Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Levyepiteelisyöpä keuhkosyövän osuus on noin 25% uusista keuhkosyöpä tapauksissa ja 40000 kuolemantapausta vuodessa Yhdysvalloissa. Vaikka on olemassa useita genomisesti kohdistettuja hoitomuotoja keuhkoadenokarsinooma, kukaan ei ole vielä raportoitu okasolusyöpä keuhkosyöpä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä SNP erilaisia ​​analyysi, huomasimme, että tietyn alueen kromosomi segmentin 8p11-12 sisältää kolme genes-

WHSC1L1

,

LETM2

, ja

FGFR1

-asetusta monistettiin 3% keuhkojen adenokarsinooman ja 21% squamous cell keuhkokarsinoomista. Lisäksi osoitimme, että ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjassa kätkeminen polttoväli monistamiseen

FGFR1

riippuu FGFR1 toimintaa solujen kasvua, koska hoito tämän solulinjan joko

FGFR1

– erityisiä shRNAs tai FGFR pienimolekyylisiä entsymaattinen inhibiittorit johtaa solujen kasvun estäminen.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tutkimukset osoittavat, että

FGFR1

vahvistus on yleinen okasolusyöpä keuhkosyöpä, ja että FGFR1 voi edustaa lupaava terapeuttinen kohde ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Dutt A, Ramos AH, Hammerman PS, Mermel C, Cho J, Sharifnia T, et al. (2011) Inhibitor-Sensitive

FGFR1

Amplification Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 6 (6): e20351. doi: 10,1371 /journal.pone.0020351

Toimittaja: Ming Sinä, Medical College of Wisconsin, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 joulukuu 2010; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2011; Julkaistu: 07 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Dutt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoituslähteet tämän työn sisältää tuen Novartis Pharmaceuticals, American Lung Association, Uniting Against Keuhkosyöpä, Sarah Thomas Monopoli Fund, Seaman Foundation ja Genentech MM A. D. tukee Ramalingaswami apurahan päässä Department of Biotechnology, tiede-, Intian hallitus. P.S.H. tukee nuorten tutkijoiden palkinnon National Keuhkosyöpä Partnership. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: M. M. on konsultti Novartis ja vastaanottaa tutkimuksen tukea Novartis, saa tutkimus tukea Genentech, ja on perustamassa neuvonantaja ja konsultti, ja oman pääoman haltija Foundation Medicine. N.G. laboratorio vastaanottaa sponsoroi tutkimusta Novartis. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuoleman kehittyneissä maissa kuolemaa vuonna 2009 arvioidaan noin 160.000 Yhdysvalloissa, noin 28% kaikista syöpäkuolemista [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on 75% kaikista keuhkosyövässä ja sisältää kaksi hallitseva alatyyppiä, adenokarsinooma ja okasolusyöpä (SCC), joka sisältää 40% ja 25% NSCLCs, vastaavasti [2], [3] . Huolimatta selkeistä histologiset ja biologinen erotteluja, keuhkon adenokarsinooma ja okasolusyöpä pitkälti käsitellään samalla kemoterapia-aineiden kanssa lukuun ottamatta antifolaattisyöpälääke pemetreksedi joka on hyväksytty hoitoon ei-squamous NSCLC [4].

merkittäviä edistysaskeleita hoitoon keuhkoadenokarsinooma ovat johtui yksityiskohtainen genomisesta analyysejä ja käyttöönoton molekyylirakennetta suunnattu aineiden johtava jotka ovat johtaneet parannuksiin hoitotuloksia. Esimerkkejä ovat käyttö kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjien, kuten gefitinibi ja erlotinibi [5], [6], [7] keuhkojen adenokarsinooman varustettujen

EGFR

mutaatioita [8], [9], [ ,,,0],10], ja ALK estäjien kuten crizotinib [11] keuhkojen adenokarsinooman varustettujen

EML4-ALK

translokaatiot [12], [13].

vähän kuitenkin nykyään tiedetään kohdistettavaksi geneettisiä poikkeavuuksia taustalla okasolusyöpä keuhkosyöpä. Sen lisäksi, että

TP53

mutaatioita [14], levyepiteelisyöpä keuhkosyövän on osoitettu satama-amplifikaatiot

PIK3CA

[15],

Sox2

[16], ja

EGFR

[16] sekä

EGFR

variantti III mutaatioita [17]

DDR2

mutaatioita [18] ja harvinainen amplifikaatioita

PDGFRA /KIT

[ ,,,0],19], [20] ja

BRF2

[21]. Tuore tutkimus on osoittanut polttoväli monistamisen

FGFR1

lokukseen kromosomissa 8p liittyy solujen riippuvuus

FGFR1

ja herkkyys FGFR estäjiä [22]. Tällä hetkellä ei ole olemassa FDA-hyväksyttyjä kohdistettuja hoitomuotoja okasolusyöpä keuhkosyöpä.

kohdistaminen monistettiin tyrosiinikinaaseiksi vasta-aineilla tai pienmolekyylisalpaajien on johtanut dramaattisia parannuksia vasteluvuissa ja eloonjäämisaste syöpäpotilaille, joiden kasvaimet satama erityisiä genomista poikkeavuuksia. Amplifikaatioita

EGFR

ja

ErbB2

on raportoitu erilaisia ​​maligniteetteja, kuten pään ja kaulan, ruokatorven, mahalaukun, rinta- ja paksusuolen syövät sekä NSCLC [23]. Kohdistaminen näistä tyrosiinin kinaasien, kuten käyttö setuksimabin kohdistaa

EGFR

peräsuolen ja pään ja kaulan alueen syöpä [24], [25] ja käyttää trastutsumabi kohdistaa

erbB2

vuonna rintasyövän [26], on johtanut merkittävää parannusta hoitotuloksia kussakin näistä sairauksista, mutta ei kaikilla potilailla, joilla nämä monistuksissa reagoida kohdennettuja tekijöille [27], [28], mikä johtuu todennäköisesti ylimääräisiä genomisia muutoksia sisällä kasvain, joka johtaa perus-resistenssin tietyille tekijöille [29], [30].

fibroblastikasvutekijäreseptori tyypin 1 geeni (

FGFR1

) on yksi yleisimmin monistettujen geenien ihmisen syövässä [16 ]. Fibroblastikasvutekijän reseptorin (FGFR) tyrosiinikinaasiperheen koostuu neljästä kinaasien, FGFR1, 2, 3, ja 4, jotka pelata ratkaiseva rooli kehityksessä, ja niiden on osoitettu olevan tavoitteita sääntelyn joko vahvistus, pistemutaatio tai translokaatio (tarkistetaan [31]). Toiselle siirtäminen liittyy

FGFR3

sekä aktivoivat somaattisia mutaatioita

FGFR3

on tunnistettu useita myelooma ja virtsarakon syöpä [32], [33], [34]. Me ja muut ovat tunnistettu aktivoivia mutaatioita

FGFR2

endometriumin syöpä [35], [36]. Monistaminen tai aktivoitumista

FGFR1

on raportoitu suun levyepiteelikarsinooma syöpä [37], ruokatorven levyepiteelikarsinoomien [38], munasarjasyöpä [39], virtsarakon syöpä [40], eturauhassyöpä [41], rhabodomyosarcoma [ ,,,0],42], ja keuhkosyöpä [16], [43], [44], [45], [46]. Tämän mukaisesti yleiseurooppalainen FGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla on osoitettu estävän kasvainsolujen proliferaatio osajoukko NSCLC solulinjojen käyttöön FGFR signalointia, mutta sillä ei ole vaikutusta soluihin, jotka eivät aktivoi reitin [47].

FGFR1

on tunnistettu kuljettaja tapahtuma rintakarsinoomissa ja NSCLC, erityisesti levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä karsinoomat, kätkeminen samanlainen monistuksia on 8p11 kromosomisegmentin [22], [48]

Perustuen SNP array kopioluku analyysi 732 näytettä, me raportoimme että

FGFR1

on somaattisesti monistetaan 21% keuhkojen okasolusyöpää verrattuna 3,4% keuhkojen adenokarsinooman. Vahvistamme FGFR1 mahdollisena terapeuttisena kohteena osoittamalla, että ainakin yksi

FGFR1

-amplified NSCLC tuumorisolulinja on herkkä FGFR entsymaattinen esto ja riippuvainen

FGFR1

lauseke solujen elinkelpoisuuden osoituksena shRNA hoitoon. Yhdessä aikaisempien raporttien tarkistetaan edellä, nämä tulokset viittaavat siihen, että FGFR1 voi olla houkutteleva terapeuttinen kohde NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

NSCLC Perusnäytteissä ja solulinjoissa

NSCLC solu linjat, NCI-H1703 (levyepiteelikarsinooma), NCI-H2444 (keuhkojen), NCI-H520 (levyepiteelikarsinooma), HCC95 (suomuinen), NCI-1581 (suuri karsinooma), Calu3 (ei ole mainittu muualla), NCI-H1734 (ei muuten määritelty), Colo699 (adenokarsinooma), NCI-H2170 (levyepiteelikarsinooma), NCI-H226 (levyepiteelikarsinooma), A427 (adenokarsinooma), NCI-H1563 (adenokarsinooma), NCI-H1781 (adenokarsinooma) ja HCC15 (suomuinen) saatiin kokoelmasta AF Gazdar, J. Minna ja työtovereiden [49], [50], [51], ATCC (Manassas, Virginia, Yhdysvallat) ja /tai DSMZ (Braunschweig, Saksa). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 täydellinen median täydennetty 10% vasikan seerumia (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, Yhdysvallat) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco /Invitrogen). NSCLC kasvain /normaali paria analysoitu tässä tutkimuksessa on kuvattu aiemmin [16], [20], [45], [50], [52].

SNP array data-analyysi

SNP array kokeet suoritettiin 732 NSCLC kasvain ja solujen näytteitä ja tiedot analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [16], [20], [45], [50], [52]. Rajojen 8p11 amplikonin määritelty synergisillä analyysi [53] tunnistettiin raportoitu [52] (https://www.broadinstitute.org/tumorscape/pages/portalHome.jsf). Tietojen näyttö on suoritettu käyttäen integroiva Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv).

Transfektio ja infektio

Phoenix 293T pakkaus solulinja (Orbigen, San Diego, California, Yhdysvallat) transfektoitiin pBabe-Puro-pohjainen gateway vektoreiden avulla Fugenea® 6 transfektioreagenssia (Roche, Indianapolis, Yhdysvallat) tuottaa replikaatioinkompetentin retrovirusten. Target-soluja infektoitiin näillä retrovirusten läsnä ollessa 8 ug /ml polybreeniä. Kaksi päivää infektion jälkeen solut käsiteltiin 2 ug /ml puromysiiniä (Sigma, St. Louis, Missouri, Yhdysvallat) kaksi päivää. Saatu stabiilien solulinjojen käytettiin kokeellisiin tutkimuksiin.

shRNA välittämä

FGFR1

pudotus

shRNA vektorit saatiin TRC (RNAi Consortium). Tavoitteena sekvenssit shRNA konstruktioita ovat:

FGFR1

# 1 (TRCN 0000121307): 5′- AGTGGCTTATTAATTCCGATA-3 ’.

FGFR1

# 2 (TRCN 0000121308): 5′- GCTTGCCAATGGCGGACTCAA-3 ’.

FGFR1

# 3 (TRCN 0000121309): 5′- CTTGTATGTCATCGTGGAGTA-3′.

FGFR1

# 4 (TRCN 0000121310): 5′- CAAGATGAAGAGTGGTACCAA-3 ’.

FGFR1

# 5 (TRCN 0000121311): 5′- GAATGAGTACGGCAGCATCAA-3′.

LETM2

# 1 (TRCN 0000040243): 5′- CGCACCTTCTACCTGATAGAT-3 ’.

LETM2

# 2 (TRCN 0000040244): 5′- CCCAGCACAAAGGAGATAGTT-3 ’.

LETM2

# 3 (TRCN 0000040245): 5′- CCAGTTACATCATCACCCATA-3′.

LETM2

# 4 (TRCN 0000040246): 5′- CCAGGAACTAGACTAATACAA-3 ’.

LETM2

# 4 (TRCN 0000040247): 5′- GCATTGAGTGTATCAGAACTA-3′.

WHSC1L1

# 1 (TRCN 0000015613): 5′- CGAGAGTATAAAGGTCATAAA-3 ’.

WHSC1L1

# 2 (TRCN 0000015614): 5′- CCATCATCAATCAGTGTGTAT-3′.

WHSC1L1

# 3 (TRCN 0000015615): 5′- CGAGAATATCATGTCCAGTTT-3 ’.

WHSC1L1

# 4 (TRCN 0000015616): 5′- GCTTCCATTACGATGCACAAA-3′ .

WHSC1L1

# 5 (TRCN 0000015617): 5′- GCAGGGAATTGTTTGAGTCTT-3 ’.

sekvenssi kohteena

GFP

shRNA on 5 ”-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3 ’. Lentiviruksiin tehtiin transfektoimalla 293T pakkausten solujen Näiden rakenteiden avulla kolmen plasmidin järjestelmä aikaisemmin kuvatulla [54]. Kohdesoluja inkuboitiin lentivirukset 6 tuntia, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä ja jätetään tuoretta väliainetta. Soluja kasvatettiin kaksi päivää. Viisikymmentä mikrogrammaa kokosoluliuotteista valmistettu tartunta solulinjoista analysoitiin Western blottauksella.

Kasvu ja Proliferaatiomääritykset

selviytymisen määritykset, 2 x 10

6 solua kullekin kasvainsolun joka ilmentää shRNAs konstrukteja kohdistaminen

FGFR1

,

WHSC1L1

,

LETM2

tai

GFP

yhdessä infektoimattomia soluja ympättiin 3 replikoituu on 6 kuoppalevyllä . Solujen elinkelpoisuus määritettiin 24 tunnin ajankohtina 4 peräkkäisenä päivänä laskemalla solut käyttäen Beckman Coulter Vi-Cell Automatisoitu elinkykyyn Analyzer seuraavat trypaanisinivärin värjäystä. Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuuden piirrettiin kullekin solulinjalla saatujen lukemien päivänä 4 suhteessa päivä 1.

Soft agar ankkurista riippumaton kasvu määrityksessä

pehmeä agar määrityksiä, 2 x 10

4 NSCLC-solut ilmentävät sh

FGFR1

ja sh

GFP

suspendoitiin pintakerros RPMI1640, joka sisältää 10% vasikan seerumia ja 0,4% Select agar (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, Yhdysvallat) ja maljattiin pohjakerros RPMI1640, joka sisälsi 10% vasikan seerumia ja 0,5%: Valitse agar on 6-kuoppaiselle levylle. PD173074 tai FIIN-1 [55] lisättiin kuvatulla alkuun agar. Sen jälkeen kun 3-5 viikkoa inkuboinnin pesäkkeet laskettiin kolmena kappaleena. IC50 määritettiin epälineaarisella regressiolla käyttämällä Prism 5 -ohjelmaa (GraphPad Software).

Sytotoksisuusmääritykset

Riippuen kasvukäyrät kustakin solulinjasta, 800 ja 2000 NSCLC-solut ympättiin 6 rinnakkaista 96-kuoppalevylle. Yhden päivän kuluttua pinnoitus, kasvavien annosten FGFR estäjät PD173074 tai FIIN-1 lisättiin ja solujen lisääntymistä arvioitiin 4 päivää myöhemmin käyttäen WST-1 määritys (Roche Applied Science). Kukin datapiste edustaa mediaania kuusi rinnakkaisten kaivojen kullekin tuumorisolulinja ja inhibiittoriväkevyyden. IC50 määritettiin epälineaarisen regression avulla käyttäen Prism Graphpad ohjelmiston.

Western blotit

Yhteensä proteiini uutettiin ja erotettiin geelielektroforeesilla lyysaamalla solut puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,4 ), 150 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1% Triton X-100 ja 0,25% IGEPAL. Proteaasi-inhibiittorit (Roche Applied Science) ja fosfataasi-inhibiittorit (Calbiochem) lisättiin ennen käyttöä. Ennen kuin lataat geeliä, näytteet normalisoitiin proteiinin kokonaismäärästä. Kokonaisproteiinia lysaatit keitettiin näytepuskurissa, eroteltiin SDS-PAGE: 8% polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin PVDF-membraanille, ja tutkittiin yön yli käyttäen sopivan primaarisen vasta-aineita. Vasta-aineita käytetään immunoblottauksella olivat: anti FGFR1-ainetta (# 3472, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Yhdysvallat), anti- fosfori FRS2 Y436 (# 3861, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Yhdysvallat), anti-fosfo -FRS2 Y196 (# 3864, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Yhdysvallat), anti-FRS2 (# sc-17841, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Yhdysvallat). anti-WHSC1L1 monoklonaalinen vasta-aine (# sc-130009, Santa Cruz Biotechnology), anti-LETM2 monoklonaalinen vasta-aine (# ab84626, Abcam), ja anti-Actin monoklonaalinen vasta-aine (# sc-1615, Santa Cruz Biotechnology).

tilastollinen analyysi

vertailut SNP array kopioluku tiedot keuhkoadenokarsinooma (AC) ja okasolusyöpä (SCC) kasvaimia suoritettiin käyttäen Fisherin t testi laskea kaksisuuntainen p-arvojen joukossa näytteitä kätkeminen korkeatasoinen vahvistus, joka määritellään log2 suhde 0,7 tai 3,25 normalisoitu DNA kappaletta. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

määrittämiseksi IC50 FGFR-inhibiittorit, solujen elävyys mittaukset kuuden toistoa vaihtelevia pitoisuuksia inhibiittoreita normalisoitiin käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Sigmoidinen annos-vaste-käyrät sovitetaan tietojen lineaarisella regressiolla käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston. Standardipoikkeamat määritettiin keskiarvo kunkin arvon käyttämällä sisäänrakennettu moduulin ohjelmisto.

shRNA kokeissa, suoritettiin kolme toistoa, solujen lukumäärä laskettiin ja keskiarvo ja keskihajonta määritettiin käyttämällä toimintoja Microsoft Excel.

tulokset

FGFR1

monistetaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

Tutkimme 8p11-12 genomin alueella käyttäen Affymetrix 250K SNP array kopiomäärä datan aiemmin raportoitujen tietojen joukko 732 NSCLC näytteistä (628 ensisijainen kasvaimia ja 104 solulinjoja) (taulukko S1) [16], [20], [45], [50], [52]. Havaitsimme korkea vahvistus, joka määritellään log2 suhde 0,7 tai 3,25 normalisoitu DNA kopioita, on 8p11-12 kromosomisegmentin kattaa

FGFR1

lokukseen 44 (6%) NSCLC näytteistä (kuva 1a; Taulukko S2). Suurin osa (93%, 41/44) näistä monistukset olivat suhteellisen polttoväli tapahtumia ( 50% pituudesta kromosomin 8p), joka osoittaa suosivista valinta erityisten kohdegeenien alueella amplifikaation [52]. Päätelty kopioluku liitetyt normalisoituivat kopio joukko 2 jokaisesta näytteestä, vaihteli 3,25-25 kopiota (mediaani = 2,8 kappaletta). Arvioitu laajuus alueen keskipiste monistukset vaihteli 0,47-112,7 Mb (mediaani = 2,74 Mb).

(A) Kopioi numero arvioi kromosomissa varsi 8p11-12q 44 NSCLC näytteitä (sarakkeet; tilaaman vahvistusta of 8p11), jolla vahvistus on suurempi kuin 3,25 kappaletta (log2 suhde 0,7) kokoelmasta 732 NSCLC perusnäytteiden ja solulinjoissa. Vaakasuora viiva osoittaa alueen, joka sisältää

FGFR1

,

LETM2

ja

WHSC1L1

geenejä. Väriskaala vaihtelee sinisestä (poistetaan) punaiseen (vahvistus) arvioitu kopio numerot näytetään. Harmaa alueet edustavat puuttuessa SNP kopioluvun tiedot. (B) pylväsdiagrammi, joka esittää prosenttiosuudet näytteiden kätkeminen 8p11-12 vahvistus keuhkon adenokarsinooman (AC) ja okasolusyöpä (SCC) osoittaa, että

FGFR1

vahvistus havaitaan SCC at paljon korkeammalla taajuudella kuin AC. (C) FGFR1 lauseke (ylempi paneeli) esitetään kymmenen NSCLC soluissa; kahdeksan solulinjat kätkeminen

FGFR1

vahvistus-HCC1734, HCC95, NCI-H2444, Calu3, NCI-H2077, NCI-H1703, NCI-H1581 ja NCI-H520 (merkitty punaisella rekki alla) oni NSCLC solu linja kätkeminen poistetaan alueen HCC15 (merkitty sinisellä rekki alla) – ja kolme NSCLC-solujen ilman vahvistusta-A427, NCI-H226, NCI-H2170 (merkitty mustalla rekki alla) – käyttäen aktiini latauskontrollina (näytetään in alapaneeli).

FGFR1

kopiomäärä tila ja 8p11-12 amplikonin pituus määräytyy SNP array on esitetty seuraavassa -solut vahvistusta. Huomattavaa on, että NCI-H2077 ja NCI-1581 havaittiin olevan genotyyppisesti identtinen sormenjälkien analyysin.

alueiden tunnistamiseksi merkittävien kopioluvun muutos, haimme synergisillä (Perimän merkityksellisten tavoitteiden Cancer ) [53], ja tunnistaneet 170 Kb alueen 8p11 (38,28-38,45 Mb) kuin merkittävästi laajemmat. Vaikka yleinen malli 8p11 vahvistus oli yhdenmukainen kirjallisuutta keuhkosyöpään kuin raportoitu, meidän otoskoko ja resoluutio tarjotaan enemmän valtaa täsmällisesti ja paikantaa sekä laajamittaisen ja polttoväli kromosomaalisia muutoksia verrattuna aikaisempiin kertomuksiin [45], [52 ]. Ainoa geenien alueen vahvistus tunnistettu analyysimme kaikissa näytteet olivat

FGFR1

ja

LETM2

. Meidän kopiomäärä data,

WHSC1L1

yleisesti monistettiin

FGFR1

ja

LETM2

(41/44 näytteet), mutta koko

WHSC1L1

geeni teki kuulu synergisillä huippu (CHR 8: 38,284,229-38,451,475). Erityisesti kolme primäärikasvain näytteiden monistettiin

FGFR1

ja

LETM2

geenit oli amplikoni breakpoints sisällä

WHSC1L1

selittäen poissulkeminen

WHSC1L1

päässä synergisillä vahvistus huippu (Kuva S1; Kuva S2). Amplikonin raja-arvot alueella

WHSC1L1

ovat yhdenmukaisia ​​puute vahvistus funktionaalisen SET domain (CHR 8: 38,265,630-38,255,125), joka liittyy histoni metyylitransferaasin entsyymiaktiivisuus geenituotteen [56]. Nämä tulokset eivät sulje pois

WHSC1L1

tavoitteeksi amplifikaatiokier- 8p11 yhdessä

FGFR1

mutta viittaavat siihen, että sen histoni metyylitransferaasiaktiivisuus ei todennäköisesti kohdennettuja monistamista.

verrattaessa alatyyppejä NSCLC primaarikasvainten ja solulinjoissa, 3,4% (20/588) ja adenokarsinoomien ja 21% (12/57) ja okasolusyöpää kanna 8p11 monistuksia, mikä osoittaa, että vaikka 8p11 monistuu on tuntuva taajuuksilla sekä kautta suuria NSCLC alatyyppien, se on edullisesti monistetaan SCC (

p

0,001, Fisherin eksakti testi) (kuva 1b). Tilastollisesti merkittävää korrelaatiota ei havaittu läsnäolo 8p11 monistukset ja käytettävissä kliinisten parametrien histologia, aste histologinen eroavuus, vaiheessa kirurginen resektio kasvainten ja ikä, sukupuoli, tai ilmoitetaan etnisen potilaista (taulukko S3). Lisäksi, kohdennettua sekvensointi kinaasidomeenin

FGFR1

52 NSCLC solulinjojen ja koko

FGFR1

koodaavan sekvenssin kolme solulinjoissa (NCI-H1581, NCI-H1703, NCI-H2170 ) ei ilmennyt näyttöä kinaasidomeeni mutaatioita (tuloksia ei esitetty).

SNP array data paljasti koholla

FGFR1

geenikopiomäärä 11 NSCLC solulinjoissa ulos 104 NSCLC solulinjojen analysoitiin (kuvio S3) kanssa monistukset havaittiin 36% (4/11) squamous NSCLC solulinjoista määritettiin. Tutkimme FGFR1 proteiinin ilmentymistä immunoblottausanalyysillä 8 ensisijainen NSCLC solulinjoissa että satama keskeisten tai laaja 8p11 vahvistusta edellä log2 suhde 1,6 tai 6,0 normalisoitu DNA kappaletta (NCI-H1703, NCI-H2444, NCI-H520, NCI-1581, NCH -H2077, Calu3, NCI-H1734, ja HCC 95), 3, jotka ovat suunnilleen neutraali

FGFR1

kopiomäärä (NCI-2170, NCI-H226 ja A427) ja 3, jotka satama

FGFR1

poisto (NCI-H1781, NCI-H1563 ja HCC15) immunoblot-analyysillä. Löysimme 6 ulos 8

FGFR1

monistettiin NSCLC solulinjoja-ilmentävät FGFR1 verrattuna solulinjoja, jotka eivät satama vahvistusta poikkeuksin NCI-H1703 ja Calu3 soluja (Kuva S4, kuva 1c). Tämän mukaisesti havainnon, NCI-H1703, joka satamat 8p11 vahvistus, on osoitettu olevan riippuvainen

FGFR1

[44] mutta täydennetty

PDGFRA

[19], [20] . Lisäksi kohonnut fosforylaation FGFR1 substraatin FRS2 havaittiin NCI-H1581 suuri cell carcinoma kantavien solujen polttoväli monistamisen

FGFR1

, mutta ei soluissa, kätkeminen suhteellisen laajempi tasot

FGFR1

vahvistus (Kuva S4).

FGFR1

vaaditaan selviytymisen kannalta NSCLC solulinjan kätkeminen polttoväli vahvistus

Koska meillä kopiomäärä analyysi,

FGFR1

ja

LETM2

kuului synergisillä määritellyn alueen tilastollisesti merkitsevä monistuksessa

WHSC11

välittömässä läheisyydessä. Määrittää solun vaatimus geenien alueella kohteena vahvistus, arvioimme vaatimuksen

WHSC1L1

,

LETM2

ja

FGFR1

ilme kasvaimen huoltoa kuluttamalla niitä yksitellen shRNA. Transfektion viisi shRNA konstruktioita, kumman tahansa

WHSC1L1

tai

LETM2

ei ollut ero vaikutusta eloonjäämiseen -solut keskipiste tai laaja 8p11-12 vahvistus verrattuna kontrollisoluihin, ilman vahvistusta (tietoja ei ole esitetty).

sen sijaan, kolme viidestä shRNA konstrukteja kohdistaminen

FGFR1

, jotka kaikki johtivat 3- 5-kertainen pieneneminen FGFR1 proteiinin tasojen suhteen shRNA kontrolleihin (kuvio 2a), esti merkittävästi solujen eloonjäämisestä NSCLC solulinjassa kuljettaa polttoväli

FGFR1

vahvistusta (NCI-H1581, kuvio 2b). shRNA rakentaa # 3 ja # 4, joka ei johtanut merkittäviin knockdovvn FGFR1 proteiinin tasot, ei vaikuttanut solujen eloonjääntiä kätkeminen 8p11 vahvistusta (kuva 2b). Ei ollut havaittua selviytyminen vaikutukset

FGFR1

shRNA Solulinjoihin kätkeminen suhteellisen laajempi

FGFR1

vahvistusta (NCI-H1703, HCC95, HCC1734, Calu3; ei esitetty) tai ilman

FGFR1

monistus (NCI-H2170, kuvio 2c. HCC15, NCI-H1563 ja NCI-H1781, jota ei ole esitetty). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset väittävät, että

FGFR1

ilmaus tarvitaan elinkelpoisuuden ainakin yhden NSCLC solulinja kuljettaa

FGFR1

vahvistusta.

(A) Vaikutukset viisi

FGFR1

shRNA rakentaa päälle FGFR1 proteiinin ilmentymistä NCI-H1581-soluissa analysoituna immunoblottauksella. shRNAs # 1, # 2 ja # 5 tehokkaasti kaataa endogeenisen FGFR1 ilmentymistä NCI-H1581-soluissa tartunnan shRNA ilmentävien lentiviruksien taas shRNAs # 3 ja # 4 eivät. Aktiini näkyy latauskontrollina (alempi kuva).

(B

ja

C) B, infektio kolme riippumatonta FGFR1-tukahduttamalla pinnit (# 1, # 2 ja # 5) estää selviytymisen NCI-H1581-soluista jotka ilmentävät

FGFR1

(B), mutta ei estänyt selviytymistä soluissa ei kätkeminen

FGFR1

vahvistusta, NCI-H2170 (C) arvioituna WST määrityksessä. NI, ei infektio. shGFP, ohjaus hiusneula spesifinen vihreää fluoresoivaa proteiinia käytetään negatiivisena kontrollina. Kaikki tulokset normalisoidaan eloonjäämistä solujen tartunnan shGFP.

edelleen vahvistaa spesifisyyden solujen elävyyden muutoksia, jotka liittyvät shRNA aiheuttamaa FGFR1-ehtyminen, tutkimme kyky kohdunulkoisen ilmentymisen

FGFR1

cDNA pelastaa vaikutuksia FGFR1 kaataa. Villityypin

FGFR1

cDNA, josta puuttuu 3′-transloimaton alue (UTR) endogeenisen FGFR1 mRNA kohteena FGFR1 shRNA # 1, on yli-ilmentynyt NCI-H1581-soluja, jotka on transfektoitu tämän shRNA konstruktilla. Liuotettu tasoja villityypin FGFR1 proteiini aiheutti merkittäviä pelastamiseen selviytymisen esto fenotyypin (kuvio 3a, c), mutta ei ollut vaikutusta

FGFR1

riippumattaman NCI-H2170-solut (kuva 3b). Yhdessä nämä kokeet sekaantumaan

FGFR1

kriittinen kasvaimia synnyttävän tavoite 8p11-12 vahvistusta.

(A) Pylväsdiagrammi pelastus määritystä. Kuolleisuutta johtuu köyhdytettyä tasolle huomiota sisäiseen FGFR1 tasolla NCI-H1581 pelastaminen yli ilmentymistä villityypin (WT) täyspitkä

FGFR1

koodaussekvenssin. (B) ei ole vaikutusta eloonjäämiseen NCI-H2170-solujen havaittiin takia yli ilmentymisen villityypin muotoa FGFR1. NCI-H2170 ei riipu FGFR1 toimintaa. NI, ei infektio. shGFP, ohjaus hiusneula spesifinen vihreää fluoresoivaa proteiinia käytetään negatiivisena kontrollina. Kaikki tulokset on normalisoitu eloonjäämistä infektoitujen solujen shGFP. Näytetty data on keskiarvo kolme toistoa. (C) validointi FGFR1 pelastus immunoblottauksella. Köyhdytettyä tasot endogeenisen FGFR1 tason NCI-H1581-soluissa tartunnan

FGFR1

shRNA ilmentävien Lentiviruksiin kohdistaminen FGFR1 3’UTR (kaista 1) pelastaminen yli-ilmentyminen villin tyypin muotoa FGFR1 cDNA, josta puuttui 3’UTR (kaista 2) samanaikaisen vaatimaton pelastus tasojen tyrosiinitähteen fosforylaation FGFR1 alustan FRS2 (keskimmäinen paneeli). Aktiini näkyy latauskontrollina (alempi kuva).

Mielenkiintoista, yksi NSCLC solulinja kuljettaa polttoväli

FGFR1

vahvistusta, NCI-H2444 (kuva S3), ei ollut herkkä ja knockdown FGFR1 (tuloksia ei ole esitetty). Tämä solulinja on myös satamiin aktivoiva

KRAS

G12V mutaatio [57], [58], joka on liitetty vastuksen peräsuolen syövät, että EGFR-terapiasta setuksimabin [25]. NCI-H2444 ei näytä FRS2 fosforylaatiota (kuvio S4). Tämä havainto viittaa siihen, että co-esiintymiseen muiden aktivoivan onkogeenien voi lievittää

FGFR1

riippuvuutta ja erityisesti, että ensisijainen vastustuskykyä FGFR1 esto voidaan säännellä

KRAS

mutaatiostatus.

FGFR kinaasin estäjät inhiboi

FGFR1

monistettiin NSCLC-solujen

arvioimaan mahdollisuutta, että kohdistaminen

FGFR1

vuonna 8p11 monistetaan SCC voisi edustaa uutta terapeuttista strategiaa SCC, tutkimme vaikutukset yleiseurooppalaisen FGFR estäjä PD173074 on NSCLC solulinjoissa.

FGFR1

-amplified NCI-H1581 solut olivat herkkiä hoidon PD173074 analysoituna pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa IC

50s ovat välillä 10-20 nM (kuviot 4a ja S5). Sen sijaan, NCI-H2170-soluissa villityypin

FGFR1

kopiomäärä oli tunteeton PD173074 (kuva 4a). Olemme myös suorittaa PD173074 annos-vaste-käyrät solun eloonjäämiseen nesteviljelmässä verrata solujen herkkyys kätkeminen

FGFR1

vahvistusta ja ilman ja jälleen havaittiin, että NCI-H1581-solut tapettiin IC50-arvot 14 nM, kun taas ilman vahvistusta tarvitaan enemmän kuin 100-kertaisesti suuremmilla annoksilla PD173074 proliferaation inhiboimiseksi (kuvio 4b). Suostumuksella nämä tulokset, myös havaittu, että toinen FGFR palautumaton estäjä, FIIN-1, estää leviämisen NCI-H1581-solujen polttoväli

FGFR1

vahvistus verrattuna NCI-H2170 ilman

FGFR1

vahvistus, jossa on IC50-arvot 2,5 nM verrattuna on suurempi kuin 10 mikromolaarinen, vastaavasti (kuvio S6).

(A) käsittely konsentraatiot pan FGFR estäjä PD173074 esti pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen NCI-H1581 NSCLC solulinjat kätkeminen

FGFR1

vahvistusta, verrattuna NCI-H2170 linja, joka ei satama

FGFR1

vahvistusta. Pesäkkeet kuvattiin ja kvantitoitiin 4 viikon kuluttua. (B) Hoito konsentraatiot PD173074 esti selviytymisen NCI-H1581-soluissa, mutta ei NCI-H2170-soluissa, määritettynä WST-määritys suoritetaan sen jälkeen 4 päivää hoidon. IC50-arvot on ilmoitettu.

Keskustelu

Tässä olemme osoittaneet, että

FGFR1

usein monistetaan keuhkokarsinoomien, ja että tämä vahvistus on rikastettu keuhkojen SCC. Ainakin yksi NSCLC solulinjan fokaalisesti monistettiin

FGFR1

vaatii geeni osoituksena shRNA ehtymisestä, ja on myös herkkä eston kanssa FGFR estäjien.

Genes muu kuin

FGFR1

on ehdotettu olevan toiminnallinen kohde vahvistus kromosomissa segmentin 8p11-8p12, etenkin

WHSC1L1

[44] ja

BRF2

[21]. Uskomme kuitenkin, että esitetyt todisteet täällä sekä tuoreessa raportissa [22] puoltaa

FGFR1

toiminnalliset tavoite vahvistus ainakin yhdessä NSCLC solulinjan. Lisäksi meidän tietokokonaisuus

WHSC1L1

ei ole monistettu kaikissa

FGFR1

monistetaan näytteitä, väittäen, että se ei todennäköisesti ole ainoa merkityksellinen monistettu geeni 8p11-12 amplikonin. Solulinjaa joka osoitettiin vaatia

WHSC1L1

sen toiminnan jatkumisen, NCI-H1703 [44], ei yli-express FGFR1 (kuva 1c), ei osoita FRS2 fosforylaatiota (kuvio S4) ja on riippuvainen toinen monistettu tyrosiinikinaasin onkogeeni,

PDGFRA

[19], [20]. Sen sijaan knockdovvn

WHSC1L1

ollut vaikutusta

FGFR1

-amplified,

FGFR1

ilmentävä NCI-H1581-soluissa, mikä viittaa siihen, että monistuminen joko geeni voi edistää solujen muutoksen sopiva solujen yhteydessä.

Tuoreessa tutkimuksessa luonteenomaiset DNA vahvistus NSCLC ehdotti, että

BRF2

, joka koodaa transkription aloitus- kompleksi alayksikköä RNA-polymeraasi III, on kohde vahvistus on 8p11 amplikoni [21]. Vertasimme

FGFR1

vahvistuksen

BRF2

vahvistus valossa tämän raportin ja totesi, että 12 näytettä, joilla on korkein monistamiseen

FGFR1

meidän aineisto (log2 suhde