Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On katsottu, että havaitsemismenetelmät kierrättämiseksi kasvainsoluja (CTC), joka perustuu epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) aliarvioida määrä CTC ja voivat menetä metastaattinen alapopulaatio syövän kantasolujen (CSC) ominaisuuksia. Siksi tutkimme EpCAM-positiivinen ja -negatiivinen CTC ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilasta eri vaiheissa, arvioi kliininen arvo on CTC ja tutkitaan niiden kyky seuraavissa CSC mallia.

Methods

CTC rikastettiin ehtyminen valkosolujen bi-vasta-aineilla käyttämällä magneettista helmi erotusmenetelmällä ja sitten tunnistetaan ilmaus EpCAM ja sytokeratiinia 7 ja 8 käyttäen multi-parametri virtaussytometria. Selvitimme jakautumista CTC luokiteltu ilmentymistä EpCAM 46 pienisoluista keuhkosyöpää osuuksilla I-IV, arvioi diagnostinen arvo on CTC pituus- seurantaa 4 indeksin potilaiden aikana adjuvanttihoito ja ominaista stemness näiden CTC että ilmaus CXCR4 ja CD133 10 potilaasta.

tulokset

EpCAM-negatiivinen (E-) CTC havaittiin olevan huomattavasti suurempi kuin EpCAM-positiivinen (E +) CTC IV vaiheessa (

p

= 0,003). Potilaat, joilla prosenttiosuus E-CTC yli 95% (

r

95%) havaittiin olevan huomattavasti kasvanut 13,3% vaiheen I-II 61,1% IV vaiheessa (

p

= 0,006). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on

r

95%: lla oli huomattavasti lyhyempi elinaika kuin ne, joilla on

r

≤ 0,95 (

p

= 0,041). Pitkittäinen seuranta CTC osoittivat, että potilailla, joilla on suuri osa E-CTC veressä eivät reagoi joko kemoterapian tai täsmähoitoihin. Edelleen luonnehdinta CTC paljasti, että varren kaltainen subpopulaatio CXCR4 + CD133 + CTC havaittiin olevan huomattavasti yleisempiä E-CTC kuin että E + CTC (

p

= 0,005).

Johtopäätökset

rikastuminen CTC jonka ehtyminen valkosolujen bi-vasta-aineilla on arvokas menetelmä määrän arvioiminen CTC, jota voidaan mahdollisesti soveltaa ennustettaessa ennusteeseen, seuranta terapeuttinen vaikutus NSCLC potilaiden ja analysoimalla lisäksi biologiaan CTC.

Citation: Yin J, Wang Y, Yin H, Chen W, Jin G, Ma H, et al. (2015) verenkierrossa olevia kasvainsoluja rikastuttanut ehtyminen Leukocytes Bi-vasta-aineet ei-pienisoluinen keuhkosyöpä: Potential Clinical Application. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10,1371 /journal.pone.0137076

Editor: Huei-Wen Chen, Graduate Institute of toksikologian, Taiwan

vastaanotettu: 24 tammikuu 2015; Hyväksytty: 12 elokuu 2015; Julkaistu: 28 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Yin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee Jiangsu Natural Science Foundation (BK20141435); Käyttöönotto pätevää Foundation (2011RC11); Lääketieteen ja teknologian kehityksen Foundation, Nanjing Department of Health (YKK13088); Avain ohjelma National Natural Science Foundation of China (81230067); National Key Basic Research Program Grant (2013CB911400).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän -aiheiset kuolema [1], ja noin 85% keuhkosyöpää ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Vaikka systemaattinen hoito on parantunut, yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 10-20% [2]. Ensisijainen syy alhaiseen eloonjäämisaste on kaukainen etäpesäke syöpäsoluja. Vuonna metastaattinen cascade, verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) on katsottu olevan keskeinen osallistujille muodostumiseen etäispesäkkeitä [3]. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että CTC ilmentäviä epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) ovat havaittavissa vaiheessa IV ei potilaita ja ovat uusi ennustetekijä tähän tautiin [4]. Kuitenkin on ehdotettu, että menetelmät perustuvat ilmaus EpCAM aliarvioida määrä CTC ja voivat menetä metastasoitunut alapopulaation CTC syövän kantasolujen (CSC) ominaisuudet [5, 6]. Tuoreessa tutkimuksessa raportoitiin, että CTC havaitaan 2 kertaa tehokkaammin ISET (eristämistä koko epiteelikasvainsolut) kuin jonka CellSearch, ja että alapopulaatio CTC, joka ei ilmaissut EpCAM (eli E-CTC), voi olla havaita verestä NSCLC potilaiden [7]. Toinen tutkimus on myös osoittanut, että luettelointi näiden solujen on paljon suurempi kuin CTC vangiksi CellSearch [8]. Tähän asti kliinistä arvoa ja biologian näiden E-CTC on ollut epäselvä, ja tuore julkaisu on ilmoittanut, että tulevissa tutkimuksissa tulisi sisällyttää havaitseminen E-CTC [9].

CTC käynnissä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on katsottu olevan tärkeä rooli kasvainten muodostuminen [5]. EMT voi tuottaa solujen kantasolujen ominaisuuksia [10]. Aikana EMT, ilmaus EpCAM kasvainsoluissa tullaan alassäädetty. Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että SDF-1 /CXCR4 akseli on tärkeä rooli välittämisessä solujen vaeltamiseen ja selviytymisen jälkeen TGF-β-aiheuttama EMT [11]. On kuitenkin epäselvää, ovatko nämä (tai mikä tahansa) CTC kanssa alassäädetty EpCAM on lisääntynyt metastaattista kylvöön mahdolliset tai kohonneen vastustuskyvyn systeeminen hoito, ja, kuten viime aikoina osoitettu, enemmän ennusteen arvioinnissa [12]. Edellisessä tutkimuksessa kävi ilmi, että CXCR4: ää ilmentävien CTC havaittiin veressä kiinteä kasvain potilaista [13]. Tuoreessa tutkimuksessa raportoitu, että säätely ylöspäin CXCR4 on toiminnallisesti ratkaiseva ylläpitämiseksi stemness in lääkeresistenttiä NSCLC-solujen [14]. Sen vuoksi on tarpeen luonnehtia stemness E-CTC.

CTC ovat harvinaisia ​​veressä kasvain potilaiden, ja tutkimuksia biologiaan CTC rajoittavat alhainen pitoisuus ja saanto CTC [9] . Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ISET tekniikka on tehokkaampi vangitsemaan E-CTC in NSCLC [7, 8], äskettäisessä tutkimuksessa raportoitiin, että keuhkojen kasvaimet kasvavat nopeammin ja irtoa huomattava määrä tappava metastaattisen solujen pienet koot [15]. Siksi ”puolueeton” eristäminen menetelmä CTC on toivottavaa. Olemme aiemmin perustettu negatiivinen rikastumista CTC [16], joka perustuu ehtyminen leukosyyttien käyttämällä magneettista helmi erotusmenetelmällä ja sen jälkeen sen havaitsemiseksi multi-parametri virtaussytometrialla. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme parantaneet tätä tekniikkaa kuluttamalla leukosyyttien bi-vasta-aineiden puhtauden parantamiseksi CTC niiden kuvaamista ja soveltaminen tulevaisuudessa molekyylien analyysiin. Tällä menetelmällä, määritimme jakelu CTC luokiteltu ilmentymistä EpCAM 46 NSCLC potilaalla on vaiheet I-IV, tutkitaan niiden diagnostista arvoa systemaattisen hoidon pituus- seurantaa näiden CTC 4 indeksin potilailla, arvioi ennusteen arvioinnissa on nämä CTC ja ominaista stemness näiden CTC mittaamalla ilmaus CXCR4 ja CD133.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista ja terveillä vapaaehtoisilla ennen tutkimukseen osallistuneiden. Verinäytteen keruu ja analyysit hyväksynyt Institutional Review Board of Nanjingin Medical University. Rakenne ja toiminta Nykyisen tutkimuksen ihmiseen kohdistuvan selvästi kuvattu tutkimus protokollaa.

Tutkimuskanta ja valmistelu verinäytteiden

Oheislaitteet verinäytteistä 46 pienisoluista keuhkosyöpää kerättiin tammikuusta marraskuussa 2013 Nanjing Rinta Hospital ja Jiangsun Cancer sairaala. Potilaiden ominaisuudet on lueteltu taulukossa 1. Verta otettiin jälkeen hylätään ensimmäiset 2 ml, jotta vältetään mahdolliset ihon solujen saastuminen injektiokanyyliin ja käsiteltiin sitten 4 tunnin keräämisen jälkeen. Verinäytteissä 4 indeksi potilaista kerättiin myös lopussa kutakin kemoterapiaa tai täsmähoitoihin välittömästi, ja terapeuttisia vaikutuksia potilaiden arvioitiin mukaan Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia.

CTC rikastamiseen

kennoliuokset verinäytteistä valmistettiin aikaisemmin kuvatulla [16]. CTC Sitten rikastettiin ehtyminen valkosolujen bi-vasta-aineilla mukaan seuraavasti: ensimmäinen, joka perustuu Leukocyte yhteiseen antigeeni CD45 ihmisen kokoveri CD45 väheneminen Kit (EasySep, Stem Cells Technologies, Inc., Vancouver, BC, Kanada) käytettiin ensimmäinen askel valkosolujen ehtymisestä Toinen, joka perustuu leukosyyttien pinta-antigeeni CD53, solut värjättiin PE hiiren anti-ihmisen CD53-vasta-ainetta (BD Bioscience, USA), pestiin PBS: llä ja sitten edelleen köyhdytettyä PE positiivisen valinnan Kit (EasySep, Stem Cells Technologies, Inc., Vancouver , BC, Kanada) toisena askel leukosyyttien. Menettely toteutettiin noudattamalla valmistajan ohjeita vähäisin muutoksin.

Virtaussytometria

Kun rikastamiseen, CTC jaettiin tasan 2 putkiin ja värjättiin ihmisen anti-EpCAM, anti-CK7 /8 , anti-CD45 (BD Bioscience, USA) ensimmäisessä putkessa ja vastaavat isotyyppikontrollivasta vasta toisessa putkessa. Tutkia biologiaan CTC vuonna stemness, rikastetun solut yhdessä värjättiin ihmisen anti-CXCR4 (BD Bioscience, USA) ja anti-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Saksa) (ensimmäisessä putki) ja vastaava isotyyppikontrollivasta aineita ( toisessa putkessa) 10 näytettä. Lopullinen pitoisuus kullekin vasta-aineelle oli 10 ug /ml. FACS AriaIII järjestelmä (BD Biosciences) suoritettiin ekspression määrittämiseksi kaikkien markkereiden, ja tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo 7.2.5 ohjelmistoa (Tree Star, Ashland, OR, USA). Solujen ilmentymisen edellä markkereita saatiin erotettua vastaavalla isotyyppikontrolli perusteella erotettavissa niiden välillä. CTC määriteltiin sytokeratiinivasta + CD45-CD53- soluihin.

Analyysin kokeilu

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjaa PC9 (korkea ilmentymä EpCAM ja sytokeratiinivasta) oli myötävaikuttanut Cancer Center Nanjing Medical University ja viljeltiin korkean glukoosin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. PC9 solut kerättiin mukaisesti samaa menettelyä kuin edellä on kuvattu [16]. Nolla, 10, 50, 100 ja 500 PC9 solut oli lisätty 2 ml verta terveistä vapaaehtoisista. PC9 solut mukainen rikastettu edellä kuvatun menetelmän. Kohottamisen jälkeen, CTC jaettiin tasan 2 putkiin ja värjättiin ihmisen anti-EpCAM, anti-CK7 /8, anti-CD45 ja vastaava isotyyppikontrollivasta aineita. Virtaussytometrialla analysointia, prosenttiosuus CTC kaikki pysyivät soluissa (mukaan lukien leukosyyttien ja CTC) rikastuksen jälkeen määriteltiin puhtaus CTC. Recovery ja puhtaus laskettiin arvioimaan suorituskykyä menetelmän, joka määritettiin seuraavasti: Recovery = n

1 /n

2 x 100%, puhtaus = n

1 /(n

1 + n

3) x 100% (n

1 oli määrä PC9 solujen löytyi kohottamisen jälkeen; n

2 oli määrä PC9 solujen oli lisätty 2 ml verta; n

3 oli leukosyyttien löytyi kohottamisen jälkeen). Piikitysproseduurin kokeilu jokaisessa kunnossa toistettiin kolme kertaa.

tutustu CTC alusta on edelleen toimiva, PC9 solulinja on alhainen ilmentyminen EpCAM saatiin mukaisesti seuraavasti: solut ympättiin tiheydellä 5 × 10

5 solut neljässä 6cm-ruokia ja inkuboitiin 5% CO

2, 95% ilmaa 37 ° C: ssa kunnes sen tiheys saavutti 80%. Viljellyt solut ylläpidettiin seerumittomassa DMEM (0,1% BSA: ta, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä yön yli, ja sitten kannustanut 5 ng /ml rhTGF-β1 (PeproTech, USA) samassa väliaineessa 3 päivää. Piikitysproseduurin Kokeet edennyt tämäntyyppisten PC9 solujen (nimeltään PC9-EMT) noudattaen samaa menettelyä kuin edellä kuvattiin.

Cutoff arvo

lähtötilanteessa E + ja E-CTC määritettiin niiden luettelointi verinäytteissä 11 terveillä vapaaehtoisilla. Cutoff-arvot E + ja E-CTC laskettiin yläraja keskiarvo CTC plus keskihajonta (SD). Jos kahden CTC olivat molemmat alle raja-arvojen, tämä potilas olisi määritelty olevan havaitsematta CTC ja olisi jätettävä tilastollinen analyysi. Jos vain yksi tyyppi CTC oli alle kynnysarvon, tämän tyyppinen CTC katsottaisiin 0 mukavuussyistä tilastolliseen analyysiin. Prosenttiosuus E-CTC laskettiin kokonaismäärä E + ja E-CTC. Jos prosenttiosuus E-CTC oli suurempi kuin 95% (

r

95%), tämä potilas katsotaan olevan ehdoton enemmistö E-CTC veressä.

Statistical analyysi

Tietojen analysointi toteutettiin Stata tilastollinen paketteja (Stata Corporation, College station, TX, USA). Mann-Whitney ja χ

2 testiä käytettiin vertaamaan kahta ryhmää. Coxin suhteellisten riskien mallia suoritettiin SPSS (Statistical Package for Social Sciences) v. 16,0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) arvioimaan korrelaatio elinaika potilaiden ja prosenttiosuus CTC.

P

arvojen 0,05 joiden katsottiin olevan merkittäviä eroja.

Tulokset

arviointi CTC rikastusmenetelmällä

Kun stimulaatiota TGF-β 3 päivää, ilmaus EpCAM vuonna PC9 soluissa laski 97,7%: sta 51,7%. Käyttämällä menetelmää tippakokeilla, keskiarvo elpymisen /puhtaus PC9 ja PC9-EMT solut olivat 80,7% /9,5% ja 74,3% /9,5%, tässä järjestyksessä. Kalibrointikäyrä on esitetty kuvassa 1. On lineaarinen suhde kulmakerroin 0,678 (0,782) välillä logaritmien PC9 solujen (PC9-EMT soluja) löytyy ja PC9 soluja (PC9-EMT soluja) lisättiin.

Kalibrointikäyriin vuonna tippakokeilla käyttäen (A) PC9 solulinjaa ja (B) PC9-EMT-solut; (C) FACS-analyysi: n ilmentämiseksi EpCAM on PC9 ja PC9-EMT-solut stimuloitiin 5 ng /ml TGF-β varten 3 päivää.

raja-arvot E + ja E-CTC määritettiin 11 verinäytteitä terveillä vapaaehtoisilla. E + CTC havaittiin vain yksi näyte, ja E-CTC havaittiin 8 näytettä. Keskiarvo CTC + SD oli 0,09 + 0,30 ja 1,18 + 0,98 /ml verta E + ja E-CTC, vastaavasti. Siksi nolla ja 2 määriteltiin raja-arvot E + ja E-CTC vastaavasti.

46 verinäytettä, CTC oli havaittaisi viisi näytettä (1 vaiheessa II ja 4 vaiheessa IV) takia sekä E + ja E-CTC onko kyseiseen raja-arvot. 41 verinäytteiden kanssa havaittu CTC, keskiarvo [alue] puhtauden CTC oli 10,6% [0,1% -51,1%]. Näistä näytteistä 36,6% (15 41), puhtaus oli CTC yli 10,0%. Suurin puhtaus CTC oli 51,1%. Edustavia tulokset FACS-analyysi annetaan S1 Fig.

jakelu CTC potilailla

detektiomäärät E + ja E-CTC esitetään kuviossa 2A. E + CTC havaittiin 13 16 (81,3%) vaiheen I-II, 6 8 (75,0%) vaiheen III ja 8 22 (36,4%) vaihe IV potilaille. E-CTC havaittiin 13 16 (81,3%) vaiheen I-II, 8 8 (100%) vaiheen III ja 18 22 (81,8%) vaihe IV potilaille. E + CTC määritettiin olevan huomattavasti alhaisempi vaiheessa IV potilailla kuin vaiheen I-II potilaat (

p

= 0,007). E + CTC ja E-CTC havaittiin olevan merkittävästi erilainen vaiheessa IV potilailla (

p

= 0,003). Lisäksi 2 15 (13,3%) vaiheen I-II, 3 8 (37,5%) vaiheen III ja 11 18 (61,1%) vaihe IV potilasta havaittiin olevan ehdoton enemmistö E-CTC veressä (

r

95%). Taajuus potilaalla on

r

95% havaittiin olevan merkittävästi suurempi IV vaiheessa kuin vaiheessa I-II potilaat (

p

= 0,006, Kuva 2B).

(A) jakautuminen detektiomäärät E + ja E-CTC potilailla eri vaiheissa; (B) Prosenttiosuus havaittu potilailla, joiden osuus E-CTC yli 95% (

r

95%); (C) jakautuminen määrää E + ja E-CTC potilailla, joilla on eri vaiheissa; (D) jakautuminen Prosenttia E-CTC eri vaiheissa. (+ /+, Sytokeratiinivasta + EpCAM +, +/-, sytokeratiinivasta + EpCAM-).

mukaan raja-arvot, CTC havaittiin 41 potilaalla ja jakelun määrä E + ja E -CTCs on esitetty kuviossa 2C. Mediaaniarvot [kvartiiliväli, IR] /ml verta E + ja E-CTC oli 6,0 [2,5-12,0] ja 18. [11,0-47,5] vaiheessa I-II potilaiden, 11.0 [3,25-16,0] ja 31,5 [22,5 -31,5] vaiheessa III ja 6,5 ​​[2,25-49,25] ja 15,5 [5,75-35,75] vaiheessa IV potilaista. Oli merkitsevä ero määrän E + ja E-CTC sekä vaiheen I-II ja III (

p

= 0,001 molemmat), mutta ei vaiheessa IV, koska määrä E + CTC korotettiin useille potilaille. Jakelu prosenttiosuus E-CTC on esitetty kuviossa 2D. Mediaaniarvot [IR] prosenttiosuuden E-CTC oli 83,0% [50,0% -91,0%] vaiheessa I-II, 90,0% [72,8% -99,0%] vaiheessa III ja 100,0% [60,5% -100,0% ] vaiheessa IV potilaille. Vaikka suuri prosenttiosuus E-CTC havaittiin kaikissa vaiheissa, ei ollut merkittävää eroa.

Longitudinal seuranta CTC vuonna adjuvanttihoito

E + ja E-CTC oli dynaamisesti seurattiin 4 indeksi potilasta, ja tulokset on esitetty kuviossa 3. Potilas 1 (kuvio 3A ja S2 kuvassa), joka oli etenevä sairaus hoidon aloittamisesta kanssa Gefitinibi, osoitti sairauden osittaisen loppuun remission hoidossa ALIMTA (pemetrexeddisodium) + sisplatiini . Määrä E + CTC laski 4-0 /ml verta, mutta määrä E-CTC nousi 15-44 /ml verta ensimmäisellä kaudella ja laski lähelle 0 /ml verta kolmen viime aikoja. Prosenttiosuus E-CTC oli 79% alussa, hieman kasvoi 100% ensimmäisen jakson aikana, laski 50% ja tämä määrä seuraavassa kahdessa jaksossa, mutta havaitsematta viime kaudella.

(A) Gefitinibi ja sitten ALIMTA + sisplatiini hoidon; (B) Paclitaxel liposomiin + sisplatiini ja sitten sädehoidon + erlotinibi hoitoon; (C) ALIMTA + karboplatiinin ja sitten erlotinibin hoito; (D) Erlotinibi hoitoa. Jokainen hoitojakso oli yksi kuukausi.

Potilas 2 (kuvio 3B ja S3 kuvassa), joka oli etenevä sairaus hoidon aloittamisesta paklitakselihoidon liposomiin + sisplatiini, osoitti stabiili tauti ensimmäisen jakson aikana, mutta oli etenevä tautia toisella kaudella vuoksi aivometastaasi. Sen jälkeen sädehoidon + erlotinibin, tämä potilas osoitti osittaista peruuttamista taudin. Määrä E-CTC laski 34-3 /ml verta ensimmäisellä kaudella, nousi 13 /ml verta toisessa jaksossa ja sitten laski 3 /ml verta viime kaudella, kun taas määrä E + CTC osoitti tunteeton muutos 0, 0, 2: 1 /ml verta aikana hoidon. Prosenttiosuus E-CTC säilyi korkealla tasolla (100%) ensimmäisellä kaudella, ja sitten laski 87% ja 75% viimeisten kahden kauden.

Potilas 3 (kuvio 3C ja S4 kuvassa ), joka oli etenevä sairaus hoidon aloittamisesta ALIMTA + karboplatiinin, osoitti osittainen remissio ensimmäisen jakson aikana, mutta oli etenevä sairaus toisen jakson aikana hoidon kanssa erlotinibin. Tämä potilas kuoli kuukautta myöhemmin. Määrä E-CTC laski 69-10 /ml verta ensimmäisellä kaudella, ja nousi 25 ja 19 /ml verta kahden viime aikoja. Määrä E + CTC oli huonokuntoinen muutos 8-23 /ml verta ensimmäisellä kaudella, ja sitten laski 7 /ml verta ja havaita viimeisen kahden kauden. Prosenttiosuus E-CTC säilyi korkealla tasolla (90%) alussa, laski 30% yhdessä vastauksena osittaista peruuttamista taudin ja sitten nousi 78% ja 100% seuraavan sairauden etenemisen.

Patient 4 (kuvio 3D ja S5 kuvassa), joka oli etenevä tauti alustavan diagnoosin, osoitti osittainen remissio, stabiili tauti, etenevä sairaus ja vakaa taudin ensimmäisestä neljänteen ajanjaksoon hoidon erlotinibin. Määrä E-CTC osoitti fluctuant muutos 23, 17, 6, 17-5 /ml verta, kun taas E + CTC olivat lähes havaitsemattomia koko ajan. Prosenttiosuus E-CTC säilyi lähes 100% kaikkina aikoina.

Seuranta

Kaikilla potilailla oli seuranta kirjaa 10-20 kuukautta riippuen näytteenottokerralla. Seitsemäntoista potilasta kuoli kaukainen etäpesäke (vaiheissa I-II: 3 tapauksissa vaiheen III: 3 tapausta, vaihe IV: 11 tapausta). Vuonna 17 tapausta, 4 potilasta sisällytetä tilastolliseen analyysiin, koska CTC oli huomaamatta. 41 potilaalla, joilla havaittavissa CTC, 9 16 potilaalla on ehdoton enemmistö E-CTC veressä (

r

95%) ja 8 25 potilasta

r

≤ 95% kuoli. Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on

r

95%: lla oli huomattavasti lyhyempi elinaika kuin ne, joilla on

r

≤ 95% (

p

= 0,041, Kuva 4).

karakterisointi CTC vuonna stemness

Tutkiakseen kapasiteetin CTC seuraavista CSC mallia, määritimme ilmaus CXCR4 ja CD133 E + ja E-CTC vastaavasti 10 potilaalla. CXCR4 havaittiin 8/10 potilaiden alaryhmässä E-CTC, kun se havaittiin vain 3/10 potilaista alaryhmässä E + CTC. Sekä CXCR4 ja CD133 havaittiin 6/10 potilaiden alaryhmässä E-CTC, kun ne havaittiin vain kymmenesosa potilaista sisällä E + CTC alaryhmä. CXCR4 + CTC ja CXCR4 + CD133 + CTC havaittiin olevan huomattavasti suurempi E-CTC kuin E + CTC (

p

= 0,021 ja 0,005, vastaavasti, kuvio 5A). Lisäksi ilmaus CD133 havaittiin olevan huomattavasti korkeampi CXCR + E-CTC kuin muun tyyppisissä CTC (

p

= 0,029, kuvio 5B). Mielenkiintoista on, että samat henkilöt, määrä CTC ilmentymisen kanssa CXCR4 ja /tai CD133 oli aina enemmän alaryhmässä E-CTC kuin E + CTC. Yksikään potilas ei löytynyt, että ilmaus CXCR4 ja /tai CD133 havaittiin vain E + CTC mutta ei E-CTC.

Distribution (A) määrä CXCR4 + ja CXCR4 + CD133 + solujen ja ( B) positiivisuus detektiomäärät CXCR4 + CD133 + solujen CTC luokiteltuna ilmentymistä EpCAM 10 pienisoluista keuhkosyöpää.

keskustelu

CTC voidaan käyttää ennustetyövälineenä merkki [17 18]. Kuitenkin pieni määrä ja alhainen pitoisuus CTC on rajoittanut tutkimuksen biologian CTC [9, 19]. Johtuen heterogeenisyys CTC, on vaikea vangita kaikentyyppisten CTC by EpCAM perustuvia menetelmiä. Järkevämpi strategia on heikentävistä valkosoluja. Käyttämällä parannettu menetelmä, puhtaus CTC korotettiin 10 kertaa tippakokeilla, ja jopa 50-kertainen verinäytteistä verrattuna aiemmin raportoitu menetelmä, joka perustuu magneettisen nanohelmien [16]. Käyttämällä tätä menetelmää, keskiarvo puhtauden CTC voi olla jopa 10% tippakokeilla ja 10,6% verinäytteet potilaista, jotka tukevat myös sen uuden hakemuksen molekyylitason analyysi. Tämä menetelmä on verrattavissa havaitsemiseksi CTC ja ilman ilmentymistä EpCAM. Haussa, 36,4% (E + CTC) ja 81,8% (E-CTC) potilaista oli vaiheen IV tauti. Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä julkaistun tulokset E + CTC havaittiin vain 23 ~ 32% kehittyneiden NSCLC potilaiden CellSearch ja 80% niistä koon eristäminen strategia [4, 7]. Tämä menetelmä on spesifinen tunnistaminen CTC ja ilman ilmentymistä EpCAM. Sekä E + ja E-CTC havaittiin olevan paljon pienempi verinäytteissä terveiltä vapaaehtoisilta suhteessa kuin potilailla, mikä oli myös sopusoinnussa aiemmin julkaistu tutkimus [20]. Vaikka E + ja E-CTC oli havaittaisi viidellä potilaalla, on mahdollista, että luettelointi CTC oli pienempi kuin raja-arvojen tai poissa ylimääräisiä markkereita tunnistamaan heterogeeninen kasvainsoluihin NSCLC [21, 22].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet jakelu CTC ja ilman ilmentymistä EpCAM NSCLC potilaiden parannettu menetelmä. Haussa, E + ja E-CTC havaittiin olevan merkittävästi erilainen vain vaiheessa IV potilaille, vaikka ne eivät olleet vaiheen I-II ja III potilaiden. Lisäksi potilaiden prosenttiosuus, joiden ehdoton enemmistö E-CTC veressä merkittävästi kasvanut vaiheen I-II-IV. Lisäksi tulokset Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on ehdoton enemmistö E-CTC veressä oli lyhyempi elinaika kuin ne potilaat, joilla on pieni osa E-CTC. Nämä tulokset viittaavat siihen, että prosenttiosuus E-CTC voidaan käyttää ennustamaan ennuste pienisoluista keuhkosyöpää.

hetkellä, diagnostinen arvo CTC ja ilman ilmentymistä EpCAM NSCLC on epäselvä. Tässä tutkimuksessa, suoritimme pitkittäinen seurantaa 4 indeksin potilaiden aikana adjuvanttihoito. Prosenttiosuus E-CTC havaittiin olevan tarkempi kuin määrä E + CTC arvioitaessa terapeuttinen vaikutus sekä kemoterapiaa ja kohdennettu hoito. Lisäksi pieni määrä E-CTC liittyi myönteisen vastauksen potilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että prosenttiosuus E-CTC voi olla potentiaalia merkkiaineena seurannassa ja ennustamisessa terapeuttisen vaikutuksen NSCLC. On mahdollista, että noncancerous soluja voidaan sisällyttää E-CTC [9], ja myös ei löytänyt mitään kliinistä arvoa yksinkertaisesti luettelointi E-CTC. Tämä ilmiö oli myös sopusoinnussa hiljattain julkaissut tuloksia kemoterapiaa rintasyöpä [23]. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että suuri osa E-CTC saattavat merkitä vahvistunut kyky kasvainsolujen invaasion ja leviämisen.

tutkia edellä biologiaa CTC, me luonnehti stemness on CTC eri ekspressioprofiileja of EpCAM seuraavista tuloksista edellisessä työssä [13]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmä CXCR4 ja CD133 voidaan käyttää CSC merkki [24, 25]. Meidän tulokset, CXCR4 + CD133 + CTC havaittiin olevan huomattavasti yleisempiä E-CTC kuin E + CTC, ja määrä E-CTC ilmentymisen kanssa CXCR4 ja /tai CD133 oli aina enemmän kuin E + CTC on samassa yksilöiden, joka ehdotti, että E-CTC näytti olevan varren kaltainen. Tämä tulos saattaa selittää ainakin osittain huono tulos potilaiden ylivoimainen E-CTC veressä jossain määrin. Lisäksi CXCR4 säädelty aikana TGF-β aiheuttama EMT. Mahdollinen suhde enemmän varsi kaltainen E-CTC ja EMT olisi tutkittava. Vaikka suhteellisen pieni määrä potilaita käytettiin tässä tutkimuksessa, nämä tulokset edistävät parempaa ymmärtämistä suhde CSC: n ja EMT CTC. Lisätutkimukset on suuri otoskoko ja EMT tunnistamista tarvitaan tilan selventämiseksi tämäntyyppisen CTC ja sen toiminta kasvaimen etenemistä NSCLC.

Johtopäätös

Perustuu tekniikka CTC väkevöimisen ehtyminen leukosyyttien bi-vasta-aineilla, tässä tutkimuksessa arvioitiin kliinistä arvoa CTC ja ilman EpCAM ilmaisun NSCLC. Tuloksemme viittaavat siihen, että prosenttiosuus E-CTC merkittävästi kasvanut vaiheen I-II-IV ja voitaisiin käyttää arvioimaan kaukainen etäpesäke, terapeuttista vaikutusta ja ennusteen potilaiden NSCLC. Lisäksi E-CTC näytti olevan varren kaltainen kuin E + CTC. Nämä tulokset ovat ensimmäinen todiste mahdollinen kliininen soveltaminen E-CTC NSCLC.

tukeminen Information

S1 Kuva. Edustavia FACS analyysi CTC verinäytteissä 4 NSCLC potilaiden.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137076.s001

(TIF)

S2 Kuva. Tietokonetomografia (TT) kuvien potilas1 hoidettiin Gefitinibi ja sitten ALIMTA (pemetrexeddisodium) + sisplatiini.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137076.s002

(TIF)

S3 Fig. CT-kuvia potilas 2 hoidettiin paklitakselilla liposomiin + sisplatiini ja sitten sädehoidon + erlotinibi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137076.s003

(TIF)

S4 Fig. CT-kuvia potilas 3 hoidettiin ALIMTA + karboplatiinin ja sitten erlotinibin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137076.s004

(TIF)

S5 Fig. CT-kuvia potilas 4 hoidettiin erlotinibia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137076.s005

(TIF) B