Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

sisäiset kasvaimen steroidien ja konstitutiivista androgeenireseptorin (AR) aktiivisuus on liitetty kastraatio kestävät eturauhassyöpä (CRPC). Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia, jos CRPC luuetäpesäkkeistä ilmaistuna korkeampi steroidi-muuttavien entsyymien kuin käsittelemätön luustometastaaseja. Steroidien entsyymi tasot analysoitiin myös suhteessa ilmentymisen konstitutiivisesti aktiivisen AR variantteja (AR-Vs) sekä kliiniset ja patologiset muuttujia.

Menetelmät /Principal Havainnot

Hoitamattomana hormoni-infektoitunut (HN , n = 9) ja CRPC luun etäpesäkkeitä näytteitä (n = 45), saatiin 54 potilaiden etäpesäke leikkausta. Non-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhas- näytteet hankittiin 13 eturauhasen yksilöitä. Transcript ja proteiinin tasot analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR, immunohistokemia ja immunoblottauksella. Mitään eroja steroidien entsyymiarvot välillä havaittiin CRPC ja HN luumetastaaseja. Merkittävästi korkeampi SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, ja HSD17B10 mRNA havaittiin kuitenkin luuetäpesäkkeissä kuin ei-pahanlaatuisten ja /tai pahanlaatuisen eturauhasessa, kun taas CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2, SRD5A2, ja HSD17B6 mRNA tasot etäpesäkkeitä olivat merkittävästi alhaisemmat . Alaryhmä etäpesäkkeiden ilmaisi erittäin korkeita AKR1C3, mikä ei johtunut geenimonistukseen tutkittuna kopioluvun vaihtelua määrityksessä. Ei assosioitunut AKR1C3 ilmaisun ja ydinvoiman AR värjäystä, kasvainsoluproliferaation tai potilaiden hoitotuloksiin jälkeen etäpesäkkeitä leikkauksen. Yhtä poikkeusta lukuun ottamatta, korkea AR-V-proteiinin tasot havaittiin luun etäpesäkkeitä alhainen AKR1C3 tasolla, kun taas etäpesäkkeet korkean AKR1C3 tasoilla sisältyy ennen kaikkea alhainen AR-V tasolle, mikä osoittaa selvästi mekanismeja kastraatio-resistenssi yksittäisissä luustometastaaseja.

Johtopäätökset /merkitys

aiheuttama kapasiteetin muuntaa lisämunuaisen-rauhanen peräisin steroidipistokset voimakkaampi androgeenien ilmaistiin alaryhmän PC luustometastaaseja. Tämä ei liittynyt CRPC vaan pelkästään kehittyneen vaiheessa etäpesäke. Alaryhmiä luuetäpesäkkeistä voitiin tunnistaa niiden ekspressiotasoja AKR1C3 ja AR-Vs, joka saattaa olla merkitystä potilaan vaste 2

toinen linja androgeenipuutteen terapia.

Citation: Jernberg E, Thysell E, Bovinder Ylitalo E, Rudolfsson S, Crnalic S, Widmark A, et al. (2013) karakterisointi Eturauhassyöpä luustometastaaseja mukaan ekspressiotasoja steroidien Entsyymit ja androgeenireseptorin Splice vaihtoehdot. PLoS ONE 8 (11): e77407. doi: 10,1371 /journal.pone.0077407

Editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 14, 2013; Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 07 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Jernberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Research Council, Ruotsin Cancer Society, Cancer Research Foundation Pohjois-Ruotsissa, Lion Cancer Research Foundation, ja Uumajan yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ensilinjan hoitoon potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä (PC) on androgeenien puute hoitoa (ADT). Tämä hoito on tehokas useimmilla potilailla, mutta jakson jälkeen alkuperäisen remission kasvainten yleisesti taudin uusiutumiseen, pääasiassa luuhun, ja sitten kutsutaan kastraatio kestävä PC (CRPC).

Huolimatta alhainen verenkierrossa androgeenien kastroituihin miehillä useimmissa CRPC kasvaimista osoittavat androgeenireseptorin (AR) aktiivisuus ja ilmentymistä AR geenien [1]. Mahdollisia mekanismeja AR toimintaa CRPC kuuluu AR-geenin monistaminen ja mutaatiot, sisäisen kasvaimen synteesi androgeenien, ja ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen AR silmukointivarianteista [2], [3]. Eritoten CRPC kasvaimia, ja yksittäiset tuumorisolut useimmilla potilailla, osoittaa hyvin alhainen tai poissa ydinaseiden AR Immuunivärjäystä ja tekijät alas-stream AR eivät välttämättä säädelty niissä tapauksissa [4], [5], [6] [7]. Olemme äskettäin ominaista sarjan hormonin infektoitunut (HN) ja CRPC luustometastaaseja potilaille mukaan AR aktivointia ja ilmaus AR silmukointivarianteista (AR-Vs) [5], [8]. Tasot AR-V7 (kutsutaan myös AR3) [9], [10], ja AR-V567es [11] variantteja korotettiin CRPC verrattuna HN etäpesäkkeitä ja lisäksi havaittu olevan erittäin ilmaistava alaryhmä CRPC potilaille, joilla on erityisen huonoon ennusteeseen [8]. AR-V7 ja AR-V567es puuttuu ligandisitoutumisdomeenista (LBD) ja niillä konstitutiivinen aktiivisuus [9], ja potilaat ilmentävät niitä AR-vs todennäköisesti on huono vaste ADT ja anti-AR lääkkeiden kohdistaminen LBD. Jotkut CRPC potilaat kuitenkin reagoida 2

toinen linja ADT ja tämä saattaa johtua sisäisistä kasvaimen steroidien ja testosteronin, dihydrotestosteronin (DHT), tai muita androgeenien tasolle riittävän korkea AR aktivoinnin ilmoituksen mukaan muut [13 ], [14], [15], [16]. On kuitenkin ole tiedossa, kun nämä steroidien entsyymit ovat ajan säännelty. Ovatko ne kasvoivat jo aiemmin hoitamattomilla HN etäpesäkkeitä, tai AR-Vs [8] lisääntyi seurauksena kastraatio hoitoa? Yksi Tutkimuksen tavoitteena oli siis analysoida ilmentymisen steroidi-muuttavien entsyymien mahdollisesti mukana synteesissä testosteronin ja DHT joukko HN ja CRPC luustometastaaseja saatu potilaiden etäpesäke leikkausta. Lisäksi entsyymi ekspressiotasoja analysoitiin suhteessa ilmentymisen AR-Vs, jotta voidaan tunnistaa mahdollisia eri mekanismeja CRPC yksittäisissä luustometastaaseja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen tarkastelu hallituksen Uumajan yliopiston ja osallistujat antoivat kirjallinen tai suullinen suostumus. Johtuen akuutti tilanne, kun luun etäpesäke leikkaus suoritetaan, jotta helpotusta selkärangan oireita ja pareesi, logistiikka eivät aina salli kirjallinen suostumus ja paikallisen eettisen tarkastelun aluksella siis erikseen hyväksynyt myös suullinen suostumus. Sanallinen suostumus on dokumentoitu lääkäri potilaan lehdessä.

Potilaat

luumetastaasipotilailla kudosta saatiin sarja tuoreiden pakastettujen ja formaliinikiinnitetyt koepaloja kerättiin potilailta PC toiminut metastaattisen selkärangan johto puristus tai patologisen murtumia Uumajan yliopistollisessa sairaalassa (2003-2011). Kliinisiä piirteitä ja hoitoja on esitetty taulukossa 1, ja tämä potilas sarja on kuvattu aikaisemmin Crnalic et ai [5], [17], [18]. Tutkimus sisältää myös 13 potilaalla, joita hoidettiin eturauhasen Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, välillä helmikuu 2005 ja syyskuussa 2006. Mediaani-ikä potilaille oli 60 vuotta (vaihteluväli 48-68 vuotta) ja mediaani PSA olivat 6,6 ng /ml (vaihteluväli 3,5 -24 ng /ml). Yksitoista potilasta oli kasvaimet luokiteltiin Gleason (GS) 7 ja kaksi GS 8. Neljä kasvaimia vaiheessa T2 ja yhdeksän vaiheessa T3. Lisätietoja kudos käsittely on kuvattu aikaisemmin Hornbergissä et al [8].

Näytteen valmistus

edustavalla luuetäpesäkkeistä, ensisijainen PC ja ei-pahanlaatuiset eturauhasessa oli cryo -sectioned osaksi uuttoputkiin ja RNA eristettiin käyttäen Trizol-protokollaa (Invitrogen, Tukholma, Ruotsi), tai AllPrep DNA /RNA /proteiini Mini Kit (Qiagen, Sollentuna, Ruotsi). Tapauksissa oli DNA: ta ja proteiinia, analysoitiin rinnakkain RNA, nukleiinihappojen ja proteiinin eristettiin samasta kudosleikkeiden käyttäen AllPrep menetelmää. Prosenttiosuudet kasvainsolujen näytteet olivat yli 50% useimmissa tapauksissa. RNA ja DNA-pitoisuudet määritettiin kvantitatiivisesti absorbanssilla mittauksia käyttämällä spektrofotometriä (ND-1000 spektrofotometrillä, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay (Pierce Chemical Co., IL, USA). RNA laatu analysoitiin 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja tarkasti olla RNA eheyden numeron ≥6.

Reaaliaikainen RT-PCR

RNA käänteisfaasi- transkriptoidaan Superscript II käänteistranskriptaasilla (Invitrogen) kokonaistilavuudessa 10 ui. Sen jälkeen PCR-monistus suoritettiin käyttäen Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) tai ABI PRISM 7900HT Instrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) kokonaistilavuudessa 20 ui käyttäen IQ SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad Laboratories) tai TaqMan geeniekspression Mastermix (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Tukholma, Ruotsi) mukaan valmistajien protokollia. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Kukin näyte ajettiin kahtena kappaleena ja oikaistu vastaavan RPL13A mRNA-tasoja. Sulamiskäyräanalyysillä vahvisti monistetut tuotteet, jotka analysoitiin myös 1% agaroosigeelielektroforeesilla vahvistaa odotetun koon (tuloksia ei ole esitetty).

immunohistokemia

Näytteet kiinnitettiin puskuroituun formaliiniin, kalkittomat muurahaishapossa ja valettiin parafiiniin [5]. Viisi um parafiinileikkeet poistettiin parafiini standardimenetelmien mukaisesti, keitetään 0,01 M sitraattipuskurissa, pH 6,0, ja immunovärjättiin AKR1C3 (NP6-G6.A6, laimennettiin 1:1000, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA), AR (PG -21, laimennettu 1:25, Upstate, Lake Placid, NY, USA), PSA (A0562, laimennettu 1:2000, DAKO, Glostrup, Tanska) ja Ki67 (MIB1, laimennettu 1:50, DAKO) kanssa Ultraview Universal DAB Detection Kit (Ventana Medical Systems). Nuclear AR ja sytoplasmaattinen AKR1C3 ja PSA värjäyksen kasvaimen epiteelisolujen pisteytettiin mukaan voimakkuuden (0 = ei värjäystä, 1 = heikko, 2 = kohtalainen, 3 = voimakas värjäytyminen) ja osa värjättyjen solujen (1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%). Kokonaispistemäärä (vaihteluväli 0-12) saatiin kertomalla värjäytymisen intensiteetti ja murto tulokset. Ki67 pisteytettiin arvioimalla 300-1000 kasvain epiteelisolujen potilasta kohden, kuten aiemmin on kuvattu [5].

Kopioi numero analyysi

kopioluku AKR1C3 geenin PC luuetäpesäkkeissä tutkittiin käyttäen Hs03060693_cn ja Hs02574521_cn TaqMan kopiomäärä määritykset (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Tukholma, Ruotsi), kohdistaminen AKR1C3 eksonin 2 ja eksonin 7, vastaavasti. Kokeet sujua valmistajan kuvaus, jossa RNaseP referenssinä geeni, ja analysoitiin käyttäen Copy Caller ohjelmisto (Applied Biosystems).

Immunoblottausmääritys

22Rv1 soluja huolletaan valmistajan ohjeiden ( ATCC) ja proteiini uutettiin kuten edellä. Näytteet (10 ug proteiinia) erotettiin 7,5% SDS-PAGE: lla pelkistävissä olosuhteissa ja siirrettiin sen jälkeen PVDF-kalvoille (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Kalvot blokattiin 5% maitoa seurasi ensisijainen vasta-inkuboimalla 4 ° C: ssa yli yön (N-20-vasta-ainetta laimennettuna 1:500 1% maito /PBST, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), jotta voidaan havaita koko pituus AR ja noin 80 kDa katkaistun AR-Vs ehjät N-terminaalit. Sekundaarinen anti-kani-IgG: tä (Dako, Glostrup, Tanska), vasta-ainetta (laimennettu 1:20 000 2,5% maito) levitettiin pesun jälkeen PBST: ssä ja inkuboitiin 1 h RT: ssä. Proteiinin ilmentyminen visualisoitiin jälkeen pesty käyttämällä ECL Advanced havaitseminen kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Suodattimet kuorittiin sitten, standardimenetelmien mukaisesti, ja analysoitiin aktiinin proteiinin tasot käyttäen kanin anti-aktiini-vasta-aine SIGMA (Saint Louis. Missouri), laimennettu 1:8000, jotta varmistetaan yhtä suuri näyte lastaus. ECL signaalit kvantitoitiin käyttäen ChemiDoc skanneri ja Määrä One 4 ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories). Intensiteetti 80 kDa kullekin potilaalle näyte analysoitiin ja ilmaistiin suhteessa vastaavaan täyspitkä AR kaistan intensiteettiä. 22Rv1 solu-uute ajettiin positiivisena kontrollina näyte kustakin geelillä.

Tilastollinen

väliset korrelaatiot muuttujien analysoitiin Spearmanin testiä. Ryhmät verrattiin käyttäen U-testi jatkuvien muuttujien ja Chi-neliö testi kategorisen muuttujia. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin kuoleman PC tapahtuman ja seuranta-ajan ajan välillä etäpesäke kirurgian ja uusimmat seurantatutkimuksessa (joulukuu 2012). Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences, SPSS 20,0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, USA). P-arvo yhtä suuri tai pienempi 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Ei induktio steroidien entsyymien kastraatio kestävä verrattuna hormonia naiivi luuetäpesäkkeistä

geeniekspressiotasot keskeisten entsyymien mukana muodostumista testosteronin ja DHT kolesterolia (kuvio 1) arvioitiin RT-PCR-analyysi HN (n = 9) ja CRPC luun etäpesäkkeitä (n = 45) verrattuna ensisijaisen kehävyöhyke eturauhasen kasvain (n = 13) ja ei-pahanlaatuiset eturauhasessa (n = 13).

Entsyymit huomattavasti korkeammat mRNA havaittiin luun etäpesäkkeitä kuin ei-pahanlaatuisten ja /tai pahanlaatuisen eturauhasen kudosta on lihavoitu ja entsyymit on huomattavasti alhaisemmat havaitun luun etäpesäkkeitä näkyvät

kursiivilla

. Steroidit erittyy lisämunuaisten on korostettu harmaalla.

Yhtään analysoitu entsyymien steroidogeneesiin polku (kuva 1 ja 2) osoittivat merkitsevästi eri mRNA-ekspressiotasot välillä HN ja CRPC etäpesäkkeitä luustossa (vertailun välillä etäpesäkkeitä ja eturauhasessa katso alla). Vaihtelevuus eri CRPC etäpesäkkeitä oli kuitenkin suuri ja yksilöiden erityisen suuri spesifisten steroidien entsyymien havaittiin CRPC ryhmässä (kuva 2).

Kaikki mRNA korjattiin mRNA tasoilla taloudenhoito geenin RPL13A ja normalisoitu mediaani primaarikasvaimen näytteitä. * P 0,05. ** P 0,01, *** P 0,001. Avoimet ympyrät osoittavat poikkeavia havaintoja ja ääripäitä. X tarkoittaa äärimmäistä ulkopuolella mittakaavassa.

Eturauhassyöpä luuetäpesäkkeistä voi muuntaa heikko kiertävän androgeenien osaksi voimakkaampi joukkoon, mutta todennäköisesti on alhainen yleinen kapasiteetti de novo steroidogeneesiin

Transcript tasot entsyymit aikaiset vaiheet steroidien pienennettiin HN ja CRPC luun etäpesäkkeitä verrattuna ei-pahanlaatuista eturauhasen kudoksen (kuvio 2); mediaani CYP11A1, CYP17A1 ja HSD3B2 mRNA-tasot olivat 0,15, 0,29 ja 0,32 kertaa HN ja 0,14, 0,32, ja 0,31 kertaa CRPC luuetäpesäkkeistä pitoisuuksiin verrattuna ei-pahanlaatuinen eturauhasessa (P = 0,004, 0,025 ja 0,071, ja P = 0,00004, 0,019 ja 0,01, vastaavasti). Mediaani CYP11A1 mRNA tasolla CRPC etäpesäkkeet oli 0,41 kertaa tasoon verrattuna ensisijainen kasvainkudoksessa (P = 0,011, kuva 2), kun taas CYP17A1 ja HSD3B2 mRNA tasot CRPC luun etäpesäkkeitä eivät merkittävästi poikkea tasoilla ensisijainen kasvainkudoksessa. Kuitenkin CYP11A1 mRNA-tasot korreloivat vastaavaan CYP17A1, HSD3B2, SRD5A1 ja SRD5A2 mRNA tasoilla CRPC etäpesäkkeitä (R = 0,80, P 0,000001, R = 0,740, P 0,000001, Rs = 0,53, P 0,0002, ja Rs = 0,70, P 0,000001), mikä osoittaa, että varhainen vaiheet steroidien voisi olla aktiivinen yksittäisissä etäpesäkkeitä.

Transcript tasoja monien entsyymien mukana myöhemmissä vaiheissa androgeenisynteesin korotettiin etäpesäkkeitä verrattuna ei-pahanlaatuinen eturauhasen ja primaarisen kasvaimen kudoksessa (kuvio 2). Mediaani AKR1C3 ja AKR1C2 mRNA tasot olivat 5,5 ja 5,4 kertaa suurempi HN (P = 0,03, P = 0,007) ja 3,7 ja 5,8 kertaa suurempi CRPC luun etäpesäkkeitä (P = 0,0006, P = 0,00008), tässä järjestyksessä, verrattuna ensisijainen eturauhasen kasvaimia. Havaitsimme siirtyminen SRD5A2 ja SRD5A1 mRNA: n ilmentymisen kanssa etenemistä hyvänlaatuisen eturauhasen PC ja PC etäpesäkkeiden (kuvio 2), joka on tulosten mukaisesti aiemmissa tutkimuksissa [14], [15], [19]. Samanlainen siirtyminen ensisijaisesti HSD17B6 ilmentymistä ei-pahanlaatuinen ja ensisijainen eturauhasen kasvain kudosta lähinnä HSD17B10 ilmentymistä PC etäpesäkkeitä oli lisäksi huomattava (kuva 2). AKR1C3 mRNA-tasot olivat merkittävästi korreloi AKR1C2 ja UGT2B15 mRNA-tasot (R = 0,39, P = 0,008 ja R = 0,49, P = 0,001).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PC luun etäpesäkkeitä potilailla voi on aiheuttama kykyä muuntaa androgeenien alhainen AR affiniteetilla osaksi voimakkaampi androgeenien, kun taas

de novo

synteesiä androgeenien kolesterolista on epätodennäköisempää.

Jotkut luuetäpesäkkeistä ilmaista hyvin korkeita AKR1C3

Vaikka yksikään tutkituista steroidien entsyymit osoittivat huomattavasti ekspressiotasot CRPC verrattuna HN luun etäpesäkkeitä, yksittäiset CRPC etäpesäkkeitä havaittiin ilmaista erittäin transkriptitasot (kuvio 2). Eräs entsyymi, joka esittää erityisen suuri mRNA alaryhmässä CRPC etäpesäkkeitä oli AKR1C3. Koska tämä entsyymi on kyky muuntaa kiertävän DHEA ja androsteenidionin (syntetisoitiin in lisämunuaisten) osaksi 5-androstenediol ja testosteroni, sen katsottiin olevan erityisen kiinnostavia.

onko AKR1C3 mRNA tasot etäpesäkkeitä näkyivät vastaavan proteiinin tasot, arvioimme AKR1C3 proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti ja käyttämällä pisteytysjärjestelmää, joka vei sekä värjäyksen intensiteetin ja jakelu huomioon (kuva 3). Sytoplasmisen AKR1C3 immunovärjäys osoitettiin tuumorispesifisimmät epiteelisolujen kun tumavärjäystä oli heterogeenisesti havaittujen ja ei lasketa. Kaikki etäpesäkkeitä oli vahvaa positiivista värjäytymistä endoteelisolujen, kun taas vaihteleva värjäytyminen havaittiin fibroblasteissa ja hematopoieettisten solujen luuytimessä. AKR1C3 immunovärjäyty- kokonaispistemäärä oli korreloi voimakkaasti AKR1C3 mRNA-tasoja vastaavaan etäpesäkkeitä (R = 0,73, P 0,000001, n = 51). Korkea AKR1C3 ilme ei johtunut AKR1C3 geenimonistuksen mukaan AKR1C3 geenikopiomäärä analyysi 6 etäpesäkkeitä näytettä (3 näytettä äärimmäisen AKR1C3 mRNA-tasoja ja yhteensä immunovärjäys tulokset 12 ja 3 näytettä alhainen AKR1C3 ilmaus) suhteessa 2 ei- pahanlaatuinen eturauhasessa (tuloksia ei ole esitetty).

kokonaispistemäärä (vaihteluväli 0-12) saatiin kertomalla värjäyksen intensiteetti pisteet (0-3) kasvaimen epiteelisolujen kanssa positiivinen fraktio pisteet (1 -4). (A) Histogrammi mukaan yhteensä AKR1C3 värjäystä pisteet hormoni-infektoitunut (harmaa) ja kastrointi kestävä (musta) luustometastaaseja. (B) edustaja osassa luumetastaasin kanssa AKR1C3 kokonaispistemäärä 0. (c) edustaja osassa luumetastaasin kanssa AKR1C3 kokonaispistemäärä 12. Bar osoittaa 100pM.

CRPC etäpesäkkeitä luustossa, The AKR1C3 yhteensä värjäys pisteytys korreloi UGT2B15 mRNA-tasot (R = 0,39, P = 0,009, n = 43), mikä saattaa olla osoitus DHT tuotantoa etäpesäkkeet korkean AKR1C3 proteiinin ilmentymisen. Oli kuitenkin selvää, että korkea AKR1C3 -proteiiniekspressio eivät suoraan liity korkea AR aktiivisuus CRPC etäpesäkkeitä; 14 ulos 18 (78%) näytteiden korkea AKR1C3 värjäys tulokset, määritellään AKR1C3 immunovärjäyty- pisteet yli mediaani (6), ja 15/25 (60%) näytteet, joilla on alhainen AKR1C3 värjäyksen tulokset (≤6) osoitti ydinvoiman AR värjäys tulokset (≥8, edellä mediaani määritellyn [5], P = 0,22). Mukaisesti aiempien tulosten [5], korkea AR immuunivärjäyty- etäpesäkkeet liittyi lyhyempi syöpäspesifisessä selviytymisen jälkeen etäpesäke leikkauksen (log-rank = 8,1, P = 0,004, n = 45). Vastakohtana tälle, ei ollut mitään korrelaatiota välillä havaittiin AKR1C3 immunovärjäykseen ja syöpää erityisiä eloonjäämistä CRPC potilaiden jälkeen etäpesäkkeiden leikkauksen (tuloksia ei ole esitetty). Ei myöskään ollut yhdistyksen välillä havaittu AKR1C3 immunovärjäyty- pisteet ja PSA värjäytyminen pisteet (tuloksia ei ole esitetty) tai kasvainsoluproliferaation indeksin (Ki67 värjäys pisteet, tuloksia ei ole esitetty).

ilmentäminen steroidien entsyymien suhteen tasot androgeenireseptorin silmukoitumisvariantit

AR proteiinin tasot tutkittiin immunoblot-analyysi 29 CRPC luuetäpesäkkeistä valittava AR immunohistokemia tuloksiin sisällyttää AR alhainen AR korkeat pisteet etäpesäkkeitä, ja jos riittävä kudos pysyi sallia immunoblot analyysi. Täyspitkä AR on suunnilleen 110 kDa: n havaittiin useimmissa tapauksissa, kun taas katkaistun AR-Vs on noin 80 kDa, oletettu edustavat AR silmukoitumisvariantit, josta puuttuu LBD C-terminaalinen domeeni, havaittiin joissakin tapauksissa (kuvio 4). Intensiteetti 80 kDa-bändi oli vahvasti korreloi vastaavan AR-V7 mRNA tasolla (R = 0,76, P 0,000002, tuloksia ei ole esitetty), mukaisesti omien aiempien tulosten [8]. Hornbergissä et ai [8] potilailla, joilla on suuri etäpesäkkeiden tasot AR-V7 mRNA, määritellään olevan mRNA-tasot ylimpään neljännekseen, havaittiin olevan erittäin huono ennuste. Tämän tiedon perusteella, ja käyttäen samanlaista lähestymistapaa, 7 näytettä analysoitiin immunoblottauksella määriteltiin ilmaisemaan korkeita AR-Vs suhteena intensiteetit 80 ja 110 kDa: n juovat tavataan 75

persentiilin tietojen (≥0.5).

analyysi suoritettiin käyttäen vasta-ainetta, joiden tavoitteena on N-terminaalinen domeeni AR. 22Rv1 solu-uute sisällytettiin positiivisena kontrollina.

Mielenkiintoista, vain yksi 13 (7,8%) CRPC etäpesäkkeet korkea AKR1C3 ilme (immunovärjäyty- pisteet edellä mediaani) osoittivat myös korkean AR-V-proteiinia tasoilla. Tämä oli huomattavasti pienempi osa kuin joukossa etäpesäkkeet alhainen AKR1C3 tasolla (6/15, 40%, P = 0,049). Olemme lisäksi arveltu, että kasvainsolun ilmaus AKR1C3 ja konstitutiivisesti aktiivinen AR variantteja voi olla merkitystä yksittäisten kasvaimen vaste 2

toinen linja ADT ja kliiniseen etenemiseen [8], ja 28 luustometastaaseja arvioitava sekä AKR1C3 ja AR-V ilme oli siten jaoteltu niiden AR-V ja AKR1C3 proteiinin ekspressiotasoja, kuten kuvassa 5, jotta voidaan osoittaa alaryhmiä voi olla kliinistä merkitystä.

korkea AKR1C3 olivat pohjimmiltaan todettu etäpesäkkeitä alhainen tasot AR-Vs ja päinvastoin (P = 0,049, mukaan Chi-square test).

on huomattava, yksikään etäpesäkkeiden homogeenisen AKR1C3 värjäys, eli osa positiivisesti värjäytyneiden solujen yli 75% , osoitti korkea AR-V tasoa verrattuna 7/15 etäpesäkkeitä 75% positiivisesti värjäytyneiden solujen (P = 0,004). Tämä havainto ansaitsee tutkitaan edelleen, koska se saattaa osoittaa, että korkea AR-V tasoja indusoituu parempi kasvaimissa soluja ilman endogeenistä steroidogeneesiin. Valitettavasti emme pystyneet tutkimaan tämän hypoteesin heterogeenisuus tuumorisoluihin vasta immunohistokemiallista arviointia AR-Vs eivät olleet saatavissa.

Keskustelu

sisäiset kasvaimen synteesiä testosteronin ja DHT on ehdotettu vaikuttavan CRPC kasvua. Tässä tutkimuksessa verrattiin ilmentymisen tasoja steroidien entsyymien CRPC luumetastaaseja tasoihin etäpesäkkeitä saatu un saaneista ja yllättävästi löytänyt induktio tutki entsyymien CRPC verrattuna HN etäpesäkkeitä. Olemme kuitenkin löytäneet korkeita ekspressiotasoja tiettyjen steroidien entsyymien; SRD5A1, AKR1C2, AKR1C3, ja HSD17B10, luun etäpesäkkeitä verrattuna hyvänlaatuisen eturauhasen ja ensisijainen eturauhasen kasvain kudosta. Lisäksi pystyimme osoittamaan selviä eroja ekspressiotasot AKR1C3 ja tasojen AR silmukointivarianteista yksittäistapauksissa CRPC luuetäpesäkkeistä, jota oletamme voisi olla merkitystä potilaan vaste 2

toinen linja hoitoja.

Tissue androgeenien voisi olla peräisin

de novo

synteesiä kolesterolista [20], [21] tai muuntamalla lisämunuaisen prekursorien voimakkaampi steroidien [22]. Tuloksemme osoittavat yleensä korkeita AKR1C3 ja SRD5A1 in etäpesäkkeet ovat linjassa aikaisempien raporttien [14], [15], [16] ja saattaa ilmoittaa synteesiä testosteronin ja DHT yhdessä ja kahdessa vaiheessa, vastaavasti, lisämunuaisen johdettuja androsteenidionin . Jonka toimintaa SRD5A1, DHT voidaan myös syntetisoida 5α-vähentämistä androsteenidionin androstanedione ja sitten edelleen vähentäminen androstanedione DHT AKR1C3. Tämä reitti DHT synteesi, joka ohittaa testosteroni, äskettäin osoittaneet Chang ja työtoverit hallitsevat CRPC solulinjoissa sekä potilaan etäpesäkkeitä yksilöitä stimuloidaan androsteenidionin [23]. Lisäksi korkea AKR1C2 ja HSD17B10 tehdä DHT synteesi kautta androsterone ja androstaanidioli mahdollista yksittäistapauksissa, samanlainen kuin mitä on havaittu PC solulinjoissa sekä kastraatio kestävä CWR22R- hiirissä [24]. Sisäiset kasvaimen synteesi androsterone ja androstaanidioli voisi stimuloida kasvaimen kasvua paitsi väli- steroideja DHT synteesi, mutta myös niin voimakas AR aktivaattoreita tapauksissa kanssa mutatoitunut AR [25]. Samoin voisi androstenediol, presumingly tuotetaan DHEA etäpesäkkeet kanssa AKR1C3 aktiivisuutta, aktivoi AR erityisiä mutaatioita [26]. Toisin kuin alussa raportit [14], [15], mutta linjassa Hofland ja työtoverit [16], löysimme alhainen ekspressiotasot CYP11A1, CYP17A1 ja HSD3B2 sekä käsittelemätöntä ja CRPC etäpesäkkeitä. Korkea CYP11A1, CYP17A1 ja HSD3B2 mRNA tasot sijaan todettu ei-pahanlaatuinen eturauhasessa, ehkä johtuen korkeasta synteesiin ne entsyymit normaalissa eturauhasessa stroomasolujen, ja sama päti SRD5A2 ja HSD17B6 [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Tästä haluamme päätellä, että lisämunuaisen johdettuja Androgeenit todennäköisesti edistää kasvua CRPC luuetäpesäkkeistä niiden sisäiset metastasoitunut muuntaminen voimakkaampi androgeenien, kun taas

de novo

synteesiä Androgeenien kolesterolista sisällä etäpesäkkeitä on epätodennäköisempää , paitsi ehkä yksittäistapauksia vastaaviin ilmaus CYP11A1, CYP17A1, ja HSD3B2.

Löysimme korkeat ekspressiotasot AKR1C3 in alaryhmä PC luuetäpesäkkeistä, jotka vahvistavat tuloksia aikaisemmin raportoitu kastraatio kestävä ensisijainen eturauhasen kasvaimia [16], [31] ja CRPC kudosten erilaisten metastaattisen alkuperä [14], [15], [32]. Nousu AKR1C3 toiminta voisi ilmeisesti osaltaan muuntaminen lisämunuaisen johdettujen steroidien kohdalla voimakkaampi AR-ligandeja, kuten edellä on käsitelty, ja AR aktivointi CRPC. Samoin Hamid ja työtoverit osoittivat AKR1C3 riippuvainen synteesiä testosteronin CRPC stimuloitu DHEA [31]. Hyödylliset vaikutukset korkeat AKR1C3 tasojen HN etäpesäkkeitä tai etäpesäkkeitä alhaisen ydin- AR immunovärjäystä, kuten on osoitettu joissakin tapauksissa tässä tutkimuksessa, eivät ole yhtä selviä, mutta voi riippua muita reaktioita ohjaavat tämän entsyymin. Lisäksi 17β-hydroksisteroididehydrogenaasi (17β-HSD) aktiivisuus AKR1C3 myös hallussaan prostaglandiini F (PGF) aktiiviseen toimintaan, joka johtaisi leviämisen PC soluissa riippumaton androgeenireseptorin ja AR tila johtuu muodostumisen PGF epimeereistä ja aktivoitumista FP reseptorin ja myös ehkäisemällä PGJ2 muodostumisen ja sen pro-eriyttää ja antiproliferatiivisia vaikutuksia [33].

Yhteenvetona haluamme korostaa, että lisääntynyt kasvain ilmentymistä steroidien entsyymien yksittäisillä potilailla ei ole selvästi yhteydessä CRPC vaan liittyy kehittynyt kasvain vaiheessa, koska se voidaan nähdä paitsi CRPC kudoksessa eri alkuperää [14], [15], [16], [31], [32], mutta myös aiemmin YK-käsitelty, HN, etäpesäkkeitä luustossa (tässä tutkimuksessa). Lisäksi tämä tutkimus yhdessä aikaisempien tutkimusten mukaan CRPC kasvaimia voitaisiin luokitella erillistä ekspressiomalleja steroidien entsyymien, ja siten todennäköisesti erilainen mekanismeja kastraation-vastus (tässä tutkimuksessa ja [16], [32], [34]). Olemme lisäksi osoittavat, että alaryhmä CRPC luuetäpesäkkeistä ilmentävät korkeita AKR1C3 on pitkälti erillään alaryhmä ilmentävät korkeita LBD-katkaistu, konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs. Mahdollisia kliinistä merkitystä on, että potilaat, joilla on korkea AKR1C3 ilme ja alhainen AR-V ilmaisu voisi olla potilaat, joilla on hyvä vaste hoidon abirateronin asetaatilla (Cyp17 esto, [35]) ja /tai hyötyisivät huumeita kohdistaminen AKR1C3 [36] , kun taas potilailla, joilla on korkea ilmentymä konstitutiivisesti aktiivinen AR-vs todennäköisesti ei reagoi abirateronin asetaatin tai jollekin hoidon kohdistamista androgeenisynteesin tai LBD AR.

rajoitus tähän työhön on rajoitettu määrä luun etäpesäkkeitä, ja lisäksi yksi etäpesäke tutkittua näytettä kustakin potilaista, mikä tietenkin tehdä johtopäätöksiä tästä heterogeeninen sairaus ja yleinen potilaan tila epävarma. Olemme myös tietoisia siitä, että ekspressiotasot eivät välttämättä biologisia toimintoja ja meidän hypoteesia, että kasvain ekspressiokuviota steroidien AKR1C3 ja konstitutiivisesti aktiivinen AR variantit ennustaisi vastauksena 2

toinen rivi hoitoja on CRPC on testattava etukäteen kliinisissä tutkimuksissa.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Alukesekvenssit käytetään reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0077407.s001

(DOC) B

Tiedoksi

Skilful teknisiä apu on annettu Ms Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom, ja Inger Lindström.