Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ingenol-3-angelaatti (I3A) on ei-kasvain edistävät forboliesterillä kaltainen yhdiste tunnistettu mahlaa

Euphoria peplusista.

Samanlaisia ​​kasvaimen edistämään fosboliestereillä, I3A on diasyyliglyserolia (DAG) analoginen, joka sitoutuu suurella affiniteetilla C1 domeeneihin PKCS, värvää PKCS solukalvoihin ja edistää entsyymin aktivointi. Lukuisat syöpälääkkeen toiminta on katsottu johtuvan I3A ja katsoneet I3A vaikutuksista PKCS. Osoitamme tässä, että I3A myös sitoutuu ja aktivoi jäseniä RasGRP perheen Ras aktivaattoreita johtaa vankka korkeus Ras-GTP ja sitoutuminen Raf-Mek-Erk kinaasikaskadin. Vastauksena I3A, yhdistelmä-DNA-proteiinit, jotka koostuvat GFP fuusioitu erikseen täyspitkän RasGRP1 ja RasGRP3 poistettiin nopeasti rekrytoitiin solukalvojen, joka yhdessä suoran sitoutumisen yhdisteen RasGRP n C1 verkkotunnuksen. Kun kyseessä on RasGRP3, IA3 hoito johti positiivinen sääntelyn fosforylaatio T133 ja aktivointi ehdokas sääntelyn kinaasin PKCδ. I3A kohtelu select B non-Hodgkin-lymfooman solulinjojen johtanut määrällisiä ja laadullisia muutoksia Bcl-2-perheen jäsen proteiinien ja apoptoosin induktion, kuten aiemmin osoitettu DAG analogisten bryostatiini 1 ja sen synteettinen analogi pico. Tuloksemme tarjoavat edelleen oivalluksia syövän vastaisen ominaisuuksia I3A, tukevat ajatusta, että RasGRPs edustavat mahdollisia syövän terapeuttisia kohteita sekä PKC, ja laajentaa tunnettu vaihteluväli ligandien RasGRP sääntelyä.

Citation: Song X, Lopez- Campistrous A, Sun L, Dower NA, Kedei N, Yang J, et al. (2013) RasGRPs Ovatko tavoitteet Anti-Cancer Agent Ingenol-3-angelaatti. PLoS ONE 8 (8): e72331. doi: 10,1371 /journal.pone.0072331

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2013; Hyväksytty: 08 heinäkuu 2013; Julkaistu: 21 elokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tutkimus tukivat apurahoja JCS Kanadan Institutes of Health Research (CIHR avustus MOP14630, http: //www.cihr-irsc .gc.ca), kanadalainen Cancer Society Research Institute (CCSRI avustus 018453, https://www.cancer.ca/Research.aspx), Alberta Cancer Foundation (ACF myöntää 26050, https://albertacancer.ca), ja Alberta nerokkuus-Health Solutions (200100408 https://www.aihealthsolutions.ca). Tutkimus myös tukee Intramural tutkimusohjelma Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Project Z1A BC 005270). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

diasyyliglyserolia (DAG) on voimakas toisiolähetti, joka syntyy soluissa vasteena kalvo reseptorin stimulaation fosfolipidiaineenvaihduntaan. DAG ja DAG analogit kuten PMA (forboli 12-myristaatti 13-asetaattia) sitoutuvat perinteisten ja uusien muotojen proteiinikinaasi C (PKC) konservoituneen kutsuttu alue C1. Tämä prosessi vaikuttaa PKC membraanilokalisaatiota ja entsyymi aktivoinnin. Pitkäaikainen altistus DAG analogeja voidaan myös vaikuttaa negatiivisesti PKC-aktiivisuuden kautta aiheuttama entsyymin hajoamista. Jotkut DAG analogit, kuten PMA, ovat voimakkaita kasvainjouduttimet. Muut DAG analogit, kuten prostratin ja bryostatiini 1, ovat ei-kasvainjouduttimet tai voi todellakin estää kasvaimen edistäminen. Lääkkeet DAG analogit, kuten bryostatiini 1 aiheuttavat erilaisia ​​syövän solujen ja immuunijärjestelmän moduloivia vaikutuksia. Perustuen rohkaisevia prekliiniset tiedot, bryostatiini 1 on tehty laajoja syövän kliinisissä kokeissa (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=bryostatin).

Toinen lääkkeiden DAG analoginen kliinistä merkitystä on ingenol -3-angelaatti (I3A). I3A todettiin aktiivisen aineen mahlaa

kolmisädetyräkki

, joka on ollut käytössä perinteisessä lääketieteessä, kuten hoito ihosyöpien [1]. Pep005, paikallisesti levitetystä muotoilu I3A, kehitetään voimakkaasti arvioitu kliinisissä tutkimuksissa (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pep005 pg=2). Pep005 on osoitettu olevan tehokkaita hoidettaessa aktiininen keratoosi [2], ja kehitetään hoitoon tyvisolusyöpä ja okasolusyöpä [1]. Eri kokeellisissa malleissa, I3A voi indusoida kasvainsolun ensisijainen kuolion [3], apoptoosin [4] ja vanhenemista [5]. Kasvain solunulkoisen syöpälääkkeen vaikutuksia I3A kuuluu häiriöitä verisuonien [6], rekrytointi tuumorisidistä neutrofiilien [7] ja sytotoksisten T-solujen kasvain taantuu toimintaa [8]. I3A sitoutuu puhdistettu klassista ja uusia PKC-isoformit

in vitro

[9]. I3A hoito viljeltyjen solujen aikaan nopean siirtämisen näiden entsyymien solukalvoihin [9]. Niinpä jotkut biologisten vaikutusten todennäköisesti syntyvät I3A aktivointi PKCS elävissä soluissa.

Vaikka varhain tutkimuksen DAG ja DAG analogit keskittynyt niiden sääntelyä PKC perheenjäsenten, nyt on selvää, että muita perheitä proteiinien esiintyy homologisten DAG sitovia C1 aloilla ja että nämä perheet palvelevat kriittisiä biologisia rooleja [10], [11]. RasGRPs ovat positiivisia säätelijöitä pienen GTPaasi Ras. Chimerins toimivat alipaineensäätöventtiileillä pieni GTPaasi Rac, joka säätelee aktiinisytoskeletonin. MRCK (lihasdystrofia kinaasi liittyviä Cdc42 sitova kinaasi) signaalit alavirtaan pienten GTPaasi Cdc42, valvontaan filopodia muodostumista ja vaikuttaa kasvaimen invaasio. Munc13 perheenjäsenet säännellä synapsirakkulan membraanifuusioaktiivisuuden ja synaptic toiminta. Proteiinikinaasi D perheenjäseniä avainasemassa solujen lisääntymistä ja elinkelpoisuus. DAG kinaasien muuntaa DAG on fosfatidihappoa, lieventävien signalointi kautta edellä DAG reagoivan proteiinin perheitä sekä mahdollisesti parantaa fosfatidihapolla vastanneilla signalointireitteihin. Ymmärtäminen valikoivuus terapeuttisten aineiden kohdennettu DAG sitovaan C1 domeenien näitä muunkinlaisia ​​DAG sitovien proteiinien on siis tärkeää ymmärtää niiden terapeuttista potentiaalia ja niiden vaikutusmekanismeja.

korkean tason ilmentymistä RasGRP1 ja RasGRP3 näyttää rajoitettua kudosjakaumastaan ​​merkittävässä ilme lymfosyyteissä [12]. Yhä useammat todisteet tukevat oletusta, että keskeinen rooli näiden proteiinien on toimia alavirtaan immuuni reseptorien B- ja T-solujen [12]. Immuunijärjestelmän reseptorin stimulaatio johtaa fosfolipaasi C: n aktivoitumista ja DAG kertymisestä kalvoja. DAG vaikuttaa RasGRP1 ja RasGRP3 kahden koordinoidun mekanismeja. Ensinnäkin C1 domeenit RasGRP1 ja RasGRP3 sitoutuvat DAG ja forboliesterin [13], [14], mikä aiheuttaa RasGRPs rekrytoitaville solukalvoihin missä he kohtaavat heidän alustaan, lipidoitujen Ras. Poistetaan C1 domain aiheuttaa menetyksiä forboliesterin reagointikykyä [15]. Lisäksi, RasGRP1 ja RasGRP3 tehdään aktivoivan fosforylaation PKC, itse aktivoida DAG [16] – [19]. Ras aktivaatio RasGRPs on tärkeää tymosyyttien erilaistumisen, T-solun efektoritoiminnan ja lymfosyyttien homeostaasin [12]. RasGRP4, kuten RasGRP1 ja RasGRP3, myös todennäköistä sitoo DAG ja aktivoi Ras [20], [21], vaikka asetus PKC ei ole dokumentoitu. RasGRP4 osoittaa näkyvästi ilmentymistä syöttösolut [21], mutta on myös todettu muissa myelooista suvusta ja varhaisen tymosyyttien [22], [23].

Olemme väittäneet, että RasGRPs voisi olla toteuttamiskelpoinen lääkekohteita jotka voitaisiin manipuloida DAG analogeja kliinisesti hyödyllisiä päihin [24]. Erityisesti, me olemme osoittaneet, että valitsemalla johdetut solulinjat tietyt B-non-Hodgkin-lymfooma (B-NHL) läpikäyvät apoptoosin RasGRPs stimuloidaan DAG analogit, kuten bryostatiini 1 tai synteettinen analogi ”pico”. Aluksi keskityimme DAG analoginen aiheuttaman apoptoosin solulinjasta Toledo, joka todennäköisesti oli seurausta siitä, germinaalikeskuksen johdettu maligniteetti. Olemme osoittaneet, että apoptoosin tapahtunut 48 tunnin kuluessa ja mukana pro-apoptoottisen fosforylaation BH3-vasta-proteiinin Bim kautta RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk-reitin [25]. Viime aikoina olemme keksineet toinen mekanismi indusoiman apoptoosin, joka nähtiin Burkittin lymfooman (BL) -johdannainen solulinjaa, BL-2 ja 5 6 Manttelisolulymfooman (MCL) -johdannainen solulinjat [26]. Useimmat näistä solulinjoista olivat Bim puutteesta ja apoptoottisen mekanismin liittyi sen sijaan määrällisiä muutoksia muissa Bcl-2-perheen jäsentä: ilmaus proapoptoottisten BH3-vasta perheenjäsenen Bik yleisesti kasvanut ja antiapoptoottinen jäsentä Bcl -XL ja Mcl-1 väheni. Tämä toinen mekanismi eteni paljon hitaammin kuin on havaittu Toledo soluissa.

Tässä osoitamme, että RasGRPs ovat tavoitteita I3A viljellyissä soluissa. Lisäksi I3A hoito edustavan B-NHL solulinjojen aktivoi kaksi dokumentoitu RasGRP kytketty johtavien mekanismien apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymän Health Sciences eläinten suoja ja hyvinvointia käsittelevät yliopiston Alberta mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care suuntaviivoja.

reagenssit

Ingenol-3-angelaatti ostettiin Calbiochem (La Jolla, CA) ja liuotettiin DMSO: hon 1 mM. Massa laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen 100 nM väliaineessa, ellei toisin mainita, ja niitä verrattiin DMSO vastaavasti laimennettuna. Mek inhibiittorit ja reagenssien tutkimiseen apoptoosin kuvattiin aiemmin [25], [26]. PMA oli LC laboratorioiden (Woburn, MA), Gö6983, proteaasi cocktail asettaa 1 ja NP-40 oli Calbiochem (Billerica, MA).

Cell Culture

Rat2 solut muokattu ekspressoimaan retrovirusvektorin pBabePuro tai vektorin sisältävät johdannaiset koodaavat cDNA: t RasGRP1, RasGRP3 tai RasGRP4 kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Rat2-soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, jota oli täydennetty penisilliinillä, streptomysiinillä ja glutamiinilla (Gibco, Burlington, ON, Kanada). Ihmisen lymfooma solulinjoja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), kuten edellä. Alkuperä solulinjat on julkaistu [25], [26]. Ramos-B-solulinja, LNCaP eturauhas- solulinja ja HEK-293-soluja, jotka ilmentävät GFP-RasGRP3 [28] kasvatettiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 2 mM glutamiinia (ATCC, Manassas, VA).

hiiret

Rasgrp1 – /-

hiirissä on kuvattu aiemmin [27] ja ylläpidettiin C57BL /6J-tausta. C57BL /6J-hiiriä käytettiin villityypin kontrolleihin.

I3A in vitro sitoutumisen tutkimukset

sitomisaffiniteetit I3A että RasGRP1 C1 domain ja RasGRP3 määritettiin edellä kuvatulla [13], [ ,,,0],14]. Inkubaation lämpötila, optimoitu stabiilius Proteiinien sidonta olosuhteissa, oli 37 ° C: ssa RasGRP1 C1-domeenin ja 18 ° C: ssa RasGRP3.

analyysi proteiinien immunoblottaus

Analyysi aktiivisten ja yhteensä Ras, pErk1 /2, Erk1 /2: n ja Bcl-2-perheen jäsenten, ellei toisin ole mainittu, on selostettu aikaisemmin [25], [26]. Analysoida RasGRP3 fosforylaation, Ramos-soluja käsiteltiin PMA, I3A tai DMSO-kontrollin ajoneuvon kuten 30 minuuttia, minkä jälkeen ne otettiin talteen lyysipuskurissa (1% NP-40 PBS: ssä, jossa proteaasiestäjäseostabletit asetettu 1). Joissakin tapauksissa soluja esikäsiteltiin 30 min pan-PKC-inhibiittorin Gö6983 (5 uM). Immunoblottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28] käyttämällä seuraavia vasta-aineita: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling, # 3334), PKCδ (Santa Cruz, sc-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Cell Signaling, # 9106), Erk1 /2 (Cell Signaling, # 9102), β-Actin (Santa Cruz, sc-47778). Kehittämisen jälkeen signaaleista ECL (tehostettu kemiluminesenssi), kalvot skannattiin ja kvanti- signaalin suoritettiin käyttäen ImageJ (National Institutes of Health).

konfokaalimikroskopia

translokaatio GFP- RasGRP1 LNCaP-soluissa arvioitiin, kuten on kuvattu [29]. 60000 LNCaP-soluja maljattiin ibidi μ-annoksia (Ibidi LLC, Verona, WI), ja sitten transfektoitiin 48 h myöhemmin GFP-merkityn RasGRP1 koodaavan plasmidin käyttäen Lipofectamine-reagenssia yhdessä Plus mukaisen reagenssin valmistajan (Invitrogen, Carlsbad, CA ) suosituksia. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 1000 nM PMA tai I3A in confocal väliaineessa (Dulbeccon Modified Eagle Medium ilman fenolipunaista lisätty 1% FBS), ja time-lapse kuvia kerättiin 30 s välein käyttämällä Zeiss AIM ohjelmisto. Imaging oli Zeiss LSM 510 tai Zeiss LSM 710 konfokaalimikroskopia järjestelmä (Carl Zeiss, Inc.), jossa on Axiovert 100 M -käänteismikroskoopissa toimivat 25 mW argon laser viritetty 488 nm. 63 × 1,4 NA Zeiss Plan-Apochromat öljy-immersio-objektiivi käytettiin yhdessä vaihtelevalla zoomaa (1,4 2X). Luodaan vektori Näiden tutkimusten hRasGRP1 (NM-005739) insertoitiin pQB125-FN1 vektorin klassisen kloonausta käyttäen

Nhel

I restriktioentsyymipilkkominen. DNA-sekvenssit konstruktit varmistettiin sekvenssianalyysillä (DNA, Minicore, CCR, NCI, NIH).

Kalvo fraktiointi

HEK-293-soluja, jotka ilmentävät GFP-RasGRP3 [28] käsiteltiin PMA tai I3A (1000 nM tai 100 nM) 30 minuutin ajan tai DMSO vehikkelikontrollina. Lopussa hoidon jälkeen solut pestiin PBS: llä, poistettiin levyt kaapimalla ja pelletoitiin sentrifugoimalla alhaisella nopeudella (5000 rpm 5 minuutin ajan jäähdytetyssä Eppendorf-mikrosentrifugissa). Solut sonikoitiin (3 x 6 s) PBS: ssä, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta asettaa 1 ja sitten sentrifugoitiin alhaisella nopeudella, kuten edellä poistamiseksi ehjänä soluja. Alikvootit tätä supernatanttia edustavat ”koko proteiini” oli varattu analyysiä. Loput supernatantista altistettiin sitten korkean nopeuden sentrifugaatiolla (100000 x g 1 tunnin ajan), jolloin saatiin supernatantti ”sytoplasminen osa”. Nopea pelletti pestiin, liuotettiin 1% Triton-X-100, ja pesuaine-liukenematon materiaali poistettiin high-sentrifugoinnilla, kuten edellä. Saatu lopullinen supernatantti edustaa ”membraanifraktiota”. Fraktiot koko, soluliman ja kalvon proteiinit SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja immunoblottauksella, yhtä proteiinia ladattiin kuhunkin kaistaan.

Apoptosis and Cell Proliferation määritykset

Menetelmiä tutkimalla lääkkeen indusoiman apoptoosin ja MTT-määritystä varten elävien solujen kertymisestä on julkaistu [26].

tulokset

Sitovat I3A jotta RasGRP1 ja RasGRP3 in vitro

sekä RasGRP1 ja RasGRP3 C1 verkkotunnuksia aiemmin osoitettu sitoutuvan DAG analogit mukaan lukien forboliesterit [13], [14]. Mallinnus osoittaa, että ingenol 3-estereistä sitoutuvat C1 verkkotunnuksia samalla tavalla forboliesterit ja DAG [30]. Näin ollen meidän arvioitiin sitoutuminen I3A käyttäen kompetitiomäärityksessä käyttäen [

3H] forboli 12,13-dibutyraa-, kun läsnä on 100 ug /ml fosfatidyyliseriiniä (taulukko 1). RasGRP1 (C1 domain) ja RasGRP3 (täyspitkä) sidottu I3A 2- ja 9- kertaa suurempi affiniteetti, vastaavasti, kuin ne sitovat forboliesteri PDBu. Verrattuna PKC-a, RasGRP1 ja RasGRP3 sidottu I3A noin samanlaisia ​​kantoja, mikä osoittaa, ettei valikoivuuden näiden kahden perheiden tavoitteita, ainakin

in vitro

.

I3A Aktivoi RasGRPs in Viljellyt fibroblastit ja Jurkat T Cells

Rat2 fibroblastit eivät havaittavasti nimenomaista endogeenistä RasGRPs. Näin ollen, Rat2 ekspressoimaan muokatut solut yksittäisten RasGRPs, verrattuna soluihin, joita on muokattu ilmentämään tyhjän vektorin, tarjota kätevä järjestelmä määrittää, onko DAG analoginen voi aktivoida RasGRPs. Verrattuna soluihin, jotka ilmentävät tyhjän vektorin, Rat2 solut, jotka ilmentävät RasGRP1 osoitti vahvaa Ras aktivoinnin arvioitiin käyttämällä pull-down-määritys, että talteen Ras-GTP sitoutuneen Ras-sitovan domeenin Raf1 (Fig. 1A). I3A oli yhtä tehokas kuin PMA tässä määrityksessä. Samoin ilmaus RasGRP3 vuonna Rat2 soluissa siirrettävä kykyä aktivoida Ras vastauksena sekä DAG vastineita (Fig. 1 B). Jurkat T-solut ilmentävät endogeenisesti RasGRP1 muttei huomattavia määriä RasGRP3 tai RasGRP4. I3A hoito toistettavasti esiin toistettavissa Ras aktivaation Jurkat-T-soluissa, samanlainen kuin PMA (Fig. 1 C).

. Viljelmiä Rat2 muokatut solut joko tyhjällä vektorilla tai RasGRP1 cDNA-ilmentävällä vektorilla käsiteltiin l3A: n tai PMA: ssa 10 minuuttia ja vertailuryhmän viljelmät käyttäen Ras-GTP pull-down-määrityksessä. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. B. yksi kokeessa Rat2 soluja, jotka ilmentävät RasGRP3 cDNA analysoitiin samalla tavoin. C. Jurkat T-solut analysoitiin DAG analogisten aiheuttaman Ras-aktivaation kolmen erillisen kokeen. D. sama määrä C57BL /6J (WT, villityypin) ja

Rasgrp1

– /- (KO, tyrmäys) tymosyyttejä käsiteltiin DMSO (negatiivinen kontrolli), I3A tai PMA kuten 10 minuuttia ja proteiini lysaatit verrattiin käyttämällä fosfo-Erk signaloinnin määrityksessä. Tulokset edustavat päällekkäisiä kokeita. Kvantitointi suhteita RasGTP /Ras tai p-Erk1 /2 /Erk1 /2 on esitetty alla yksittäiset paneelit.

aiemmin osoitti RasGRP1 oli välttämätön DAG analogisten aiheuttama aktivointi Ras hiiri tymosyyttejä;

Rasgrp1

– /- tymosyyttejä olivat täysin viallinen, kun villityypin (C57BL /6J) tymosyyttien osoitti vahvaa Ras aktivointi [27]. Koska meillä oli rajoitettu määrä soluja, käytimme herkempää fosfo-Erk määritys korvikkeena Ras aktivointia. Kuten odotettua, mutantti tymosyyttien osoittivat paljon vähentynyt signalointi ERK jälkeen joko PMA tai I3A hoitoon (Kuva. 1 D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että I3A, kuten PMA, voi aktivoida RasGRP1 ja RasGRP3. Suuri pohjapinta Ras-GTP tason käsittelemättömissä soluissa turhautunut samanlaisia ​​kokeita, joiden tarkoituksena on arvioida RasGRP4 sisään Rat2 soluissa. Kuitenkin käyttämällä solumorfologiaan määritys keräsimme epäsuoria todisteita, että I3A ja PMA kukin voi aktivoida RasGRP4 sisään Rat2 soluissa. RasGRP4 ilmentäviä Rat2 soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan PMA: lla tai I3A oletetaan transformoidun morfologia, kuten aiemmin on kuvattu RasGRP1 ilmentävien Rat2 soluihin [15]. Tätä vaikutusta ei havaittu tyhjällä vektorilla soluja tai käsittelemättömiä RasGRP4 ilmentäviä Rat2 soluja (tietoja ei esitetty).

DAG analogit aktivoida RasGRPs PKC-välitteisen fosforylaation sekä suoran rekrytointia solukalvoihin [16] – [19]. Käyttäen Ramos B-solulinjaa, päätimme annoksen riippuvuutta I3A ja PMA indusoimiseksi fosforylaatioon endogeenisten RasGRP3 on T133. Samanaikaisesti, tutkimme sekä aktivoinnin PKCδ, joka voidaan arvioida sen tilasta fosforylaation S299 [31], samoin kuin alavirran vaste Erk-fosforylaation. Sillä kinaasien kuten PKC joihin sovelletaan allosteric ja sijoitteluun sääntely, mittaukset aktiivisuutta eristetyn kinaasin eivät ole luotettava mittari tason

in vivo

toimintaa. Sillä PKCδ, fosforylaation S299 näyttää raportoi ligandin riippuvainen aktivaatio [31]. Valitettavasti vasta-aineet eivät ole kaupallisesti saatavilla fosforylaatiopaikat heijastaa aktivaation muiden PKC-isoformien, erotuksena monista vasta raportointi fosforylaatioon PKCS at aktivointi silmukka, käännä aihe, ja hydrofobinen aihe. Nämä jälkimmäiset kohdat ovat mukana kypsymisen PKC jolloin se kykenee aktivoituu ligandin sitoutumisen. Siksi vain tarkasteltiin aktivoitumisen PKCδ vastauksena I3A ja PMA. Muut PKC-isoformit raportoitu Ramos-solujen sisältävät PKC-a, β, ε, ja θ [32].

Tässä solussa järjestelmässä, havaitsimme, että I3A ja PMA näytti suunnilleen yhtä potencies aktivoinnin PKC δ ja Erk ( kuva 2A). RasGRP3 fosforylaation T133 oli havaittavissa hieman alhaisempi pitoisuus joko ligandin, mikä viittaa siihen, muiden PKC-isoformien lisäksi PKCδ. Vahvista osallistuminen PKC vuonna RasGRP3 fosforylaatioon, selvitimme kykyä yleisen PKC estäjä Gö6983 estää näiden fosforylaatiotapahtumien (Fig. 2B). Kun itse esikäsittely Gö6983 oli vain vähän vaikutusta. Sen sijaan hoitovaste kanssa I3A tai PMA dramaattisesti vähentynyt. Erityisesti, fosforylaatio RasGRP3 on T133 lähes täysin poistettu, sopusoinnussa inhibition PKCδ fosforylaation, kuten loppupään vastaus Erk-fosforylaation. Samoin Jurkat T-solut pannulla PKC estäjä bis-indolemaleimide I poisti loppupään vastaus I3A ERK-fosforylaation (kuvio. 2C). Lisäksi olemme vahvistaneet, että tämä PKC estäjä suuresti vähentynyt muodostuminen Ras-GTP vastauksena I3A, suoraan osoittaa, että vaikutus I3A on Erk fosforylaatioon oli ylävirtaan Ras ja yhdenmukaisia ​​tunnetun vaatimuksen PKC aktivaatio RasGRP1 lisäksi koskevaan vaatimukseen ligandin sitoutumista RasGRP1 C1 verkkotunnuksen [15], [18], [19].

. Ramos-soluja käsiteltiin 30 minuuttia osoitettujen konsentraatioiden l3A: lla tai PMA seuraa analyysi solulysaattien immunoblottauksella. DMSO osoittaa ajoneuvon ohjaus. Pylväät osoittavat määritysrajan (keskiarvo ± SEM) tulokset kolmesta itsenäisestä kokeesta. Edustava immunoblottaus on kuvitettu. On huomattava, että vaikka RasGRP3 vasta-aine ei ole suunnattu RasGRP3 fosforylaatiokohdan, se jatkuvasti saadaan noin signaalin kasvun olosuhteissa RasGRP3 fosforylaation. B. Ramos-soluja käsiteltiin 3 nM I3A tai PMA, joissakin tapauksissa esikäsittelyn jälkeen Gö6983 (5 uM 40 min), ja analysoitiin kuten edellä. Pylväät osoittavat määritysrajan (keskiarvo ± SEM) tulokset kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Edustava immunoblottaus on kuvitettu. Ylimääräinen koe suoritettiin samanlaisissa olosuhteissa saatiin samanlaisia ​​tuloksia. C. Jurkat-T-soluja stimuloitiin yhdessä kokeessa, jossa I3A 10 min kanssa tai ilman 10 minuutin esi-inkuboinnin pan-PKC-inhibiittorin bisindolymaleimide I (4,6 uM), jota seurasi analyysi Ras-GTP, yhteensä Ras, pErk1 /2 ja yhteensä Erk1 /2 tasoa.

I3A aktivoi RasGRPs in Select B-NHL solulinjojen

aiemmin osoittaneet, että DAG analogit kuten bryostatiini 1 ja synteettinen analogi pico voisi aktivoida RasGRPs B-NHL-solulinjoja, jotka on luonnehdittu herkkä apoptoosin induktion näiden samojen yhdisteiden [25], [26]. Vakiinnutettuaan yläpuolella I3A toimi DAG analoginen päällä RasGRP1 /3, halusimme tutkia tarkemmin kyky tämän yhdisteen saamaan aikaan Ras aktivaation edustaja DAG analoginen herkkä B-NHL solulinjoissa. Lyhyt hoito BL2 (Burkittin lymfooma), Jeko-1, Z138 (molemmat Manttelisolulymfooman) ja Toledo (germinaalikeskuksen lymfooma) johti vahvaa aktivoituminen Ras (Fig. 3).

Vuonna yksi kokeilu, soluja käsiteltiin 100 nM I3A tai DMSO ohjaus 10 minuuttia, jonka jälkeen analyysi Ras-GTP kiinnitysanalyysillä määrityksessä. Suhde Ras-GTP /Ras kvantitoitiin.

I3A hoito Syyt Solunsisäinen Uudelleen jakelu RasGRP1 ja RasGRP3

DAG analogit sitoutuvat hydrofiilinen halkeama C1 domain, täyttämällä hydrofobisen pinnan ja siten ajo kalvo insertion DAG analogisten – C1 verkkotunnuksen monimutkaisia ​​[33]. DAG ja DAG analogit siten osaltaan RasGRP aktivaatio osittain aiheuttamalla näiden proteiinien uudelleen sijoittaa solukalvoihin jossa he voivat fyysisesti vuorovaikutuksessa lipidimuodossa Ras [34]. Siksi tutkittiin kykyä I3A aiheuttavan proteiinin uudelleenjako käyttäen sekä

in situ

ja subsellulaarifraktiointikokeet lähestymistapoja.

in situ

tutkimuksissa GFP-RasGRP1 ilmentyi LNCaP solut. Hoidon jälkeen I3A tai PMA, muutokset solunsisäisessä rakenteessa leimatun proteiinin visualisoitiin konfokaalimikroskopialla. LNCaP-solut valittiin, koska niiden hyvin levinnyt morfologia helpottaa kuvantaminen. Ne on helppo transfektoimaan ja olemme saaneet laaja kokemus vaikutuksista eri forboliesterien PKC translokaatio tässä järjestelmässä [29]. Ennen hoitoa, GFP-RasGRP1 jaettiin koko sytoplasmassa (Fig. 4). Kun PMA (1000 nM) Lisäksi, GFP-RasGRP1 kulkeutua solukalvoon 2 minuutin kuluessa. I3A samoin indusoi nopean toiminnan, mutta kuvio oli hyvin erilainen, jossa lausutaan klusterointi sisäisissä paikoissa.

Solut ilmentävät GFP-RasGRP1 hoidettiin 1000 nM PMA tai I3A. Translokaation kuvio tutkittiin elävien solujen ajan funktiona. Tulokset päällekkäisiä kokeita I3A näkyvät. Näissä kuvissa edustavat neljää itsenäistä koetta. Mittakaavapalkki edustaa 10 um.

Koska täydentävä lähestymistapa, esitimme GFP-RasGRP3 HEK-293-soluista, käsiteltiin I3A tai PMA, altistetaan solut subsellulaarifraktiointikokeet, ja tutki muutokset jakelu GFP-RasGRP3 välillä sytoplasminen ja kalvon fraktiot (Fig. 5). GFP-RasGRP3 havaittiin sekä vastaan ​​kohdistettu vasta RasGRP3 sekä itse vasta-aineen kanssa vastoin GFP-tag. Vertailun vuoksi tutkimme myös muutoksia jakeluun endogeenisen PKCδ.

HEK-293-soluja, jotka ilmentävät GFP-RasGRP3 käsiteltiin 30 minuuttia PMA: lla tai I3A ilmoitettuina pitoisuuksina. Solusonikaateista saatettiin subsellulaarifraktiointikokeet ja tasot PKCδ ja RasGRP3 analysoitiin immunoblottauksella. Sillä RasGRP3, ekspressiota havaittiin sekä anti-RasGRP3-vasta-aineen ja vasta-aine GFP tag. Pylväät osoittavat määritysrajan (keskiarvo ± SEM) tulokset kolmesta itsenäisestä kokeesta. Edustava immunoblottaus havainnollistetaan.

Hoito I3A indusoi selvästi lisääntynyt taso GFP-RasGRP3 talteen membraanijakeen, havaitaan joko vasta-aineella, joka muistuttaa vaste havaitaan PMA. Menetys GFP-RasGRP3 päässä solulimafraktio oli vähemmän ilmeinen, mutta nämä tulokset tulisi lieventää havainto, että proteiini havaitaan proteiinin kokonaismäärän näyte lievästi koholla DAG analoginen Käsitellyt näytteet, tuntemattomista syistä. Samassa kokeessa, sekä I3A ja PMA indusoi uudelleenjako PKCδ membraanin osa.

I3A Treatment Vaikuttaa Bcl-2 proteiinit Select B-NHL Cell Lines

Aiemmissa tutkimuksissa vertasimme DAG analoginen herkän solulinjan Toledo RL, joka on DAG analoginen kestävästä germinaalikeskuksen tyypin B-NHL solulinjassa [25]. Me kertoi, että indusoiman apoptoosin DAG analogeja Toledo B-NHL-soluissa oli riippuvainen proapoptoottisten BH3-vasta-proteiinia Bim [25]. Toledo B-NHL-solujen hoito bryostatiini 1 tai pico johti RasGRP-Erk signalointi ja fosforylaatiota Bim pro-apoptoottinen sivusto, joka on yhteinen sekä BimEL ja BimL liitos muotoja. Osoitimme myös, että anti-apoptoottinen fosforylaatio sivustoja ainutlaatuinen BimEL johti tehokkaaseen proteolyysin proteosomin riippuvalla tavalla DAG analogisen vastustuskykyisten solulinjan RL. Kuitenkin tämä antiapoptoottisia mekanismi oli vähemmän ilmeinen Toledo. Nykyinen tuloksia I3A osoittavat täsmälleen samaa kaavaa: BimL oletetaan alentuneen elektroforeettinen liikkuvuus, joka osoittaa fosforylaation jälkeen I3A kohtelu sekä RL ja Toledo (Fig. 6A). I3A myös herättänyt fosforylaatiota BimEL sekä RL ja Toledo. Kuitenkin BimEL alassäätöä Toledo oli suhteellisen tehoton jälkeen I3A hoidon (Fig. 6A), aivan kuten olemme havainneet aiemmin bryostatiini 1 ja pico [25].

Määritettyjä solulinjoja hoitamatta tai käsitelty 3 päivinä (BL2, UPN1, Z138) tai 24 tuntia (RL ja Toledo). Proteiini lysaatit analysoitiin immunoblottaamalla vasta-aineilla osoitti proteiineja. Paneelit A ja B olivat peräisin kahtena geelejä. Erk käytettiin latauskontrollina.

Viime aikoina olemme osoittaneet, että pico indusoi apoptoosin Burkittin lymfooman solulinjassa BL2 ja 5 6 manttelisolulymfooma solulinjat, joista suurin osa oli Bim- puutteellinen [26]. Näissä tapauksissa apoptoosi liittyy lisääntyneen ilmentymisen Bik ja vähentynyt ilmentyminen Mcl1 ja Bcl-XL. Esillä olevissa tutkimuksissa, huomasimme, että Bik aiheutettiin I3A hoitoa BL2 ja Z138 edustava Manttelisolulymfooman solulinjassa (kuvio. 6B). Erityisesti BL2, paljon ilmaistuna Bik oli kasvanut elektroforeettinen liikkuvuus. Tämä ilmiö, joka voi heijastaa vaihtoehtoisen mRNA tai translaation jälkeisen modifikaation, aiemmin nähty pico-käsitellyissä soluissa [26]. Sen sijaan, DAG analoginen kestävä UPN1 MCL solulinja ei ilmentänyt I3A aiheuttama Bik ilmentymistä. Sekä BL2 ja Z138 osoitti IA3 aiheuttama vähentynyt ilmentyminen Mcl1 ja Bcl-XL, mutta nämä vaikutukset eivät olleet yhtä ilmeistä UPN1 soluissa (Fig. 6B). Joka suhteessa, saadut tulokset täällä l3A rinnakkain, jotka saatiin bryostatiini 1 ja sen analogi pico edellisessä tutkimuksessa [25], [26].

I3A indusoi apoptoosia Select B-NHL Cell Lines

sen määrittämiseksi, onko I3A voi indusoida apoptoosia B-NHL-solulinjoja on aikaisemmin osoitettu olevan herkkä bryostatiini 1 ja /tai sen analoginen pico, käytimme kolmea eri solujen merkintöjä protokollia ja virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu [25], [26]. Lisäksi solulinjat edellä mainittiin, olemme mukana analyysissä aiemmin tunnettu DAG-analogi-herkkä MCL solulinjoissa Mino, REC1, ja SP53 ja kestävä Burkittin lymfooman solulinjassa Daudi. Kyvyttömyys solujen kerääntyä TMRE (tetrametyylirodamiini etyyliesteri) käytettiin havaitsemaan menetys mitokondrion ulomman kalvon potentiaali (Fig. 7A). Joissakin tapauksissa, olemme sisältyi Mek-inhibiittorit U1026 tai PD184352 arvioida rooli kanonisen Ras-signalointireitin apoptoosiin. Fluoresoiva kaspaasi pseudo-substraattia käytettiin havaitsemaan maailmanlaajuisen kaspaasiaktiivisuus (Fig. 7B). DNA end-merkintöjä käytetään dUTP ja terminaalin transferaasin (TUNEL) käytettiin seuraamaan tuman DNA pirstoutuminen (Fig. 7C). Edustavia tulokset esitetään kuvassa 7, ja tulokset on koottu taulukkoon 2. Yleisesti I3A aiheuttama laaja apoptoosin DAG analoginen-herkkien solujen linjat (Toledo, BL2, Jeko-1), mutta paljon vähemmän niin resistenttien solujen linjat (RL , UPN1 ja Daudi). Menetys TMRE värjäys aiheuttama I3A Toledo soluissa pääosin kumottu Mek estäjien (Fig. 7A), mutta tämä vaikutus oli vähemmän dramaattista joissakin MCL solulinjojen (tuloksia ei esitetty).

. RL ja Toledo soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan, inkuboitiin TMRE, ja analysoitiin tahra oton virtaussytometrialla. Joissakin tapauksissa viljelmiä inkuboitiin joko U0126 tai PD184352 arvioida vaikutuksia Mek eston. B. UPN1 ja Jeko-1-soluja inkuboitiin DMSO: ssa tai 100 nM I3A ja 4 päivää, ja sitten analysoitiin CaspACE ™ tunnistaa kaspaasi aktivointia.