Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Raakaöljy otteita

Selaginella

tamariscina

, joka on itämainen lääkeyrtti, on osoituksena hoitoon useiden ihmisten sairauksia. Tässä tutkimuksessa tutkittiin mekanismeja, joilla

Selaginella

tamariscina

estää invasiivisuus ihmisen suun squamous-cell carcinoma (OSCC) HSC-3-soluissa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä osoitamme, että

Selaginella

tamariscina

heikennettyjä HSC-3 solumigraatio ja invaasiota annoksesta riippuvaisella tavalla. Anti-metastasoitunut toiminta

Selaginella

tamariscina

esiintyi ainakin osittain siksi, että säätely alaspäin metalloproteinaasien (MMP) -2 ja MMP-9 gelatinaasiaktiivisuutta ja alas-säätely proteiinin ilmentymiseen. Ilmaisu ja toiminta sekä MMP-2 ja MMP-9 säädeltiin

Selaginella

tamariscina

at transkription tasolla, kuten on esitetty kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ja toimittaja määritykset. Kromatiinin immunosaostus (chip) data ilmoitti lisäksi sitoutuminen cAMP-vaste-elementin sitova (CREB) proteiini ja aktivoiva proteiini-1 (AP-1) ja MMP-2 promoottorin pienentynyt korkeimmalla annostasolla

Selaginella

tamariscina

. DNA-sitova aktiivisuus spesifisyys proteiinin 1 (SP-1), MMP-9 promoottori tukahdutti myös samana pitoisuutena.

Selaginella

tamariscina

ei vaikuttanut mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin signalointireitin, mutta estävät vaikutukset gelatinaasi vähentämällä aktivointi seriini-treoniinikinaasi, Akt.

johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat, että

Selaginella

tamariscina

voi olla voimakas adjuvantti terapeuttista ainetta ehkäisyssä suusyövän.

Citation: Yang JS, Lin CW, Hsin CH, Hsieh MJ, Chang YC (2013)

Selaginella

tamariscina

Vaimentaa etäpesäke kautta Akt Pathways in Oral Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e68035. doi: 10,1371 /journal.pone.0068035

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 23 toukokuu 2013; Julkaistu: 14 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimus avustusta National Science Council, Taiwan (NSC100-2632-B-040-001-MY3). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pään ja niskan levy–cell carcinoma vastaa noin 3% kaikista syövistä Yhdysvalloissa, ja suun squamous-cell carcinoma (OSCC) on yleisin muoto pään ja kaulan alueen syöpä [1]. Korkeilla etäpesäkkeitä kaulan imusolmukkeet aiheuttaa huono eloonjäämisaste suusyövän [2]. Syöpäsolut yleensä leviää erittämällä erilaisia ​​molekyylejä, jotka hajottavat soluväliaineen (ECM), valtaavat verisuonia, ja vaeltavat kaukaisiin elimiin [3]. Matrix (MMP) ovat merkittävä ryhmä entsyymejä, jotka säätelevät ECM koostumus normaalin kehityksen ja patologisia vasteita [4]. Vaikka erilaisia ​​MMP edistää syöpäsolumetastaasi, gelatinaasien MMP-2 ja MMP-9 on suurin intensiivisesti tutkittu [5]. MMP-2, joka tunnetaan myös gelatinaasi A, on 72-kDa: n proteiini, joka ilmentyy suurimmassa osassa kudoksia ja soluja [6]. Sen sijaan, MMP-9 (gelatinaasi B), joka on 92-kDa: n proteiini, on ehdollisesti havaittu leukosyyttejä [7]. Kohonnut MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun on havaittu invasiivisen ja metastaattisen tapauksissa ihmisen suusyövän [8-10]. Siten tiivistetty on pyritty kehittämään MMP-inhibiittorit (MMPIs) pysäyttämään syöpäsolujen leviämiseen [11].

Selaginella

tamariscina

on yrtti käytetään perinteisesti itämaisen lääketieteen jonka useat terapeuttinen kykyjä. Ensiksi, koska

Selaginialla tamariscina

on osoitettu vähentävän veren sokeria ja seerumin Lipidiperoksiditasot, se osoittaa mahdollisten käyttötarkoitusten diabeteksen hoidossa [12,13]. Toiseksi bioflavonoideja eristää

Selaginella

tamariscina

osoittanut antibakteerisia ja antifungaalisia vaikutuksia [14-16]. Kolmanneksi, raa’at otteet

Selaginella

tamariscina

ovat esti ihmisen mesangiumsolujen lisääntymisestä ja ovat vähentyneet interleukiini-1-beeta ja tuumorinekroositekijä-alfan tuotantoa [17]. Neljänneksi,

Selaginella

tamariscina

voisi olla potentiaalinen chemopreventive aineena erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa, kuten mahasyövän [18], keuhkosyöpä [19], rintasyöpä [20], ja kohdunkaulan syöpä [21]. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia valaista vaikutuksia

Selaginella

tamariscina

ihmisen OSCC HSC-3-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että

Selaginella

tamariscina

pysähtyi suun syöpäsolu läpi kulkeutumista alas-MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun ja vähentämällä DNA-sitoutumisaktiivisuutta promoottori elementtejä. Lisäksi antimetastaattisia vaikutukset liittyvät inaktivoimiseksi seriini-treoniinikinaasi Akt.

Materiaalit ja menetelmät

Ote

Selaginella

tamariscina

Selaginella

tamariscina

hankittiin yrtti tallentaa ja kuivattu kasveista (100 g) uutettiin kahdesti 500 ml: lla 50% etanolia tislatussa vedessä. Yhdistetyt uutteet suodatettiin ja väkevöitiin 70 ° C: ssa pyöröhaihdutinta käyttäen alhaisessa paineessa. Konsentroitu Raakauute jäädytettiin -80 ° C: ssa 2-3 päivää, ja sitten se pakastekuivattiin lyofilisaattorissa ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Uuttosaanto oli 2,8% (w /w) ja kemiallinen profiilia Selaginella tamariscina ote (ETS) analysoitiin korkean paineen neste kromatogrammit (HPLC) -mass spektrometri [19]. Lyhyesti,

Selaginella

tamariscina

analysoitiin HPLC-massa- spektrometrillä käyttäen HPLC (Hitachi L-6200, jossa on L-4500 diodirividetektori) ja PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF-massa- spektrometri. Näytteet (10 ui) ruiskutettiin Merck LiChrospher 100 RP-18-kolonnia (4 x 250 mm). Pylväs tasapainotettiin 0,05% etikkahappoa /vettä (liuos A) ja eluoiden komponenttien saavutettiin lisäämällä pitoisuutta liuosta B (100% asetonitriiliä) 0-100% 30 minuutin ajan virtausnopeudella 1 ml /min. Absorbanssi seurattiin 254 nm: ssä. Molekyyli massat piikit määritettiin sähkösumutusionisaatio massaspektrit käyttäen moninkertaisesti varautunut ioni profile [19]. Uute liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma Co., USA) ja sen eri pitoisuuksina valmistettua myöhempää kokeita.

Soluviljely ja

Selaginella

tamariscina

uute (STE) käsittely

HSC-3, ihmisen kielen levyepiteelikarsinooma solulinja saatiin ATCC: stä (Manassas, VA, USA), viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa (Life Technologies, Grand Island, NY , USA), 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki soluviljelmät pidettiin 37

oC: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Sillä STE hoitoon, sopivat määrät kantaliuosta STE lisättiin viljelyalustaan ​​saavuttaa ilmoitettu pitoisuuksina ja inkuboitiin sitten solujen osoitetun ajanjaksojen taas dimetyylisulfoksidissa ratkaisu ilman STE käytettiin tyhjä reagenssi.

määritys solujen elinkelpoisuus (MTT-määritys) B

solujen elinkelpoisuuden kokeessa mikroviljelylevyille tetratsolium (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) kolorimetrinen määritys suoritettiin määrittämiseksi sytotoksisuuden STE. HSC-3-solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa ja käsiteltiin STE pitoisuutena 0-100 ug /ml 37

° C: ssa 24 h. Valotuksen jälkeen ajan, väliaine poistettiin, ja solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja inkuboitiin sitten 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 4 h. Elinkykyisten solujen määrä per malja on suoraan verrannollinen tuotannon formatsaanin, jota voidaan mitata spektrofotometrisesti 563 nm: ssä seuraavan liuottamalla isopropanolilla.

In vitro haavansulkemiseen

HSC-3-soluja (1 x 10

5 solua /kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia, haavoittui raaputtamalla pipetin kärjen, sitten inkuboitiin DMEM-alustalla, joka sisälsi 0,5% FBS: ää ja käsiteltiin kanssa tai ilman STE (0, 25, 50 , 75 ja 100 ug /ml) 0, 12 ja 24 h. Solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa (x 100).

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Solun maahanmuutto- ja invaasion analysoitiin menetelmien mukaisesti kuvanneet Yang et al. [19]. Käsittelyn jälkeen STE (0, 25, 50, 70 ja 100 ug /ml) 24 tuntia, elossa solut kerättiin ja kylvetään Boyden kammioon (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) 10

4 solut /hyvin seerumittomassa väliaineessa ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tuntia 37

oC. Sillä invaasiomääritys, 10 ui Matrigel (25 mg /50 ml, BD Biosciences, MA, USA) pantiin 8 um huokoskoon polykarbonaattikalvosuodattimia ja alaosaan sisälsi standardin väliaineessa. Suodattimet olivat kuivattiin sitten ilmassa 5 tuntia laminaarivirtauskaapissa. Tunkeutuneet solut kiinnitettiin 100% metanolia ja värjättiin 5% Giemsa. Solujen lukumäärät laskettiin valomikroskoopilla. Migraatiokokeessa suoritettiin kuvatulla tavalla invaasiomääritys ilman pinnoite matrigeelin.

määritys MMP-2 ja MMP-9 gelatiinitsymografialla

toiminta MMP-2 ehdolliseen keskipitkän mitattiin gelatiinitsymografialla proteaasin määrityksiä. Lyhyesti, kerätyt media sopivan määrän (oikaistuna elintärkeää solujen määrä) valmistettiin SDS-näytepuskurissa ilman kuumennusta tai vähentäminen ja alistettiin 0,1% gelatiinia-8% SDS-PAGE-elektroforeesilla. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin 2,5% Triton X-100, ja sitten inkuboitiin reaktiopuskuria (40 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM CaCl

2 ja 0,01% NaN3: a) 12 tuntia 37

oC . Sitten geeli värjättiin Coomassie brilliant blue R-250.

valmistaminen kokosoluliuotteista

kokosoluliuotteista valmistamiseksi, solut huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja raaputettiin 0,2 ml: lla kylmää RIPA-puskuria sisältäviä proteaasinestäjät cocktail, ja sitten pyöritettiin 4

oC 10 minuutin ajan. Solulysaatit altistettiin sentrifugoimalla 10000 rpm: ssä 10 min ajan 4

oC, ja liukenematon pelletti heitettiin pois. Proteiinipitoisuus kokosolulysaateille määritettiin Bradford-määrityksellä.

Western blot-analyysi

20 ug näytteet kokosoluliuotteista tai ydin- jakeet erotettiin SDS-PAGE: lla 10% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle käyttäen Mini-Protean Tetra Elektroforeesi System kuten aiemmin on kuvattu [22]. Blottia jälkeen sitä inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) 1 h estää ei-spesifinen sitoutuminen, ja sitten yön polyklonaalisilla vasta-aineilla MMP-2, MMP -9, TIMP-1, TIMP-2, kolme MAPK (ERK 1/2, JNK 1/2 ja p38), tai Akt erityisten vasta-aineiden fosforyloitumaton tai fosforyloidun muotoja vastaavan ERK 1/2, JNK 1/2 , p38 ja Akt. Blotteja inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasi vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IgG: ssa 1 tunti. Jälkeenpäin signaali havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) kaupallinen (Amersham Biosciences) ja suhteellinen valokuvaus- tiheys kvantitoitiin skannaamalla negatiivit geelillä asiakirjat ja analysointijärjestelmä (AlphaImager 2000, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA ).

RNA: n valmistaminen ja TaqMan kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin suun syöpäsolujen käyttäen Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen Taqman yksivaiheista PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng kokonais-cDNA lisättiin per 25 ui reaktiossa MMP-2, MMP-9 tai GAPDH-alukkeita ja Taqman. MMP-2, MMP-9 ja GAPDH-alukkeita ja koettimet suunniteltiin käyttäen kaupallista ohjelmistoa (ABI PRISM Sequence Detection System; Applied Biosystems). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-määrityksissä suoritettiin kolmena rinnakkaisena on StepOnePlus sekvenssin tunnistusjärjestelmä. Se oli vahvistettu yläpuolella ei-mallin ohjaus tausta ja lineaarisella vaiheessa kohdegeenin vahvistus laskea syklin, jossa kopio todettiin.

Transfektio ja MMP-2, MMP-9 promoottori perustuva Lusiferaasimäärityksiä

HSC-3-soluja ympättiin pitoisuutena 5 x10

4 solua per kuoppa 6-kuoppaisille soluviljelylevyille. 24 tunnin inkubaation, pGL3-basic (vektori), MMP-2 tai MMP-9-promoottorin plasmidi kotransfektoitiin kanssa β-galaktosidaasin ekspressiovektorilla (pCH110) soluihin käyttäen Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). 12 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut käsiteltiin ajoneuvon tai STE (0 tai 100 ug /ml) 24 tuntia. Solulysaatit otettiin talteen ja lusiferaasi-aktiivisuus määritettiin käyttämällä lusiferaasianalyysissä kit. Arvo lusiferaasiaktiivisuuden normalisoitiin transfektion tehokkuuden ja seurataan β-galaktosidaasin ilmentymistä.

Kromatiini immunosaostusanalyysille (ChIP) B

Kromatiini immunosaostus-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23,24] . DNA immunosaostettiin anti-CREB, anti-SP1 tai anti c-fos puhdistettiin ja uuttamalla fenoli-kloroformia. Immunopresipitoidun DNA analysoitiin PCR: llä tai kvantitatiivinen PCR käyttäen spesifisiä alukkeita, kuten on kuvattu aiemmin [23].

Tilastollinen

Kaikille mittausten varianssianalyysi seurasi Scheffe jälkikäteen verrattuna käytettiin arvioimaan eroja valvontaa ja solujen käsiteltiin erilaisilla pitoisuus STE. Ero at p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja kokeet toistettiin kolmesti.

Tulokset

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

HSC-3 solujen elävyyden ja liikkuvuus

HSC-3 solujen elinkykyä, kun läsnä on eri pitoisuuksina (0-100 ug /ml)

Selaginella

tamariscina

24 tuntia, on esitetty kuviossa 1A . Jopa korkein pitoisuus, 100 ug /ml, ei ollut sytotoksinen vaikutus HSC-3-soluja. Käytimme 0-100 ug /ml

Selaginella

tamariscina

suorittaa seuraavissa kokeissa. Kuvio 1B esittää tuloksia käyttäen alusta-haavan määrityksessä laskea siirtyminen kyky HSC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla

Selaginella

tamariscina

. Tulokset osoittavat, että

Selaginella

tamariscina

vähentää merkittävästi solun liikkuvuus sekä ajasta ja annoksesta riippuvasti (p 0,001) (kuvio 1 B ja 1 C).

(A) HSC-3-soluja käsiteltiin STE (0, 25, 50, 75 ja 100 ug /ml) 24 tuntia, ennen kuin sille tehdään MTT-määritys solun elinkelpoisuuden. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (B) HSC-3-solut haavoittuneen ja sitten käsiteltiin vehikkelillä (DMSO) tai STE (0, 25, 50, 75 ja 100 ug /ml) 0h, 12 h ja 24 h 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa. Klo 0, 12 ja 24 tuntia, vaihe-kontrastin kuvia haavoista kolmessa eri otettiin.

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

maahanmuutosta ja invaasio HSC-3-solujen

vaikutusten tutkimiseksi

Selaginella

tamariscina

solumigraatioon ja invaasiota, käytimme Boyden kammion määrityksessä havaitsemaan solun liikkuvuus. Kuvio 2A osoittaa, että

Selaginella

tamariscina

esti merkittävästi maahanmuuttoa pitoisuudesta riippuvalla tavalla 24 tunnin ajan. Vastaavasti, kuvio 2B osoittaa, että invasiivisuus HSC-3-solujen vähensi myös inkuboinnin jälkeen eri pitoisuuksien kanssa (0-100 ug /ml)

Selaginella

tamariscina

24 tuntia.

(A) solujen muuttoliike ja (B) soluinvaasiota mitattiin käyttämällä Boyden kammion 16 tunnin ja 24 tunnin ajan polykarbonaattisuodattimille vastaavasti. Siirtyminen ja hyökkäys kyvyt HSC-3-solut kvantifioitiin laskemalla solujen hyökkäsi alapuolelle huokoisen polykarbonaatista kuvatun

Materiaalit ja menetelmät

osassa. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna vehikkeliryhmässä.

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

MMP-2 ja MMP-9-proteiinin ilmentymisen ja entsyymin aktiivisuus

kyky

Selaginella

tamariscina

tukahduttaa muuttavien ja invasiivisia kyvyt HSC-3-solujen vähentämällä MMP-2 ja MMP-9 ilmentyminen arvioitiin käyttäen gelatiinitsymografialla. Kuvio 3A esittää, että entsyymin aktiivisuutta MMP-2 ja MMP-9 tukahdutettiin

Selaginella

tamariscina

pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Korkein pitoisuus

Selaginella

tamariscina

, 100 ug /ml, inhiboivat MMP-2 ja MMP-9-aktiivisuuden 57% ja 51%, vastaavasti (kuvio 3B).

Selaginella

tamariscina

myös vähentää huomattavasti MMP-2 ja MMP-9-proteiinin ekspressiota, kun havaittiin käyttäen western-blottauksella (kuvio 3C). Niinpä ehdotamme, että antimetastaattisia kykyä

Selaginella

tamariscina

ainakin osittain inhiboitu MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun. Tutkimus vaikutuksista STE proteiinin ilmentymistä MMP endogeenisen estäjän, TIMP-1 ja TIMP-2, osoittivat, että STE indusoi TIMP-1 ja TIMP-2 säätelyyn ylöspäin pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3C ja 3D)

(A ja B) HSC-3-soluja käsiteltiin STE (0-100 ug /ml) 24 tunnin ajan ja sitten alistettiin gelatiinitsymografialla analysoida MMP-2 ja MMP-9, tässä järjestyksessä. (C) HSC-3-soluja käsiteltiin STE (0-100 ug /ml) 24 tunnin ajan ja sitten alistettiin western blotting analysoida proteiinin MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ja TIMP-2. (D) määrälliset tulokset MMP-2, MMP-9, TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin tasot, jotka säädettiin β-aktiini-proteiinin tason. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna vehikkeliryhmässä.

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

MMP-2 ja MMP-9 mRNA: n ekspression ja DNA-sitoutumisaktiivisuutta

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

MMP-2 ja MMP-9 mRNA ilmaisun tutkittiin. Alhainen MMP-2 ja MMP-9 mRNA: n ekspressio havaittiin suurimmalla annoksella

Selaginella

tamariscina

(100 ug /ml) 6 tunnin ajan (kuvio 4A ja 4B). Tutkia tarkemmin, kuinka

Selaginella

tamariscina

säätelee transkriptionaalista aktiivisuutta MMP-2 ja MMP-9, teimme lusiferaasireportteri- määritys, jossa sekä

Selaginella

tamariscina

ja ohjaus solut transfektoitiin MMP-2 ja MMP-9 promoottorikonstruktiin. Kuvio 4C osoittaa, että MMP-2-promoottorin aktiivisuuden väheni

Selaginella

tamariscina

annoksesta riippuvalla tavalla. Vastaavasti, noin 50%: n inhibition MMP-9-promoottorin aktiivisuus oli ilmeistä 100 ug /ml

Selaginella

tamariscina

(kuvio 4D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että

Selaginella

tamariscina

säätelee MMP-2 ja MMP-9 aktiivisuutta transkription tasolla.

HSC-3-soluja käsiteltiin STE ( 0, 25, 50, 75 ja 100 ug /ml) 24 h ja sitten suoritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR analysoida mRNA MMP-2 (A), tai MMP-9 (B). (C) MMP-2 tai (D) MMP-9-promoottori reportteri määritys analysoida promoottorin aktiivisuutta MMP. Lusiferaasiaktiivisuus, määritettiin kolmena rinnakkaisena, normalisoitiin P-galaktosidaasin aktiivisuuden. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna vehikkeliryhmässä.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MMP promoottorit säätelevät useat transkriptiotekijät, kuten AP-1, NFKB, CREB, ja SP-1 [23,25,26]. Olemme suorittaneet kromatiinin immunosaostus (ChIP) määrityksessä arvioimaan osallistumista transkriptiotekijöitä estovaikutukset

Selaginella

tamariscina

on MMP-2 ja MMP-9 -aktiivisuuden (kuvio 5A ja 5B) . ChIP määritys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR osoitti, että

Selaginella

tamariscina

olennaisesti tukahdutti sitovat CREB ja SP-1 on MMP-2-promoottorin (kuvio 5A). Kuvio 5B osoittaa, että

Selaginella

tamariscina

huomattavasti inhiboi AP-1, mutta ei NF-KB: n DNA-sitoutumisen MMP-9-promoottori. Nämä tulokset osoittavat, että

Selaginella

tamariscina

esti MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun säätelemällä sitoutumisaktiivisuutta transkriptiotekijöiden on cis-elementin MMP promoottorien.

HSC-3-soluja käsiteltiin STE 100 ug /ml 24 tuntia, ja sitten tumafraktios- valmistettiin, kuten on kuvattu ”

Materiaalit ja menetelmät

”. ChIP analyysi yhdistyksen eri transkriptiotekijöiden kanssa MMP-2 (A) tai MMP-9 (B) promoottorialueen HSC-3-soluissa. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05 verrattuna vehikkeliryhmässä.

vaikutukset

Selaginella

tamariscina

MAPK ja Akt polkuja

tutkimiseksi edelleen taustalla olevien mekanismien alkupään signalointireittejä MMP-2 ja MMP-9, käytimme western blottauksella vaikutusten arvioimiseksi

Selaginella

tamariscina

MAPK ja Akt polkuja. Kuvio 6A-6C osoittavat, että MAPK-reitin, joka sisältää ERK, JNK, ja p38 proteiinikinaasien, ei erityisesti estyy. Kuitenkin,

Selaginella

tamariscina

vähentää fosforylaation Akt annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 6D). Täten ehdotamme, että aktivointi Akt-signalointireitin vaaditaan

Selaginella

tamariscina

tukahduttaa MMP-2 ja MMP-9.

HSC- 3-soluja viljeltiin eri pitoisuuksia STE (0, 25, 50, 75 ja 100 ug /ml) 24 tunnin ajan, ja sitten solujen lysaatit altistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen western blot, jossa (A) anti-ERK1 /2, (B) anti-JNK, (C) ja anti-p38 ja (D) anti-Akt (yhteensä ja fosforyloituu) vasta-aineita, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Määritetyn toiminta Näiden proteiinien jälkeen kvantifioitiin densitometrisellä analyysien, että valvonta on 100%, kuten on esitetty alapuolella geeli tietoja. Edustamat arvot keskiarvoina ± SD on vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. * P 0,05 verrattuna vehikkeliryhmässä.

Keskustelu

Lukuisat lääkekasveja on tutkittu syövän vastaista sovelluksiin, kuten

Dioscorea

nipponica

Makino [23 ] ja

Terminalia

Catappa [26]. Kuluneen vuosikymmenen aikana,

Selaginella

tamariscina

on tullut perinteistä hoitoa eri sairauksiin [14,15,18,19]. Tässä tutkimuksessa, ehdotamme, että

Selaginella

tamariscina

näyttelyitä edullisia vaikutuksia suun kautta syöpäsolun käsittely (1) estämällä HSC-3 suullinen syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota, (2) vähentää MMP- 2: n ja MMP-9-geenin ilmentymisen ja entsyymin aktiivisuus, (3) estämällä fosforylaation AKT, (4) vähentämällä tumaansiirtymiseen CREB ja SP-1 MMP-2-promoottori, ja (5) vähentämällä tumaansiirtymiseen AP-1 MMP-9-promoottori. Lukuisat flavonoideja löytyy raakauutteista

Selaginella

tamariscina

, että niillä on erilaisia ​​farmakologisia vaikutuksia. Amentoflavone merkittävästi pidätettiin solusykleihin ja indusoi apoptoosin ihmisen rinta- ja kohdunkaulan syöpäsolut [21,27,28]. Lisäksi, sumaflavone kohdistuu anti-inflammatorisia vaikutuksia estämällä iNOS ilmaisun AP-1 inhibition [29]. Lisäksi Mirzoeva et al osoittivat, että apigeniini osoittaa antiangiogeenistä potentiaalia eturauhasen karsinooma soluissa inhiboimalla Smad2 /3: n ja Src /FAK /Akt reitit [30]. Edelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että flavonoidit on ratkaiseva rooli antimetastaattisia vaikutukset

Selaginella

tamariscina

, mutta taustalla olevien mekanismien tätä prosessia vaativat lisäselvityksiä.

Metastasis, joka aiheuttaa noin 90% syöpäkuolemista, on prosessi, jossa syöpäsolut leviävät alkuperäisen kasvaimen kaukaisiin elimiin [31]. Hajoaminen ECM komponenttien ja tyvikalvon on kriittinen vaihe etäpesäkkeitä. On olemassa useita erityyppisiä proteaasien, jotka ohjaavat ECM hajoamista ja remodeling. MMP-2 ja MMP-9 ovat laajimmin tutkituista MMP perhe, koska niiden korkea yhdessä syövän muuttoliike ja invaasiota [5]. Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että luonnolliset tuotteet estävät syövän etäpesäkkeiden estämällä MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun [23,26]. Tuloksemme osoittavat, että

Selaginella

tamariscina

inhiboivat MMP-2 ja MMP-9-entsyymin aktiivisuutta, sekä proteiinin ilmentymisen. Väheneminen maahanmuutto- ja invaasion kyvyt johtuvat tukahduttaminen MMP-2 ja MMP-9 aktiivisuus on ehdotettu. Tulokset ovat samanlaisia ​​kuin edellisessä tutkimuksessa, jossa antimetastaattisia vaikutukset

Selaginella

tamariscina

keuhkosyöpäsoluissa tapahtui alentamalla gelatinaasin ilmaisun [19]. Lukuisat raportit osoittavat, että MMP-geenin ilmentyminen oli nimenomaan säätelee mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK), perheen seriini /treoniinikinaaseja myös ERK: t, JNK: ihin, ja p38 [31-33]. Kuitenkin Tutkimuksemme tulokset osoittivat, että mitään havaittavaa vaikutusta MAPK signalointireitin johtui MMP tuotannon

Selaginella

tamariscina

. Lisäksi osallistuminen fosfoinositidi-3 kinaasi (PI3K) /AKT duktioreaktiotiessä MMP geenien ilmentyminen ja solujen vaeltaminen on tutkittu riittävästi. Wang et ai paljasti, että isoliquiritigenin esti ilmaisun ja Gelatinolyyttinen MMP-2 ja MMP-9 säätelemällä ylävirran AKT signaalireaktioteissä rintasyöpä MDA-MB-231-solujen [34]. Toisessa tutkimuksessa todettiin, että berberiini, joka on isokinoliini alkaloidi, esti rintasyöpä solujen etäpesäke moduloimalla AKT-reitin [35]. Tuloksemme ehdotti myös, että PI3K /AKT signalointireitille on mukana ylävirran laukaista MMP-2 ja MMP-9 sääntelyä.

Ilmaisu MMP voidaan säädellä useilla tasoilla, kuten transkriptio, post-transkriptio , käännös, proentsyymisekvenssiä-aktivointi, ja tukahduttaminen tasolla erityisillä inhibiittorit [36]. On ehdotettu, että

Selaginella

tamariscina

säädellään MMP-2 ja MMP-9 transkriptionaalisella tasolla, koska promoottorin aktiivisuutta ja mRNA: n ilmentyminen inhiboituu. MMP promoottorit on useita cis-elementtejä, jotka voidaan transaktivoi useita transkriptiotekijöitä, kuten NF-KB: n, AP-1, CREB, ja SP-1. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että AKT /SP-1-reitin säännelty MMP-2 promoottorin aktiivisuutta ja vaikuttaa siirtyminen kykyä syöpäsoluja [24,37]. Satpathy et al osoittivat, että kudostransglutaminaasi 2 moduloi CREB aktivointi ja MMP-2-transkription munasarjasyövän [38]. Ylävirran promoottorin sekvenssi MMP-9-geeni sisältää AP-1: n ja NF-KB: n sivustoja. Epigallokatekiinigallaattia (EGCG) kykenee sen anti-invasiivisen vaikutus tukahduttamalla AP-1 aktivaatio ihmisen mahasyövän soluihin [39]. Lisäksi NF-KB säätelee MMP-9 erilaisissa syövissä [33,40,41]. Vaikka MMP-9 mRNA ilmentyminen säädeltiin

Selaginella

tamariscina

, emme tarkkailla merkittävä vaikutus NF-KB DNA-sitova toiminta. Tutkimuksemme osoittaa, että MMP-2: n ilmentymistä säätelee CREB ja SP-1 DNA: ta sitovan toiminnan, kun vaikuttaa

Selaginella

tamariscina

, ja AP-1 site olivat välttämättömiä inhibition MMP -9 ilme.

tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että

Selaginella

tamariscina

pienentää suusyövän muuttoliikettä ja invaasiota estämällä MMP-2 ja MMP-9-geenin ilmentymisen, ja entsyymin aktiivisuutta. Nämä anti-kasvain vaikutuksia OSCC liittyvät tukahduttamista AKT ja tukahduttaminen DNA-sitovan toiminnan MMP-2 ja MMP-9 promoottorit. OSCC invaasio ja etäpesäkkeiden ovat merkittävä este syövän hoidossa. Siksi esto etäpesäke mukaan

Selaginella

tamariscina

voisi tarjota tärkeää ennaltaehkäisevä ja terapeuttinen hyöty hoitoon suun syöpä.