Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpä diagnosoidaan kystoskopian, kallis ja invasiivinen toimenpide, joka liittyy potilaan epämukavuutta. Analyysi kasvain-spesifisten DNA sedimenteistä tyhjiä virtsan on potentiaalia havaitsemiseksi ei-invasiivisesti virtsarakon syövän; kuitenkin, herkkyys on rajoitettu alhainen jakeet ja pieniä määriä syöpäsoluja paisutettu virtsaan huonolaatuisesta kasvaimia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli parantaa herkkyyttä ei-invasiivisia havaitseminen virtsarakon syövän koon perustuvaa talteenotto ja rikastaminen kasvainsolujen virtsaan. Murto-näyte perustamiseen, virtsaa peräkkäinen primaarisessa tai toistuvien virtsarakon kasvaimet (N = 189) käsiteltiin mikrosuodatuksella käyttämällä suodattamalla kalvolla, jonka määritellyn huokoskoon, ja sedimentaatio sentrifugoimalla, vastaavasti. DNA näytteistä analysoitiin seitsemän virtsarakon kasvaimeen liittyvien metylaatio merkkiaineiden avulla MethyLightTM ja pyrosekvensointi määrityksissä. Osa kasvaimesta peräisin DNA oli suurempi suodinnäytettä kuin vastaavana sedimenteissä kaikille markkereita (

p

0,000001). Kaikissa kasvain vaiheissa, tapausten määrä positiivisia yhden tai useamman markkereita oli 87% vuonna suodinnäytettä verrattuna 80% vastaavalla sedimenteissä. Suurin kasvu herkkyys saavutettiin heikompilaatuisen Ta kasvaimet, jossa 82 ulos 98 tapausta positiiviseksi suodinnäytettä (84%) verrattuna 74 ulos 98 sedimenteissä (75%). Tuloksemme osoittavat, että ennalta analyyttinen käsittely mitätöidään virtsan koon perustuva suodatus voi lisätä herkkyyttä DNA perustuva tunnistus virtsarakon syöpään.

Citation: Andersson E, Steven K, Guldberg P (2014) koko- pohjainen rikastaminen paisutettu kasvainsolujen Virtsa lisää herkkyyttä DNA-Based havaitseminen virtsarakon syövän. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10,1371 /journal.pone.0094023

Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 lokakuu 2013; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2014; Julkaistu: 14 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Andersson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant tuki : Candy Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on seitsemänneksi yleisin syöpä maailmassa ja kattaa yli 150000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Yli 90% virtsarakon kasvaimet ovat siirtymäkauden solukarsinoomat (kutsutaan myös urothelial karsinooma) johtuvat urothelial epiteelisoluihin rakko. Tyypillisiä oireita virtsarakon syöpä ovat mikroskooppisia ja makroskooppisia hematuria, kivulias virtsaaminen ja polyuria. Kuitenkaan mikään näistä oireista on spesifinen tauti ja voi aiheuttaa useita muita ehtoja, kuten kystiitti, munuaiskivet ja eturauhasen sairaus. Kultakanta diagnosointiin virtsarakon syöpä on höyläysleikkaus virtsarakon kasvain (TURBT). Useimmat potilaat ovat diagnosoitu ei-invasiivisia virtsarakon syöpä (vaihe Ta), joka on viiden vuoden eloonjäämisaste 90%. Kuitenkin toistumisen määrä on korkea (50-70%) ja 10-25% edistymisestä invasiivisia virtsarakon syövän, jotka oikeuttavat pitkäaikainen seurantaa kystoskopian potilailla, joilla on ei-invasiivisen kasvaimet [2] – [4]. Kystoskopia on invasiivinen menetelmä, joka on epämiellyttävä potilaille ja vaatii suuria teknisiä ja taloudellisia voimavaroja. Sen vuoksi on tärkeää kehittää ei-invasiivisia menetelmiä, jotka ovat yksinkertaisia ​​ja kustannustehokkaita diagnoosiin ja seurantaan virtsarakon syöpä.

Mitätöity virtsanäytteiden potilailta virtsarakon kasvaimia sisältävät yleensä paisutettu syöpäsolujen voi havaita sytologinen analyysi. Virtsa sytologia on ei-invasiivinen menetelmä, joka on korkea spesifisyys mutta alhainen herkkyys ( 40%), erityisesti potilailla, joilla matala-asteinen kasvaimet [5], [6]. Vielä herkkä ei-invasiivinen menetelmä havaitsemiseksi virtsarakon syövän perustuu analyysiin kasvaimen-spesifisiä muutoksia DNA eristettiin virtsasta sedimenteistä. Kromosomi-tappiot ja somaattiset mutaatiot erityisiä geenejä, kuten

FGFR3

ja

TP53

ovat kaikki käytetty menestyksellisesti biomarkkereina havaitsemiseksi eri vaiheissa virtsarakon syöpä [7] – [9]. Viime vuosina, poikkeava hypermetylaation on promoottori-CpG-saarekkeiden on osoitettu esiintyy usein ja varhain syövän kehittymisessä, ja ne voivat jopa ennen geneettiset muutokset, kuten mutaatioiden ja genomisen uudelleenjärjestelystä cancerogenesis [10]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu hypermetylaatiota promoottorin CpG saarista rakkokasvaimista (tarkistetaan viitteet. [11] – [13]) ja nämä muutokset voidaan havaita virtsasta sedimenteissä virtsarakon syöpäpotilailla [14], [15]. Ei ole olemassa yhtä DNA-metylaatio markkeri, joka määrittelee kaikenlaisia ​​virtsarakkokasvain, ja useimmat tutkimukset ovat hyödyntäneet paneelin merkkiaineiden havaitsemiseksi virtsarakon syövän kliinisissä näytteissä. Herkkyys ja DNA-pohjainen virtsarakkokasvain havaitsemiseen vaihtelevat huomattavasti eri tutkimuksissa, jotka voivat johtua valikoima merkkejä ja menetelmiä, joilla arvioidaan näitä markkereita, sekä erot edustus eri kasvaimen vaiheissa potilasaineistoihin [16] – [23].

tutkimuksissa, joissa pariksi kasvain näytteet ja sedimenttien virtsasta on analysoitu rinnakkain sama paneeli DNA-markkereita, havaitsemisen herkkyyttä on johdonmukaisesti pienempi virtsan [15], [17], [20]. Kuorinta kasvainsolujen osaksi virtsaan riippuu kasvaimen ominaisuuksista kuten koko, vaihe ja laatu sekä myös osoittaa suurta sisäistä yksilöllinen vaihtelu [24]. Varsinkin pienet ei-invasiivisia kasvaimet eivät todennäköisesti irtoa tarpeeksi soluja virtsaan voidaan havaita seuraavaa analyysiä. Lisäksi virtsaa virtsarakon syöpä potilailla saattaa olla lisääntynyt määrä muiden solutyyppien, mukaan lukien valkosolut, jotka voivat vaikuttaa herkkyyteen sedimentin analyysi. Siksi menetelmä, joka sallii rikastuminen kasvainsolujen virtsanäytteet saattaa lisätä kestävyyttä ja herkkyys ei-invasiivisia havaitseminen virtsarakon syövän.

kasvainsoluista peräisin epiteeli- solut ovat yleensä suurempia kuin valkoisten verisolujen, ja tämä kokoero voitaisiin mahdollisesti hyödyntää rikastamiseksi kasvainsolujen biologiset näytteet kuten virtsasta. Aiemmat tutkimukset ovat käyttäneet suodattimia kokoon perustuva eristäminen harvinaisia ​​verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) ääreisverenkierrossa [25], [26]. Ajatus pyydystää solujen virtsaan suodattimella otettiin käyttöön yli kolmekymmentä vuotta sitten [27], ja myöhemmin tutkimukset ovat käyttäneet kalvosuodattimia valmistamiseksi epiteelisolujen virtsasta havaitsemiseksi urothelial karsinooma mukaan sytologian tai fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) analyysi [28] – [30]. Tässä tutkimuksessa olemme testanneet yksinkertainen ja kustannustehokas menettely edeltävän analyyttisen virtsan suodatus lisätä osa kasvainsolujen ja siten herkkyys DNA perustuva tunnistus yli suodattamatonta sedimenttejä. Murto-näyte perustamiseen, virtsanäytteiden virtsarakon syöpäpotilaiden arvioitiin läsnäolo kasvain DNA paneelin kanssa metylaation merkkiaineiden usein havaittu virtsarakon syöpään. Jakeet Metyloitujen alleelien määrä määritettiin sedimentoidusta ja suodatetaan näytteiden MethyLightTM määrityksiä ja pyrosekvensointi. Olemme havainneet, että tämä suodatus tuloksesta kasvoi osa kasvain- DNA ja paransi myös herkkyyttä ja luotettavuutta virtsarakkokasvain havaitseminen virtsanäytteistä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus hyväksyttiin Kööpenhaminan eettinen komitea, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja valvonnan osallisuutta.

kokoelma Virtsanäyteanalyysit

Mitätöity aamuvirtsasta kerättiin virtsarakon syöpäpotilaiden kelpuutettiin TURBT Kööpenhaminan yliopistollisessa sairaalassa, Herlev, Tanska, kesä 2010 lokakuuta 2011 ja terveillä vapaaehtoisilla ilman tiedossa urologiset syöpäsairauksia. Näytteet lähetettiin Tanskan Cancer Society ja prosessoidaan 4-6 tunnin kuluttua virtsaamisen.

Jalostus Virtsanäyteanalyysit

Viisikymmentä millilitraa kutakin virtsanäytettä sedimentoitiin sentrifugoimalla 2000 g 10 minuuttia . Pelletti pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), jota seurasi toinen 10 min sentrifugoimalla. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudelleen noin 200 ul: aan PBS: ää. Samanaikaisesti virtsaa samasta näytteestä imettiin kertakäyttöiseen ruiskuun ja läpi Whatman Nucleoporen track-syövytetty polykarbonaatti hydrofiilinen kalvosuodattimen (halkaisija 25 mm), joka on asennettu vastaavaan suodatintelineeseen (Whatman, Maidstone, UK). Virtsanäyte johdettiin suodattimen positiivinen voima, kunnes vastus tuntui (kylläisyys), kuitenkin enintään 125 ml. Kaikki suodattimet huuhdottiin PBS ennen irrotusta suodattimen pidin. Virtsa sedimentit ja suodattimia suodatin sisältö säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes jatkokäsittelyä.

DNA eristäminen ja bisulfiittikonversion

DNA eristettiin virtsan sedimentin ja suodinnäytettä Qiagen Mini Prep Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suodinnäytettä ja sedimentit inkuboitiin ATL puskurilla ja proteinaasi K 56 ° C: ssa vähintään yhden 1 tunti tai yön yli. Myöhempi käsittely suoritettiin protokollan mukaan DNA: n puhdistamiseen kudoksista. DNA suodattimet ja sedimenttien eluoitiin 50 ui ja 100 ui puskuria AE, vastaavasti, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa. DNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Bisulfiittikonversio tehtiin käyttäen EZ DNA Metylointi-Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) valmistajan protokollaa. Vetysulfiitilla muunnetulle DNA eluoitiin 2 x 10 ui M-eluutiopuskuria ja varastoitiin -80 ° C: ssa. For pariksi näytteitä (sedimentin ja suodatin), sama määrä DNA: ta käytettiin, enintään 500 ng. Tapauksissa, joissa DNA-pitoisuus oli liian pieni tarkasti määrittää käyttämällä NanoDrop spektrofotometriä, suurin näytteen tilavuus (20 ui) käytettiin. Normaalit ihmisen virtsarakkoepiteeliin peräisin 66-vuotias mies ostettiin Capital Biosciences (Rockville, MD, USA).

Cell Culture

T24 solulinja (DSMZ, Braunschweig, Saksa) oli viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Lymfosyytit eristettiin verestä peräisin terveestä luovuttajasta oleellisesti, kuten on kuvattu [31], ja sitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Solujen yhden solun suspensio laskettiin ja mitattiin käyttäen Countess Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Nämä kaksi solu- tyyppiä sekoitettiin ilmoitetuissa suhteissa ja käsitellään sentrifugoimalla ja suodattamalla, kuten edellä on kuvattu virtsanäytteitä.

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

mutaatioanalyysi

HRAS

eksonin 2 denaturoivalla gradientilla (DGGE) suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu [32]. Alukesekvensseissä ja PCR-olosuhteita ovat taulukossa S1. PCR-tuotteet ladattiin 0% denaturoivaa /6% polyakryyliamidi-90% denaturoivaa /9% polyakryyliamidia double-gradienttigeeli [33]. Geelit ajettiin 170 V 4,5 tuntia TAE-puskurissa pidetään tasaisessa lämpötilassa 58 ° C, värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-läpivalaisulla.

MethyLightTM

Reaaliaikainen kvantitatiivinen metylaatiospesifinen PCR (MethyLight; Ref. [34]) suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu [20]. Aluke ja koetin sekvenssit on lueteltu taulukossa S1. Reaktiot suoritettiin LightCycler 480 alustalla käyttäen LightCycler 480 Probes Master Kit (Roche, Mannheim, Saksa) ja 1 ui bisulfiitti-käsitellyn DNA kohti reaktiota. Spesifisyys jokaisessa määrityksessä määritettiin käyttämällä

in vitro

metyloituja DNA (IVM; CpGenomeTM Universal Metyloidut DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) ja DNA valittujen syöpäsolulinjoissa positiiviset ja negatiiviset kontrollit metylaation, vastaavasti ja veden ja ei-bisulfiitti käsitelty genomista DNA: ta negatiivisten kontrollien vahvistusta. MethyLight määritys

ALUC4

ja laimennussarjaan IVM määrittämiseen käytettiin DNA-näytteen pitoisuus bisulfiittikäsittelyn jälkeen [20], [35]. Tapauksia hävitettävä, jos jompikumpi pariksi sedimentin tai suodinnäytettä pitoisuus oli alle vastaa 0,25 ng /ul kuin bisulfiitti-käsitellyn DNA. Metylaatiotasoilla laskettiin prosenttia metyloituja viite (PMR, Ref. [35]) normalisoimalla markkeri-spesifisen reaktion arvoja

ALUC4

arvot suhteessa samat arvot täysin metyloitu ohjaus (IVM). Pieniä määriä lähtö-DNA monien näytteiden rajoitettu määrä markkereita, jotka voidaan testata, ja kaikki analyysit suoritettiin yksittäisinä reaktioita. Taustalla metylointi tasolla kunkin markkerin määritettiin käyttämällä DNA sedimentoidusta ja suodatetaan virtsanäytteiden 11 tervettä verrokkia sekä ihmisen genomista DNA: ta (Roche, Mannheim, Saksa). Cut-off-PMR-arvot olivat 3

HOXA9

, 2

POU4F2

, 0,5

SALL3

ja 2

VIM2.

pyrosekvensointi

pyrosekvensointi määrityksiä varten

HRAS

p.G12V (c.35G T) mutaatio ja

BCL2

promoottori metylaatio suunniteltiin käyttäen PyroMark määritystä suunnitteluohjelmisto (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Alukesekvensseissä ja PCR-olosuhteita ovat taulukossa S1. PCR suoritettiin lopputilavuudessa 25 ui, joka sisälsi PCR-puskuria (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa), 200 uM kutakin dNTP: tä, 0,4 uM kutakin aluketta ja 1 U Taq-HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Pyrosekvensointi suoritettiin PyroMark Q24 alustalla käyttäen PyroMark Gold Q24 reagenssit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Tulosten analysointi suoritettiin kanssa PyroMark Q24 ohjelmisto (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa). Keskimäärin metylaatiotasoilla varten

BCL2

laskettiin seitsemän CpG sivustoja mukana kokeessa. Taustalla signaali

BCL2

metylaatiomääritystä asetettiin 5% perustuen analyysiin bisulfiitti-käsitellyn ihmisen genomista DNA: ta (Roche, Mannheim, Saksa). Sillä

BCL2

metylointianalyysi, vain kliinistä näytettä, jonka pitoisuus vastaa 5 ng /ul kuin bisulfiitti-käsitellyn DNA: n tai useamman olivat mukana.

Tulokset

Capture ja Enrichment virtsarakon kasvainsolujen kalvosuodattimella

kyvyn testaamiseksi kalvosuodattimet kaapata virtsarakon kasvainsoluihin, ensin käytetty malli, joka on suunniteltu muistuttamaan virtsanäytteet, jotka sisältävät vähäisiä jakeet syöpäsoluja. Eräässä kokeessa on esitetty kuviossa 1. Puhdistettu viljeltiin periferaalisen veren lymfosyyttejä (halkaisija 7-8 um) terästettiin 0,5% T24 virtsarakon syövän solujen (halkaisija 16-17 um). Osa tästä solujen seos sentrifugoidaan, ja loput johdettiin kalvosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on 8 um (kuvio 1A). Läpivirtauksesta suodattimesta kerättiin myös ja sentrifugoidaan. Arvioida, suodatus kasvattaa osa kasvainsolujen näytteessä, DNA eristettiin ja analysoitiin kaksi kasvain-spesifisiä muutoksia läsnä T24-soluissa;

HRAS

p.G12V mutaatio ja hypermetylaatiota

BCL2

promoottori. Kuviossa 1B on esitetty fyysinen resoluutio mutanttien ja villityypin

HRAS

alleeleja käyttäen DGGE, joka on havaisemistasosta noin 2% [36]. Mutantti

HRAS

alleeli oli selvästi havaittavissa homo- ja heterodupleksien suodattimessa näytteessä muttei sedimentissä tai läpivirtaus näytteistä (kuvio 1 B). Kvantitatiivinen analyysi samoista näytteistä käyttäen pyrosekvensointi kasvoi suhteessa mutantti (T) yli villityypin (G)

HRAS

alleelit 3-4% sedimentin ja läpivirtaus näytteitä 19% suodattimen näytteessä (kuvio 1C ja tietoja ei ole esitetty). Bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi osoitti samanlaista lisäystä osa

BCL2

hypermetyloitunut alleelit, spesifinen T24 soluja, kun suodatus (kuvio 1 D).

(A) Kaaviokuva jaetun näytteen kokeellisesta up. Virtsanäytteen tai solususpensiota jaetaan kahteen osaan ja sentrifugoitiin ja suodattamalla, vastaavasti. DNA soluista sedimentissä tai jää suodattimen jälkeen eristettiin ja analysoitiin kasvaimen-spesifisten. (B) havaitseminen

HRAS

p.G12V mutaation DGGE. Solulinja T24 on homotsygoottinen mutanttialleelin. Sedimentin ja läpivirtaus näytteitä näyttää vain villityypin alleeli, kun taas suodattimen näyte näkyy sekä mutantti ja villityypin alleelit. Heterodupleksit ovat hybridi molekyylejä muodostuu yhdestä mutantin juosteen ja yhden villityypin säie. (C) Pyrographs osoittaa jakautuminen villityypin (G) ja mutantti (T)

HRAS

alleelit sedimentin ja suodatin näytteitä. (D) Pyrographs on

BCL2

promoottori CpG-saarekkeen metylointianalyysi sedimentin ja suodatin näytteitä. Yksittäiset CpG sivustoja kohdealueen on merkitty tumman harmaa varjostus, ja prosenttiosuus metyloitu alleelien (C) on merkitty kullakin sivustolla.

Testaa suodatuksen menetelmä kliinisessä ympäristössä, virtsa näytteet saatiin 15 virtsarakon syöpään tuotujen potilaiden varten TURBT. Tässä sarjassa näytteitä, myös arvioitava, huokoskoko voi vaikuttaa kasvainsolujen normaaleihin soluihin. Kustakin virtsanäyte, 50 ml valmistettiin sentrifugoimalla, kun taas jäljellä oleva tilavuus jaettiin tasan ja johdetaan kaksi suodatinta, joiden huokoskoko on 8 um ja 10 um, vastaavasti. DNA eristettiin kaikista virtsasta sedimenteistä ja suodatin näytteitä ja tutkittiin

BCL2

metylaatio käyttämällä erittäin spesifinen ja herkkä MethyLightTM määritys. Seitsemällä 15 virtsanäytteet olivat positiivisia tämän merkin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien osoittaa

BCL2

hypermetylaation suuri prosenttiosuus rakkokasvaimista [16], [22]. Arvioida osa kasvain- DNA, metylaatiotasoilla laskettiin

BCL2

positiivisten näytteiden käyttäen normalisoidut arvot (PMR). Oli vain pieni ero metylaatiotasoilla välillä 8 ja 10 um suodattimia, hieman korkeammalla tasolla 8 um: n suodattimen (taulukko S2). Kvantitatiivinen analyysi

BCL2

metylaation pyrosekvensointi vahvisti tulokset MethyLightT analyysi (kuvio 2). Erityisesti, kaikki suodinnäytettä (sekä 8 um ja 10 um) oli suurempi

BCL2

metylaatiotasoilla kuin vastaava sedimenttinäytteissä, osoittaa suurempi osa kasvainsolujen.

Keskimääräinen metylaatio tasot

BCL2

promoottori CpG-saarekkeen virtsanäytteistä seitsemästä virtsarakon syöpäpotilaita, määritettynä pyrosekvensointi. Sedimentin ja kaksi suodinnäytettä (8 ja 10 mm: n huokoskoon, vastaavasti) valmistettiin kustakin virtsanäytettä. Sedimentin näyte potilas 2 puuttuu, koska se epäonnistui DNA: n uuttaminen.

Virtsa Filtration Lisäykset osa Kasvain DNA kliinisissä näytteissä

ottavat saa todisteet periaatteellisista kalvosuodattimia voi kaapata ja rikastamiseksi virtsarakon kasvainsolujen virtsanäytteistä, suoritimme kliinisen tutkimuksen 220 peräkkäisen virtsarakon kasvain potilaita. Väestörakenteen ja kliinis-patologinen ominaisuudet näistä potilaista ovat taulukossa S3. Oli sama määrä primaarisessa ja toistuvien kasvainten tässä kohortissa. Aamuvirtsasta kerättiin ja prosessoitiin jaetun näyte design kuvassa 1A, käyttämällä 8 um suodattimen. DNA eristettiin kaikista virtsan sedimentin ja suodatin näytteitä ja käsiteltiin natriumbisulfiitin. Pitoisuus ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta kussakin näytteessä määritettiin käyttäen MethyLightTM määritystä

ALUC4

. Kolmekymmentäyksi pariksi näytteet hylättiin, koska alhainen DNA tuotto (taulukko S3).

Screening kaikista 189 pariksi näytteitä

BCL2

metylaation MethyLightTM analyysi tunnistettu 121 tapauksissa positiivinen tämän merkin (esimerkit on esitetty kuviossa 3A). 60 näistä tapauksista, sekä suodatin ja sedimenttinäytteet sisälsi riittävän määrän DNA luotettavan kvantitatiivisen analyysin mukaan pyrosekvensointi (kuvio 3B). 18 ulos 60 tapausta, keskimääräinen

BCL2

metylaatio taso oli alle tausta signaalin pyrosekvensointi sekä sedimentin ja suodatin näytteitä. Lopuista 42 tapausta, 29 (69%) osoitti korkeampia metylaatiotasoilla suodattimessa näytteessä verrattuna sedimenttinäyte, viidessä tapauksessa (12%) olivat yhtä hyviä metylaatiotasoilla ( 2 prosenttia pistettä eroa), ja kahdeksassa tapauksessa (19% ) osoitti korkeampia metylaatiotasoilla sedimenteissä kuin vastaavana suodattimet (kuvio 3C). Keskimääräinen metylaatio taso oli 28% vuonna suodinnäytettä verrattuna 21% sedimentteihin (

p

0,001, pariksi t-testi). Kasvu metylaatiotasoilla sedimentistä suodattaa vaihteli 3-35 prosenttiin pistettä, joiden mediaani 10 prosenttia pistettä. Kvantitatiivinen analyysi kaikista 121 tapauksissa positiivinen

BCL2

metylaatio käyttäen normalisoidut arvot (PMR) alkaen MethyLightT analyysi osoitti keskimäärin metylaatio taso 10,0% sedimentin näytteitä ja 14,4% vuonna suodinnäytettä mediaanin taso kasvoi 1,6%: sta 4,0% (kuvio 4;

p

0,001, pariksi t-testi).

(A) Esimerkkejä MethyLightTM analyysi

BCL2

promoottori CpG-saarekkeen metylaation. Potilaalla A vahvistus nähdään suodattimen näytteessä, mutta ei sedimenttinäyte. Potilaalla B, vahvistus nähdään molemmissa näytteissä; mutta joilla on korkeampi Ct arvo sedimenttinäyte. (B) Esimerkkejä

BCL2

promoottori CpG-saarekkeen metylaation analyysi pyrosekvensointi pariksi näytteistä. Keskimäärin metylaatio taso lasketaan seitsemän yksittäisen CpG sivustoja analysoidaan (merkitty tumman harmaalla varjostuksella). Keskimääräinen metylaatio tasolla sedimentin näytteen potilaan B oli pienempi kuin tausta signaalin pyrosekvensointi, toisin MethyLightT määrityksessä (A), jossa ero analyyttisen herkkyyden välillä määrityksissä. (C) Keskimääräinen metylaatiotasoilla parittaisin määritettynä pyrosekvensointi. Siinä on esitetty tulokset, joissa on vähintään yksi parin näytteet osoittivat yläpuoliset signaalit tausta pyrosekvensointi (N = 42).

esitetty on mediaani normalisoidut arvot (prosenttia metyloidut viite, PMR) alkaen MethyLight analyysin seitsemästä metylaation markkereita. Kunkin markkerin, metylaatiotasot vaihtelivat 1%: sta 100% (ei esitetty). *, P 0,05; **, P 0,01.

analysoimiseksi näytteet negatiivisia

BCL2

metylaatio, laajensimme MethyLightT perustuva analyysi kuusi ylimääräistä promoottori CpG-saarekkeiden aiemmin raportoitu usein hypermetyloitunut virtsarakon syöpä, mukaan lukien

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

ja

VIM2

[16], [18], [23]. Olemme validoitu näitä merkkiaineita sekä

BCL2

paneelissa 51 rakkokasvaimista edustavat eri kasvaimen vaiheissa (22 huono laatu Ta kasvaimet, 2 korkealaatuista Ta kasvaimet, 8 T1 kasvaimet, 17≥T2 kasvaimet, ja 2 Tis ). Kukin näistä merkkiaineiden oli positiivinen 45% kasvaimista tässä paneelissa, ja 48 kasvainten (94%) oli positiivisia ainakin yksi merkki. Kasvain spesifisyys merkkiaineiden vahvistettiin analyysi normaalin virtsarakkokudos.

kvantitatiivinen analyysi kaikista seitsemästä DNA: n metylaatio markkereita osoitti kasvua metylaatiotasoilla in suodinnäytettä verrattuna sedimenttien (kuva 4;

p

0.000001, pariksi t-testi). Tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä joitakin yksittäisiä merkintöjä, kuten

BCL2

,

HOXA9

ja

VIM2

(kuva 4).

Virtsa Filtration Kasvattaa herkkyys havaitseminen virtsarakon syövän

ratkaisi lopullisesti onko kasvatettu jakeet kasvainperäinen DNA saavutetaan virtsan suodattamalla voivat vaikuttaa havaitsemisherkkyyden virtsarakon syöpään. Tasojen määrittämiseksi tausta metylaation kunkin seitsemän markkereita, tutkimme DNA suodattimen ja sedimentin virtsa- näytettä 11 terveen kontrollin sekä DNA: n perifeerisen veren lymfosyyttejä. Jälkisyklinen monistaminen joskus havaittiin neljän markkerin (

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

ja

VIM2

), joista jotkut olivat pidettiin toistettujen mittausten. Sen Näiden tietojen perusteella, cut-off-arvo määriteltiin kullekin näistä merkeistä, jonka yläpuolella näyte pidettiin positiivisena.

BCL2, CCNA1

ja

EOMES

ei osoittanut taustaa metylaatio.

positiivisuus määritellään hypermetylaatiota ainakin yksi seitsemästä markkereita, herkkyys kaikissa kasvaimen vaiheisiin oli 80% (152/189) virtsassa sedimenteissä, kun se oli 87% (164/189) suodattimeen näytteissä. Tämä malli oli selvää myös yksittäisiä markkereita, jotka kaikki näkyvät hyvin herkkiä suodattimeen näytteissä (kuvio 5). Merkitsin, jolla on suurin herkkyys oli

VIM2

, joka oli positiivinen 56%: n sedimenttinäytteiden ja 67% suodattimen näytteitä. Kuusi muuta markkereita oli herkkyydet 35-53% sedimenteissä ja 43-62% suodattimissa. Herkkyys korkeamman vaiheen kasvaimet (≥T1) oli yleensä korkea ( 90%) sedimenteissä ja oli vain hieman, joskin jatkuvasti lisääntynyt suodatuksen jälkeen. Erityisesti kuitenkin dramaattinen vaikutus havaittiin huonolaatuisia Ta kasvaimia, jossa herkkyys kasvoi 75% (74/98) sedimentteihin 84% (82/98) suodattimiin (taulukko 1). Niistä 95 primaaristen kasvainten, 80 (84%) havaittiin sedimentin ja 84 (88%) havaittiin suodattimen. Niistä 94 toistuvien kasvainten, 73 (78%) havaittiin sedimentin ja 80 (85%) havaittiin suodattimen.

Näkyy ovat prosenttiosuuksia positiivisissa näytteissä seitsemän DNA-metylaatio markkereita. Viimeinen sarake ( ”kaikki”) näyttää prosentteina näytteiden positiivisia yhden tai useamman markkereita.

Keskustelu

Ei-invasiiviset määrityksiä, joita voidaan tarkasti ja luotettavasti havaitsemaan virtsarakon syöpä on merkittävä vaikutus potilaiden ja terveydenhuollon järjestelmä vähentämällä tarvetta usein, kalliita ja epämiellyttävä kystoskopia. Merkittävää edistystä on tapahtunut tunnistamisessa virtsa-pohjainen biomarkkerit, jotka ovat parempia virtsan sytologia, ja jotkut näistä merkeistä on kehitetty kaupallisiksi testejä. Silti haasteet ovat edelleen saavuttamaan herkkyyden kystoskopian [37] – [39]. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli lisätä herkkyyttä DNA-pohjainen havaitseminen virtsarakon syövän virtsanäytteistä yksinkertaisen suodatuksen menettely, rikastamiseksi syöpäsoluja. Suuressa peräkkäisen kohortin virtsarakon kasvain potilailla, olemme testanneet kaupallinen track-kaiverrettu polykarbonaatti suodatinta, jonka huokoskoko 8 pm ja sitä verrattiin standardi virtsan sedimentin analyysi. Kvantitatiivinen analyysi poikki paneelin seitsemästä DNA: n metylaatio markkereita osoitti merkitsevästi kohonneeseen kasvaimen DNA suodatetaan virtsanäytteistä verrattuna vastaavaan sedimenttejä, mikä viittaa siihen, että suodatin vangitsee virtsarakon kasvainsolujen valikoivasti muihin soluihin virtsassa. Mikä tärkeintä, suodatus menettely tunnistettu useampia näytteitä virtsarakon kasvain potilaiden positiivisina, johtaen kaiken diagnostisen herkkyyden 87% vuonna suodinnäytettä verrattuna herkkyys on 80% vastaavassa sedimenteissä.

Low -laadun, matala-vaihe rakkokasvaimista ovat suurin haaste virtsan perustuva tunnistus lähestymistapoja, kuten standardi sytologia ja FISH, koska nämä kasvaimet ovat yleensä irtoa pienemmät numerot solujen virtsaan [40], [41]. Tämä rajoitus oli ilmeistä myös meidän DNA-lähestymistapaan, jossa herkkyys virtsassa sedimenteissä oli lähes tai yli 90% vaiheessa ≥T1 kasvaimia, kun se oli vain 75% huonolaatuisia Ta kasvaimia. Mielenkiintoista, suodatus virtsanäytteiden lisääntynyt herkkyys huonolaatuista Ta kasvaimia 84%, mikä viittaa siihen, että tämä menettely voi lievittää joitakin vaikeuksia havaitsemisessa näissä kasvaimissa. Niistä yhteensä 189 potilasta tutkittiin, 16 tapausta olivat negatiivisia kaikissa metylaation markkereita sekä suodatin ja Sedimenttinäytteiden ja näistä 13 oli korkea- tai huonolaatuisen Ta kasvaimia. Olemme [20] ja muut [42] ovat aikaisemmin osoittaneet, että osajoukko pinnallisen virtsarakon kasvaimet näyttää alhainen hypermetylaation tapahtumia. Mielenkiintoista nämä kasvaimet sen sijaan näyttää suhteellisen korkeat aktivoimalla

FGFR3

mutaatioita [20] ja näin ollen yhdistelmä metylaation merkkejä ja

FGFR3

mutaatiot voivat lisätä havaitsemisherkkyyden pinnallisten kasvainten diagnostinen asetus [20], [43]. Poistimme analyysimme yhdenlaisia ​​merkki (DNA hypermetylaation) tarjota johdonmukainen ja vertailukelpoinen määrällinen mitta arvioitaessa kaksi menettelyt valmistelua diagnostisten solujen (suodatus ja sedimentaatio), mikä oli tärkein tutkimuksen tarkoituksena. Lisäksi olemme hävittää suhteellisen suuri määrä näytteitä (14%) alhaisen DNA tuotto, joka voisi vaarantaa kvantitatiivisen analyysin. Nämä näytteet voi hyvinkin ovat laadullisesti testattu DNA: n metylaation markkereita diagnostisessa ympäristössä.

Koska jopa 70% potilaista, joilla on ei-invasiivisia virtsarakon syöpä kokevat uusiutumisen, ei-invasiivisia virtsan testit ovat erittäin toivottavia uusiutumisen valvontaan. Puolet potilaista meidän kohortin esitetään toistuvia kasvain, ja tässä ryhmässä, kuten primaarisessa kasvaimia, virtsa suodatus tarjosi suurempi herkkyys kuin laskeutumisen (85% vs. 78%). Nämä tiedot viittaavat siihen, että virtsa voi myös suodatus parantaa diagnoosin virtsarakon syövän uusiutumiseen, jotka voivat olla erityisen käyttökelpoisia, koska toistuva kasvaimia ovat usein pienempiä ja irtoa vähemmän soluja kuin ensisijainen kasvaimia. Kuitenkin tämä menettely ei ehkä lievittää muita rajoituksia DNA: n metylaatio-pohjainen toistuminen valvottava, myös korkea positiivisten määrä keskuudessa kystoskopian-negatiivinen tapauksissa, mikä voi johtua epigeneettiset muutokset normaali esiintyvät uroteeliin (epigeneettisellä näkökenttäpuutoksesta) [44], [ ,,,0],45].

ilmeinen kriittinen parametri kokoon perustuva rikastumista kasvainsolujen biologisista näytteistä on huokoskoko suodattimen. Ihannetapauksessa, huokoset tulisi olla riittävän suuri jättää normaalit solut ja tarpeeksi pieni säilyttämään kasvainsoluja, ottaen huomioon muovattavuuden solujen paineen alla. Aiemmat tutkimukset, joiden tarkoituksena on rikastaa harvinainen CTC veressä suodattamalla todettu, että 8 mm: n huokoskoon suodattimen köyhdytettyä näytteitä 99,9% valkosolujen säilyttäen 85-100% of karsinoomasoluja [25], [46]. Jossa on suurempi huokoskoko (12-14 um), vähemmän leukosyyttien mutta myös huomattavasti vähemmän karsinoomasolut (alas 18%) oli pysyy suodattimen pinnalla [46]. Käyttäen kaupallista track-syövytetty polykarbonaatti-suodatinta, jonka huokoskoko on 8 um, joka on samanlainen kuin suodattimia käytetään näissä aikaisemmissa tutkimuksissa, pystyimme rikastuttaa osa kasvainsolujen virtsanäytteistä.