Krooninen sairaus

tiivistelmä

Positroni tuhoaminen käyttöikä spektroskopia (PALS) tarjoaa suora mittaus vapaa tilavuus mitätön kokoja polymeerit ja biologiset järjestelmät. Tämä vapaa tilavuus on kriittinen selittää ja ymmärtää fysikaaliset ja mekaaniset ominaisuudet polymeerien. Lisäksi PALS on äskettäin ehdottanut mahdollisena välineenä havaita syöpä varhaisessa vaiheessa, luotaa erot subnanometer mittakaavassa vapaa tilavuus väliset tyhjät syöpä- /terveen ihon näytteet saman potilaan. Huolimatta useista tutkimukset vapaan tilavuuden monimutkaisissa syöpäkudokset, ei positroni tuho tutkimuksia elävien syöpä soluviljelmissä on raportoitu. Osoitamme, että PALS voidaan soveltaa tutkimus ihmisen elävä 3D soluviljelmissä. Tekniikka pystyy myös havaitsemaan atomitasolla muutoksia koko vapaan tilavuuden huokosia johtuen biologisia vasteita TGF-β. PALS voidaan kehittää luonnehtia vaikutus eri kulttuurin olosuhteet vapaa tilavuus huokosten kasvatettujen solujen

in vitro

.

Citation: Axpe E, Lopez-Euba T, Castellanos-Rubio A, Merida D, Garcia JA, Plaza-Izurieta L, et al. (2014) havaitseminen Atomic Scale muutokset Free Volume Void koko Kolmiulotteinen peräsuolen syövän Cell Culture käyttäminen positroniannihilaatio Annihilation Lifetime Spectroscopy. PLoS ONE 9 (1): e83838. doi: 10,1371 /journal.pone.0083838

Editor: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, Israel

vastaanotettu: 12 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 17 marraskuu 2013; Julkaistu: 02 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Axpe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: baski Department teollisuusministeriön myönnä. SAI11 /263 – PRODETEC ja Baskimaan opetus-, yliopistot ja tutkimus myönnä. IT /443/10. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vapaa tilavuus huokosten avainasemassa eri mekaanisten ominaisuuksien polymeerien [1] ja dynaamisia prosesseja biologisissa systeemeissä, kuten läpäisevyys pieniä molekyylejä ja levittämistä huumeita solukalvojen läpi [2]. Positroni tuhoaminen käyttöikä spektroskopia (PALS) tarjoaa suoran mittauksen vapaa tilavuus mitätön kokoja polymeerit ja biologiset järjestelmät molekyylitasolla, ja tämä vapaa tilavuus on tärkeää ymmärtää fyysisten ja mekaanisten ominaisuuksien monimutkaisten biomolekulaaristen järjestelmien kollageeni [3], sian silmän linssi [4], rotan aivojen osissa [5] ja ihmisen iholla [6].

Se on hiljattain osoitettu, että PALS on herkkä muutoksille vapaa tilavuus huokosten koko, jotka liittyvät tietyn tyyppisten kasvainten ja pystyy erottelemaan terveen ja syöpä- iho näytteitä samasta potilaasta. Näin ollen, PALS on ehdotettu myös mahdollisena keinona havaita syövän muodostumisen alkuvaiheessa kasvaimen kehityksen [6], [7]. Kuitenkin solukoostumuksesta kudosnäytteiden vaihtelee samasta organismista ja voivat sisältää muutoksia mitätön koot [8].

Oletuksena on, että biologisia vasteita ympäristötekijöihin, kuten solujen erilaistumista ja muutoksia solujen pesäkkeiden rakenne mukana atomitasolla muutokset vapaan tilavuuden mitätön solujen koon, ja että nämä muutokset voidaan luonnehtia PALS. Testata tätä ajatusta, käytimme T84 ihmisen paksusuolen syöpä 3D soluviljelymalli kahdella eri olosuhteissa, joiden seurauksena selvästi

in vitro

monisoluisten järjestämisestä siirtomaita. Soluja kasvatettiin jonkin tyypin I kollageenigeelimatriksissa tai ilman transformoivan kasvutekijän β (TGF-β), fibroblasti johdettu vaikuttava tekijä epiteelisolujen proliferaatiota, erilaistumista, liikkuvuuteen ja T84 solujen erilaistumista. Solut kollageenin muodossa järjestäytymätön 3D soluklusterien sisällä geelejä, mutta kun kasvatettu TGF-β, T84 epiteelisolujen kykenevät järjestämään ja erilaistua selvä fenotyypin, joka muistuttaa suoliston crypts [9]. Osoitamme, että PALS mittaukset pystyvät havaitsemaan atomitasolla muutoksia huokosten koko ihmisen paksusuolen adenokarsinooma 3D soluviljelmissä kehittää ajan mittaan ja kun käsitelty TGF-β.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen paksusuolen adenokarsinooman T84 solulinja (CCL 248, ATCC Rockville, MD, USA) luovutti ystävällisesti professori Markku Maki (Keliakia Study Group, University of Tampere, Suomi). Soluja pidettiin viljelmässä laboratoriossa. Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine F12 ravinteiden seos (01:01) (DMEM-F12 ref 31330), penisilliini-streptomysiiniä (viite 15070) ja natriumbikarbonaattia hankittiin Life Technologies (Espanja). Lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (viite F9665), 10 x RPMI-1640 (viite R1145), trypsiini /EDTA: ta (viite T4049), Triton X-100 (viite T9284), albumim naudan seerumia (ref B4287) ja ribonukleaasi A (ref R6513) saatiin Sigma-Aldrich (Espanja). Rotanhäntäkollageenin I (viite 354236) ostettiin Beckton Dickinson (Espanja). Transformoiva kasvutekijä beeta 1 rekombinantti ihmisen (rhTGF-β, viite 240-B) ostettiin R Normaalin kasvun olosuhteissa keskimääräinen huokostilavuus huippu oli 102 ± 1 Å

3 34 päivää, kun taas kulttuuri TGF-β oli 111 ± 1 Å

3 20 päivää. Kuten kuvassa 2, kun keskimääräinen mitätön koko saavutti maksimi, tämä arvo alkanut laskea asteittain: keskimääräinen mitätön määrä väheni 7% tavanomaisissa olosuhteissa 1 viikko, ja 16% 3 viikon ajan TGF-β olosuhteissa.

sininen käyrä kuvaa kontrolliviljelmiin ja punainen käyrä edustaa käsitellyt viljelmät TGF-β.

keskimääräinen elinikä ja jakelu

o

-PS kolmessa ulotteinen soluviljelmät olivat vastaavasti 2-12% ja 20-120% suurempi kuin kollageenia (taulukko 1). Riippuen kasvua ajankohtana,

o

-PS käyttöikä jakelu TGF-β kulttuureissa oli välillä 0,11 ± 0,08 ns 0,26 ± 0,07 ns suurempi kuin alle stimuloimattomasta kasvuolosuhteissa.

Keskustelu

Olemme osoittaneet, että T84 3D kulttuuri malli mahdollistaa tietyn tutkimuksen vapaan tilavuuden elävissä soluissa PALS. Huomasimme, että PALS havaitsee atomitasolla muutoksia keskimääräinen vapaa-tilavuus mitätön koko ihmisen paksusuolen adenokarsinooma 3D soluviljelmissä ajan. Morfologiset muutokset havaitaan immunofluoresenssimikroskopialla soluviljelmissä eri olosuhteissa ovat varmasti seurausta molekyyli tapahtumia, jotka tapahtuvat solujen ja heijastuvat myös PALS mittauksissa. Vaikka soluviljelmässä kehityshäiriöitä tapahtumia ei voida korreloida suoraan vapaa tilavuus, tulokset viittaavat siihen, että solumuutoksia todellakin heijastuvat nanorakenteiden näiden viljelmien.

o

-PS käyttöikä muuttuu todennäköisesti ilmenevät dynaamisia prosesseja sekä soluviljelmissä (kasvua, jako ja kuolema). Lisäksi TGF-β indusoi solun erilaistumista, ja tämä on acompained lisääntyminen jakelu

o

-PS käyttöikä (ja siten vapaan levyn koko) 3D-soluviljelmissä. Tämä tulos merkitsee suurempaa hajontaa aukon koko näytteissä käsitelty TGF-β verrattuna stimuloimattomiin olosuhteissa. Solukuolemaa voisi osallistua lasku

o

-PS elämiä.

Olemme kynnyksellä PALS sovelluksia monimutkaisten solujärjestelmät, mutta tuloksemme osoittavat, että 3D soluviljelmissä (

o

-PS elinikä mitataan solujen seoksesta ja kollageeni) voi olla hyvä lähtökohta tällaista tutkimusta. Tällä hetkellä PALS sallii vain bulk mittauksia, jotka eivät tarjoa riittävää resoluutio erottamaan

o

-PS elämiä erillisissä soluissa vuodesta koko kulttuuriin. Kuitenkin mitattu kasvu elämissä ja jakaumien on johtua molekyyli- ja rakenteellisia muutoksia, jotka vaikuttavat vapaa tilavuus solujen ja siten, että 3D kulttuurin. Lisäksi PALS on ei-aineistoissa tekniikkaa; se häiritsee ei rakenteen 3D-kulttuurin eikä solun dynamiikkaa. Käytimme Tao-Eldrup mallin polymeerien laskettaessa koot vapaan tilavuuden huokosten päässä

o

-PS elinikä, kuten aikaisemmin tehdä monella PALS tutkimuksissa biologisissa järjestelmissä [3] – [7].

parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus soveltamisen PALS 3D elävät soluviljelmissä ja todellakin lisää mittauksia eri solulinjoissa ja viljelyolosuhteet, jotka muokkaavat erilaisia ​​biologisia parametreja tarvitaan, jotta tämä menetelmä voi olla pidetään potentiaalisesti käyttökelpoinen diagnostinen työkalu ihmisille. Yhdessä kokeellista tutkimusta, tutkimukset osoittavat, onko paikallinen sähkökentät aiheuttama transmembraaninen jännite solut vaikuttavat positron signaalia, tai mitkä osat solun ovat edullisia kohteita positronin tuhoaminen olisi myös sitoutunut. Lisäksi simulaatioiden arvioida sovitus Tao-Eldrup malli (toteutettu vapaaseen volyymin luonnehdinnan polymeerit) monipuolisemmin eloperäisen aineksen on tarpeen.

Kaiken kaikkiaan tämä on ensimmäinen tutkimus soveltamalla PALS varten luonnehdinta eläviä soluja. Tuloksemme osoittavat, että 3D soluviljelmät ovat käyttökelpoisia mitattaessa vapaan tilavuuden elävissä soluissa PALS realistisesti ja hallitusti, ja havainnoimiseen muutosten vapaan tilavuuden mitätön koot soluviljelmissä vuoksi erityisiä tekijöitä (esimerkiksi kasvu aikaa ja TGF-β). Tämä tutkimus on yhtäpitävä PALS tekniikkaa oikea väline luonnehdinta biologisten järjestelmien ja tarjoaisi tietoa syövän tutkimuksen atomien ja molekyylien mittakaavassa.

tukeminen Information

Kuva S1.

suunnittelu ja käyttöönotto näytteen pidin ja positroni lähde soveltamisesta PALS biologisista näytteistä ja nesteitä. Me suunnitella ja valmistaa alumiini näytepitimen mittaamiseen biologisten näytteiden ja nesteitä. Tuikeaineita ja Valomonistimet käytetään tässä työssä pantiin pystyasentoon. Kuvassa pitkittäisleikkauksen näytteen pitimeen (1). Kohdassa (2) kuvaamme näyte täyttämällä alapuolelle haltijalle. In (3), me aseta kapton lähde näytteen yli, istuu alumiinin projektio. Voimme myös nähdä, kuinka

22Na on aikaisemmin talletettu juuri keskellä kapton, joten kaikki positronit tuhota näytteessä, eikä haltijalle. Tämä kapton lähde on oltava vankka, joten käytimme paksumpi kapton folio 75 um osan istuu pidikkeen uloke (Kapton folio B), verrattuna 7,5-um kapton folio A. (4) osoitamme, miten positroni lähde kerrostettu kaksi identtistä neste /biologisia näytteitä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083838.s001

(TIFF)

Video S1.

Konfokaaliset immunofluoresenssimenetelmällä kolmiulotteinen T84 pesäkkeet 7 päivän jälkeen viljelmässä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083838.s002

(AVI)

Video S2.

Konfokaaliset immunofluoresenssimenetelmällä kolmiulotteinen T84 pesäkkeet 17 päivän jälkeen viljelmässä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083838.s003

(AVI)

Video S3.

Konfokaaliset immunofluoresenssimenetelmällä kolmiulotteinen T84 pesäkkeet 7 päivän jälkeen viljelmässä 10 ng /ml TGF-β.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083838.s004

(AVI) B Video S4 .

Konfokaaliset immunofluoresenssimenetelmällä kolmiulotteinen T84 pesäkkeet 17 päivän jälkeen viljelmässä 10 ng /ml TGF-β.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083838.s005

(AVI) B

Kiitokset

Tekninen ja ihmisten tukea, jota SGIker (UPV /EHU, MICINN, GV /EJ, EAKR ja ESR) kiittävät.