Krooninen sairaus

tiivistelmä

helpottamiseksi eturauhassyövän kuvantamisessa kohdistamalla molekyylejä, rakensimme ultraääni nanobubbles yhdistettynä erityinen anti-PSMA (eturauhasspesifinen kalvoantigeeni) nanobodies, ja arvioitiin niiden

in vitro

sitomiskyky ja

in vivo

kuvantamisen tehoa. ”Kohdennettu” nanobubbles, joka oli rakennettu kautta biotiini-streptavidiini-järjestelmä, oli keskimääräinen halkaisija on 487,60 ± 33,55 nm ja suorittaa anti-PSMA nanobody osoituksena immunofluoresenssilla. Mikroskopia paljasti kohdennettu sitoutumisen nanobubbles

in vitro

ja PSMA-positiivisten solujen. Lisäksi ultraäänitutkimus indikaattorit nanobubble kuvantaminen (myös saapumisaika, ruuhka-aikaan, piikin voimakkuus ja parannettu kesto) arvioitiin, että ultraääni kuvantamisen kolmenlaisia ​​eläinten ksenograftien (LNCaP, C4-2 ja MKN45), ja osoittivat, että nämä neljä indikaattorit kohdennettuja nanobubbles näytteillä merkittäviä eroja tyhjä nanobubbles. Siksi tämä tutkimus ei vain esittää uusi lähestymistapa kohdistaa eturauhassyöpä ultrasonography, mutta myös perustan ja menetelmät rakentaa pienikokoisen ja suuritehoista kohdistettu ultraääni nanobubbles.

Citation: Fan X, Wang L, Guo Y, Tu Z, Li L, Tong H, et al. (2015) Ultraääni Nanobubbles kantaminen anti-PSMA Nanobody: Rakentaminen ja soveltaminen Eturauhassyöpä-Kohdennettu Imaging. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10,1371 /journal.pone.0127419

Editor: Serge Muyldermans, Vrije Universiteit Brussel, BELGIA

vastaanotettu: 5. marraskuuta 2014; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Fan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä työ on tuettu rahallisesti National Natural Science Foundation (lupanumeroon: 30970830), Chongqing Science Foundation (lupanumeroon: cstc2012jjB0072) ja Nuorten Science Foundation of Jiangxi Department of Education (lupanumeroon: GJJ12142).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erityinen tunnistaminen eturauhasen syöpä on kliinisesti kiireellinen tehtävä [1]. Tässä suhteessa kehitys ultraääni molekyylikuvantaminen on tarjonnut uuden keinon varhaisen eturauhassyövän diagnoosia. Tämä tekniikka käsittää merkintöjä kuvantamisen yhdisteitä, joilla on erityisiä vasta-aineita tai ligandeja tuottaa kohdennettua ultraäänikontrastiaineita, joka kykenee sitoutumaan spesifisiin kudoksiin tai muutoksia. Laskimoon annon jälkeen nämä molekyylinäytteitä aggregoitua nimenomaan kohdekudoksissa kautta verenkiertoon, jolloin ultraääni-pohjainen erityinen kuvantaminen patogeenisten muutosten molekyyli- tai solutasolla. [2]. Kuitenkin mikronin mittakaavan ultraäänikontrastiaineita (mikrokuplia) käytetään tällä hetkellä tärkeimmät kuvantamistutkimukset halkaisijat ovat 1-10 pm [3,4]. Kasvain Neovaskulaarista rakenteet ovat usein epätäydellisiä, koska kasvain verisuonia on epätäydellinen tyvikalvoissa, puuttuu sileän lihaksen kerrokset ja on huono lymfakiertoa; Näin ollen näitä aluksia näytteille lisääntynyt läpäisevyys verrattuna normaaliin verisuonia, vaikutus, joka on nimetty tehostetun läpäisevyyttä ja retentiotehoa (EPR). Tästä huolimatta läpäisevyys, maksimaalinen verisuonten huokosten halkaisija vaihtelee välillä 380-780 nm, ja teoreettisesti vain hiukkasia 700 nm halkaisijaltaan voi kulkea kasvaimen uudissuonittumisen; Siksi säännöllinen ultraäänikontrastiaineita useinkaan voi kulkea verisuoniston tutkimus kasvainsoluihin ja helpottaa erityisten kasvaimen kuvantamiseen [5,6]. Näiden EPR havaintojen jotkin ryhmät ovat hiljattain rakennettu nanobubbles ja tutkittiin niiden läpäisevyyttä. Nanobubbles valmistettu Yin

et al

. oli keskimääräinen halkaisija on 436,8 ± 5,7 nm ja näytetään passiivinen kasvaimeen kohdistaminen [7]. Alustavissa tutkimuksissa olemme kehittäneet myös kohdistettuja nanobubbles, joiden keskimääräinen halkaisija on 644,30 ± 55,85 nm, joka suorittaa monoklonaalisia vasta-aineita prostataspesifisen kalvon (PSMA) ja tutkittiin kuvantamisen mahdollisuuksia näiden nanobubbles eturauhassyövän nude-hiirissä. Tuloksemme paljasti, että nämä kohdennetut nanobubbles voisi tehostavan ksenograftissa ruuhka-aikaan ja voimakkuuden arvoihin verrattuna tyhjä nanobubbles ja olivat siten omiaan kasvain-kohdennettuja kuvantamisen [8].

Kuitenkin, monoklonaalinen vasta-kohdennettuja nanobubbles on kaksi ilmeistä rajoitukset. Ensimmäinen, hiiren monoklonaalisia vasta-aineita ovat immunogeenisiä ihmisissä. Toiseksi suuret molekyylipainot vasta-hiukkasten komplekseja aiheuttaa pieniä määriä kohdistaminen komplekseja saavuttaa tarkoitettu tavoitteita [9], mikä vaarantaa kuvantamisen tuloksia. Siksi tunnistaminen pienikokoinen vasta-aine, joka on kätevä, suuritehoista ja tunkeutuva on ratkaiseva kasvaimeen kohdennettua molekyylikuvantaminen. Löytö nanobodies [10] edellyttäen, lupaava strategia kehittää uusia ultraääni kohdistettujen nanobubble koska nämä nanobodies ovat pienempiä. Erityisesti IgG2 ja IgG3 (raskas ketju vasta-aineet) peräisin eläimistä Camelidae perheen luonnollisesti puuttuu kevyitä ketjuja ja CH1; nämä ovat pienimmät toiminnallisia hetkellä tiedossa antigeenisia sitovia fragmentteja ja on ominaista alhainen molekyylipainot, kätevä ilme, vakaus ja alhainen immunogeenisyys

in vivo

. Siksi nanobodies ovat lupaavalta suhteen tarkka diagnoosi ja kohdennettuja hoitomuotojen [11-16]. Kuitenkin vain harvat kasvaimeen kohdennettua ultraääni nanobubbles yhdistettynä tiettyyn nanobodies kuvattiin. Tässä työssä kehitimme pienikokoisen ja suuritehoista kohdennettua nanobubble muotoilu, joka kuljettaa anti-PSMA nanobody, todentaa hypoteesi, että nanobody päällystettyjä nanobubbles voi parantaa diagnostista arvoa ultraääni eturauhassyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja eläimiä

LNCaP, joka on tyypillinen ihmisen androgeeniriippuvaisen eturauhassyövän solu, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, joka on alatyypin LNCaP-solulinjan ja ihmisen androgeenista riippumaton eturauhassyöpä-solulinjaa, hankittiin ViroMed Laboratories Johns Hopkins, USA. MKN45, ihmisen mahasyövän solulinja kontrollina, saatiin Kiinan Academy of Medical Sciences Cancer Institute (Beijing, Kiina). Neljän 5 viikkoa vanhoja BALB /c-nu nude-hiiriä (Experimental Animal Center, kolmas Military Medical University) pidetään spesifisissä patogeenivapaissa ympäristön käytettiin alla kuvatulla tavalla. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eläinten eettisen komitean Kolmas Military Medical University.

Western blotting kolmessa solulinjoissa

LNCaP, C4-2 ja MKN45 soluja kasvatettiin logaritmisen, huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), asetettiin jäille ja suspendoitiin 400 ul: aan radioimmunosaostuskokeella (RIPA) proteiini hajotuspuskuria. Seuraavaksi kaikki kasvainsolujen lysaatit siirrettiin 1,5 ml: n putkeen ja sentrifugoitiin 15000 rpm ja 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Saatu supernatantti siirrettiin uuteen 1,5 ml: n sentrifugiputkeen. Bikinkoniini- happo (BCA) kit käytettiin sitten määrittämään proteiinin pitoisuus. Lisäksi, näytteet täydennettiin 5X natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) latauspuskuria, sekoitettiin ja keitettiin 5 minuutin ajan täysin denaturoimiseksi proteiineja. Kolmekymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinin erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo kautta puolikuiva blotting-menetelmällä. Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa puskuria huoneen lämpötilassa 2 tuntia, ja sitten tutkittiin peräkkäin 1: 400 laimennus (2,5 ug /ml), anti-hPSMA monoklonaalinen vasta-aine 4 ° C: ssa yön yli ja 1: 2000-laimennus piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta huoneen lämpötilassa 2 h; membraani pestiin kolme kertaa PBST: llä (PBS, jossa oli 0,1% Tween-20) jokaisen vasta-aineen inkubaation jälkeen.

Generation erityisten ja biotinyloitua nanobody

ekstrasellulaarisen alueen PSMA ensin ilmaistu eukaryoottisissa ihmisalkion munuaisen (HEK) -293-solut, jonka jälkeen rekombinanttiproteiini käytettiin päällystemateriaalin seuloa aiemmin määritettyihin luonnollinen nanobody kirjasto nimetty NA-PDL. Vastaavasti, nanobody faagit, jotka kykenevät sitoutumaan spesifisesti PSMA molekyyli- ja solutason tasot saatiin [17]. Nämä faagit myöhemmin sekvensoitiin, ja seuraavat alukkeet suunniteltiin mukaisesti sekvensointi tulokset: forward-aluke, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (joka sisältää

BamHI

päällä) ja reverse-aluketta, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (joka sisältää

HindⅢ

site ). Polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin sitten käyttäen positiivista fagiklooni templaattina monistamiseen kohdegeenin; Reaktion tuote kloonattiin sen jälkeen

BamHI

ja

Hindlll

kohtiin pET28a: han ekspressiovektorin (Novagen /EMD Millipore, Billerica, MA, USA), joka sisältää kuuden histidiinin tagin. Rekombinanttivektori transformoitiin

E

.

coli

DH5a-kanta. Saatu positiiviset kloonit sekvensoitiin niiden tunnistamiseksi, joilla on oikea sekvenssi; oikeista klooneista transformoitiin

E

.

coli

Rosseta lauseke kannan (DE3; Novagen /EMD Millipore), jolloin korkean ekspressiotason. Ni-agaroosi (Qiagen, Venlo, Alankomaat) käytettiin sen jälkeen puhdistamaan histidiini-nanobody. Seuraavaksi merkitty nanobody liuoksen kanssa biotiini. Yksityiskohtaisesti kaksi milligrammaa sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) oli kokonaan liuotetaan 360 ul: aan steriiliä DDH

2O. Tämä liuos inkuboitiin nanobody 4 ° C: ssa 72 tuntia, mitä seuraa dialyysi 4 ° C: ssa yön yli. UV-spektroskopiaa käytettiin määrittämään vasta-aineen pitoisuudesta. Erityisesti, teoreettinen ekstinktiokerroin päässä sekvenssi nanobody oli 21555 M

-1 · cm

-1, ja absorbanssi 280 nm: ssä mitattiin laskea vasta-aineen konsentraatio kaavan mukaisesti ”Absorbanssi = ε ( ekstinktiokerroin, M

-1 · cm

-1) X väyläpituutta (cm) x pitoisuus (M) ”. Biotiiniligandi kvantifiointi (Pierce /Thermo Scientific) käytettiin laskemiseen biotiini pitoisuudet näytteissä ja tuottavat biotiini /vasta konjugaatio suhde

validointi nanobody affiniteetin kautta entsyymi immunosorbenttimääritys (ELISA)

saamiseksi affiniteetti biotinyloidun nanobody, standardi kompetitiivinen ELISA käytettiin. Jokainen kuoppa mikrotiitterilevyn päällystettiin 1 mM rekombinantti-PSMA-antigeeni, blokattiin 3% naudan seerumin albumiinia (BSA) -PBST huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja sitten huuhdeltiin kolme kertaa PBST: llä. Seuraavaksi 1 nM biotinyloitua nanobody inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa antigeenin konsentraatioilla alueella 0,1 nM 100 uM rinnakkain Eppendorf-putkiin. 30 minuutin inkuboinnin, 90 ui reaktioseokset pantiin kuoppiin antigeenin päällystetyn mikrotiitterilevyn. 10 minuutin inkubaatioajan jälkeen, seokset heitettiin pois, ja kuopat huuhdeltiin PBST: llä. Seuraavaksi 100 ui HRP-streptavidiini konjugoitua-biotiini (Kangwei Century, Peking, Kiina) 1: 2000 laimennosta lisättiin jokaiseen kuoppaan, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa 1 h. Jokainen kuoppa huuhdellaan sitten 5 kertaa PBST: llä, ennen kuin lisättiin 100 ul /kuoppa 3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidiini (TMB) käyttöliuos (Beyotime, Shanghai, Kiina) ja inkuboimalla levyä huoneenlämpötilassa 15 min . Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 50 ui 2 M rikkihappoa kuhunkin kaivoon. Absorbanssi 450 nm: ssä sen jälkeen määritettiin kullekin hyvin. Näin ollen, suurin optinen tiheys (OD)

450 nm olisi havaittu pieninä pitoisuuksina antigeenin. Pitoisuus antigeenin, jossa puolet maksimaalisesta ELISA signaali havaitaan, vastaa dissosiaatiovakio K

D.

valmistelu ja validointi kohdennettujen nanobubbles

sekoitukset, joissa erityinen suhde dipalmitoyylifosfatidyyliko- koliini (DPPC; Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Ruotsi), biotinyloitu distearoyyli fosfatidyylietanoliamiini (Bio-DSPE; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA) ja difenyylifosforyyliatsidia (DPPA; Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Saksa) punnittiin ja kylmäkuivattiin käyttäen pakastuskuivauslaitteessa (Shanghai Pudong kylmäkuivauslaitteet Co, Shanghai, Kiina). Alikvootit nämä seokset laitettiin pulloihin; oktafluoripropaani (C

3F

8) kaasua hitaasti ruiskutetaan korvata ilman päällykset ampulleissa. Ennen käyttöä, sekoitettu liuos, jossa oli 1 osa glyserolia: 9 osaa PBS lisättiin pulloon ja sen jälkeen lämmittämällä 37 ° C: ssa helpottamaan liukenemisen. Valmisteita vaakasuorassa sekoitettiin käänteisesti käyttämällä ST sarja amalgamator (AT M Biomaterials Co., Ltd, Peking, Kiina) kanssa seuraavat erityiset toimintakriteereitä: värähtelytaajuus, ≥4500 /min; tärinän amplitudi, 15 ± 1 mm ja tärinän kesto, 60 s [8]. Nämä valmisteet ovat sitten seistä 4 ° C: ssa, faasien erottumisen helpottamiseksi. Alempi-faasi maitomainen suspensio sentrifugoitiin nopeudella 300 rpm 3 minuutin ajan erottamiseksi biotinyloidun nanobubbles alareunassa alkaen mikrokuplien yläosassa. Seuraavaksi 3 ug avidiini lisättiin per 10

7 nanobubbles, mitä seurasi inkubointi 4 ° C: ssa 1 h. Valmisteita annettiin levätä faasien erottumisen helpottamiseksi; pintakerros sen jälkeen talteen ja sentrifugoitiin 300 rpm: ssa 3 minuutin ajan. Näyte huuhdeltiin kolme kertaa ylimääräisen hallinnollisen avidiiniin. Seuraavaksi 1 ui biotinyloitua nanobody kohti lisättiin 10

7 nanobubbles, mitä seurasi inkubointi, sentrifugoimalla ja huuhtelu poistaa ylimääräisen biotinyloidun nanobody. Tuloksena nanobubbles nimettiin Kohdistetun NB, kun taas nanobubbles ilman vasta-ainetta lisäravinteen nimettiin Tyhjä NB. Hiukkaskoot 2 tuotteet analysoitiin Malvern Zetasizer nano ZS90 analysaattori (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK), ja laskukammiossa käytettiin määrittämään pitoisuudet 2 tuotteita. niiden

in vitro

kuvantaminen vaikutuksia eri pitoisuuksilla tutkittiin agaroosin mallia edellyttäen mekanismin indeksi 0,12 ja voitto 60%.

Sen tutkimiseksi, onko tämä menetelmä voisi olla jota käytetään liittämään biotinyloidun nanobody on nanobubbles, Tyhjä tai Kohdennettu NB inkuboitiin hiiren anti-His-vasta-ainetta 1 tunnin ajan, mitä seurasi sentrifugointi, huuhtelu ja inkubointia pimeässä kanssa fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta 3 tuntia 4 ° C: ssa. Näytteet sentrifugoitiin ja huuhdeltiin poistamaan sitoutumaton sekundäärinen vasta-aine. Sitten näytteet havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) arvioimaan loisteputki sitova.

Nanobubbles ja

in vitro

solusitoutumisen määrityksessä

LNCaP , C4-2 ja MKN45 soluja kasvatettiin logaritmisen sentrifugoitiin ja ympättiin peitinlasit kuoppiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 1,5 x 10

4 solua /kuoppa. Soluja viljeltiin yön yli, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä. Kaksi ryhmää peitelaseja valmistettiin per solu tyyppi; 1 ryhmä, johon oli lisätty 30 ui Kohdennettu NB (1,0 x10

8 /ml) ja toinen Blank NB, jonka jälkeen seoksia inkuboitiin 4 ° C: ssa 3 h. Myöhemmin peitelaseja huuhdottiin kolme kertaa PBS, kuvapuoli alaspäin päälle dioja ja havaittu valomikroskoopilla (Olympus) tutkia nanobubbles. Adheesion prosenttiosuus, joka määritellään prosenttiosuutena solujen merkitty ≥4 suunnattu nanobubbles tietyllä satunnaisesti alalla on laskettu osoittamaan sitoutumisen. Tämä koe toistettiin 4 kertaa.

Nanobubble kuvantaminen eri ksenografteissa

Logaritminen-vaiheen LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa ja C4-2-soluja käytettiin valmistamiseksi solususpensioihin tiheydellä 5 x 10

7 solua /ml; MKN45 mahasyövän solut logaritmisen kasvun vaiheessa valmistamiseen käytettiin solususpensiot 1 x 10

7 solua /ml. Kaksisataa mikrolitraa kutakin solususpensiota jälkeen sekoitettiin 200 ui BD Matrigel (BD Biosciences, USA); saadut seokset inokuloitiin subkutaanisesti osaksi 4-5 viikon vanhoja koiraspuolisia BALB /c-nu nude-hiiriä, joiden paino on 18-20 g. Viisi eläintä käytettiin kunkin ksenograftin kasvaimen tyypistä. Ksenografteja tarkkailtiin päivittäin mikrometrillä, kunnes oli saavutettu tuumoreiden halkaisija oli noin 1 cm.

Tumor-nude-hiiret nukutetaan intraperitoneaalisesti 1% natriumpentobarbitaalia. Kuvantamiseen, pinnat sekä anturin ja kasvaimen peitettiin 5 mm paksuinen kytkentäainetta. 50-mm L12-5 laajakaista lineaarinen ultraääni koetin kytketty iU22 ultraääni-järjestelmä (Philips, Amsterdam, Alankomaat) käytettiin suorittamaan B-moodin ultraääni kuvantaminen ksenografteista. Kun poikkileikkaus vierassiirrännänmallissa oli liiankin, koetin immobilisoitiin jotta set-up on ultraäänitutkimus tilassa (mekaaninen indeksi, 0,12; vahvistus, 90%). Ultrasonography aloitettiin kun kiintopisteen oli sijoitettu kasvaimen keskelle. Kukin testi eläin sai 200 ui Tyhjä tai Kohdennettu NB (3 x 10

7 hiukkaset) häntälaskimon kautta injektio, jonka jälkeen putki huuhdeltiin 100 ui suolaliuosta. Dynaamisia kuvia kerättiin kunnes kasvain alue oli täysin vapaa NB. Lisäksi, 200 ui vastaava määrä muuta tyyppiä nanobubbles ja 100 ui suolaliuosta annettiin samalla tavalla helpottaa ultraääni samoissa olosuhteissa; kuvantamisen kerätyt tiedot samasta nude-hiirissä analysoitiin käyttämällä Qlab8.1 ohjelmistoa (Philips) vertaamaan 4 kuvantamisen parametrit (saapumisaika, ruuhka-aikaan, piikin voimakkuus ja parannettu kesto) on ksenograftissa alueella 2 varjoaineiden. Saapumisaika määriteltiin Kokoluokka injektion loppuun ja ensimmäisen kerran piste, jossa 10% piikin intensiteetti saavutettiin. Parannettu kesto määriteltiin väli 2 aikavälit, missä 10% piikin intensiteetin saavutettiin. Ruuhka-aika määriteltiin väli injektioaikaa ja aika piikin intensiteetti [18].

Tilastolliset analyysit

Statistical Package for Social Science (SPSS) 16.0 ohjelmisto (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) käytettiin suorittamaan tilastolliset analyysit. Kaikki kvantitatiivisen tiedon ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeamat. Kohdistettua NB ja Blank NB ultraääni indikaattoritiedon

in vitro

ja

in vivo

kuvantamisten saatiin ja analysoitiin käyttämällä pariksi otoksen T-testi. Ultraääni indikaattorit nanobubbles, joka kohdistaa 3 ksenografti tyyppiä analysoitiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Histogrammit ja käyrä ei-lineaarinen regressio piirrettiin käyttämällä GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Tulokset

PSMA sen erilaisissa solulinjoissa ja valmistelu PSMA-erityisiä nanobody

Western blotting käytettiin tutkimaan PSMA ilmaisun LNCaP, C4-2 ja MKN45 soluja. Tulokset osoittivat, että yksi näistä solulinjoista, LNCaP-solut ekspressoivat korkean tason PSMA, jonka jälkeen C4-2-solut; MKN45 mahasyövän solut eivät osoittaneet ilmeistä PSMA ilmentymistä (kuvio 1).

LNCaP-soluista ilmensi korkeampaa PSMA kuin C4-2-soluissa, kun taas MKN45 soluja ei esiintynyt ekspressiota.

faagikloonista valittu kautta prokaryoottisia vieritys käytettiin rekombinantin ilmentymisen ja helpottanut hankkiminen His-PSMA-erityisiä nanobody (molekyylipaino 18 kD). Jälkeen biotinyloi- nanobody, UV-spektrometria suoritettiin paljastaa, että vasta-aineen konsentraatio oli 0,59 mg /ml, ja biotiini /nanobody konjugointi oli noin 3,6: 1 mukaan biotiinin määrän kit. Joka perustuu periaatteeseen kilpailevan sitoutumisen, dissosiaatiovakio on yhtä suuri kuin pitoisuus puoli-maksimaalinen arvo ELISA. Siksi K

D biotinyloitua nanobody rekombinantti PSMA oli 519 nM, kun taas ei-lineaarisen regression oli hyvä istuvuus R

2 = 0,978 (kuvio 2).

Käyrä kanssa ei-lineaarisen regression noin pitoisuus recombint PSMA alueella 0,1 nM 100 uM obbtained.

Kohdennettu NB karakterisointi fluoresenssimikroskopialla

nanobubbles ja biotinyloitua nanobody konjugoitiin streptavidiinilla -biotiini. Kevyt mikroskoopilla ja Malvern Zetasizer nano ZS90 analysaattorin käytettiin tutkimaan morfologioita ja halkaisijat Kohdennettu NB ja tyhjä NB ja paljasti, että molemmat näytteillä säännöllinen pallomainen muotoja, ja kohdistettua NB valmiste oli keskimääräinen halkaisija on 487,60 ± 33,55 nm, kun taas tyhjä NB valmiste oli keskimääräinen halkaisija on 445,30 ± 32,96 nm; niiden

in vitro

kuvantaminen vaikutuksia, eli ultraääni signaaleja, ei ollut eroja samana pitoisuutena (P = 0,06, kuvio 3). Immunofluoresenssikoe paljasti myöhemmin, että kohdennetut NB pääsee vihreän fluoresenssin signaaleja mikroskoopilla (kuva 4). Sen sijaan tyhjä nanobubbles, joita ei ole merkitty biotinyloidulla nanobody, ei näytä näennäisen fluoresenssisignaalin, joka ilmaisee, että nanobubbles spesifisesti sitoivat nanobody kautta biotiini-avidiini-vuorovaikutuksia.

Malvern Zetasizer analysaattorin käytettiin tutkia hiukkaskoot. Blank NB (ilman biotinyloitu nanobody) oli keskimääräinen halkaisija on 445,30 ± 32,96 nm (A), kun taas Kohdennetut NB (biotinyloidulla nanobody) oli keskimääräinen halkaisija on 487,6 ± 33,55 nm (B). Eikä ole eroa niiden

in vitro

kuvantamisen samoina pitoisuuksina (C).

mikroskooppinen tarkkailu Kohdennettu NB (A ja B). Rengas kaltaisia ​​rakenteita, joissa on paksut kalvot ovat NB (B). Tulokset osoittivat, että kohdistettua NB voisi konkreettisesti sisällyttää nanobody kautta biotiini-avidiini-vuorovaikutuksia.

sitominen kohdennettuja nanobubbles soluihin

Cell-nanobubble sitova tutkittiin kautta mikroskopialla (kuvio 5). Tavoiteltu nanobubbles kiinni parhaiten LNCaP-soluja, joista kukin palvelukseen keskimäärin 7,27 ± 1,70 nanobubbles, jolloin saatiin tartunta prosentteina 98,00 ± 2,31%, jonka jälkeen C4-2-soluja, joista kukin palvelukseen 5,67 ± 1,61 nanobubbles, jolloin saatiin tarttuvuus prosenttiosuus 92.00 ± 8,64%. Sen sijaan ei ole merkittävää sitoutumista välillä havaittiin nanobubbles ja MKN45 solujen, sitovan taajuudella 0,72 ± 0,87 nanobubbles per solu. Lopuksi, ei ole selvää sitovia välillä havaittiin Blank NB ja kukin 3 eri solujen, mistä on osoituksena vastaava sitova määrä 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 ja 0,68 ± 0,94 per solu, vastaavasti.

valomikroskoopilla, sekä LNCaP ja C4-2 solujen näkyvästi sitoutunut Kohdennettu NB (A ja B), kun taas MKN45 solut eivät sitoudu Kohdennettu NB (C). Mikään 3 tyyppisiä soluja näy näkyvä sitoutumisen Blank NB (D, E ja F). Scale, 5 um.

Ultraääni ksenografti kuvantamisen

Qlab8.1 ohjelmistoa käytettiin analysoida ja vertailla kuvantamisen indikaattorit (saapumisaika, ruuhka-aikaan, piikin voimakkuus ja parannettu kesto) kohdistettua NB ja Blank NBS 3 ksenograftissa ryhmää (kuvio 6 ja taulukko 1). Vuonna eturauhassyöpäksenografteissa (LNCaP ja C4-2), tulokset osoittivat, että piikin intensiteetin arvot (P-arvot, 0,003 ja 0,002, vastaavasti) ja parannettu kestot (P-arvot, 0,001 ja 0,004, vastaavasti) kohdistettua NB merkittävästi korkeampi ja pidempi, vastaavasti kuin Tyhjä NB. Kuitenkin saapumisajat ja ruuhka-aikoina olivat erottamattomat välillä 2 eri nanobubbles. Vuonna ohjaus MKN45 mahasyövän ksenografti- ryhmä, kohdistettua NB ja Blank NB siinä esiintynyt selviä eroja suhteessa 4 indikaattoreihin. Vertailu 3 tyyppisiä ksenograftien suhteen kohdennettuja nanobubble kuvantamisen ominaisuuksia kävi ilmi, että C4-2 ksenografteista eläintutkimuksissa merkitsevästi erilainen piikin intensiteetin arvot, parannettu kestot tuloajat ja ruuhka-aikoina vertasi MKN45 ksenografteista, vastaaviin P-arvot 0,024, 0,007, 0,000 ja 0,050. Lisäksi LNCaP ksenografteista näytetään myös merkittävästi eri saapumisajat ja huippuarvot kun verrattiin MKN45 ksenograftien (P-arvot 0,000 molempien), vaikka jäljellä 2 indikaattorit eivät olleet merkittävästi erilaiset. Siksi käytetään ultraääni kuvantamisen Kohdennettu NB, sekä androgeeniriippuvainen LNCaP eturauhassyövän solut ja androgeenista riippumaton C4-2 soluissa, ilmestynyt suurempi huippuarvot ja myöhemmin saapumisajat kuin valvonta mahasyövän ksenograftien. Lisäksi kun LNCaP ja C4-2 ksenograftit verrattiin, saapumisaika (P = 0,026), ruuhka-aikaan (P = 0,005) ja huippuarvo (P = 0,008) poikkesivat merkittävästi taas tehostettua kesto ei ollut merkitsevästi erilainen (P = 0,261). Kuitenkin pienet erot (vain alle sekunnissa) in saapumisajan ja aika huippuun kahden kasvaimia tai kahdenlaisia ​​varjoaineet eivät ole helppo havaita, joten huippuarvo ja kuvantamisen kesto olisi keskittyä eniten huolta .

Paneelit B, E ja G esittävät klassisen poikkileikkaukset 3 tyyppisiä ksenograftien alle B-mode ultraääni. Paneelit A, D ja H osoittavat sitoutumisen Blank NB on ksenografteissa piikin intensiteetin. Paneelit C, F ja I osoittaa sitoutumista kohdistettua NB on ksenografteissa piikin intensiteettiä. Ultraäänitutkimuksessa kuvat sekä LNCaP ja C4-2 ksenografteissa paljasti, että kuvantamisen intensiteetti oli ilmeisesti suurempi kuin kuvantamisen voimakkuus saavutetaan Blank NB huipulla nanobubble tasolla. Vuonna MKN45 ksenografteissa, kuvantamisen tulokset Kohdennettu NB ja Blank NB olivat vertailukelpoisia huipulla nanobubble tasolla. Kaikista, sininen alueet edustavat exnografts, kun taas punainen ja keltainen alueet esittävät vastaavasti eri kuvantamisen alueilla LNCaP ja C4-2 exnografts.

Keskustelu

Tällä hetkellä eturauhasen syöpä on yleinen ja vakavasti vaarantaa terveyden miehillä, mikä johtaa usein kuolemaan [19,20]. Vaikka peräsuolen ultraääni on tullut rutiinia tutkimus työkalu, joka on tärkeä rooli sairauden koepala, seuranta ja hoito, kliiniset tutkimukset ovat paljastaneet, että tämä menettely on rajoitettu riittämätön herkkyys ja [21-23]. Kehittyvällä alalla molekyylien kaikukuvaukseen integroi ultrasonography, molekyylibiologian ja muut tieteenalojen ja näin lisätään uusi Avenue jonka diagnosoida ja hoitaa kasvaimia; se tarjoaa myös mahdollisuuden eturauhasrokotteita kuvantaminen molekyylitasolla ja vastaavat varhainen diagnoosi [24]. Tällä hetkellä rakentamisen ja suunnittelun eturauhasen syövän kohdistettuja mikrokuplia ovat enimmäkseen keskittynyt kohdemolekyylejä osallisena angiogeneesissä, kuten kohdistettu mikrokuplat jotka kuljettavat verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori tyyppi 2 (VEGFR2) vasta-aine. Tämä muotoilu on 2 ilmeinen haittoja: i) enimmäkseen mikronin mittakaavan varjoaine on huono läpäisevyys ja voi matkustaa ympäri kasvaimen verisuonten tulla välitilat ja siten kohdistaminen kuplat eivät voi suoraan kiinni eturauhassyövän solut; ii) tämä menetelmä on alhainen spesifisyys, joka johtaa kyvyttömyyteen tehdä erityisiä eturauhassyövän kudoksen kuvantamisessa [25]. EPR ponnistus kasvaimia tekee teoriassa mahdollista käyttää nanobubbles molekyylikuvantamisen kasvaimen ekstravaskulaarista matriisi ja kasvaimen parenkyymisoluissa. Aiemmin käyttäen valo- ja elektronimikroskopialla, osoitimme, että nanobubbles joiden keskimääräinen halkaisija on 435,20 ± 60,53 nm voisi kulkea verisuonten endoteelin aukot ksenografteissa, mikä antaa kokeiluluontoisena joka saavuttaa tavoiteltuja kuvantamiseen kasvaimen ekstravaskulaarisesta rakenteita [26]. Samalla tämä menetelmä hyödyntää täysin joitakin ominaisuuksia nanobubbles, kuten suhteellisen suuri pinta-ala, vahva pito kyky ja pitkäkestoisia kuvantamisen

in vivo

.

PSMA on eturauhasen syöpä biomarkkeri jolla on suurempi herkkyys ja spesifisyys kuin muut vastaavat molekyylit. PSMA on erityisen ilmentyy voimakkaasti hormoni-tulenkestävien eturauhasen syöpien ja eturauhassyöpäetäpesäkkeet [27]. Lisäksi ekstrasellulaarisen alueen PSMA, joka käsittää 707 aminohappoa, mahtuu useita antigeenisiä epitooppeja. Siksi PSMA on tullut tutkimuskohteet suhteen immuuni kohdistetun kasvaimen hoitojen ja molekyylien kasvaimen kuvantamiseen [28,29]. Sanna

et al

. konjugoitu urea-pohjainen PSMA estäjä DCL että mikrokuplien vaipan osan poly (maito-ko-glykolihappo-polyetyleeniglykoli (PLGA-PEG), mikä tuottaa kohdennetusti Ultraäänikontrastiainekoostumus, jota käytetään eturauhassyövän solun sitova arviointien

vuonna vitro

[30]. Aiemmissa tutkimuksessa antoi monoklonaalinen vasta-aine oli immunogeeninen, mikä yhdessä suurten molekyylipainojen vasta-paticle komplekseja, johti huonoon kudokseen tunkeutuminen. Näin ollen, sen jälkeen kun laskimoiden annon pitoisuus kohdealueella oli alhainen. Tämä ongelma rajoittaa huomattavasti suurempi kliininen käyttö mikrokuplien kohdennettuja diagnostisia ja kuvantamismodaliteetit. Vaihtoehtoisesti erityisiä pienimolekyylisiä peptidejä käytetään usein molekyylikuvantaminen tutkimuksissa. Vaikka nämä yhdisteet ovat helposti syntetisoida ja niissä pieni molekyylipaino , korkea kudoksen tunkeutumisen ja alhainen immunogeenisyys, niillä on myös ongelmia, kuten lyhyet puoliintumisajat (alttiutta hydrolyysille ja munuaispuhdistuma) ja haihtuvien yhtäläisyyksiä, mikä vahingoittaa merkittävästi vakautta lyhyen peptidin kantavien kohdistettuja nanobubbles. Sen sijaan nanobodies ovat erittäin vakaita ja niillä korkea antigeeni affiniteetit. Lisäksi niillä on hyvin alhainen immunogeenisyys, on osoituksena eläinkokeiden tuloksilla, joissa ei humoraalinen tai solujen immuunivasteita havaittiin toistuvan annon [31]. Siksi eri ominaisuudet nanobodies antaneet vakuuttavia todisteita toteutettavuutta kohdistaminen ja keskittämällä nanobubbles sisällä kohdekudoksissa

in vivo

. Vaikka nanobodies ovat tiettävästi sovellettu molekyylikuvantamisen tutkimuksissa, mukaan lukien joitakin molekyylien isotooppilääketieteen sovellukset [32-34], sovellettaessa tätä tekniikkaa alan ultraäänitutkimus on rajoitettu ultraääni mikrokuplia [35]; tietojemme mukaan muutama tutkimuksia koskien nanobody-leimatun nanobubbles on raportoitu tällä alalla.

Siksi käytimme biotiini-avidiini-järjestelmä yhdistää edut nanobubbles ja nanobody tuottamalla nanobubbles että harbored PSMA nanobody.