Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) on pidetty kriittinen tekijä kohdistaminen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille kasvainten synnyssä. Geneettinen alttius on miRNA-signalointireittien kehittämiseen liittyviä suun okasolusyöpä (OSCC) on edelleen ratkaisematta. Tutkimuksessa selvitettiin yhdistysten polymorfismien neljä miRNA kanssa herkkyys ja kliinis ominaisuudet OSCC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Yhteensä 895 miespuolisilla koehenkilöillä, mukaan lukien 425 valvonta ja 470 miehen suun syöpä potilaat, valittiin. Polymeraasiketjureaktio-restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR-RFLP) ja reaaliaikainen PCR käytettiin analysoimaan miRNA146a, miRNA196, miRNA499 ja miRNA149 geneettisten polymorfismien välillä kontrolliryhmän ja kyseessä ryhmä. Tässä tutkimuksessa määritettiin, että merkittävä yhdistys miRNA499 kanssa CC genotyyppi, verrattuna potilailla, joilla TT genotyyppi, oli suurempi riski (AOR = 4,52, 95% CI = 1,24-16,48) ja OSCC. Lisäksi vaikuttaa näistä neljästä miRNA geenin polymorfia herkkyydestä pähkinä ja tupakan kulutus johtaa suusyövän kävi myös ilmi. Löysimme suojaava vaikutus välillä kliinisen vaiheen kehitystyötä (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36-0,94) ja kasvaimen koon kasvua (AOR = 0,47, 95% CI = +0,28-0,79) nuoremmilla potilailla (ikä 60).

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että geneettistä vaihtelua miRNA499 liittyy suun kautta syövän synnyn, ja vuorovaikutus miRNA geneettistä polymorfismia ympäristön karsinogeenien liittyy myös lisääntynyt riski suusyövästä Taiwanin.

Citation: Chu YH, Tzeng SL, Lin CW, Chien MH, Chen MK, Yang SF (2012) vaikutukset MicroRNA geenipolymorfismien sen herkkyys Ympäristötekijät Johtavat Karsinogeneesi suun Cancer. PLoS ONE 7 (6): e39777. doi: 10,1371 /journal.pone.0039777

Editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine Dartmouth, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 tammikuu 2012; Hyväksytty: 25 toukokuu 2012; Julkaistu: 28 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Chu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MircoRNAs (miRNA) ovat pieni fragmentti RNA: ita, jotka sisältävät noin 20-22 nukleotidia, voidaan kohdistaa tiettyihin mRNA: iden ja säätelemään negatiivisesti niiden translaation tehokkuutta ja vakautta [1]. Aiemmat havainnot ovat osoittaneet, että yksi miRNA voi vaikuttaa ilmaus useiden kohdegeenien. Mukaan säännellään eri kohde-RNA: t, miRNA voivat osallistua solun prosesseihin kuten proliferaatiota, erilaistumista, ja selviytymistä [2]. Altered miRNA ilme on havaittu useissa sairauksissa, erityisesti syövän [3].

Taiwanissa, suun syöpä on neljänneksi yleisin syöpä miehillä. Nopea kasvu ilmaantuvuuden suusyövän tapahtunut viime vuosina ja raakaöljyn kuolleisuus suusyövän oli 10,1 prosenttia 100000 vuonna 2007 ja sijoittui kuudenneksi syy syövän kuolema [4]. Viimeisten vuosien aikana, esiintyvyys suusyövästä oli erityisen korkea Etelä-Aasiassa. Tämä ilmiö näkyy erityisen tottuneiden pureskelua areca- (betelpähkinöiden) mutteri [5]. Epidemiologiset tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että alttius suusyövän välittyy sekä ympäristön karsinogeenien (mukaan lukien alkoholin nauttiminen, tupakan kulutusta, ja pähkinä pureskelua) ja geneettiset tekijät [6]. Yhä enemmän näyttöä siitä, että miRNA liittyy pään ja kaulan /suun syöpä [7], ja useat miRNA on osoitettu olevan sääntelemätöntä pään ja kaulan alueen syöpä [8]. Tämä suhde on määritetty myös laboratoriossa tutkimus [9].

Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) on muunnos DNA-sekvenssi, joka esiintyy, kun nukleotidin (A, T, C tai G) muutos on vähintään 1 % tietyn väestön. Jotkut epidemiologiset todisteet osoittavat, että miRNA geneettisiä muunnelmia etenemiseen liittyvä suusyövän [10], [11]. Vaikka miRNA ovat saaneet paljon huomiota viime vuosina, SNP miRNA ja pre-miRNA-sekvenssien on havaittu olevan yhteydessä niiden kandidaattigeenien [12]. Vuonna dbSNP tietokanta, yli 400 miRNA SNP on dokumentoitu. Saada riittävää tehoa arvioitaessa mahdollisia yhteyksiä, tutkimme miRNA146a (rs2910164), miRNA149 (rs2292832), miRNA196 (rs11614913), ja miRNA499 (rs3746444), joilla on pieniä alleelifrekvenssit ≥5% ja myös sijaitsee ennalta miRNA alueilla Kiinan väestö [13], [14]. Toisessa piirteessä, nämä neljä miRNA-SNP: iden on raportoitu tärkeää kasvaimien synnyn, koska niiden kohdistaminen useita tärkeitä geenejä [15]. Siksi nämä neljä miRNA SNP valittiin tässä tutkimuksessa. Pidimme myös ainutlaatuisen ilmiön Etelä-Aasiassa, missä suurin osa suun syöpä ihmisillä on pähkinä pureskelua tapa. Yhdistimme kliininen tila ja laboratorion tulosten määrittämiseen suhde näiden SNP ja herkkyydestä suusyövän.

Tulokset

tilastollinen analyysi demografisten ominaisuuksien on esitetty taulukossa 1. oli huomattavia eroja jakaumissa betel-mälli pureskelua (

p

0,001), alkoholin kulutus (

p

0,001), ja tupakointi (

p

0,001 ) terveillä verrokeilla ja OSCC potilaita. Koska nämä erot ryhmien välillä voi olla sekoittavat tekijät, sopeutimme nämä ominaisuudet edelleen tilastollinen analyysi.

Jakelu miRNA SNP genotyyppejä on kuvattu taulukossa 2. Meidän terveillä verrokeilla, miRNA polymorfismit (rs2910164 , rs11614913, ja rs3746444) sopeutui Hardy-Weinberg tasapaino, paitsi rs2292832 (

p

0,001). Käytimme logistista regressiomallia arvioida odotusarvo suhteet (AORs). Säätämisen jälkeen iästä, tupakoinnista, alkoholin nauttiminen ja pähkinä pureskelua tottumuksia, huomasimme, että miRNA499 CC genotyypit eläintutkimuksissa merkitsevästi (

p

0,05) korkeampi riski 4.52- (95% CI = 1,24-16,48) ja ottaa OSCC verrattuna vastaavaan villityypin (WT) homotsygootit. Kuitenkin, ei ollut merkitsevästi suurempi suun syöpäriski yksilöiden miRNA146a, miRNA149 ja miRNA196 Monimuotoinen geeni verrattuna WT-geenin.

Koska riskitekijöitä kuten pähkinä pureskelua voi muuttaa geneettinen alttius suusyövän, ja vuorovaikutteinen vaikutusten välillä ympäristöön liittyvien riskitekijöiden ja geneettisten polymorfismien sekä miRNA on esitetty taulukossa 3, taulukko S1 ja Taulukko S2. Potilaat, joilla on vähintään yksi C-alleelin miRNA499 ja pähkinä pureskelua tapana oli kunkin suurempi riski 17.33- (95% CI = 9,63-31,17) ottaa suun syöpä (taulukko 3). Potilaat, joilla on vähintään yksi G-alleelin miRNA146a, C-alleelin miRNA149, tai C alleeli miRNA196, ja pähkinä pureskelua tapa oli kunkin korkeampi riski 9.93- (95% CI = 6,01-16,41), 8.67- ( 95% CI = 5,06-14,89), ja 10.98- (95% CI = 6,21-19,39) ottaa suun syöpä (taulukko S1). Vastaavasti tupakan kulutusta merkittävästi kohonnut suullisen syöpäriskiä henkilöillä Monimuotoinen varten miRNA146a, miRNA149, miRNA196 ja miRNA499 verrattuna yksilöiden WT geenin ilman tupakoinnin (taulukko 3 ja taulukko S2). Arvioimme lisäksi geeni-ympäristö tilastollinen vuorovaikutus miRNA polymorfismien, tupakointi ja betel mälli suusyövän (taulukko 3, taulukko S1 ja taulukko S2). Tilastollinen merkittävyys löytynyt vuorovaikutusta kaikkien miRNA polymorfismien, tupakointi ja betel mälli suusyövän kehitykseen (p 0,05). Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että miRNA geenipolymorfismien on voimakas vaikutus suusyövän alttius pähkinä ja /tai tupakointi kuluttajille.

tutkia vaikutukset polymorfisten genotyyppien miRNA kliinisestä tilasta OSCC, me edelleen luokiteltu OSCC potilaat kahteen alaryhmään: yksi alaryhmä, jossa on ainakin yksi polymorfisen alleelin, ja toinen alaryhmä, joilla on homotsygoottinen WT alleelien. Data tilastollisen analyysi osoitti, että, jotka ovat polymorfisia miRNA499 geeni oli suojaava vaikutus kasvaimen koon kasvua (AOR = 0,46, 95% CI = 0,29-0,72) verrattuna potilailla, joilla on villin tyypin (taulukko 4). Ei kuitenkaan ole merkittäviä yhdistyksen välillä miRNA416a, miRNA149 ja miRNA196 geenipolymorfismien ja ennusteeseen viittaavia kovariaatit havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, verrattuna WT-genotyyppi (T /T), potilailla, joilla on ainakin yksi polymorfinen C alleelin miRNA499 osoitti suojaavaa vaikutusta välillä kliinisessä vaiheessa kehityksen (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36-0,94), ja tuumorin koon kasvuun ( AOR = 0,47, 95% CI = ,28-,79), nuoremmilla potilailla (age≤60), kuten taulukosta S3. Kuitenkaan mitään merkittävää yhdistyksen välillä miRNA499 geenipolymorfismien ja ennusteeseen viittaavia kovariaatit havaittiin iäkkäillä potilailla (ikä 60) (taulukko S4).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, tarjosimme novel tietoa SNP miRNA499 yhdistyksen suun syöpäalttiutta. Yhdistämisen jälkeen merkittävä riskitekijä suusyövän, nämä geneettiset vaikuttaa voi myös lisätä alttiutta suusyövän. Ottaen huomioon aikaisemmat havainnot, miRNA499 on määritetty omaavan voimakasta ilmentymistä sydämen ja luuston lihaksia [16]. Erityisesti sydämessä, aiemmat tutkimukset ovat myös todenneet, että korkea ilmentyminen miRNA499 riskiä sydänlihassolujen hypertrofiaa ja kardiomyopatia. Lisäksi joitakin todisteita siitä, että miRNA499 voi säädellä mitokondrioiden dynamiikkaa läpi kohdistamalla erityisiä proteiineja kuten p53 [17]. Aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että miRNA499 on erittäin liittyy sydänsairauksien säätelevät solujen erilaistumista ja lisääntymistä [18], [19]. Nämä havainnot osoittavat, että miRNA499 on mahdollisesti liittyy sydänsairauksia ja myös syövän synnyn.

Kliinisen tilan, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA-486, miRNA-30d, miRNA-1, ja miRNA-499 näytteillä korkea ilmaisun seerumissa ja olivat liittyy myös selviytymisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [20]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että geneettinen muunnos ennalta miRNA voi edistää prosessia syövän rintasyövän [14], [21], mahasyöpä [22], kohdunkaulan syöpä [23], [24], ja pään ja kaulan syöpä [15]. Tässä tutkimuksessa, ensin osoittaneet, että polymorfismi miRNA499 liittyy suun syöpään.

Aikaisemmissa tutkimuksissa on havaittu, että miRNA146a voi edistää tuumorin etenemistä, etäpesäkkeiden, ennuste, ja selviytyminen ja mahalaukun syövän suusyövän [25 ], [26]. Toinen havainto osoitti myös, että miRNA146a polymorfismi voi säädellä miRNA146a ilmaisun [27]. Useat laboratoriotutkimuksissa ovat myös havainneet, että miRNA146a voi estää solujen erilaistumista ja eloonjääntiä hematopoieesijärjestelmän [28]. Lisäksi yhdistetty syöpään, miRNA146a voisi tukahduttaa soluinvaasiota haimasyövän [29]. Yksityiskohtaisesti, joitakin todisteita yhdistää miRNA146a transkriptiotekijöiden, kuten NF-kB [30]. Nämä havainnot tarjoavat uuden vision, joka miRNA146a voivat vaikuttaa syövän etenemiseen säätelemällä solujen erilaistumista, mutta ei saa vaikuttaa apoptoosia. Vaikka emme löytäneet yhdistyksen välillä miRNA146a ja useissa kliinisissä tiloja tutkimuksessamme, joka perustuu näihin havaintoihin, tulevissa tutkimuksissa voitaisiin harkita yhteistä ennustetta tila tai jopa eloonjääneitä.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat havainneet, että miRNA196 voivat olla vuorovaikutuksessa useiden transkriptiotekijöiden ja mukana syövän kehittymisessä ja etenemisessä [31], [32]. Jotkut havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen miRNA196 johtaa edullisempia ennustetta ja eloonjäämisen leukemia [33]. Lisäksi, miRNA196 liittyy tulehdus tiettyjen syöpien [34]. Lisäksi Christensen et al., Raportoi polymorfia kypsän sekvenssin miRNA196a2 on tapauskontrollitutkimuksessa (n = 1039) pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [35]. Kun kirjoittajat kerrostunut kasvaimen päällä he eivät noudata Merkitsevä yhteys suusyövän ja miRNA196a2, vaikka vaikutus arvio oli suojaava, samanlainen tulokset esitetään tässä tutkimuksessa. Vaikka syy näiden poikkeamien ei tunnettu, erilaiset tulokset raportti ja tässä tutkimuksessa voi koskea rotua /eroa.

Kun otetaan huomioon, että syitä karsinoomat ovat monimutkaisia, olemme analysoineet useita riskejä tekijät, kuten tupakointi ja pähkinä pureskelua tottumuksia, tässä tutkimuksessa. Odotamme, että nämä geenipolymorfismien voi vaikuttaa alttiuteen suusyövän. Tulosten perusteella havaitsimme, että nämä polymorfismit huomattavasti kertoimet suhde kussakin ryhmässä, mahdollisesti koska toimintoja näiden miRNA säännellä erot ja planktonin kasvu kasvaimen etenemiseen. Olemme myös havainneet, että geneettistä vaihtelua miRNA499 liittyy distaalinen etäpesäke OSCC. Aiemmassa tutkimuksessa on peräsuolen syöpä on havaittu, että yli-ilmentyminen miRNA499 voi helpottaa siirtymistä ja hyökkäys syöpäsolujen in vitro, sekä etäpesäkkeiden keuhkojen ja maksan in vivo [36]. Lisäksi tämä tutkimus havaitsi forkhead laatikko O4 (FOXO4) ja ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) suorana ja toiminnallisia tavoitteita miRNA499 [36]. Lisäksi Reis et al., Raportoi myös, että PDCD4 kuin vaimentimen siirtolaisuuden ja hyökkäyksen ja voi olla kliinisesti merkittävää biomarkkereiden kanssa ennusteen arvioinnissa in OSCC [37]. Nämä edellä mainitut havainnot voivat tarjota alustava selvitys kanssa löydöksen yhdistyksen välillä miRNA499 ja distaalisen etäpesäke OSCC. Asiaankuuluvat yksityiskohtaiset mekanismit voivat oikeuttaa lisätutkimukset.

Yksi rajoituksista Tutkimuksemme on, että tietoa alkoholin, pähkinä ja tupakan käyttö on kaksijakoinen osaksi ”alati käyttäjä” versus ”ei-käyttäjä.” Koska tuloksena tarkempi analyysi perustuu määrään, pituus, ja aikaisempi pähkinä, alkoholin ja tupakan kulutus eivät kyenneet tehdä. Tietojen keruu tukeutunut itse raportteja, jolle jotkut yksilöt voivat olla haluttomia ilmoittamaan tavanomainen tällaisten aineiden. Näin ollen ei voi olla jäljellä sekoittavia päivästä pähkinä, alkoholin ja tupakan käyttö luokitteluvirheen. Lisäksi toiminnallista roolia miRNA kasvavat tai etäpesäkkeiden suusyövän kannattaa lisätutkimuksia, joka sisällytetään tulevaan työhön. Klooneja, jotka sisältävät erilaisia ​​genotyyppejä miRNA499 SNP rakennetaan valottaa mahdollisten toimintojen miRNA499 (proliferaation, solusyklin säätelyssä, muuttoliike ja invaasio) suun syöpäsolulinjoissa sekä taustalla olevien mekanismien. Lisäksi tämä tutkimus paljasti olennaisesti kuuluvan miRNA 149 (rs2292832) genotyypit Hardy-Weinberg tasapaino kontrolliryhmässä. Aikaisempi tutkimus 107000 genotyyppejä tuotetaan 443 SNP on todennut, että genotyyppi jakaumat 36 pois 313 määritykset (11,5%) poikettiin HWE (P 0,05) [38]. Kun etsitään mahdollisia syitä, määrityksiä SNP osoittautui epäspesifistä tai genotyypin virheitä on havaittu. Ne kuitenkin myös todettu poikkeama HWE jäljellä 10 SNP oli selittämättömiä. Vaikka syy olennaisesti kuuluvan miRNA 149 genotyypit on HWE meidän kontrolliryhmässä ei pohdita vielä, aiheuttaa edellä mainittu tutkimus voi tarjota joitakin suuntaa tulevaisuuden tutkimuksessa.

Yhteenvetona huomasimme Merkitsevä yhteys miRNA499 geenipolymorfismien ja herkkyydestä suun syöpä. Kuitenkin, ei ole yhteyksiä SNP ja kliininen tila. Tutkittuaan pähkinä pureskelua, joka on kaikkein vaikuttava tekijä suun syöpä, huomasimme, että nämä neljä miRNA jotka kantavat mutaatiota genotyyppi saattaa lisätä alttiutta suusyövän. Näitä geenimutaatioita voivat vaikuttaa miRNA tavoite tehokkuus ja vakaus ja lisätä niiden esiintymistä suusyövän, mutta yksityiskohtaisia ​​mekanismeja geenien tasolla proteiinin tasot, jotka lopulta vaikuttavat kasvainten kehittymiseen olisi luokiteltava, ehkä kartoitus uuden suunnan tavoite terapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

Oppiaineet ja Näytteenotto

rekrytoitiin 470 miespotilailla Chung Shan Medical University Hospital Taichung ja Changhua Christian sairaala ja Näytä Chwan Memorial Hospital Changhua, Taiwan case ryhmä vuosina 2007 ja 2011. Samalla valvonta otettiin pois lääkärintarkastus näiden kolmen sairaalat, jotka ovat myös palveluista tapaukset kerättiin. Lopussa rekrytointi, yhteensä 425 miehen osallistujien että ei ollut itse raportoitu historia syövän mitään kohdetta sisällytettiin. Lisäksi potilailla, joilla on suun kautta precancerous sairaus kuten suun kautta submukoottinen fibroosia, leukoplakia, erytroplakia, verrukoosinen liikakasvu jne jätettiin kontrolliryhmään. Osallistumisprosentti oli noin 91% tapauksista ja 76% valvontaa. Koska kaikissa tapauksissa ja verrokkien peräkkäin talteen ilman valintaa, ja toimittamien tietojen perusteella kyselyihin, mitään merkittävää geneettistä suhdetta tai suvussa löydettiin.

Kuten tapauksissa ja valvontaa altistumista tiedot, kuten betel mälli pureskelua ( alati vs. koskaan käyttäjä), tupakointi (tupakoitsijan vs. tupakoimaton) ja alkoholin kulutus (nykyinen raskas juomari, määritelty CDC vievää keskimäärin yli 2 annosta päivässä verrattuna ei nykyinen raskas juomari), olivat kaikki saadut kyselylomakkeen. Vaikka lääketieteellistä tietoa tapauksista, kuten TMN kliininen lavastus, primäärikasvain koko, imusolmuke osallistuminen ja histologinen, saatiin potilastietoja. Suun syöpäpotilailla oli lavastettu kliinisesti aikaan diagnoosin mukaan TNM lavastus järjestelmä American sekakomitean Cancer (AJCC) [39]. Kasvain eriyttäminen tutkinut patologi mukaan AJCC luokituksen. Tämä tutkimus on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Review Board ja tietoisen kirjallisen suostumuksen saatiin kunkin yksittäisen.

DNA Extraction

Koko verinäytteitä, kerätään terveiden verrokkien ja suun syöpäpotilailla, olivat sijoitetaan putkiin, jotka sisältävät EDTA: ta, sen jälkeen sentrifugoitiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Laskimoverta Kunkin kohteen vedettiin vacutainer putkiin, jotka sisälsivät EDTA: ta ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Genomi-DNA uutettiin QIAamp DNA veren mini sarjat (Qiagen, Valencia, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA liuotettiin TE-puskuriin [10 mM Tris (pH 7,8), 1 mM EDTA] ja sitten kvantitoida mittaus OD260. Lopullinen valmiste oli varastoitu -20 ° C: ssa ja käytettiin templaatteina polymeraasiketjureaktio.

polymeraasiketjureaktio-restriktiofragmentin pituuspolymorfismi (PCR-RFLP) B

miRNA-geeni rs2910164, rs11614913, ja rs3746444 polymorfismit määritettiin PCR-RFLP-määritys [15]. Alukkeet sekvenssit ja restriktioentsyymin analysoida niitä miRNA geenipolymorfismien kuvattiin taulukossa S5. PCR suoritettiin yhteensä 10 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 100 ng DNA-templaattia, 1,0 ui 10 x PCR-puskuria (Invitrogen, Carslbad, CA, USA), 0,25 U Taq-DNA-polymeraasia (Invitrogen), 0,2 mM dNTP: itä (Promega, Madison, WI , USA) ja 200 nM kutakin aluketta (MDBio Inc. Taipei, Taiwan). PCR-syklien oli 5 min 94 ° C: ssa seurasi 35 sykliä 1 min 94 ° C: ssa, 1 minat 58 ° C: ssa miRNA146a, 1 min 63 ° C: ssa miRNA196a2, ja 1 min 67 ° C: ssa miRNA499, ja 2 min 72 ° C: ssa, ja lopullinen vaihe 72 ° C: ssa 20 minuutin ajan, jotta täydellisen laajenemisen kaikki PCR-fragmentit. Tulokset esitetään kuviossa 1. Kutakin määritystä varten asianmukaista valvontaa (nontemplate ja tunnetun genotyypin) sisällytettiin kuhunkin kirjoittamalla ajon seurata reagenssiin saastumista. Validoimiseksi tulokset PCR-RFLP ja laadunvalvontaan, noin 10% määritykset toistetaan eri erissä ja useissa tapauksissa kunkin genotyypin varmistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.

(A) miRNA146a rs2910164 geenin polymorfismin villityyppinen homotsygoottinen alleelit (C /C), saatiin 25 ja 122 bp: n tuotteet, heterotsygoottinen alleelit (C /G) tuotti 25-, 122- ja 147-bp tuotteita, kun taas mutatoitunut tyypin homotsygoottinen alleelien (G /G ) tuotti 147 bp: n tuotteen. (B) miRNA196 (rs11614913) geenin polymorfismi, villityypin homotsygoottinen alleelit (T /T), tuotti 149 bp: n tuote, heterotsygoottinen alleelit (C /T) tuotti 24-, 125- ja 149-bp tuotteita, kun taas mutatoituja tyyppi homotsygoottinen alleelien (C /C), saatiin 24- ja 125-bp tuotteet (C) varten miRNA499 (rs3746444) geenin polymorfismi, villityypin (T /T), jolloin saatiin 26- ja 120-bp-tuotteet; heterotsygoottinen alleelit (C /T) tuotti 26-, 120- ja 146-emäsparin tuotteet, kun taas mutatoitunut tyyppi homotsygoottinen alleelien (C /C) tuotti 146 emäsparin tuotteen.

Reaaliaikainen PCR

alleeliset syrjintä on miRNA149 rs2292832 geenipolymorfismien arvioitiin kanssa ABI StepOne ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ja analysoitiin käyttäen SDS v3.0 ohjelmisto (Applied Biosystems) käyttäen TaqMan määritystä. Lopullinen tilavuus Kunkin reaktio oli 5 ui, joka sisälsi 2,5 ui TaqMan genotyypin Master Mix, 0,125 ui Taqman sekoitus, ja 10 ng genomista DNA: ta. Reaaliaikaisen PCR-reaktioon sisältyy ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä, joista kukin koostuu 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min.

Tilastollinen analyysi

jakaumat demografisten ominaisuuksien ja genotyyppi taajuudet tapausten ja kontrollien välillä sekä kliinis eri genotyypit analysoitiin Fisherin testiä, koska pieni otoskoko oli läsnä joidenkin luokkien muuttujia. Kertoimet suhteet (syrjäisimmillä alueilla) kanssa 95%: n luottamusväli (CI) yhdistyksen välillä genotyypin taajuuksien ja suusyövän arvioitiin useita logistinen regressio malleja, kun kontrolloi kovariantteja. Nonparametric menetelmää käytettiin vuoksi ei normaalijakaumaa noin arvioidun muuttujia. Olemme asennettu logistiikkaregressiomallin kanssa tärkeimmät vaikutukset (miRNA geneettistä vaihtelua, tupakoinnista ja betel mälli pureskelua asema), sekä vuorovaikutusta termi välillä (miRNA genotyypit * demografiset ominaisuus), verrataan malli vasten malli vain tärkeimmät vaikutukset . Vuorovaikutus vaikutus määritetään erona niiden poikkeavuuteen, ja edelleen arvioitiin käyttäen uskottavuusosamäärä laskea χ

2 ja

p

arvoja [40].

p

arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Aineisto analysoitiin R tilastollisia ohjelmistoja.

tukeminen Information

Taulukko S1.

ry miRNA genotyypin ja pähkinä pureskelua tila.

doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s001

(DOC) B Taulukko S2.

ry miRNA genotyypin ja tupakoinnista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s002

(DOC) B Taulukko S3.

suhde kliinisen statuksen ja miRNA499 genotyyppejä suun syöpäpotilailla (≤60 vain, N = 332).

doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s003

(DOC) B Taulukko S4.

suhde kliinisen statuksen ja miRNA499 genotyyppejä suun syöpäpotilailla ( 60 vain, N = 138).

doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s004

(DOC) B Taulukko S5.

Alukesekvensseillä ja PCR-olosuhteet monistamiseen miRNA SNP.

doi: 10,1371 /journal.pone.0039777.s005

(DOC) B