Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jäkälät ovat symbioottinen organismeja, jotka tuottavat erillisiä toissijaisia ​​aineenvaihduntatuotteita. Tässä tutkimuksessa testasimme sytotoksista aktiivisuutta 17 jäkälälajien vastaan ​​useita ihmisen syöpäsoluja ja edelleen tutkittiin molekyylitason mekanismit niiden syövän vastaisen aktiivisuuden. Huomasimme, että joukossa 17 jäkälien lajien,

F. cucullata

esillä voimakkain sytotoksisuus useita ihmisen syöpäsoluja. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia-analyysi osoitti, että asetonin uute

F. cucullata

sisältää usnic happo, salazinic happo, Squamatic happo, Baeomycesic happo, d-protolichesterinic happoa, ja lichesterinic happoa alikomponenteista. MTT-analyysi osoitti, että syövän solulinjat olivat alttiimpia sytotoksisia vaikutuksia uutteen kuin ei-syöpäsolulinjoilla. Lisäksi joukossa tunnistettu alikomponentit, usnic happokäsittely oli samanlainen sytotoksinen vaikutus syövän solulinjoissa mutta heikompina kuin poistoilman. Tällä kuolettavan annoksen hoito uute tai usnic hapolla suuresti kasvanut apoptoottisten solupopulaation ja erityisesti aktivoida apoptoottisen signalointireitille; kuitenkin käyttäen sub-tappava annos, uute ja usnic happokäsittely vähentynyt syövän solun liikkuvuus ja esti

vitro

ja

vivo

tuumorigeenisia potentiaalit . Näissä soluissa, havaitsimme merkittävästi alhaisempia epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) merkkejä ja fosfori-Akt, kun taas fosfori-c-Jun ja fosfori-ERK1 /2-tasot vaikuttaa vain marginaalisesti. Kaiken syövän vastaista aktiivisuutta uutteesta on tehokkaampi kuin usnic happoa yksin. Yhdessä

F. cucullata

ja alakomponentti, usnic happo yhdessä lisäosan, aiheuttavat syövän vaikutuksia ihmisen syöpäsoluja läpi apoptoosin induktio ja inhibitio EMT.

Citation: Nguyen TT, Yoon S, Yang Y, Lee HB, Oh S, Jeong MH, et al. (2014) Lichen sekundäärimetaboliitteja in

Flavocetraria cucullata

näytteille Anti-Cancer Vaikutukset ihmisen syöpäsoluja läpi apoptoosin ja Vastustamisesta Kasvaimia synnyttävä potentiaalit. PLoS ONE 9 (10): e111575. doi: 10,1371 /journal.pone.0111575

Editor: Chengfeng Yang, Michigan State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 26 syyskuu 2014; Julkaistu: 31 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Nguyen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609) sekä Korea National Research Resource Center Program (NRF-2012M3A9B8021726). Tutkimuksessa saanut tukea myös tutkimuksen apurahan rahoittamaa Sunchon Research Center for Natural Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on merkittävä kuolinsyy maailmassa. Ryhmänä syöpien osuus on noin 13% kaikista kuolemista vuosittain yleisimmillä olento keuhkosyöpä (1,37 miljoonaa kuolemantapausta), mahasyöpä (736000 kuolemia), maksasyöpä (695000 kuolemia), peräsuolen syöpä (608000 kuolemia), ja rintasyöpä (458000 kuolemia) [1]. Kohdunkaulan syöpä on johtava kuolinsyy kehittyneissä maissa ja toiseksi yleisin kuolinsyy kehitysmaissa [2], joten näistä syistä eri syöpähoitojen on kehitetty, mukaan lukien laaja valikoima syöpälääkkeet, joiden tiedetään sytotoksisia vaikutuksia syöpäsoluja.

Jäkälät ovat symbioottinen organismeja, yleensä koostuu sieni kumppanin (mycobiont) ja yhden tai useamman photosynthetic yhteistyökumppanit (photobiont), joka on useimmiten joko vihreä levä tai syanobakteeri [3] . Vaikka kaksijakoinen luonne useimpien jäkälien on nyt laajalti tunnustettu, se on vähemmän yleisesti tiedossa, että jotkut jäkälien ovat symbioses mukana kolme (kolmen osapuolen jäkälät) tai useamman kumppanin. Yleensä jäkälien esiintyä erillisinä thalli ja implisiittisesti kohdellaan yksilöinä monissa tutkimuksissa, vaikka ne voivat olla symbioottinen kokonaisuus, johon lajeja kolmesta kuningaskuntia. Geneettisestä ja evoluution näkökulmasta, jäkälät ei voida pitää yksilöinä vaan komposiitit, ja tämä vaikuttaa merkittävästi monilla tutkimuksen kuten kehitystä ja lisääntymisen.

Monet jäkälä toissijaiset tuotteet ovat epämiellyttävä ja voi toimia puolustava yhdisteitä vastaan ​​kasvinsyöjiä sekä hajottajat. Tästä syystä näitä toissijaisia ​​tuotteita käytetään usein lääketeollisuuden antibakteerinen ja viruslääkkeiden yhdisteet [4], [5]. Lisäksi, jäkälien ja toissijaisten aineenvaihduntatuotteiden on jo pitkään tutkittu syövän hoitoon [6] – [15]. Tässä tutkimuksessa testasimme sytotoksista aktiivisuutta 17 jäkälälajien kerätään Romanian Karpaattien vuoristossa vastaan ​​useita ihmisen syöpäsoluja ja tutki tarkemmin molekyylitason mekanismeista niiden syövän vastaista aktiivisuutta tunnistaa mahdolliset yhdisteiden uudenlaisten syöpälääkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen jäkälien uutteiden

Thalli on

F. cucullata

kerättiin Romania vuonna 2011 aikana opintomatka kansallispuistossa Calimani ja luonnonpuisto Bucegi järjestämä Dr. Crişan Babeş-Bolyain yliopisto, Cluj-Napoca, Romania. Lupa kerätä jäkäliä näytteet näistä paikoista on antanut hallinnon National Park Calimani ja hallinto luonnonpuistoa Bucegi, suostumuksella komission suojaamisesta Natural Monuments (Romanian Academy). Kentän tutkimuksissa ei liittynyt uhanalaisten tai suojeltujen. Kaksoiskappaleet talletettiin osaksi Korean Jäkälä Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Hienoksi kuivattu maa thalli jäkälän (150 g) uutettiin käyttäen asetonia Soxhlet linko. Uutteet suodatettiin ja konsentroitiin sitten alennetussa paineessa pyöröhaihduttimessa. Kuiva uutteet säilytettiin -25 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Uutteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) kaikissa kokeissa.

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) analyysiä lichen materiaalien

Kemiallinen lichen uutteet liuotettiin uudelleen 2 ml: aan asetonia, ja sitten alistettiin HPLC (SHIMADZU, LC-20A). HPLC-analyysit suoritettiin YMC-Pack ODS-A (150 x 3,9 mm I.D.) käänteisfaasi- kolonni täysin endcapped C18 materiaalia (partikkelikoko 5 um, huokoskoko, 12 nm). Eluutio suoritettiin virtausnopeudella 1 ml /min seuraavissa olosuhteissa: pylvään lämpötila, 40 ° C; liuotinsysteemi, metanoli: vesi: fosforihappoa (80:20:1, v /v /v) ennen seuraavaa injektiota. Analyysi seurattiin valodiodirividetektoria (SPD-M20A) vaihteluvälillä 190-800 nm aikana koko HPLC aikavälillä. Havaitut huiput skannattiin välillä 190 ja 400 nm. Näytettä injektiotilavuus oli 10 ui. Standardit käytetty saatiin seuraavista lähteistä: salazinic acid (t

R = 2,27 ± 0,2 min) eristettiin lichen

raidankeuhkojäkälä,

usnic happo (t

R = 11,3 ± 0,3 min) alkaen

Usnea longissima

ja protolichesterinic happo (t

R = 22,3 ± 0,2 min) ja lichesterinic happo (t

R = 26,5 ± 0,2 min) lichen

Cetraria islandica

.

Soluviljely

ihmisen syöpäsolulinjoissa HT29 (paksusuolen syöpä), AGS (mahalaukun syöpä), A549 (keuhkosyöpä), ja CWR22Rv-1 (eturauhassyöpä) ylläpidettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa (Gen Depot, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gen Depot, USA) ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä (RPMI täydellisessä alustassa) (Gen Depot, USA). HaCaT (ihmisen keratinosyyttien), NIH 3T3 (hiiren alkion fibroblastisolut), HEK293T (ihmisen alkion munuainen) soluihin, RIE (rotan suolen epiteelisolujen-solut), ja Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM ) (Gen Depot, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 5% CO

2: ssa kosteutetussa ilmakehässä 37 ° C: ssa. Solulinjat hankittiin Korean Cell Line Bank (https://cellbank.snu.ac.kr), Korea.

MTT-määritys

Lichen uutteita liuotettiin DMSO (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) ja laimennetaan sarjoittain DMEM tai RPMI 1640, jolloin saadaan pitoisuudet 6,125, 12,5, 25, 50, 100 ug /ml. -Soluja (2 x 10

4 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevylle, kasvatettiin yli yön, ja sitten käsiteltiin asetonilla uutetta tai tärkeimmät yhdisteet

F. cucullata

pitoisuuksina 100 ug /ml tai uM 10 ug /ml tai uM 48 tuntia. Kun hoito oli valmis, viljelmiä täydennettiin MTT. Inkuboinnin jälkeen MTT: llä 37 ° C: ssa, solut lyysattiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 50% DMSO: ta ja 20% SDS, ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (VERSAmax, Molecular Devices, Minnesota, USA). Prosenttiosuus eläviä soluja laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: Prosentuaalinen solujen elävyyden = (optinen tiheys (OD) kokeen näytteet /OD kontrolli) x 100. IC

50-arvot laskettiin käyttämällä Statistical Package for Social Science (SPSS) ohjelmisto.

Fluoresenssimikroskopia apoptoottisten morfologia

Soluja viljeltiin kammion dioja tiheydellä 4 x 10

5 solua /kuoppa ja annettiin kiinnittyä yön yli, mitä seuraa käsittely

F. cucullata

asetoniuute tai usnic happoa 24 h tai 48 h. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin anneksiini V FITC merkintöjä liuokseen 15 minuutin ajan. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja analysoitiin käyttämällä Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japani) fluoresenssimikroskoopilla.

Soluja viljeltiin, kuten edellä on kuvattu. 24 tunnin kuluttua tai 48 tuntia hoidon

F. cucullata

asetoniuute tai usnic happoa, solut pestiin PBS: llä kolme kertaa ja kiinteä 4% paraformaldehydissä huoneen lämpötilassa, sitten niitä inkuboitiin 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 30 minuutin ajan . Sen jälkeen näytteet värjättiin Hoechst 33257 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) huoneen lämpötilassa sen jälkeen, kun oli pesty kolme kertaa fiksatiiviliuosta PBS: ssä. Solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja kiinnitettiin objektilasille. Objektilasit analysoitiin käyttämällä Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japani) fluoresenssimikroskoopilla ja arvioidaan niiden solujen prosentuaalinen osuus, joilla on kondensoitu tai hajanaiset ytimiä kokonaismääräksi 300-soluja.

virtaussytometria määritys solusyklin

24 tunnin kuluttua inkubaation, käsittelemättömän ja asetonia extract- tai usnic happokäsitelty MDCK, HEK293T-, HT29, AGS, A549, ja CWR22Rv-1 solut trypsinoitiin. Sitten RNaasi-inhibiittoria lisättiin ja inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi näytteitä sentrifugoitiin supernatantin poistamiseksi, ja pelletti solut laimennettiin 100 ui propidiumjodidia (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ja inkuboitiin vielä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Virtaussytometria suoritettiin FACS Caliber (BD Biosciences, San Diego, USA).

Haavan paranemista määrityksessä

AGS ja A549-solut maljattiin tiheydellä 2,5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Corning, New York, USA) ja kasvatettiin yön yli konfluenssiin. Yksikerroksinen solut raaputettiin pipetin kärki luoda haava. Sitten solut pestiin kahdesti seerumittomalla RPMI 1640 poistaa kelluvat solut ja inkuboitiin väliaineessa, jossa oli 5 ug /ml

F. cucullata

purkaa tai 10 uM usnic happoa. Valokuvia solujen otettiin 0, 24, 48, ja 72 tuntia haavoittamisen jälkeen mitata leveys haavan. Etäisyyden siirtyneet solut laskettiin ero reunojen haava ajankohtana 1 ja ajankohtana 2. Jokaisesta solulinjasta, keskimäärin kahdeksan haavan määritysten otettiin määrittämiseksi keskimäärin muuttoliikkeen tietyllä pitoisuus asetoniuute tai usnic happoa. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Invasion määrityksessä

Kasvaimen soluinvaasion analysoitiin käyttäen transwell kammion (Corning Coster, Corning, NY, USA) kokeessa, jossa topchamber 8 um pore- koko polykarbonaattikalvosuodattimia päällystetty 1% gelatiinia. AGS ja A549-solut maljattiin 2,5 x 10

5 solua /kuoppa elatusaineeseen, joka sisälsi 0,2% naudan seerumin albumiinia (BSA) ylempään osastoon kammion. Alempi osasto täytettiin viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 0,2% BSA: ta ja 1 ug /ml fibronektiiniä kuin Chemo-houkutinta. Soluja viljeltiin puuttuessa tai läsnä on 5 ug /ml: ssa asetonia uutetta tai 10 uM usnic happoa 24 tunnin ajan. Ylempi kammiot kiinnitettiin ja värjättiin Diff Nopea Kit (Sysmex, Kobe, Japani). Tunkeutuneet solut analysoitiin valomikroskoopilla viidellä satunnaisesti valituilla aloilla. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona liikkuvien solujen lukumäärä per suuritehoisia alalla.

klonogeeninen määritys

A549 ja AGS solut pestiin, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 soluja (500 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille 2,5 ml: ssa RPMI 1640 -alustassa kuoppaa kohti ja inkuboitiin kiinnitys. Sen jälkeen, kun 48 tuntia hoidon, media, joka sisältää asetonia uutetta tai usnic happo korvattiin tuoreella elatusaineella ja 12 päivää. Pesäkkeet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, värjättiin 0,5% kristalliviolettia, ja laskettiin stereomikroskoopin alla. Maljaustehokkuus (PE) käsittelemättömien solujen ja hengissäsäilymisosuus (SF) käsiteltyjen solujen määritettiin sitten (n = 3) [16].

Soft agar pesäkkeiden muodostumista määrityksessä

AGS (1 x 10

4) ja A549 (1 x 10

4) solut suspendoitiin 1,5 ml: aan pehmeää agaria (0,35% agaroosi täydellisellä RPMI-väliaineessa), maljattiin 1,5 ml jähmettyneen agar (0,6% agaroosia RPMI täydellisessä alustassa) 6-kuoppalevyille ja viljeltiin 3 viikkoa. Soluja syötettiin kaksi kertaa viikossa soluviljelyaine sisälsi asetonia uute (1 ug /ml tai 5 ug /ml), usnic happo (5 uM tai 10 uM), lichesterinic happoa (10 uM), tai DMSO: ta (0,01%) . Pixel intensiteetti pesäkkeitä alueella mitattiin IMT iSolution ohjelmisto (IMT i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA) satunnaisesti valitun mikroskooppikenttää kuhunkin maljaan. Mitata prosenttia alueen siirtokunnan, pikselin määrä pesäkkeen alueen normalisoituivat pikseli x pikselin neliö. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta.

Detection proteiinien solulysaateista

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla asetoniuute tai alikomponenttien 48 tunnin ajan kerättiin ja analysoitiin Western blot kuten aiemmin on kuvattu [17]. Käytetyt vasta-aineet hankittiin Cell signalointi Technology (PARP, kaspaasi-3, Bax, Bcl_xL, α-tubuliinin), ja BD Biosciences (E-kadheriinin). Kaikki tulokset ovat edustavia vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Analysoida tason fosfoproteiineja, helmi-pohjainen multiplex määritystä (Bio-Plex fosfoproteiini määrityksessä, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) suoritettiin valmistajan ohjeiden [18], [19]. Lyhyesti, tässä testissä mitataan useita fosfoproteiini signaalia yhdestä lysaatista [20].

qRT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA (1 ug) kustakin ryhmästä käsiteltyjen solujen muutettiin cDNA: ksi käyttäen M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja SYBR vihreä (Enzynomics, Seoul, Korea). Käytetyt alukkeet reaaliaikainen PCR olivat E-kadheriinin (forward) 5′-cagaaagttttccaccaaag-3 ’ja (reverse) 5′-aaatgtgagcaattctgctt-3′; N-kadheriinin (forward) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ’ja (reverse) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; Snail (eteenpäin) 5’-gaggcggtggcagactag-3 ’ja (reverse) 5′-gacacatcggtcagaccag-3′; Twist (eteenpäin) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ’ja (reverse) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; GAPDH (eteenpäin) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ’ja (reverse) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. qRT-PCR-reaktio ja analyysi suoritettiin käyttäen CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

In vivo tuumorigeenisyystesti määrityksessä

Koemenettely hyväksyttiin Chonnam National University Medical School tutkimus Institutional Animal Care Käytä komitea. Huolto eläinten ja kaikki in vivo kokeet suoritettiin perusperiaatteita että hoito ja käyttö Animals (DHEW julkaisu, NIH 80-23). A549-soluja valmistettiin RPMI 1640-alustassa (1 x 10

6 solua /hiiri), ja suspendoidut solut esikäsiteltiin yksi kymmenesosa tappava pitoisuus on

F. cucullata

asetoniuute, usnic happo, lichesterinic happo, tai DMSO (Vehicle) juuri ennen injektiota. Solut injektoitiin ihonalaisesti kylkeen alueelle Balb /c-nude-hiiren ja kasvaimen mitattiin kahden viikon kuluttua.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet analysoitiin kolmena rinnakkaisena (n = 3). Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS version 17 Hoitovaikutukset määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA post-hoc-analyysi. P-arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi ellei toisin mainita.

Tulokset

Flavocetraria cucullata

asetoniuute on voimakas sytotoksinen vaikutus syöpäsoluihin

tunnistaa sytotoksisen aineen Romanian jäkälät, mittasimme IC

50-arvot asetonia otteita 17 jäkälälajien HT29 (peräsuolen syöpä soluja) ja AGS (mahalaukun syöpäsoluja) soluja. Niistä jäkälälajien,

F. cucullata

kohdistuu kaikkein voimakas sytotoksinen vaikutus sekä HT29 (IC

50 = 10,9 ug /ml) ja AGS (IC

50 = 11,6 ug /ml) verrattuna muihin jäkälälajien (IC

50 arvot vaihtelivat noin 25-100 ug /ml, taulukko S1 File S1). Tarkistaa, onko sytotoksisuus

F. cucullata

uute spesifinen syöpäsoluja, teimme lisätestejä muita syöpäsoluja, mukaan lukien A549 (keuhkosyöpä solut) ja CWR22Rv-1 (eturauhasen syöpäsolujen) solut ja ei-syöpäsolujen, kuten MDCK (Madin-Darby koiran munuaissolut ) ja RIE (rotan suolen epiteelisolujen), NIH 3T3 (hiiren alkion fibroblasti), HaCaT (ihmisen keratinosyytti) soluja. Tulokset osoittivat, että

F. cucullata

asetoniuute erityisesti vaikuttaa elinkelpoisuuden syöpäsoluja ja ei-syöpäsolujen ei vakavasti vaurioitunut (Fig. 1A).

(A) Prosenttia Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin asetonilla uute

F. cucullata

. Soluja käsiteltiin

F. cucullata

otteen konsentraatioalueella 10-50 ug /ml 48 tunnin ajan, ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. (B) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia kromatogrammeja

F. cucullata

uutetta. Jokaisen kyseessä -aliosa on huomattava vastaavaan huippu. (C-D) prosenttiosuus Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin joko usnic happo (C) tai lichesterinic happo (D). Soluja käsiteltiin osoitetulla alakomponentti

F. cucullata

pitoisuutena vaihtelee 12,5-50 uM 48 tunnin ajan, ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± S.E.M. (Vakio keskivirhe), n = 3.

Tunnistaa alakomponentit

F. cucullata

, HPLC suoritettiin asetoni uute

F. cucullata

; tuloksena kromatogrammit ja massaspektrometrinen analysoi jokaisen piikin esitetään kuviossa 1 B ja taulukossa S2 File S1. Kuten kuviossa 1B on esitetty, salazinic happoa (Tr = 2,268 min), squamatic happoa (Tr = 2,855), baeomycesic happoa (Tr = 4,646), usnic happoa (Tr = 11,327), d-protolichesterinic happoa (Tr = 22,315), ja lichesterinic happoa (Tr = 26,595) havaittiin asetonissa uute

F. cucullata

. Niistä alikomponentit, usnic happo oli korkein huippu (% intensiteetti = 91,49 ± 0,0025), kun taas d-protolichesterinic happo ja lichesterinic happo osoitti pienempi piikit (% intensiteetti = 2,27 ± 0,1, 2,22 ± 0,1, tässä järjestyksessä) (taulukko S2 File S1 ). Todettuaan jäkälän alikomponentit, kaksi päämetaboliittia, usnic happo (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ja lichesterinic happoa (eristetty

F. Cucullata

uutetta joka jakaa kemiallinen rakenne d-protolichesterinic happo paitsi yksi tyydyttymätön hiili-sidoksen) käytettiin lisäkokeita. Sen määrittämiseksi, mitkä alikomponentin oli vastuussa sytotoksisuuden lichen, mittasimme sytotoksisuuden usnic hapon ja lichesterinic happoa ja havaitsi, että usnic happo osoitti vastaavia sytotoksisia vaikutuksia ei-syöpä ja syöpäsoluja ja lichesterinic happo ei esiintynyt ilmeistä sytotoksista vaikutusta millään testattu solut (Fig. 1 C ja 1 D). Taulukossa S3 File S1, IC

50-arvot asetoniuute, usnic happo, ja lichesterinic happo eri soluissa on esitetty. Mielenkiintoista on, että kun otetaan huomioon molekyylipaino (MW = 344) ja% intensiteetti usnic happoa asetonissa uute

F. cucullata

, IC

50-arvot usnic happoa HEK293T-, HT29, ja A549-solut olivat todennäköisesti suuremmat kuin laskettu usnic hapon pitoisuus uutteessa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tunnistamattomia alakomponentteja

F. cucullata

ote todennäköisesti voimistavat sytotoksisuuden usnic happoa. On kuitenkin syytä huomata, että IC

50-arvot usnic happoa, erityisesti ei-syöpäsoluja, kuten MDCK, RIE, NIH 3T3, ja HaCaT solut, olivat paljon alhaisemmat kuin usnic happopitoisuus

F. cucullata

uutetta, mikä viittaa siihen, että voi olla kestävä mekanismi taustalla sytotoksisuuden usnic happoa soluissa tai että muut alikomponentin (t) voi vähentää sytotoksisuuden usnic hapon soluihin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että asetoni uute

F. cucullata

on selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluja ja että usnic happo voi toimia merkittävästi efektori näistä vaikutuksista.

Lethal pitoisuudet

on Flavocetraria cucullata

ja usnic happo indusoida syöpäsolujen

onko sytotoksisuutta

F. cucullata

ja usnic hapon johtui apoptoosin induktion jälkeen solut käsiteltiin tappava pitoisuus on

F. cucullata

(50 ug /ml) tai usnic happoa (100 uM) värjättiin Hoechst 33258 ja ydinvoiman morfologia havaittiin. Kuten kuviossa 2A on esitetty, tiivistetty ydin- morfologia havaittiin AGS soluissa, joita käsiteltiin joko

F. cucullata

purkaa tai usnic happoa. Kuviossa 2B, kvantitatiivinen solujen määrä eri solulinjoissa on esitetty. Mielenkiintoista, induktio ydin- tiivistyminen lisääntyi merkitsevästi käsiteltyjen syöpäsolujen mutta ei nähty ei-syöpäsolujen MDCK, mikä viittaa siihen, että

F. cucullata

ja usnic happo on selektiivisesti sytotoksinen syöpäsoluja läpi apoptoosin.

(A) Hoechst 33258 värjäys AGS (ihmisen mahalaukun syöpä solulinja) käsiteltyjä soluja

F. cucullata

purkaa tai sen osakomponentteja, usnic happo ja lichesterinic happoa. Nuolet osoittavat solut osoittavat kondensoitu tai hajanaiset ydinaseiden morfologia. Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Quantificational analyysin kondensoitu tai hajanaiset ydin- morfologia erilaisissa soluissa käsitelty

F. cucullata

purkaa tai sen alakomponentteja. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna dimetyylisulfoksidi-käsitellyssä ryhmässä.

Tämän vahvistamiseksi me värjättiin solut FITC-anneksiini V havaitsemaan altistumisen fosfatidyyliseriinin ulomman solukalvon, joka on tunnusomainen toteamus apoptoosin alaisten solujen. Kuten kuviossa 3A on esitetty, syövän solut, joita käsiteltiin joko

F. cucullata

ote tai usnic happo osoitti FITC positiivisuutta. Prosenttiosuuden määrittämiseksi apoptoottisten solujen, virtaussytometria-analyysi soluista värjättiin propidiumjodidilla suoritettiin. Kuten kuvioissa 3B ja 3C, väestön solujen sub G1 vaihe kasvoi seuraavien 24 tunnin hoidon syöpäsoluissa. Tämä määrällinen analyysi paljasti, että apoptoosin induktio

F. cucullata

ote oli annoksesta riippuvaa lukuun MDCK-soluissa, joissa merkittävä nousu nähdään AGS, HT29, ja A549-solut (Fig. 3B). Kuitenkin, kuten kuviossa 3C on esitetty, tehokkuus usnic hapon määrän lisääminen apoptoottisten solujen oli merkittävästi pienempi kuin

F. cucullata

uutetta. Nämä havainnot taas viittaavat siihen, että tunnistamaton -aliosa (t)

F. cucullata

voi voimistaa usnic hapon vaikka usnic happo on merkittävä rooli apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa.

(A) FITC-anneksiini V solujen värjäys käsitelty

F. cucullata

purkaa tai usnic happoa. Nuolet osoittavat solujen esittää, että FITC positiivisuutta. (B-C) virtaussytometrinen analyysi solusyklin jakaumat jälkeen

F. cucullata

ote (B) tai usnic happo (C) käsittely ja graafinen esitys tuloksista. Edustavat kuvat tai Tulokset on esitetty kolmen riippumattoman kokeen.

varmistamiseksi edelleen tason muutokset apoptoottisten proteiinien, teimme Western blot-analyysi poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), caspase- 3, Bax ja Bcl-xL. Kuten kuvioissa 4A ja 4D, uute ja usnic happokäsittely nostivat pilkotun PARP ja pilkottiin kaspaasi-3 CWR22Rv-1, AGS, HT29, ja A549-solut. Lisäksi taso pro-apoptoottisen proteiinin, Bax, oli merkittävästi lisääntynyt näillä käsitellyissä soluissa, mutta ei MDCK ja HEK293T-soluissa (kuviot. 4B ja 4E). Sitä vastoin, taso anti-apoptoottisen proteiinin, Bcl-x L, oli merkittävästi vähentynyt vasta käsiteltyjen syöpäsolujen (kuviot. 4C ja 4F). Johdonmukaisesti,

F. cucullata

oli tehokkaampi apoptoosin kuin usnic happoa ja oli tehokkaampi syöpäsolujen kuin ei-syöpäsolujen. Yhdessä tulokset osoittavat, että kuolettava pitoisuudet asetonia uute

F. cucullata

ja alakomponentti usnic hapon indusoida syöpäsolujen.

(A ja D) Western blot -analyysi poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja kaspaasi-3: lla käsiteltyjen solujen kanssa

F. cucullata

(A) tai usnic happo (D). Arrowheads osoittavat pilkottu fragmentteja jokaisen proteiinin. (B-C ja E-F) Quantificational analyysi Bax (B ja E) ja Bcl-xL (C ja F) proteiinin ekspressiotasot käsitellyissä soluissa F. cucullata tai usnic happo, vastaavasti. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna dimetyylisulfoksidi-hoidetussa ryhmässä.

Sub-tappavia pitoisuuksia

Flavocetraria cucullata

ja usnic happo estävät tuumorigeenisyyteen ja liikkuvuus syöpäsolujen

edelleen tutkia syövän vastaista aktiivisuutta

F. cucullata

purkaa ja usnic happoa, käytimme yksi kymmenesosa tappavan pitoisuuksien näiden yhdisteiden, jotka eivät osoittaa sytotoksisuutta (subletaalisia pitoisuus) ja testasi

vitro

tuumorigeenisyyteen ja liikkuvuusluokka A549 ja AGS soluja. Klonogeenisten määritys näiden solujen subletaalisia pitoisuudet uutetta (5 ug /ml) tai usnic happoa (10 uM), osoittivat merkittävää vähenemistä pesäkkeiden lukumäärä, mikä osoittaa, että solujen lisääntymistä estyi näissä pitoisuuksissa (kuviot. 5A ja 5B). Mielenkiintoista on, että käsittely 10 ug /ml uutetta tai 15 uM usnic happo inhiboi täydellisesti muodostumista pesäkkeiden molemmissa solutyypeissä (tietoja ei esitetty). Sen sijaan lichesterinic happo ei osoittanut estävää vaikutusta solujen lisääntymistä. Pehmeä agar pesäkkeitä muodostumisen määritys suoritettiin testata onko subletaalisia pitoisuudet

F. cucullata

ja usnic happo inhiboi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua A549 ja AGS soluja. Kuten kuvioissa 5C ja 5D, pesäkkeiden muodostumisen A549 ja AGS solujen pehmytagar pieneni merkitsevästi käsittelemällä

F. cucullata

purkaa tai usnic hapon annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas lichesterinic happo ei vaikuttanut kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun. Nämä tulokset osoittavat, että sekä

F. cucullata

purkaa ja usnic happo on antituumorigeenistä aktiivisuutta subletaalisia pitoisuuksia. Haava-paranemista määritys ja invaasiomääritys olivat edelleen suoritettiin testata

F. cucullata

ja usnic happo vaikuttaa muuttoliikkeen ja invaasio vastaavasti syöpäsolujen at subletaalisia pitoisuuksia. Kuvioissa 6A-C,

F

.

cucullata

uutetta ja usnic happokäsittely estivät merkittävästi migraation A549 ja AGS soluja. Kuten kuvioissa 6D-E,

F. cucullata

purkaa ja usnic happo esti myös hyökkäyksen A549 ja AGS soluja, kun taas mitään tällaista estoa invaasio havaittiin lichesterinic happokäsitellyt syöpäsoluja. Tulokset osoittavat selvästi, että

F. cucullata

ja usnic happo estävät syöpäsolun motiliteettia ja vähentää tuumorigeenisyystesti syöpäsolujen at subletaalisia pitoisuuksia.

(A-B) klonogeeninen määritys A549 ja AGS soluja käsiteltiin

F. cucullata

uute, usnic happoa, tai lichesterinic hapon (A) ja quantificational analyysi pesäkkeen lukumäärä kussakin ryhmässä (B). (C-D) Pehmeä agar pesäkkeitä muodostumisen määritys A549 ja AGS soluja käsiteltiin

F. cucullata

uute, usnic happoa, tai lichesterinic happo (C) ja quantificational analyysi prosenttia pesäkkeitä alueen kussakin ryhmässä (D). Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe), n = 3. * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna dimetyylisulfoksidi-hoidetussa ryhmässä.

(A-C) Migration määritys A549 (A) ja AGS (B) käsiteltyjä soluja

F. cucullata

uutetta tai usnic happoa, ja quantificational analyysi haavan pituus kussakin ryhmässä (C). (D-E) Invasion määritys A549 ja AGS soluja käsiteltiin

F. cucullata

uute, usnic happoa, tai lichesterinic happo (D), ja quantificational analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin ryhmässä (E). Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna dimetyylisulfoksidi-hoidetussa ryhmässä kussakin solulinjoissa. @@ P 0,01; @@@ P 0,001 verrattuna osoitettuun ryhmään.

F. cucullata

ja usnic happoa todettiin merkittävästi vähentää syövän solun liikkuvuus ja tuumorigeenisyystesti, me olivatko epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on rooli välittämisessä näitä vaikutuksia. Ilmaisu taso E-kadheriinin analysoitiin A549-soluja käsiteltiin subletaalisia pitoisuus

F. cucullata

, usnic happoa tai lichesterinic happoa. Tiedot osoittivat, että asetoni uute

F. cucullata

ja usnic hapon huomattavasti proteiinin taso E-kadheriinin (kuvio. 7A). Taulukko S1. Taulukko S2. Taulukko S3.