Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metastasoitunut munuaissyövän ilmenee useita allekirjoituksia geenien ilmentymisen. Poikkeama ilmentymisessä kypsän miRNA on yhdistetty ihmisen syövissä. Merkitys miR-21 munuaiskarsinoomia ehdotetaan päässä profilointi -tutkimukset kasvain kudosnäytteitä. Kuitenkin rooli miR-21 toiminto aiheuttaa munuaisten syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota ei ole vielä esitetty. Käyttämällä viljellyt munuaissyöpä soluja, osoitamme tehostettu ilmentyminen kypsän miR-21 sekä pre-ja pri-miR-21 lisääntynyt transkriptio verrattuna normaaliin proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen. Yli-ilmentymisen miR-21 Sponge sammuttamiseksi endogeenisen miR-21 tasoa esti jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion munuaissyöpäsoluissa. Koska mutaatio PTEN tuumorisuppressorigeenin, PTEN-proteiinin tasot ovat usein vaimentua munuaissyövässä. Osoitamme, että miR-21 tavoitteiden PTEN mRNA 3’untranslated alue pienenee PTEN-proteiinin ekspression ja täydentää Akt fosfory- munuaisten syöpäsoluja. Downregulation PTEN sekä yliekspressio konstitutiivisesti aktiivisen Akt kinaasi esti miR-21 Sieni inhiboivan vaikutuksen munuaissyövän solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Lisäksi osoitamme, että miR-21 Sponge esti inaktivoimalla fosforylaation tuumorisuppressoriproteiinia tuberiini ja vaimennetaan TORC1 aktivointi. Lopuksi osoitamme, että ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen TORC1 heikennettyä miR-21 Sieni-välittämää tukahduttaminen proliferaatio ja migraatio Munuaissyöpäsolujen. Tuloksemme paljastaa kerroksen transkription jälkeinen säätely PTEN mukaan transkription aktivoituminen miR-21 pakottaa kanoninen kasvaimia synnyttävän Akt /TORC1 signalointi putki ajaa munuaissyövän solujen lisääntymisen ja invaasiota.

Citation: Dey N, Das F, Ghosh-Choudhuryn N, Mandal CC, Parekh DJ, Block K, et al. (2012) microRNA-21 säätelee TORC1 Aktivointi Munuaisten Cancer Cell Proliferation ja Invasion. PLoS ONE 7 (6): e37366. doi: 10,1371 /journal.pone.0037366

Editor: Soumitro Pal, lastensairaalassa Boston Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 joulukuu 2011; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2012; Julkaistu: 04 kesäkuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat A Yhdysvaltojen National Institutes of Health (NIH) RO1 DK50190 apurahan GGC tukenut tätä työtä. Osa tästä työstä tukivat myös VA Research Service Merit Review avustuksen GGC. GGC tukee myös Juvenile Diabetes Research Foundation 1-2008-185 apurahat ja on vastaanottaja VA Erikoistutkija Career Scientist Award. NGC tukee VA Merit Review, NIH RO1 AR 52425 avustuksia ja Ronald P. Williams Ortopedi Oncology Developmental Research Award Cancer Therapy and Research Center, San Antonio, Texas. KB, BSK ja HEA tuetaan avustuksilla, NIH RO1 CA 131272 (KB), NIH RO1 DK 077295 (BSK), NIH RO1 DK078971 (HEA), NIH Rc2a 036613 (BSK) ja VA Research Service Ura tutkijan palkinto (KB) ja Merit Review Awards (KB, BSK ja HEA).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissyövän edustaa yleisintä munuainen pahanlaatuisiksi; noin 70000 uutta tapausta on raportoitu vuonna 2011 (www.cancer.gov). Niistä viisi alatyyppiä, kirkas cell munuaisten (RCC) osuus on noin 70%: ssa tapauksista [1]. Noin 30% potilaista, joilla on RCC kehittää invasiivinen sairaus yleisesti metastasizing luun, keuhko-, aivo- ja maksan [2], [3]. Menetys VHL (von Hippel-Lindaun) proteiinin ilmentyminen johtuu ituradan mutaation, biallellic somaattinen mutaatio tai hypermetylaatiota sen geenilokuksen aiheuttaa suuren riskin selkeitä solun munuaissyöpä, hemangiomas ja feokromosytoomien [4], [5]. Viallinen VHL ilmentyminen aiheuttaa vakauttaminen Hifα transkriptiotekijöitä, jotka vaikuttavat lisääntynyt ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ylläpitää verisuonten luonteesta kasvain. Myös Hifα säätelee anaerobinen hengitys usein löytyy RCC [5]. Hifα riippumaton toiminta VHL on raportoitu ajo munuaisen karsinooma, kuten sääntely vanhenemisen [5], [6]. Lisäksi VHL positiivinen munuaisten kasvaimia käyttämään vaihtoehtoisia menetelmiä lisätä Hifα transkriptiotekijät VEGF ilmaisun, ja, Hifα riippumaton kasvutekijän reseptorin säätelyä [5], [7].

miRNA ovat lyhyitä Koodaamattomat oligonukleotideja epätäydelliseen täydentävät pääasiassa että 3’untranslated alue (UTR) kohde- mRNA: iden [8], [9], [10]. Lähes 1000 miRNA ihmisillä säätelemään kolmasosa koko proteiinia koodaavan transcriptome klo posttranskriptionaalisella ja translaation tasolla [9]. miRNA pääasiassa toimivat estämällä mRNA käännös vaikka mRNA: n hajoamisen ja mRNA pilkkominen voi myös edistää downregulation proteiinin tasoja. Sopimaton ilmaus miRNA on liitetty onkogeneesiin [10], [11]. miRNA koodataan introni ja geenien välinen sekä eksonisekvenssejä genomissa [12]. Ne syntetisoidaan pääasiassa RNA polymeraasi II-riippuvaisen transkription tuottaa pri-miRNA hiusneula, joka sitoo Drosha /DGCR8 monimutkainen. Kaksinkertainen RNA sitovan proteiinin DGCR8 tunnistaa proksimaalisen emäkset (~ 10 bp) pri-miRNA Stem seuraa sen katkaisun RNaasi III entsyymi Drosha vapauttaa ennalta miRNA lyhyt hiusneula [13]. Exportin-5 ja sen kumppani Ran-GTP aiheuttaa tumasta ennalta miR sytoplasmaan, missä se prosessoidaan dicer RNaasi III /TRBP saatiin ~22 nukleotidin pieniä RNA duplex. Opas säie sitten sisällytetään efektori Argonaute kompleksi muodostaa RISC (RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi) ja sitoutuvan epätäydellinen komplementaarisuutta mRNA translaation tukahduttaminen [12].

Viimeaikaiset raportit saavutti vankan aseman erityisten miRNA allekirjoitus munuaisten kasvainten synnyssä. Profilointi kokeet osoittivat, että enemmän miRNA ovat vaimentua RCC kuin voimistunut [14], [15], [16], [17]. Esimerkiksi alkuseulana 470 miRNA, vain kuusi miRNA havaittiin voimistuvan RCC taas 15 oli vaimentua [16]. Toisessa tutkimuksessa, vain 2 miRNA nostettiin RCC lukien miR-21 ottaa huomioon, että ilmaisu 17 miRNA laski [17]. Samoin uudempi raportti osoitti voimistunutta ilmentymistä miR-21 joukossa 9 miRNA vaikka ilmentyminen 26 miRNA tukahdutettiin [14]. Äskettäin laajan tutkimuksen käyttäen useita syövän näytteitä 31 eri kiinteitä kasvaimia on kuvattu merkittävän kasvun miR-21 viittaa sen funktio onkogeneesissä [18]. Kuitenkin sen toiminnallinen rooli monissa syövissä kuten munuaisten syöpä ei ole selvitetty. Esillä olevassa tutkimuksessa, löydämme lisääntyneen ekspression kypsä, esi- ja pri-miR-21 munuaissyöpäsoluissa verrattuna normaaliin proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen. Tämä lisäys miR-21 liittyi vähentynyt PTEN tasoilla. Neutralointi miR-21 esti jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion näiden solujen kanssa samanaikaisesti lisääntynyt PTEN ja vähentää tuberiini fosforylaatiota ja mTORC1 aktivointi.

Tulokset

Lisääntynyt ilmentyminen miR-21 munuaissyövän

miRNA ilmentymisen profiloinnin avulla kasvain näytteet munuaisten syöpä on raportoitu. Kolmessa tutkimuksessa, ilmentymisen miR-21: n havaittiin lisääntynyt [14], [17], [19]. Kuitenkin toisessa tutkimuksessa 16 kirkas solu munuaissyöpä ja 4 kromofobista leikettä munuaisten karsinoomanäytteistä, miR-21 ei havaittu [16]. Käytimme paneelin tuumorikudosten selvää solun munuaiskarsinoomissa havaita ilmentymisen kypsän miR-21. Reaaliaikainen qRT-PCR paljasti selvästi lisääntynyt ilmentyminen kypsän miR-21 kaikkiaan asteen 2 (3 out of 3) ja 3. asteen (3 out of 3) munuaissyövän näytteitä (Kuva. S1A ja S1B). Seuraavaksi tutkimme ilmaus miR-21 ACHN munuaiskarsinoo- soluja. Löysimme merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen kypsän miR-21-ACHN-soluja verrattuna HK2 normaalin proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen (Fig. 1A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa munuaisten syövän solulinja Caki-2 (Fig. S2). Viimeaikaiset selvitykset osoittivat, että miR-21 säädellään tasolla kypsymisen [20]. Siksi tutkimme tasot ennalta miR-21. Reaaliaikainen qRT-PCR osoitti merkitty ilmaisu ennalta miR-21 ACHN soluissa verrattuna HK2 soluihin (Fig. 1 B). Vastaavasti, lisääntyneen ekspression pri-miR-21 havaittiin myös, että ACHN solut (Fig. 1 C). Tämä lisäys pri-miR ehdotti transkription mekanismi miR-21 ilme. Suoraan tutkia transkription säätely miR-21 ilmaisun, käytimme miR-21-promoottori-driven tulikärpäsen lusiferaasi reportteri-konstrukti (miR-21-Luc). Ohimenevä transfektio määrityksissä ACHN-soluissa paljasti merkittävästi lisääntynyt transkriptio reportterigeenin (Kuva. 1 D). Nämä tulokset osoittavat, että parantaakseen kypsän miR-21 munuaissyöpä solut voivat johtua lisääntyneestä transkription miR-21-geenin tuottamiseksi pri-mir-21.

(A – C) Yhteensä RNA: iden HK2 proksimaalisesta putkimainen epiteelisolujen ja ACHN munuaissyöpäsoluissa käytettiin havaitsemaan kypsän miR-21 (paneeli A), pre-miR-21 (paneeli B) ja pri-miR-21 (paneeli C) reaaliaikainen qRT-PCR, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Keskiarvo ± SE 4 mittausten näytetään. Paneeleissa A ja B, * p = 0,004 vs HK2 soluja. Paneelissa C, * p = 0,02 vs HK2 soluja. (D) HK2 ja ACHN-solut transfektoitiin miR-21-luc-reportterin kanssa Renilla null plasmidi. Solulysaatit käytettiin määrittämään lusiferaasiaktiivisuus kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Keskiarvo ± SE 6 mittauksen näkyy. * P = 0,001 vs HK2 soluja. (E) Lisääntynyt fosforylaatio p65 NFkB munuaisten syöpäsoluja. Lysaatit HK2 ja ACHN solut immunoblotattiin fosfo-p65 (Ser-536), p65 ja aktiini vasta-aineita. (F) mutantti p65 S536A estää miR-21 transkription. ACHN munuaissyöpäsoluissa kotransfektoitiin miR-21-Luc ja p65 S536A ekspressiovektoriin. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin solulysaateista. Keskiarvo ± SE neljän rinnakkaisen mittauksen näkyy. * P = 0,02 vs vektori. Pohja paneelit osoittavat ilmentymisen HA-koodattu p65 S536A ja aktiini.

transkriptio miR-21-geeni on äskettäin osoitettu säänneltävä NFKB [21]. NFKB on yliaktiivista munuaisten syöpä [22], [23]. Transkriptionaalista aktiivisuutta p65-alayksikön NFKB on riippuvainen sen fosforylaatio Ser-536 [24]. Siksi tutkimme fosforylaatiota p65. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, fosforylaatio p65 at Ser-536 oli merkittävästi lisääntynyt ACHN munuaissyöpäsoluissa verrattuna HK2 soluihin. Lisäksi parannettu p65 tasot havaittiin myös (Fig. 1 E, keskimmäinen paneeli). Seuraavaksi testasimme osallistumista NFKB transkriptioon miR-21 munuaisten syöpäsoluja. miR-21-luc-reportterin kotransfektoitiin joko S536A mutantin p65 tai vektorin plasmidiin. Expression of p65 S536A estivät merkittävästi reportteri aktiivisuutta ACHN soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että ylössäätely miR-21 saattaa osittain johtua lisääntyneestä NFKB aktiivisuutta munuaissyöpäsoluissa.

miR-21 Säätelee leviämisen ja invaasion Munuaissyöpäsolujen

miR-21 pidetään olla onkopsykologista miR monissa syövissä. Kuitenkin sen rooli munuaissolusyövässä ei ole tutkittu. Siksi testasimme osallistumista miR-21 mitogeneesin ACHN-soluja, käyttäen plasmidia ilmentävä vektori seitsemän kappaletta paksunnetun miR-21 sitoutumiskohta sijoitetaan 3′-päähän CMV-promoottorin perustuva GFP-mRNA: n (kuva. S3) [ ,,,0],25]. Ilmaus Tämän rakenteen toimii ”sieni”, joka sammuttaa tasot endogeenisen miR-21 [25], [26]. ACHN-solut transfektoitiin tällä konstruktilla (miR-21 Sponge). DNA-synteesi mitattiin

3H-tymidiinin. Expression of miR-21 Sponge esti merkittävästi DNA-synteesiin ACHN soluissa (Kuva. 2A ja Fig. S4A). Tämän havainnon varmistamiseksi, teimme runsaudenmäärityksessä laskemalla solujen lukumäärä sen jälkeen, kun transfektoimalla miR-21 Sponge. Expression of miR-21 Sponge tukahdutetaan solujen kasvua (Fig. 2B ja kuvio. S4b).

ACHN-soluja transfektoitiin miR-21 sieni tai vektoriplasmideista. (A) seerumi-ruokittu soluja inkuboitiin

3H-tymidiinin ja sen yhdistyminen DNA: han määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [115]. Keskiarvo ± SE 12 mittauksen näkyy. * P = 0,004 vs pelkällä vektorilla. (B) Soluja laskettiin osoitettuina ajanjaksoina, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Diamond yleinen symboleilla vektori ja miR-21 Sieni-transfektoiduissa soluissa, vastaavasti. Tarkoittaa ± SE kolminkertaisten mittausten on esitetty. * P 0,05 vs vektori yksin. (C) seerumin puutteessa solua siirrostettiin edelleen kalvon laajuisen hyvin kammioon. Migraatiomääritys suoritettiin ja siirretyn solut vastakkaisella puolella kalvon värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. (D) tahrat siirrettyjä soluja paneeli C eluoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. Keskiarvo ± SE kolminkertaisten mittausten näkyy. * P 0,0001 vs vektori-transfektoiduissa soluissa. (E) Transfektoidut seerumia soluja ympättiin kollageenilla upotettu kalvo on trans-Kaivokammio. Invaasiomääritys suoritettiin ja hyökkäsi solut vastakkaisella puolella kalvon värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. (F) tahrat tunkeutuneet soluissa paneelissa E eluoituivat kuvatulla Materiaalit ja menetelmät [111]. Keskiarvo ± SE kolminkertaisten mittausten näkyy. * P 0,001 vs vektori-transfektoiduissa soluissa.

munuaissyövän on usein hyvin metastaattinen. Testasimme miR-21 ohjaa ACHN solujen vaeltamiseen käyttäen trans-Kaivokammio määrityksessä. Soluja viljellään seerumittomassa elatusaineessa päälle kalvon siirtynyt pohjan kalvon (Fig. 2C, paneeli a). Expression of miR-21 Sponge esti migraation ACHN soluja (Fig. 2C ja kuvio. S4C). Kvantifiointi Näiden tulosten näyttää merkitsevän eston migraation munuaissyöpäsoluissa vastauksena miR-21 Sponge (Fig. 2D).

Ensimmäinen askel etäpesäkkeiden koostuu paikallisista hyökkäystä syöpäsoluja (intravasation). Tutkia metastaattisen potentiaalin ACHN munuaissyöpäsoluissa, me palveluksessa invaasiomääritys käyttäen kollageenin upotettu kalvot trans-kuoppiin. Vector-transfektoidut ACHN solut osoittivat selvästi invaasiota (Fig. 2E, paneeli a). Expression of miR-21 Sponge esti hyökkäyksen kasvainsoluja (Fig. 2E ja kuvio. S4d). Kvantifiointi osoitti merkitsevän eston invaasio ACHN solujen miR-21 Sponge (Fig. 2F).

miR-21 Tavoitteet PTEN in munuaissyöpäsoluissa

Mutaatio PTEN tuumorisuppressorigeeniä tai pelkistetyssä lauseke myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn ja etäpesäkkeiden monien syöpien [27], [28]. Kuitenkin PTEN mutaatio ei usein löydy munuaissolusyövässä [29]. PTEN on validoitu olevan tavoitteeksi miR-21 [30]. Tutkimme tasot PTEN vuonna ACHN munuaissyöpäsoluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, runsaasti PTEN vuonna ACHN väheni merkittävästi verrattuna että HK2 soluissa. Identtiset tulokset saatiin Caki-2 munuaisten masolulinjassa (Fig. S5a). PTEN alentaa veren PIP

3, joka ohjaa fosforylaatio /aktivointi Akt [27], [31], [32]. Alennettu PTEN tasot ACHN ja Caki-2-solut liittyy lisääntynyt fosforylaatioon Akt at Thr-308 ja Ser-473 (Fig. 3B ja kuvio. S5B), mikä osoittaa sen aktivointi [32].

(A ) lysaatteja solujen kolmesta itsenäisestä kuoppien HK2 ja ACHN solut immunoblotattiin PTEN ja aktiini vasta-aineita. (B) Sama Solulysaatit immunoblotattiin fosfo-Akt (Thr-308), fosfo-Akt (Ser-473) ja Akt-aineet.

Seuraavaksi tutkittiin, miR-21 tavoitteiden PTEN . Käytimme reportteri-konstrukti, jossa 3’UTR PTEN mRNA on kloonattu alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geenin (PTEN 3’UTR-Luc) [25]. ACHN solut transfektoitiin tämän toimittaja ja vektorin tai miR-21-ekspressioplasmidin. Expression of miR-21 estivät merkittävästi reportteriaktiivisuutta (Fig. 4A ja kuvio. S6A). Tämän havainnon varmistamiseksi käytimme miR-21 Sponge. Expression of miR-21 Sponge lisääntyi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuus PTEN 3’UTR-Luc (Fig. 4B ja kuva. S6b). Nämä tulokset viittaavat siihen, että munuaisten syöpäsoluja, PTEN voi olla myötävirtaan kohde miR-21. Tämän testaamiseksi tutkimme PTEN-proteiinin tason miR-21 Sieni-transfektoitujen ACHN soluissa. miR-21 Sponge lisäsi runsaasti PTEN (Fig. 4C ja Fig. S6c), samanaikainen vähentynyt fosforylaatio Akt at Thr-308 ja Ser-473 (Fig. 4D).

(A ja B) ACHN-solut transfektoitiin pCMV-miR-21-ekspressioplasmidi (A) tai miR-21 Sponge (B) ja vektori yhdessä PTEN 3’UTR-Luc reportteri-konstrukti. Solulysaatit käytettiin määrittämään lusiferaasiaktiivisuus kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Keskiarvo ± SE 6 mittauksen näkyy. Paneelissa A * p = 0,02 vs vektori yksin. Paneelissa B, * p = 0,002 vs vektori yksin. (C ja D) lysaatteja miR-21 Sponge-transfektoidut ACHN-soluja immunoblotattiin PTEN ja aktiinin vasta-aineet (paneeli C), ja fosfo-Akt (Ser-473), fosfo-Akt (Thr-308) ja Akt-vasta-aineita (paneeli D).

miR-21 Säätelee munuaissyövän solun lisääntymis- ja Migration kautta PTEN /Akt Axis

tulokset edellä viittaavat siihen, että miR-21 edistää Akt aktivointi pienentämällä PTEN tasoilla munuaisten syöpäsolut (Fig. 4). Jotta suoraan roolin tutkimiseksi tämän signalointireitin munuaisten syöpäsolujen lisääntymistä, transfektoimme ACHN ja Caki-2-solujen miR-21 Sponge ja siRNA kohdistaminen PTEN (siPTEN). Kuten odotettua, miR-21 Sponge esti DNA-synteesiä (Fig. 5A ja kuvio. S7A). Sen sijaan, transfektio siPTEN merkittävästi esti miR-21 Sponge-indusoidun DNA-synteesin estymiseen (Fig. 5A ja kuviot. S7A, S7b ja S7C). Samoin siPTEN päinvastaiseksi lasku leviämisen ACHN solujen aiheuttama miR-21 Sponge (Fig. 5B ja kuvio. S8). Seuraavaksi määritti siPTEN on ACHN ja Caki-2 solumigraation. Expression of miR-21 Sponge vähentynyt migraatio molempien munuaisten syöpäsolun linjat. siPTEN merkittävästi tukahdutti estävää vaikutusta miR-21 sienellä solujen vaeltamiseen (kuviot. 5C, 5D ja kuviot. S9 ja S10).

ACHN solut transfektoitiin miR-21 Sieni yhdessä siRNA altaat kohdistaminen PTEN mRNA kuten osoitettu. (A)

3H-tymidiinin määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [115]. Keskiarvo ± SE 6 mittauksen näkyy. * P 0,05 vs vektori; ** P 0,05 vs miR-21 Sieni-transfektoiduissa soluissa. (B) Transfektoidut solut laskettiin osoitettuina ajanjaksoina. Symbolit timantti, neliö ja risti edustaa vektori, miR-21 Sieni ja miR-21 sieni plus siRNA allas vastaan ​​PTEN, vastaavasti. Keskiarvo ± SE kolminkertaisten mittausten näkyy. * P 0,05 vs vektori yksin; ** P 0,01 vs miR-21 Sponge yksin. (C) Transfektoidut solut ympättiin kalvon trans-hyvin kammiot ja muuttivat solut värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. (D) tahrat kalvot paneeli C eluoitiin ja absorbanssi 590 nm: ssä mitattiin. Keskiarvo ± SE 3 riippumatonta kammioista on esitetty. * P 0,001 vs vektori yksin; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge.

lipidi fosfataasin aktiivisuus PTEN on tunnettua säätää Akt-fosforylaation [27]. Olemme edellä on esitetty, että alennetussa PTEN tasolla munuaissyöpäsoluissa liittyy lisääntynyt fosforylaatioon Akt (Fig. 3 ja Fig. S5). Koska miR-21 säätelee PTEN-proteiinin taso, joka puolestaan ​​aktivoi Akt testasimme rooli tämän kinaasin munuaisten syövän solujen lisääntymisen suhteen miR-21. Transfektoimme ACHN ja Caki-2-solujen konstitutiivisesti aktiivinen Gag-Akt yhdessä miR-21 Sponge [33]. Expression of Gag Akt merkittävästi käänteinen DNA-synteesin inhibitio indusoiman miR-21 Sponge (Fig. 6A, Fig. S11A ja Fig. S12). Expression of Gag Akt myös kääntänyt soluproliferaatiota miR-21 Sponge (6B ja kuviot. S13a). Samoin konstitutiivisesti aktiivinen Akt merkittävästi esti esto kulkeutumista ACHN solujen vastauksena miR-21 Sponge (kuviot. 6C, 6D ja kuvio. S13B). Identtiset tulokset saatiin Caki-2 munuaissyöpäsoluissa (kuviot. S14a, S14B ja S14C). Nämä tulokset osoittavat, että miR-21 tavoitteet PTEN mRNA tukahduttaa sen proteiinin ekspression, joka johtaa Akt-riippuvaisen proliferaation ja migraation munuaisten syöpäsoluja.

ACHN-soluja transfektoitiin miR-21 Sponge kanssa konstitutiivisesti aktiivinen Gag Akt plasmidit kuten. (A)

3H-tymidiinin määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [115]. Keskiarvo ± SE 6 mittauksen näkyy. * P 0,01 vs vektori; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge yksin. (B) Transfektoidut solut laskettiin osoitettuina ajanjaksoina. Symbolit timantti, neliö ja risti edustaa vektori, miR-21 Sieni ja miR-21 sieni plus Gag Akt ilmentämisplasmideja, vastaavasti. * P 0,01 vs vektori yksin; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge yksin. (C) Transfektoidut solut ympättiin kalvon trans-hyvin kammiot ja muuttivat solut värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. (D) tahrat kalvot paneeli C eluoitiin ja absorbanssi mitattiin. Keskiarvo ± SE 3 riippumatonta kammioista on esitetty. * P 0,001 vs vektori yksin; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge.

miR-21 moduloi TORC1 aktiivisuus indusoida munuaissyövän solun lisääntymis- ja Migration

Aktivoidut Akt fosforyloi tuumorisuppressoriproteiinia tuberiini at Thr -1462 mikä sen inaktivaation, ja Rheb aktivaatio TORC1 [34], [35], [36]. Olemme todenneet, että downregulation PTEN lisääntyneen miR-21 ilmentyminen munuaissyöpäsoluissa aktivoi Akt (Fig. 3), joka osaltaan lisääntymistä ja kulkeutumista näiden solujen (kuviot. 5 ja 6). Testasimme roolia miR-21 tuberiini fosforylaatioon. ACHN-solut transfektoitiin miR-21 Sponge. Kasvaneen Akt aktivointi, ACHN solut näyttää parannetun fosforylaatioon tuberiini (Fig. 7A, kaista 1). Expression of miR-21 Sponge esti fosforylaatiota tuberiini (Fig. 7A ja kuvassa. S15A). Samanlainen lisääntynyt tuberiini fosforylaation, ACHN-solut osoittivat lisätyn fosforylaatio S6-kinaasi on Thr-389 (Fig. 7B, kaista 1), mitattuna korvike TORC1 toimintaa. miR-21 Sponge estetty S6-kinaasi fosforylaatiota (Fig. 7B). Tämä vähennys S6-kinaasi fosforylaation miR-21 Sponge liittyi mTOR fosforylaation Ser-2448 (kuvio. 7C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-21 säätelee TORC1 aktiivisuus munuaisten syöpäsoluja. Sen tutkimiseksi, onko miR-21 Sponge-riippuvaisen mTOR inhibition johtuu inaktivoitumisen Rheb, me kotransfektoidaan ACHN-soluja miR-21 Sponge ja konstitutiivisesti aktiivisen Rheb ekspressioplasmidiin ja tuloksia verrattiin, että miR-21 Sponge-transfektoiduissa soluissa. mTOR aktivaatio tutkittiin solulysaateista. Expression konstitutiivisesti aktiivisen Rheb päinvastaiseksi inhiboiva vaikutus miR-21 Sponge on S6-kinaasi fosforylaation (kuvio. 7D ja kuviossa. S15B). Samoin vähennetään fosforylaatiota mTOR by miR-21 Sponge esti myös konstitutiivisesti aktiivinen Rheb (Fig. 7E ja Fig. S15C). Nämä tulokset vakuuttavasti osoittaa, että miR-21-välitteisen fosforylaation /inaktivaatio tuberiini aktivoi Rheb lisätä mTOR aktiivisuutta.

ACHN-soluja transfektoitiin miR-21 Sponge tai vektorin. Solulysaatit immunoblotattiin fosfo-tuberiini (Thr-1462), tuberiini (paneeli A), fosfori-S6-kinaasi (Thr-389), S6-kinaasi (paneeli B), fosfori-mTOR (Ser-2448) ja mTOR (paneeli C). miR-21 käyttää Rheb aktivointia TORC1 toimintaan. ACHN solut kotransfektoitiin miR-21 Sponge ja CA Rheb plasmidi. Solulysaatit immunoblotattiin fosfo-S6 kinaasin (Thr-389), S6-kinaasi (paneeli D), fosfori-mTOR (Ser-2448) ja mTOR (paneeli E).

Valaistaan ​​onko miR-21-aktivoitu TORC1 edistää proliferaatiota munuaissyöpäsoluissa, me kotransfektoitu ACHN ja Caki-2-solujen miR-21 Sponge ja konstitutiivisesti aktiivisen mTOR-ekspressiovektoriin.

3H-tymidiinin määritettiin. Expression of konstitutiivisesti aktiivisen mTOR merkittävästi esti estämällä DNA-synteesin miR-21 Sponge (Fig. 8A, kuvio. S16 ja Fig. S17). Samoin konstitutiivisesti aktiivinen mTOR esti miR-21 Sieni-välitteisen lasku ACHN solujen lisääntymisen (Fig. 8B ja kuvio. S18A). Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus konstitutiivisesti aktiivisen mTOR munuaisten syövän solujen vaeltamiseen. miR-21 Sponge poisti muuttoa ACHN ja Caki-2-solut (Fig. 8C, Fig. S18B ja Fig. S19). Kuitenkin -parin konstitutiivisesti aktiivisen mTOR kanssa miR-21 Sponge merkittävästi kääntänyt esto muuttoliikkeen sekä munuaissyövän solulinjoja vastauksena miR-21 Sponge (kuviot. 8C, 8D ja Fig. S19). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-21 vaikuttaa munuaisten syöpäsolujen proliferaatio ja migraatio kautta TORC1.

ACHN-soluja transfektoitiin miR-21 Sponge kanssa konstitutiivisesti aktiivisen mTOR plasmidit kuten on osoitettu. (A)

3H-tymidiinin määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [115]. Keskiarvo ± SE 6 mittauksen näkyy. * P 0,001 vs vektori; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge yksin. (B) Transfektoidut solut laskettiin osoitettuina ajanjaksoina. Symbolit timantti, neliö ja risti edustaa vektori, miR-21 Sieni ja miR-21 sieni plus konstitutiivisesti aktiivinen (CA) mTOR ilmentämisplasmideja, vastaavasti. * P 0,01 vs vektori yksin; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge yksin. (C) Transfektoidut solut ympättiin kalvon trans-hyvin kammiot ja muuttivat solut värjättiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät [111]. (D) tahrat kalvot paneeli C eluoitiin ja absorbanssi 590 nm: ssä mitattiin. Keskiarvo ± SE 3 riippumatonta kammioista on esitetty. * P 0,001 vs vektori yksin; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge.

Keskustelu

munuaissyöpäsoluissa tarjoamme näyttöä ilmentymisen pri-miR-21 tuottaa esi- ja kypsä miR-21, joka edistää proliferaatio ja migraatio /hyökkäystä. Osoitamme käänteinen korrelaatio miR-21 tasoa ja PTEN runsautta. Osoitamme, että miR-21-herkän PTEN säätelee proliferaatio ja migraatio Munuaissyöpäsolujen aktivoimalla Akt. Lopuksi asetamme rooli miR-21 stimuloimaa TORC1 munuaisten syöpäsolujen lisääntymistä ja muuttoliike (Fig. 9).

Tehostettu miR-21 vaimentaa PTEN-proteiinin tasoja, mikä johtaa aktivointi Akt, joka inaktivoi tuberiini lisäämiseksi TORC1 toiminta johtaa jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion munuaissyöpäsoluissa.

Altered geeniekspression valvontaa signalointi verkkojen säännellä biologisia tuotokset, jotka edistävät solun transformaatio ja etäpesäke. Vaikka transkription säätelyyn geenien tuottamiseksi mRNA: iden välittää merkittävän panoksen onkogeneesiin, äskettäin löytyneen miRNA pelissä rooli samankaltainen kuin DNA sitova transkriptiotekijät on perustettu säätelyssä ilmentymistä kohde- geenien transkription jälkeisen mekanismi. Monet miRNA on tunnistettu ja luonnehdittu kasvainjouduttimet sekä tuumorisuppressoreilla. Esimerkiksi ekspressoituvat miRNA, miR-21, on usein yliaktiivista moniin syöpiin, mukaan lukien rinta-, keuhko-, neuroblastooma, glioblastooma, leukemia, mahasyöpä, kolangiokarsinooma, paksusuolen syöpä ja hepatosellulaarinen syöpä [37], [38], [39] [40], [41], [42]. Kuitenkin tietoa toiminnallista roolia miR-21 on saatavilla vain

in vitro

tutkimuksissa. Vasta äskettäin

in vivo

rooli miR-21 syövän kehittymiseen on osoitettu pre-B-solujen lymfooma ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Molemmissa syöpiä, ilmentyminen miR-21 on kasvanut huomattavasti [43], [44], [45]. Hiirellä malleja yli-ilmentymisen sekä poistetaan miR-21, Medina et al ja Hatley et al osoittivat äskettäin erittäin spesifinen rooli tämän miRNA kehittämiseen esi-B-solujen lymfooma ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, vastaavasti [ ,,,0],46], [47].

miR-21 säätelee lisääntymistä ja mitokondrioiden apoptoottisten reittien ohjataan tuumorisuppressoriproteiinia proteiineja, solusyklin sääntelyviranomaisten ja kasvutekijät [48], [49]. miR-21 ilmentyy runsaana munuaisen proksimaalitiehyeet [50]. Eläinmalleissa, lisääntyneen ekspression miR-21 liittyy fibroottisten häiriöiden munuaisten ja munuaisten iskeeminen vaurio [51], [52], [53], [54]. Viime aikoina olemme raportoineet voimistunutta ilmentymistä miR-21 mallissa tyypin 1 diabeettisen nefropatian [25]. Olemme osoittaneet, että miR-21 säätelee hypertrofia proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen, osoittaa patologinen merkitys tämän miRNA munuaisten sairaudet [25]. Vastaavasti miRNA profilointi tutkimuksissa todettu lisääntyneen ekspression miR-21 sekä selkeä ja papillaarinen munuaiskarsinoomia [14], [19], [55]. Sen sijaan äskettäin mikrosiruanalyysi 30. laadut 1 ja 2 selkeä solu munuaissyöpä kudosta, miR-21 kerrottiin vaimentua yli 2-kertainen [56]. Mielenkiintoista, heikko vastavuoroinen korrelaatio havaittiin välillä potilaiden selviytymiseen selkeät cell munuaissyöpä ja miR-21 ilme [55]. Tässä raportissa downregulation miR-21 löydettiin VHL puutteellisia RCC4 munuaissyövän solulinjaa [55]. Käyttökuntoon VHL lisännyt ilmentyminen miR-21 on Hifα riippumattomalla tavalla. On huomattava, että 42%: n kirkas kasvainten osoittavat VHL-mutaation ja 10%: n kasvaimia kuljettaa metylaatio VHL-promoottori [57], [58], [59]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittavat merkittävää kasvua miR-21 ilmentyminen VHL positiivinen ACHN ja Caki-2 munuaissyöpäsoluissa verrattuna normaaliin proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen (Fig. 1 ja Fig. S2) [60]. Lisäksi meidän tulokset osoittavat merkittävästi parannettu miR-21 ilmentyminen 100% luokan 2 ja 3. asteen munuaisten tuumorikudoksista verrattuna vastaaviin kontrolleihin kudoksen (Fig. S1). Lisäksi käyttämällä VHL negatiivinen munuaissyövän solulinjaa, 786-O, löysimme huomattavasti ilmentymistä miR-21 verrattuna HK2 proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen (Fig. S20). Nämä tulokset osoittavat, että riippumatta siitä, VHL tila, munuaisten syöpäsolut ilmentävät korkeita tasoja miR-21.

metastasoitunut munuaissyöpä solujen lisääntynyttä TGF-riippuvainen Smad 2/3 signalointi [61]. Äskettäin roolin TGFp lisäämisessä tasot kypsän miR-21 on raportoitu [62]. Nämä kirjoittajat kuvattu transkriptiosta riippumaton toiminto TGFp erityisiä Smad proteiineja, jotka rekrytoidaan RNaasi III Drosha vuorovaikutuksessa RNA helikaasin p68. Tämä mikroprosessori monimutkainen rekrytoi pri-miR-21 helpottaa tuotannon ennalta miR-21, mikä lisää tasoja kypsän miR-21 [62]. Tämä tutkimus ei löytänyt mitään kasvua pri-miR-21 vastauksena TGF. Viime aikoina, samaan ryhmään raportoitu läsnä TGFp-spesifinen Smad sitova osa varren alueella pri-miR-21, joka rekrytoi Smad suoraan Drosha mikroprosessori /pri-miR-21 kompleksin lisäämiseksi käsittely tuottaa pre-miR 5A. 6B.