Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Glioblastoma on yleisin ja kaikkein haitallisimpia primäärisen aivokasvaimen kanssa huono ennuste. Kääntäminen terapeuttisia strategioita glioblastoma kokeellisesta vaiheesta klinikalle on rajoittanut riittämätön eläinmalleissa, mikä puuttuu tärkeitä ominaisuuksia ihmisen kasvaimista. Lentivirusvektorikonstruktit geeniterapia on houkutteleva terapeuttinen vaihtoehto ihmisen glioblastooma, jota validoitu kliinisesti merkittävää eläinmallissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme jyrsijä ksenograftimallia että yhteenveto siitä invasiivisia ja angiogeenisen piirteitä ihmisen glioblastoma analysoida transduktion malli ja terapeuttinen teho lentiviruksesta pseudotyypitettyä vektoreita. Sekä lymfosyyttisen koriomeningiittivirus glykoproteiinin (LCMV-GP) ja rakkulasuutulehdusvirusta glykoproteiinia (VSV-G) pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita erittäin tehokkaasti transdusoidut ihmisen glioblastoomasolut

in vitro

ja

in vivo

. Sen sijaan pseudotyypitetty gammaretroviral vektorit, samanlaisia ​​kuin arvioitiin kliinisessä terapiassa glioblastooma, osoitti tehoton geeninsiirto

in vitro

ja

in vivo

. Molemmat pseudotyypittää lentivirusvektoreita transdusoitujen syövän kantasoluja kaltaisten solujen ominaista niiden CD133-, nestin- ja Sox2-ilmentyminen, kyky muodostaa rakeita hermo kantasolujen keskipitkän ja ilmaista astrosyyttien ja hermosolujen erilaistumisen markkereita seerumista olosuhteissa. Kun terapeuttinen lähestymistapa käyttäen itsemurhageeniä herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-1

-tk

) fuusioitunut eGFP, sekä lentivirusvektorit välittämän täydellisen remission kiinteiden kasvainten nähty MRI tuloksena on erittäin merkittävä säilyminen hyötyä (p 0,001) verrattuna kontrolliryhmiin. Kaikissa toistuva kasvaimia, elossa eGFP-positiivisia kasvainsoluja löydettiin, kannattavat aihiolääke sovellus useita syklejä jopa parantaa ja pidentää terapeuttista vaikutusta.

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona lentivirusten pseudotyypitetty vektorit ovat lupaavia ehdokkaita geeniterapiaan gliooma potilailla. Tehottoman geeni toimitus gammaretroviral vektorit on linjassa saatujen tulosten kliinistä hoitoa GBM ja vahvistaa siten korkea toistettavuus invasiivisen gliooma eläinmallin translaatiotutkimuksen.

Citation: Huszthy PC, Giroglou T, Tsinkalovsky O, Euskirchen P, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et ai. (2009) peruuttaminen Invasive, Cancer Stem-Like Glioblastoma ksenoqraftit käyttäminen lentivirusvektori välittämää Suicide Gene Therapy. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10,1371 /journal.pone.0006314

Editor: Chris Jones, Institute of Cancer Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 9. maaliskuuta, 2009; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 20 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Huszthy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Norjan tutkimusneuvosto (myöntää 186492 HM), The Norja Cancer Society, Helse Vest, Haukeland University Hospital, Bergen Translational tutkimusohjelman, Euroopan komissio 6. puiteohjelman (sopimus 504743) ja jonka Köln Fortune Program Kölnin yliopiston (avustus 28/2006 HM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastoma on yleisin ja kaikkein haitallisimpia ensisijainen aivokasvain. Edistysaskelista huolimatta neurokirurgian, säteilyn ja kemoterapia, ennuste potilaiden edelleen huono ja keskimääräinen eloonjäämisaika 14 kuukauden [1].

Yksi pahimmista ongelmista translaatiotutkimuksessa aivosyövän tutkimus on ollut puutetta sopivista eläinmalleissa. Syngeneic- tai ksenograftikasvaimissa perustuu glioblastoomasolulinjoissa viljellään yksittäiskerroksina kasvaa rajattu ja erittäin angiogeenisen vauriot

in vivo

[2], josta puuttuu invasiivisia kasvainsoluja, jotka ovat tärkeä osa ihmisen glioblastooma. Invasiivisen solut siirtyvät pois alkuperäisestä kasvaimen massan ja voi aiheuttaa toistuvia kasvaimia eri alueilla aivoissa. Siten nämä solut ovat merkittävä terapeuttinen tavoite.

Äskettäin perustettu mallin, jossa glioblastooma koepala perustuvia pallosia siirretään sarjassa aivoissa nude rottien näyttää erittäin invasiivinen ja angiogeeninen ominaisuuksia [3]. Näin ollen, tämä malli sopii hyvin kuin uusia hoitostrategioita. Silti raportteja käyttämällä tätä eikä muitakaan kliinisesti merkittäviä malleja kokeellista hoitoa ovat niukat. Viime aikoina olemme analysoineet terapeuttista potentiaalia HSV-1-pohjainen onkolyyttinen Herpes vektori G207 vuonna biopsia pallomainen perustuvaa GBM malli. Kasvaimen tilavuus hoidetuissa eläimissä väheni verrattuna kontrolliryhmiin, mutta ei ollut merkittävää säilyä [4]. Sen sijaan, sama hoito oli tehokkaampi solussa line- perustuva eläinmalli [5], ja seurauksena on tällä hetkellä tutkitaan vaiheen I /II kliinisessä tutkimuksessa [6]. Tässä tutkimuksessa käytimme invasiivisia ksenograftimallissa arvioida transduktion ja terapeuttinen teho lentiviruksesta pseudotyypittää vektorit.

Gammaretroviral johdettuja vektoreita hiiren Moloney-leukemiaviruksen (MMLV) on useimmin käytetty retroviruksia geenihoitoon aivokasvainten [7] – [10]. Vaikka lupaavia tuloksia eläinmalleissa, kliinisissä tutkimuksissa retrovirusvektorisupernatanttien tai retroviruksen pakkaus solut ovat epäonnistuneet [11] – [13]. Yksi merkittävä haitta gammaretroviral vektoreita on yksinomainen transduktion jakautuvien solujen, koska ihmisen glioomissa, suurin osa kasvainsolujen eivät jaa tietyn hoidon ikkuna. Näin ollen, lentivirusvektorit niiden kyky myös transdusoida ei-jakautuvia soluja, ovat houkuttelevia ehdokkaita hoitoon aivosyövän. Aiemmissa tutkimuksissa olemme kehittäneet gammaretroviral ja lentivirusvektoreita pseudotyypitetty glykoproteiinit (GP) on lymfosyyttinen koriomeningiittivirus (LCMV) [14], [15]. Nämä vektorit on laaja isäntäkirjo ja voidaan keskittää ultrasentrifugoimalla varten

in vivo

sovelluksissa. Lisäksi LCMV-GP ei sytotoksinen, ja vakaa yhdistelmä-pakkaus solulinjoja voidaan vahvistaa [16], [17]. Viime aikoina olemme osoitti, että lentiviraalinen LCMV-GP pseudotyypeille tehokkaasti toimitetaan siirtogeenien rotan glioomasoluihin

in vivo

, kun asukas hermosolut eivät transdusoitiin [18]. Lisäksi me osoitti merkittävää terapeuttista vaikutusta LCMV-GP pseudotyypitettyä lentivirusvektoreita solun line -tietoa 9L rotan glioomamallissa käyttäen itsemurhageenille HSV-1-

tk

. VSV-G-lentivirus- pseudotyypeille osoitti myös merkitsevää tehoa, on samanlainen kuin LCMV pseudotyypeille, joka on pääasiassa välittävät sivullisen vaikutus transdusoitujen normaalia aivojen soluihin [19].

Esitetyssä työssä olemme osoittaneet, että molemmat , VSV-G ja LCMV-GP pseudotyypitettyä lentiviruksien tehokkaasti transdusoidut ihmisen glioomasoluihin

in vitro

ja

in vivo

, kun taas gammaretroviral transduktio oli tehotonta. Geeni siirto glioomasoluihin oli tehokas sekä lentiviraalinen pseudotyypitettyä vektori tyyppejä. Kuitenkin se oli tarkempi käyttämällä LCMV-GP pseudotyypitettyä vektorit, kuten VSV-G pseudotyypeille myös transdusoituja isäntä aivosolujen invasiivisia alueilla. Analyysi Transdusoitujen kasvainsolujen paljasti, että molemmat lentivirusvektoreita kohdistettuja CD133-positiivinen sekä CD133-negatiivinen syöpäsoluja. Lisäksi transdusoidut glioblastoomasolut ilmaisi kantasolujen merkkiaineita nestiinifenotyypin ja Sox2. Tärkeää on, kun sitä arvioidaan tarkoitettu terapeuttiseen sovellukseen käyttäen HSV-1-

tk

kuten siirtogeenin, sekä lentivirusvektorit välittämän täydellisen kasvaimen taantumiseen MRI, tuloksena on erittäin merkittävä eloonjäämistä (p 0,001) verrattuna kontrolliryhmiin .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kokoelma ihmisen biopsiakudoksesta hyväksyi alueellisen eettisen komitean. Käsittely eläinten ja kirurgisia toimenpiteitä tehtiin mukaisesti Norja eläinten lain ja paikallisten eettisten komitea hyväksyi protokollan.

Solulinjat

ihmisalkion munuais- 293T (ATCC CRL-11268) ja TE671 solulinja saatiin the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja ylläpidetään Dulbbeco n Modified eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% glutamiinia. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Kudosviljelytutkimusten

Kasvaimen fragmentit glioblastoma multiforme potilaista saatiin leikkauksen aikana. Tissue yksilöt otettiin toteuttamiskelpoinen kasvain alueet, jotka vastasivat alueille kontrastinparannus preoperative MRI-skannaa. Näytteet siirrettiin koeputkiin, jotka sisältävät täydellisen kasvualustaa, ja pallosia valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Samaa menetelmää sovellettiin kasvaimen materiaali kuljetettiin nude rotilla. Lyhyesti, kudosnäytteet hakattu -0,5 mm fragmentit ja sijoitettiin 80 cm

2 kudosviljelypulloihin (Nunc, Roskilde, Tanska) pohja-päällystetty 0,75% agaria (Difco, Detroit, MI). Pallojen pidettiin vakio kudosviljelyinkubaattorissa, jossa 5% CO

2 ja 100% suhteellisessa kosteudessa 37 ° C: ssa. Elatusaine vaihdettiin kerran viikossa. Sferoidit halkaisijat välillä 400 ja 600 pm valittiin

in vitro

kokeita ja kallonsisäisen istutusta.

dissosiaatio kasvainten

Kasvaimet hajotettiin käyttäen Hermosolujen dissosiaatio Kit (Miltenyi , Bergisch-Gladbach, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa.

virtaussytometrianalyysin ja solulaji

Solut analysoitiin ja lajitellaan on MoFlo solulajittelijaa (Beckman Coulter, USA; entinen Cytomation, USA), joka on varustettu yhtenäinen Enterprise 621 argon-ioni laser viritetty 488 nm (käytetään 180 mW), ja 635 nm diodi (25 mW). Kaksi ug /ml propidiumjodidi – PI (Molecular Probes) lisättiin näytteisiin ennen virtauksen lajittelua helpottaa kuolleiden solujen syrjintää. GFP ja PI olivat innoissaan 488 nm: ssä ja fluoresenssi mitattiin 530/40 BP ja 613/20 BP optiset suodattimet (kaikki suodattimet Omega Optical, Brattleboro, VT, USA), tässä järjestyksessä. Dupletti oli syrjitty käyttäen eteenpäin valonsironnan (FSC) vs. pulssin leveys. FL3 kanava (logaritminen tilassa) FSC käytettiin näyttämään ja portti ulos PI positiivinen /kuolleita soluja. FSC ja puoli valonsironnan (SSC) signaaleja havaittiin ja esitetään lineaaritilaa. GFP + solut määritellään SSC vs. FL1 (logaritminen tilassa) pistekuvaajan, jolle ei kuolleita soluja ja roskat edellä kuvatulla tavalla.

analyysi CD133 ekspressiosoluja värjättiin allofykosyaniini (APC) konjugoitu monoklonaalinen CD133 /1 (AC133) vasta-aineita (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Saksa) mukaan valmistajan yleinen protokolla immunofluoresenssivärjäyksellä (10 min pimeässä 4 ° C: ssa). CD133-APC viritettiin 635 nm, fluoresenssi mitattiin 670/30 BP optinen suodatin, ja elossa CD133 + solut määritellään SSC vs. FL6 (logaritminen tilassa) dot plot. Ei-värjättiin solususpensiota käytettiin kontrollina.

GFP + kasvainsoluja lajitellaan ”puhdistaa 1” -tilassa huomioon polypropeeni pyöreäpohjaiseen Falcon-putkiin (Becton Dickinson Labware Europe, Ranska), joka sisältää elatusaineet, jotka oli asetettu jäällä. Alikvootit näytteitä lopussa lajittelua poistettiin ja analysoitiin uudelleen hallinnasta lajitella puhtauden joka oli yli 98%.

Culture of lajitellut solut

Lajittelu soluja joko viljeltiin NEUROBASAL keskipitkän (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja B27 täydentää (20 ul /ml, Invitrogen), Glutamax (10 ul /ml, Invitrogen), fibroblastikasvutekijää 2 (20 ng /ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ), epidermaalisen kasvu- tekijä (20 ng ml; Peprotech) tai siirrettiin DMEM täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% glutamiinia ja kasvatettiin peitinlasien 24-kuoppalevyillä.

immunofluoresenssi pallosia /tarttuvien solujen

Pallot /kiinnittyneet solut värjättiin ihmisen erityisiä hiiren anti-nestiinifenotyypin vasta-aineita (Millipore, Billerica, MA), vuohen anti-Sox2-vasta-aineita (R kaikuajan, 36 ms, leikepaksuudella, 1 mm, näkökenttä, 3,2 cm, matriisin koko, 256 x 256, 20 viipaletta). Skannauksen aikana, eläimiä pidettiin anestesiassa 1,5% isofluoraani (Schering-Plough, Kenilworth, NJ) sekoitettuna 50% ilmaa ja 50% O2.

Tilastollinen

Survival analysoitiin log-rank-testi perustuu Kaplan-Meierin testin SPSS ohjelmistoa. Erot paria ryhmien määritettiin Studentin

t

-testi.

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Lentivirusvektorikonstruktit pseudotyypitettyä vektorit tehokkaasti transdusoida glioblastoma pallosia

in vitro

Human glioblastoma sferoidia peräisin joko suoraan potilaasta (matala sukupolvi) tai sarja

in vivo

kohtia aivoihin nude rottien (korkea sukupolvi), infektoitiin lentiviraalinen LCMV-GP (5 x 10

4 10 ui) tai VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita (molemmat 5 x 10

4 hiukkasia 10 ui) tai retroviruskäänteiskopioijaentsyy- MLV-pohjaiset vektorit pseudotyypitetty LCMV-GP (1 x 10

5 hiukkasia 10 ui). Vektorit valmistettiin samalla tavalla

in vitro

ja

in vivo

kokeissa (katso materiaalit ja menetelmät). Molemmat lentivirusvektoreita transdusoitu potilaan palloset ja korkea sukupolvi pallosia erittäin tehokkaasti (kuvio 1). Sen sijaan, retrovirusvektoreista transdusoitu vain muutamia yksittäisiä soluja korkea sukupolven pallosia (kuvio 1), ja ei transdusoida potilaan pallosia (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi molemmat lentivirusvektorit ovat paljon tehokkaampia transdusoinnissa ihmisen glioblastooma pallosia

in vitro

kuin retrovirusvektoreita.

Ihmisen glioblastooma pallosia, jotka ovat peräisin potilaan biopsia tai sen jälkeen sarja- johtamisella nude rotilla (high sukupolvi) sairastui lentivirusvektoreita pseudotyypitetty LCMV-GP (5 x 10

4) tai VSV-G (5 x 10

4) tai retrovirusvektoreita pseudotyypitetty LCMV-GP (1 x 10

5). Kaikki vektorit ekspressoivat markkerigeeni eGFP. Sferoidit analysoitiin konfokaalimikroskopiaa varten eGFP ilmaisun 7 päivää infektion. Kuvissa eGFP (vihreä), vaihekontrasti ja overlay molempia. Alhainen gen .: pallosia suoraan johdettu potilaasta materiaalista (alhainen sukupolvi). Korkea gen .: pallosia johdettu serial

in vivo

kohtia rotan aivoissa (korkea sukupolvi). Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Lentivirusvektorikonstruktit pseudotyypitettyä vektorit tehokkaasti ja erityisesti transdusoivat glioblastoomasolut

in vivo

Jos haluat vertailla transduktioteho lentiviruksesta ja gammaretroviral vektorit

in vivo

, käytimme ksenograftimallia joka heijastaa angiogeeninen ja invasiivisia piirteitä ihmisen glioblastooma

in situ

. Ksenograftikudoksista ilmentää myös hermoesiastesolut nestiiniä ja tiiviisti yhteenveto siitä histologia potilaan kasvaimen (kuvio 2). Vektorit injektoitiin keskelle progressiivisesti kasvava vaurioita käyttäen mikroprosessoriohjattu stereotaktista infuusiona. Injektio koordinaatit arvioitiin analysoinnin jälkeen MRI kuvia kunkin yksittäisen vaurion. Injektiotilavuus sovellettu oli 2 x 10 ui ja vektorin titteri 1 x 10

7 /ml kaikkia vektoreita. Transduktioteho arvioitiin 7 päivää vektorin injektion. Molemmat lentiviral pseudotyypittää vektorit osoittivat erittäin tehokas transduktio kasvainten (kuvio 3A, D). Kun analysoida suurennettuna, sekä LCMV-GP ja VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita osoitti tehokkaita siirtogeenimääriä nestiinifenotyypin-positiivisia kasvainsoluja kiinteässä (kuvio 3B, E) ja invasiivisia kasvaimen alueilla (kuvio 3C, F). Sen sijaan, retrovirusvektori vain transdusoidut harvoilla kasvainsoluja lähellä injektiokohdassa (kuvio 3 G, H). Määrällistä vertailua transduktiotehon välillä lentiviruksen pseudotyypittää vektoreita, GFP-positiiviset alueet mitattiin histologiset objektilasit (katso Materiaalit ja menetelmät). Kokonaistilavuus Transdusoitujen kasvainkudoksen oli 7,05 ± 3,51 mm

3 LCMV-GP pseudotyypitettyä vektorit ja 4,05 ± 2,04 mm

3 VSV-G pseudotyypeiksi vektorit (kuvio 3I). Vaikka oli eroa keskiarvo, se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,269) johtuen suuria yksilöiden välisiä eroja (keskihajonnat).

Parafiinisektioista potilaan kasvain ja ksenografti kasvain värjättiin H E (AD) tai immunovärjättiin ihmisen erityinen anti-nestiinifenotyypin vasta-aineita (E, F). Potilaan kasvain (A) ja -ksenografti kasvain (B) esittävät angiogeenisen piirteitä ihmisen glioblastooma kanssa palisading kuolion (nuoli) ja verisuonten lisääntyy nopeasti (nuolenpäät). Suuremmalla suurennoksella potilaan (C) ja -ksenografti kasvain (D) osoittavat samanlaisia ​​tuumorisolujen morfologia polymorfinen ytimet läheisyydessä tuumorinekroositekijä. Potilaan (E) ja -ksenografti kasvain (F) osoittaa vahvaa nestiinin ilmentyminen kasvainsoluissa. Yhden kasvainsolun tunkeutumisen valkean aineen havaitaan ksenograftissa kasvain (F). Potilas koepala oli peräisin vain kiinteän kasvaimen ydin. A, B, E, F: Alkuperäinen suurennus 100 x. C, D: Alkuperäinen suurennus 200 ×.

kallonsisäinen gliooma tartutettiin LCMV-GP tai VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita tai LCMV-GP pseudotyypitettyä retrovirusvektoreiden ilmentävät eGFP 3-4 viikkoa sen jälkeen, kun pallomainen istutuksen ja analysoitiin fluoresenssi (A, D, G) tai konfokaali skannaus laser mikroskopian (B, C, E, F, H), 7 päivää infektion jälkeen. Konfokaalinen kuvat osoittavat päällekkäin eGFP (vihreä fluoresenssi) ja ihmisen erityisiä nestiinifenotyypin (punainen fluoresenssi). Kasvaimia tehokkaasti transdusoitu lentiviruksen LCMV-GP (A-C) ja VSV-G (D-F) pseudotyypeiksi vektoreita, kun taas retrovirusvektoreita vain transdusoitu harvoilla kasvainsoluja (G, H; nuolet). Transdusoidut glioomasolut ilmaistu ihmisspesifiset nestiinifenotyypin kiinteässä (B, E, H) ja invasiivisia kasvaimen alueilla (C, F, nuolet). (I) Transduktioteho lentivirusvektorien verrattiin kvantitatiivisesti mittaamalla tilavuuden transduktion histologisen osia käyttäen fluoresenssimikroskooppia ja Nikon kuvantamisen ohjelmistoja. LCMV transdusoitu kasvaimet (n = 3) oli suurempi transduktio tilavuus kuin VSV transdusoidaan kasvain (n = 3), mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,269). A, D: Alkuperäinen suurennus 40 x. C, E, G, H: Alkuperäinen suurennus 100 x. D, F: Alkuperäinen suurennus 200 ×.

analysoimiseksi transduktio spesifisyyden histologinen kohdissa invasiivisia kasvaimen alueet värjättiin rotan markkereita Neun (neuronien) ja nestiinifenotyypin (varten astrosyytit ja progenitorisolujen). LCMV-GP pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita yksinomaan transdusoidut kasvainsolut kaikilla invasiivisia alueilla (kuvio 4A), kun taas normaali aivojen soluja ei transdusoitiin (kuvio 4B, C). Myös VSV-G pseudotyypeiksi vektorit osoittivat erityistä transduktio kasvainsolujen joillakin invasiivisia alueilla (kuvio 4D, E), mutta ne myös transdusoidut muutaman isännän aivosolut muissa kohdissa (kuvio 4G, H).

kallonsisäinen gliooma infektoitiin LCMV-GP- tai VSV-G-pseudo- lentivirusvektoreita ilmentävät eGFP 3-4 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen ja analysoitiin CLSM 7 päivää infektion jälkeen. Transduktio invasiivisen kasvainsolujen analysoitiin värjäyksen jälkeen ihmisen erityisiä nestiinifenotyypin vasta-aineita. Isäntä neuronien ja astrosyytit leimattiin käyttäen vasta-aineita Neun ja GFAP. Invasiivinen alueet osoittivat yhden solun hyökkäyksen kasvainsoluja (A-C, E, F) tai subependymaaliset kerääntyminen tuumorisoluihin (D, G, H). LCMV pseudotyypittää vektorit erityisesti transdusoidut invasiivisia glioomasoluissa (A-C). VSV-G-pseudo- vektorit osoittivat tiettyjä transduktio kasvainsolujen joillakin invasiivisia alueilla (D-F), mutta myös transduktio yhden normaalin aivosolujen toisissa (G, H; nuolet). Transdusoidut normaalia aivojen solut enimmäkseen havaittu morfologisia kriteerit (lisää prosessit), koska värjäytymistä (GFAP tai neun) ei aina ole sovitettu yhteen transdusoidut solut. A, D: nestiinivärjäys, suurennus 200 x. B, E, G: GFAP värjäystä, suurennus 200 x. C, F, H: Neun värjäystä, suurennus 200 ×.

Lentivirusvektorikonstruktit pseudotyypitettyä vektorit transdusoida syöpää varsi kaltaisia ​​glioomasoluihin

analysoitava mahdollisia molempien lentivirusvektorien tartuttaa syöpä varsi kaltaisia ​​soluja, transdusoidut kasvaimet entsymaattisesti hajotettiin ja CD133 ilmentyminen mitattiin virtaussytometrialla. Molemmat vektorit transdusoituja CD133-positiivisia ja CD133-negatiivisia soluja (kuvio 5A). Vaikka oli suuria yksilöiden välisiä eroja osa koko CD133-positiivisia kasvainsoluja eri ksenografteissa, molemmat vektorit osoittivat samanlaisia ​​tehokkuutta transdusoinnissa CD133-positiivisia soluja, jotka olivat hiukan korkeammat kuin yleinen osa CD133-positiivisia soluja (taulukko 1) .

kallonsisäinen gliooma tartutettiin LCMV-GP tai VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita ilmentävät eGFP 3-4 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen. Kasvaimet leikattiin kun suuria vaurioita ilmestyi MRI ja entsymaatti hajotettiin. Transduktiossa CD133-positiivisten solujen mitattiin virtaussytometrialla. (A) LCMV-GP ja VSV-G pseudotyypeiksi vektorit transduce CD133 positiivisia ja negatiivisia kasvainsoluja. Fraktio transdusoitujen (GFP-positiiviset solut) on hieman korkeampi CD133 positiivisia soluja (oikea sarake) verrattuna CD133 negatiiviset solut (keskimmäinen sarake). GFP + -solut lajiteltu, viljeltiin läsnä ollessa tai ilman seerumia ja analysoitiin fluoresenssilla (B-G) tai konfokaalimikroskopialla (H-O). LCMV-GP (B) ja VSV-G: tä (E) transdusoidut solut pallosten muodostamiseksi, kun kulttuuri seerumittomassa hermo ruselatusaineeseen täydennetty EGF: n ja bFGF. Transdusoidut sferoidit ilmaista hermostoputken kantasolujen merkkiaineita nestiinifenotyypin (C, F) ja Sox2 (D, G). Transdusoidut solut viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa ilmaista kantasolujen merkkiaineita nestiinin (H, L), ja Sox2 (I, M), mutta myös erilaistumisen markkereita GFAP (J, N) ja beeta-tubulinIII (K, O). Kuvat C, D, E, F, HO näyttää overlay viruksen toimitettuna siirtogeenin (eGFP, vihreä) ja havaitaan antigeenin (Alexa-647, punainen).

GFP- positiiviset solut kasvaimia transdusoitu LCMV-GP tai VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita lajiteltiin ja viljeltiin hermo peruselatusaineessa täydennetty EGF ja bFGF. Transdusoidut kasvainsolut sekä vektorit kykenivät pallosten muodostamiseksi (kuvio 5B, E). Sferoidit ilmaisi kantasolujen merkkiaineita nestiinifenotyypin ja Sox2 (kuvio 5C, D, F, G). Lajitellut solut maljattiin myös alla seerumin olosuhteissa. Solut edelleen huomattavasti ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita nestiinifenotyypin ja Sox2, mutta myös Differentiaatiomarkkerien GFAP ja β-tubulinIII (kuvio 5H-O).

Lentivirusvektorikonstruktit pseudotyypittää ilmentävät itsemurhageeniä HSV-1 –

tk

välittäjänä tehokas terapeuttinen vaikutus

in vivo

arvioimiseksi terapeuttista tehoa sekä lentivirus- pseudotyoped vektorit invasiivisia ksenograftimallia, jotka ilmentävät itsemurhageeniä HSV1-

tk

fuusioitunut eGFP injisoitiin olevien kasvainten, kun näkyvissä MRI käyttäen samaa menetelmää kuin on kuvattu

in vivo

tropismi tutkimuksessa. Eläimiä käsiteltiin päivittäin 50 mg /kg gansikloviirin 30 päivän ajan alkaen 7 päivää lähettää vektorin injektion. Kasvaimen kasvu mitattiin joka 7-14 päivää MRI. Kun 4 viikon hoidon 7 ulos 8 eläinten sekä LCMV- ja VSV-pseudotyyppi hoidetuissa ryhmissä oli täydellinen remissio MRI (kuva 6). Yksi eläin kustakin ryhmästä oli stabiili tauti loppuun GC hoidon. Kaikki kontrolliryhmän eläinten ryhmää kehitti suuria kasvaimia hoitojakson aikana 30 päivää (kuvio 6). Sekä LCMV- ja VSV-pseudotyypin hoidettujen eläinten oli erittäin merkittävä säilyä (p 0,001) verrattuna kontrolliryhmiin (kuvio 7A). Ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa eloonjäämisen välillä kahdessa hoitoryhmässä.

edustaja kolmiulotteisen MRI (T2 RARE). (A, F, K, P) Lentivirusvektorikonstruktit LCMV-GP vektorien gansikloviirin hoitoon. (B, G, L, Q) Lentivirusvektorikonstruktit VSV-G vektorien gansikloviirin hoitoon. (C, H, M, R) Lentivirusvektorikonstruktit LCMV-GP vektorit ilman gansikloviiri hoitoa. (D, I, N, S) Lentivirusvektorikonstruktit VSV-G vektorit ilman gansikloviiri hoitoa. (E, J, O, T) gansikloviiria lääkintään. Ajankohtina kasvaimen istutuksen jälkeen: (A-E) 1 vrk ennen vektorin injektiota. (F-J) 1. viikko gansikloviiria hoitoa. (K-O) 2. viikko gansikloviiria hoitoa. (PT) 4. viikko gansikloviiria hoitoon.

kallonsisäinen gliooma annettiin injektiona LCMV-GP tai VSV-G pseudotyypeiksi lentivirusvektoreita ilmentävät HSV-1-

tk

fuusioitu eGFP 3 viikkoa tuumorin implantaation jälkeen. 7 päivää vektori infektion, eläimiä sekä käsitellään ryhmissä ja yhteen verrokkiryhmään käsiteltiin gansikloviirin 30 päivää. (A) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä. Selviytymisen etu molemmissa ryhmissä verrattuna kontrolliin ryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä (

P

0,001; log-rank-testi). Ei ollut mitään merkittävää eroa eloonjäämisen välillä hoitoryhmässä. (B-D) edustaja MK (T2 RARE) toistuvia kasvaimia LCMV- (B, C) ja VSV-käsitelty (D, E) ryhmä. (B) Invasiivinen contralateral toistuminen. (C) Invasive paikalliset ja kontralateraalista uusiutumisen. (D) Lisää rajattu paikallisen uusiutumisen. (E) makroskooppinen kuva rotan aivojen toistumisen pikkuaivoissa (punainen ympyrä), käsiteltiin VSV-G pseudotyypeiksi vektoreita ja GC. (F-M) Osiot toistuvien kasvainten värjättiin vasta-aineita ihmisen erityisiä nestiinifenotyypin ja analysoitiin fluoresenssilla (F, J) tai konfokaalimikroskopia (G-I, K-M).