptoosia signa- analysoitiin Western blottauksella (kuvio. 5A). Parannettu PARP lohkominen ja aktivointi prokaspaasi-3, prokaspaasi-8 havaittiin Ad.DD3.D55-PTEN-infektoituneissa soluissa (kuvio. 5A). Olemme myös havainneet ajasta riippuva väheneminen tason precaspase-9 Ad.DD3.D55-PTEN-infektoituneissa soluissa (kuvio. 5A), mikä on yhdenmukaista aktivointi mitokondrioiden-välitteistä apoptoosia signalointireitin. Eheyden solujen mitokondrioita arvioitiin potentiometriseen fluoresoivalla JC-1 (Fig. 5B). Virtaussytometria osoitti, että infektio Ad.DD3.D55-PTEN aiheutti huomattavan laskun mitokondrion transmembraani- sähköinen potentiaali (Fig. 5C). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että PTEN tehokkaasti parantaa Ad.DD3.D55 aiheuttaman apoptoosin sisäiseen ja ulkoiseen polkuja.

. Western blot-analyysi apoptoosin liittyvien proteiinien CL1 soluissa tartunnan Ad.DD3.D55 tai Ad.DD3.D55-PTEN. B. CL1-soluja käsiteltiin osoitetuilla aineiden ja solujen elinkykyisyys analysoitiin MTT-määrityksellä sen jälkeen, kun 120 tuntia. Z-VAD-fmk-inhibitioanalyysi, soluja esi-käsiteltiin Z-VAD-fmk (20 uM) 2 tunnin ajan ennen virusinfektiota. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta (** osoittaa

P

0,01; * tarkoittaa

P

0,05; N /S osoittaa

P

0,05). C. Analyysi mitokondrion kalvon potentiaalia CL1 solujen FACS jälkeen JC-1 värjäystä. Prosenttiosuus solujen puolisuunnikkaan alue näkyy.

Vastustamisesta tuumorikasvun Ad.DD3.D55-PTEN indusoi apoptoosia

In vivo

Tulokset edellä esitetyt osoittavat, että kasvaimen vastainen vaikutus CTGVT aineen Ad.DD3.D55-PTEN on paljon parempi kuin joko onkolyyttisten virus Ad.DD3.D55 tai Ad.PTEN yksin. Eturauhassyövän solulinjoissa testattu, Ad.DD3.D55-PTEN tappoi LNCaP ja CL-1-solut, joilla on korkein tehokkuutta. Valitsimme solulinja CL1, androgeeni-riippumaton osakloonia LNCaP, arvioida onkolyyttinen potentiaalia Ad.DD3.D55-PTEN koska LNCaP huono kasvain pystyvät muodostamaan

in vivo

. Kuten on esitetty kuviossa 6A, kasvaimen kasvu injektion jälkeen oli lähes completedly inhiboi lopullinen kasvaimen tilavuus jälkeen Ad.DD3.D55-PTEN hoidon vähemmän kuin alkuperäinen tilavuus alussa Ad.DD3.D55-PTEN hoitoon. Toinen tapa sanoa, ei vain Ad.DD3.D55-PTEN-tartunnan kasvaimet eivät kasva, mutta niiden määrät todellisuudessa kutistui 41,3% mitattuna 20 päivän kuluttua injektion. Tämä osoittaa voimakas vaikutus Ad.DD3.D55-PTEN kasvaimen kasvua. Kuitenkin sekä Ad.DD3.D55 ja Ad.PTEN esti kasvaimen kasvua kanssa paljon pienempi hyötysuhde, verrattuna Ad.DD3.D55-PTEN.

. Antituumorivaikutusta tartunnan CL1 ksenograftikasvaimissa eri adenovirusten. Kasvaimen tilavuus mitattiin ja se on esitetty keskiarvona ± SD. B. Ad.DD3.D55-PTEN estää niiden kasvun CL1 ksenograftikasvaimissa. Analyysi viruskinetiikkaan Ad-PTEN tai Ad.DD3.D55-PTEN-käsitelty 22RV1 kasvaimia reaaliaikaisella PCR: llä. Adenoviruksen E3-alue monistettiin arvioida virus-DNA: sisältöä. p-aktiini DNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. (NS välineet

P

0,05, tilastollisesti merkitseviä). C. Analyysi tuumorisektioiden peräisin kasvaimista käsitelty PBS: ää tai yksi lukuisista adenovirusten TUNEL värjäys. Mittakaava, 100 pm.

viruskinetiikkaan Tutkimus

in vivo

havainnollistamiseksi edelleen paremmuus Ad.DD3.D55-PTEN sen viruksen DNA määrä jopa 100 kertaa suurempi kuin että Ad-PTEN 72 tunnin ja kestävät 2 viikkoa (Fig. 6B). TUNEL-analyysi paljasti, että injektio Ad.DD3.D55-PTEN aiheutti merkittävän määrän apoptoosin kasvaimia, kun taas mitään apoptoosia ei havaittu PBS-käsitellyt tuumorit, ja vähän Ad-PTEN-käsitellyt tuumorit (Fig. 6C).

keskustelu

tässä tutkimuksessa Ad.DD3.D55-PTEN osoitti erinomaista antituumorivaikutus

in vitro

ja

in vivo

. Kaksi suurta tekijät vaikuttavat sytotoksisuuden kohdistama Ad.DD3.D55-PTEN. Ensimmäinen on, että se replikoituu selektiivisesti eturauhassyöpäsoluissa. Olemme aiemmin raportoitu, että minimaalinen DD3 promoottorin hallinnassa onkolyyttisten virus replikoituu selektiivisesti eturauhassyöpäsoluissa [17], vaikka promoottorin aktiivisuus oli ei ole kovin tyydyttävä. PSA on tunnettu biomarkkereiden eturauhassyövän ja sen promoottori on laajalti käytetty tutkimaan Biotherapies eturauhasen syöpä, mukaan lukien geeniterapian eri vektoreilla [22], [23], [24], [25]. Eri rekombinantti-promoottorit ovat generoidaan perustuen Eturauhassyöpä-spesifinen aktiivisuus promoottori tai tehostaja lisätä Eturauhassyöpä-spesifinen aktiivisuus promoottoriin, joka kontrolloi replikaation onkolyyttisten virus [26], [27], [28], [ ,,,0],29]. Solukuolemaa tehoa voidaan parantaa monia menetelmiä, kuten yhdistämällä onkolyyttinen adenovirus sädehoitoa tai kemoterapiaa. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmä ONYX-15 virus ja kemoterapia herättää voimakkaamman kasvaimen vastaisen vasteen pään ja kaulan alueen syöpä kuin ONYX-15 tai kemoterapiaa yksinään [30]. Potilaat, joilla on eturauhasen syöpä on hoidettu useimmiten Androgeeniablaatio-. Koska aktiivisuus PSA promoottori /tehostaja on erittäin riippuvainen omien androgeenien [31],

in vivo

sytotoksisuus PSA promoottori /tehostaja-pohjainen onkolyyttisten virus voidaan vähentää merkittävästi, jos sitä käytetään potilaille, jotka on hoidettu androgeeniablaatio. Tässä tutkimuksessa toimme WPRE vuonna DD3-ohjattu E1A ekspressiokasetin. Mielenkiintoista on, että läsnä WPRE nosti tasot reportterin ilmentymisen huomattavasti, mutta ei vaikuttanut merkittävästi rajoitettu ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportoitu käytön WPRE synnyttämisessä olevan onkolyyttisten virus. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että Ad.DD3.D55-PTEN, joissa E1A ilmentymisen on alle kontrollin DD3 promoottorin ja WPRE, kohdistuva voimakas estävä vaikutus kasvuun androgeeniriippuvaisen sekä androgeenistä riippumattomia solulinjoja mukaan lukien CL1, DU145 ja 22RV1 soluviljelmässä ja CL1 kasvaimen kasvua vierassiirrännänmallissa nude mouse. Ad.DD3.D55-PTEN on voimakas sytotoksinen vaikutus androgeeni-riippumattomia solulinjoja. Siksi E1A ilmentymisen valvonnassa ja DD3 promoottorin ja WPRE voi olla kliinisesti merkittävä onkolyyttinen viruksen hoitoon potilailla, joilla on eturauhasen syöpä.

tulokset osoittivat, että ilmentyminen PTEN häntä toisen avainasemassa sytotoksisuuden Ad.DD3.D55-PTEN. PTEN toimii fosfatidyyli fosfataasi ja mahdollinen rooli fosfatidyyli 3′-kinaasi (PI3’K) -välitteisen signaalitransduktion, tukahduttaa PI3K /AKT-reitin vähentämällä tasoa PI3’K solussa [32], [33] . Onkolyyttisten virus Ad.DD3.D55 ja Ad.DD3.D55-PTEN lisännyt fosfo-Akt-ilmentymisen 24 tunnin jälkeen infektiosta (Fig. 2.D); aktivoituminen PI3K-Akt signalointi on polku palveluksessa virukset virus endosytoosin ja replikointi [34], [35], [36], [37]. Ad.DD3.D55-PTEN inhiboi fosforylaatiota Akt sen aktivoiva jäännös (Ser473) seurauksena PTEN ilmaisun, kun aktivointi Akt pidettiin kanssa infektio Ad.DD3.D55 (Fig. 2.D). Ero selvästi voimakas rooli PTEN. Lisäksi, PTEN on todettu inaktivoiva muutos useita ihmisen syövän tyyppejä, kuten gliooma, rinta-, keuhko-, eturauhas-, virtsarakko-, melanooman ja munuaisen tuumorit, astrosytooma, ja leukemia [38]. Eturauhassyövän, menetys PTEN proteiinin korreloi kasvaimia korkealuokkaisesta ja vaiheessa, mikä viittaa siihen, että muutokset

PTEN

geeni voi liittyä eturauhassyövän etenemiseen [21], [39]. Wu et ai. perustettiin hiirimallissa prostataspesifisen poistetaan PTEN [40]. Tämä hiirimallissa esitetään yhteenveto eturauhassyövän etenemistä ihmisillä aloittamisen eturauhassyövän eturauhasen intraepiteelisen neoplasian, jonka jälkeen eteneminen invasiivisia adenokarsinooma ja myöhemmät etäpesäke. Siksi PTEN on optimaalinen ehdokas syövän geeniterapiaa koska sen ainutlaatuiset ominaisuudet. Käyttöönotto PTEN adenoviruksen tai retrovirus on tutkittu bio-terapiassa eri tyyppisiä syöpä, mukaan lukien munasarjojen, kohdun limakalvon, virtsarakon, mahalaukun, paksusuolen ja peräsuolen, ja ruokatorven syöpien ja glioblastooma [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47]. Esimerkiksi, Gallick et ai. raportoitu, että adenoviruksen välittämää ilmentymä PTEN estivät leviämisen ja etäpesäke ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

in vitro

ja

vivo

[48]. Adenovirus–välitteisen PTEN ilmentymistä yhdessä sädehoidon, kemoterapian ja muiden syöpää estäviä geenejä on käytetty eturauhassyövän soluissa lisätä antituumorivaikutuksen [49], [50], [51], [52]. Tässä tutkimuksessa, korkeat PTEN ilmentymisen, jota ohjaa CMV-promoottori olivat välittämien onkolyyttisten virus, joka replikoituu valikoivasti eturauhasen syöpäsolujen käyttämällä DD3-promoottorin E1A ilmentymisen. Tuumorin vastaista tehokkuutta PTEN on onkolyyttisten virus paljon tehostunutta verrattiin adenovirus-välitteistä PTEN, joka on aikaisemmin raportoitu käytettäväksi eturauhassyövän [48], [52], se voi olla seurausta, että Ad.DD3.D55-PTEN indusoiman massiivinen apoptoosin eturauhassyövän soluissa sisäiseen ja ulkoiseen polkuja.

Havaitiin vaihtelevat herkkyydet eri eturauhassyövän solulinjojen sytotoksisuuden Ad.DD3.D55-PTEN. Taso Reportteri ilmentymistä ohjaavat DD3 promoottori ja WPRE LNCaP-soluissa oli vain 21,79% ja että 22RV1 soluissa (Kuva. 1), mikä viittaa pienempi replikointi Ad.DD3.D55-PTEN LNCaP-soluissa, mikä näyttäisi epäjohdonmukainen korkeamman tappaminen tehoa Ad.DD3.D55-PTEN LNCaP-soluissa kuin 22RV1 soluissa (Fig. 3). Kuitenkin 22RV1 ilmentävät funktionaalista PTEN, kun taas LNCaP ei [53]. Ottaen huomioon nämä tiedot Ad.DD3.D55-PTEN luultavasti kohdistaa voimakkaampi sytotoksinen vaikutus PTEN-negatiivisten PCa soluissa kuin PTEN-positiivisten PCa soluja.

volyymit kasvain CL1 solujen redued 41,3% 20 päivän kuluttua tartunnan Ad.DD3.D55-PTEN nude-hiirimallissa (Fig. 6A) viittaa vahvasti siihen, että Ad.DD3.D55-PTEN on terapeuttista potentiaalia hoidettaessa androgeeni-riippumaton syöpiä. Tutkimus osoitti, että adenoviruksen replikaatiolle hidastui kuluttua noin 12 päivää aktiivisia replikaation (Fig. 6B). Mielenkiintoista, vaikka nopeus onkolyyttisten viruksen pidetty erittäin alhainen

in vivo

jakson jälkeen (Kuva. 6B), saastuneen kasvain vieläkään ei merkittävästi kasva (Fig. 6A). Sen mekanismi tähän ilmiöön ei tunneta. Yksi todennäköinen selitys on, että valtaosa syöpäsolujen kuoli ensimmäisen päivän injektion jälkeen Ad.DD3.D55-PTEN, kun taas kasvu jäljellä olevat syöpäsolut inhiboidaan tehokkaasti myös, kun läsnä on minimaalinen määrä onkolyyttisten virus. Ilmiö on luultavasti kannustaa koska useimmat virus ratkeaa

in vivo

kun onkolyyttisten virusta käytetään kliinisesti.

Yhteenvetona olemme kehittäneet uuden prostataspesifisen CTGVT (CTGVT-PCa ), Ad.DD3.D55-PTEN, ohjaamalla ilmentymistä E1A geenin minimaalinen DD3 promoottorin ja WPRE. Ad.DD3.D55-PTEN oli erinomainen kasvainten vastainen teho sekä androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman eturauhassyövän solulinjoissa. Tämä raportti tarjoaa myös uusi strategia rakentaa CTGVT-PCa kanssa kasvaintyypeille tarkemman on muutama kasvain promoottorit käytettävissä.

Materiaalit ja menetelmät

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä ja eläinten Experiment

Mies BALB /c-nude-hiiriin (4 viikon ikäisiä) pidettiin ja käytetään valoa ja kylmä- huoneen käytettäessä AAALAC-akkreditoitu laitos, ja juotettava ja laboratorioruokaa

ad libitum

[17] . Kaikki koetoimenpiteet hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Shanghai Institute Biokemian ja solubiologian alle protokolla IBCB-SPF0029. Luoda ksenograftikasvaimissa, 5 x 10

6 22RV1 tai CL1 solujen 150 pl DMEM injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 70-150 mm

3 kooltaan, hiiret satunnaistettiin yhteen neljästä ryhmästä (kuusi hiirtä ryhmää kohti). Adenovirus (2 x 10

9 PFU per hiiri) tai PBS: ää ruiskutetaan kasvaimia joka toinen päivä, joissa on yhteensä kolme injektiota. Kasvaimen tilavuus (mm

3) mitattiin mikrometrillä joka neljäs päivä ja lasketaan (pituus x leveys

2) /2. Tutkia viruskinetiikkaan

in vivo

, kasvaimet pistetään Ad-PTEN tai Ad.DD3.D55-PTEN kerättiin 3, 6, 9, 12 ja 15 päivää viimeisen injektion ja jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä . Yhteenlaskettu kasvain-DNA eristettiin käyttäen Genominen DNA Minipreps Kit (Generay Biotech, Shanghai, Kiina). Virus-DNA mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä alukkeita, adenoviruksen E3-alue. [54].