Krooninen sairaus

tiivistelmä

meren sieni

Microascus brevicaulis

kanta LF580 on ei-malli toissijainen aineenvaihduntatuote tuottaja ja korkean tuoton kahden sekundäärimetaboliitteja scopularides A ja B, joilla on erillistä toimintoa vastaan ​​tuumorisolulinjoissa. Mutanttikanta saatiin käyttämällä UV mutageneesiä, osoittavat nopeampaa kasvua ja eroja pelletin muodostuminen lisäksi korkeammat tuotannon taso. Täällä näytämme ensimmäinen proteomiin tutkimus Meren sieni. Vertaileva proteomiikka levitettiin saada syvempää ymmärrystä tuotannon sääntely ja fysiologiasta villityyppiseen kantaan ja sen mutantti. Tätä varten optimoidun proteiiniuutto protokollaa perustettiin. Kaikkiaan 4759 proteiinit tunnistettiin. Keskeinen metaboliareitti Kannan LF580 kartoitettiin käyttäen Kegg polku analyysi ja GO huomautusta. Käyttävät iTRAQ merkintöjä, 318 proteiinit osoitettiin merkittävästi säännellä mutanttikanta: 189 olivat alas- ja 129 voimistunut. Proteomiikka ovat tehokas työkalu ymmärrystä sääntelynäkökohtien: Erot koskevat proteomiin tasolla voisi johtua rajoitetaan ravinteiden saatavuuden villityyppiseen kantaan johtuen vahvan pelletin muodostumista. Tämä tieto voidaan soveltaa optimointiin rasitusta ja prosessi tasolla. Kytkös ravinnerajoitteisuuden ja pelletin muodostuminen ei-malli sieni

M

.

brevicaulis

on yhteisymmärryksessä tietämystä malliorganismien kuten

Aspergillus niger

ja

Penicillium chrysogenum

.

Citation: Kramer A, Beck HC, Kumar A, Kristensen LP, Imhoff JF, LABES A (2015) proteomiikan analyysi Anti-syöpä Scopularide Tuotanto Marine

Microascus brevicaulis

Siivilöi ja sen UV Mutant. PLoS ONE 10 (10): e0140047. doi: 10,1371 /journal.pone.0140047

Editor: Marie-Joelle Virolle, University Paris South, RANSKA

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 21 syyskuu 2015; Julkaistu: 13 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Kramer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla olevat tiedot tiedostoja tai kautta Pangea tietokannasta (doi: https://dx.doi.org/10.1594/PANGAEA.853591).

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee taloudellisesti Euroopan unionissa 7. Framework KBBE (https://cordis.europa.eu/fp7/kbbe/about-kbbe_en.html) hanke MARINE SIENET (projekti no. 265926). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Uusi sekundäärimetaboliitteja sienten pitää paljon potentiaalia hakemuksen ihmisille tarkoitettujen [1, 2]. Kaksi cyclodepsipeptides scopularides A ja B on tuotettu kotelosienten, eristetty sisempi kudoksen -merisienestä

Tethya aurantium

[3]. Sienikanta kuvattiin alun perin

Scopulariopsis brevicaulis

LF580. Viimeaikaiset tutkimukset paljastivat

S

.

brevicaulis

olevan Teleomorph on

Microascus brevicaulis

[4-6]. Mukaan sääntöjen nimikkeistön sienet (6), nimi

Microascus brevicaulis

-kanta LF580 käytetään tässä käsikirjoitus.

Molemmat scopularides osoittivat spesifistä aktiivisuutta vastaan ​​haimasyöpäkasvainsolulinjo- linjojen Colo357 ja Panc89 sekä paksusuolen kasvaimen solulinja HT29 [3]. Molemmat scopularides koostuu viiden aminohapon syklisoidaan sivuketjun kautta (scopularide A: (

syklo

– (3-hydroksi-4-methyldecanoyl- Gly-l-Val-d-Leu-L-Ala-l- Phe); scopularide B:

syklo

– (3-hydroksi-4-methylloctanoyl- Gly-l-Val-d-Leu-L-Ala-L-Phe)). sisällä genomin analyysia

M

.

brevicaulis

LF580, 17 NRPS geenit tunnistettiin [7]. vastuullinen geeni klusterin scopularide sisältää ei-ribosomaalinen peptidi syntetaasin (NRPS1), joka on polyketidisyntaasia (PKS2), joka on CoA-ligaasin, asyylitransferaasia ja transkriptiotekijä [7, 8]. Koska rakenteellisista analogisesti synteesi sekä scopularides saman entsyymin kompleksi on oletettu.

villikannassa LF580 edustaa ei-malli sekundaarimetaboliittien tuottaja, jolla korkea saannot kohde aineenvaihduntatuotteiden (noin 200 mg L

-1 scopularide [9]). Käyttämällä optimoitu seulontaan [10], UV-mutanttikanta (

M

.

brevicaulis

kanta LF580-M26) havaittiin, mikä osoitti paremman tuottavuuden taso kahden scopularides standardiolosuhteissa, nopeampi ja erilaisia ​​kasvu ja muutokset pellettien muodostumista. Siten tämä mutanttikanta LF580-M26 valittiin yksityiskohtaista vertailu villityypin rasitusta proteomiin tasolla.

Comparative proteomiin profilointi auttaa ymmärtämään aineenvaihdunnan muutoksia sovittelu solujen aineenvaihdunnan toimintaa tapahtuu periaatteessa proteiini tasolla [ ,,,0],11, 12]. Quantitative proteomiikka voi linkittää fysiologisia muutoksia, kasvua ominaisuudet ja parannettu sekundaarimetaboliittien tuotannon molekyylitason muutoksia proteomiin tasolla. Kvantitatiivinen vertailu aikaan uusia tietoja säätelyreittejä mukana ja edistää tarkka rasitusta ja prosessien kehittäminen [13-16]. Huolimatta esiintyvyys bioteknologian alan ja niiden merkitys taudinaiheuttajien, rihmasienet jääneet vähemmälle huomiolle aloituksen aikana ja toteuttamalla innovatiivisia biologisia menetelmiä ja systeemibiologian aiemmin [17]. Kuten genomisessa aikakauden, rihmasienet ovat epäilyttävien että proteomic aikakauden: Vuonna 2008 vain muutaman sienen proteomiin tutkimukset olivat saatavilla, pääasiassa kuvaavat klassinen malli lajeja kahdesta suvuista

Aspergillus

ja

Penicillium

[15]. Tänään, 250 sieni proteomeja ovat saatavilla, mikä on alle 5% verrattuna käytettävissä bakteerien proteomeja (https://www.uniprot.org, elokuu 2015). Molecular kokosolu analysoi paljastaa kattavampia tietoja etenkin muiksi kuin malliorganismit tiedottaminen reaktion organismin ympäristön muutoksiin. Joissakin tutkimuksissa on jo antanut Hanko valtava potentiaali proteomiikka:

E

.

g

. proteomiin analyysi kehitysvaiheet vuonna

Militaris

johtanut konkreettisiin lähtökohtia kannan kehitykseen [18], proteomia tutkimukset

.

fumigatus

uutta tietoa patogeenisuutta mekanismeista [19], ja vertaileva proteomianalyysi olevan

.

nidulans

rasitusta ja sen mutanttikanta paljasti useita vaikutuksia geenien poistot [20, 21].

Proteome tekniikat kehittyvät nopeasti, mutta monet protokollat ​​on kehitetty vain pieni määrä organismeja. Lähes kaikki uudet tutkimukset tarvitsi mukauttamista proteiiniuutto menetelmiä. Yleensä sieniä tiedetään olevan jäykkä ja monimutkainen soluseinien, minkä vuoksi erityistä huomiota soluseinän häiriöitä tarvitaan näytteen valmistuksen aikana [17, 22, 23].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli proteomia perustuva luonnehdinta eroja UV mutantti LF580-M26 ja villin tyypin (WT) kanta, jotta voidaan tunnistaa taustalla molekyylitason mekanismit lisääntyneen scopularide tuotanto UV mutanttikanta. Tämä tutkimus on ensimmäinen proteomianalyysi Meren rihmasienen.

Tulokset

tunnistaminen yhtäläisen näytteenottopaikkoja määrittämällä kasvuominaisuudet ja scopularide tuotanto

Koska kaikki muutokset solun metabolinen toiminta ei aiheuta muutoksia proteiinien tasolla, vertaileva proteomianalyysi kantojen eri kasvun käyttäytymiseen ja fysiologiaan saa vain synkronoimalla metabolisen piirre kaksi kantaa. Vertailu niiden kasvua käyttäytymistä käytetään valitsemaan sato piste, jossa molemmat kannat otaksuttiin olevan samassa kasvun ja tuotantovaiheessa. Kasvukäyrät molemmat kannat saatiin kolminkertaisina ja osoittivat eroja kasvun käyttäytymistä WT kannan LF580 ja mutanttikanta LF580-M26 (kuvio 1A). Selviä eroja oli nopeus, pH, biomassan ja scopularides tuotannon (kuvio 1 B) eri kasvuvaiheissa.

(A) Aikasarjat biomassan (LF580: – ◆ – (vaaleanharmaa); LF580-M26: – ▲ – (tummanharmaa)) ja pH-arvo (LF580: – ■ – (vaaleanharmaa); LF580-M26: – ● – (tummanharmaa)) varten villityyppiseen kantaan LF580 ja sen mutanttikanta LF580- M26 on esitetty. Määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja 6 päivää. (B) Tuotanto tasot scopularide A (LF580: – ◆ – (vaaleanharmaa); LF580-M26: – ▲ – (tummanharmaa)) ja B (LF580: – ■ – (vaaleanharmaa); LF580-M26: – ● – (tummanharmaa)) aikana aikasarja verrataan perusteella piikin pinta vastaavien massa signaali jälkeen analyyttisen HPLC-MS. Käyrät edustavat suuntaus linja.

nopeassa kasvuvaiheessa mutanttikannan LF580-M26 aloitettiin 20 tuntia inokulaation jälkeen. Sen sijaan lag vaihe WT kannan päättyi noin kahdeksan tuntia myöhemmin. Kun biomassan tuotanto ja pH markkereina sienen kasvun, käyrät erosivat kesto nopeassa kasvuvaiheessa, oli noin 24 h mutantti ja 42 h WT. Nämä erot johtivat kasvuvauhti 0,0715 g biomassan L

-1 h

-1 ja 0,0426 g biomassan L

-1 h

-1 (biomassasta: μX = dX (dt)

-1) varten mutanttikanta LF580-M26 ja WT-kantaa, tässä järjestyksessä. Biomassa tuotanto Molempien kantojen tuona vaiheessa näytti melko samanlaisia ​​arvoja 1,71 g biomassan L

-1 (mutanttikanta LF580-M26) ja 1,79 g biomassan L

-1 (WT kanta). Lopullinen saanto Molempien kantojen oli samaa suuruusluokkaa (LF580: 3,4 g biomassa L

-1, LF580-M26: 4,3 g biomassa L

-1). Samanlainen biomassan käyrä, etenemistä pH-käyrän mutanttikannan LF580-M26 oli melko eksponentiaalinen suhteessa lineaarisen etenemisen pH-käyrän WT-kantaa. Verrataan ajankohta, kun molemmat kannat saavutti alimman pH (loppua osoittavaa nopea kasvu), ero oli noin 24 h molempien kantojen havaittiin. PH-arvo WT kanta pysyi tällä tasolla loppuun asti kokeen (120 h). Sitä vastoin pH-arvo mutanttikannan LF580-M26 alkoi nousta heti saavuttaa alimman pH-taso on sama etenemistä se oli laskenut aikaisemmin. PH-arvo oli enintään 7,5 lopussa kokeen.

Molemmat kannat osoittivat jatkuvaa tuotantoa scopularides samanlaisia ​​hinnat aikana nopean kasvun vaiheessa. Dramaattinen muutos johtaa tyhjentää eroja WT ja mutanttikanta havaittiin siirtymävaiheessa myöhään nopea varhaisen stationäärifaasin (Kuva 1B): Mutanttikanta LF580-M26 läpi tämä siirtymä 7 h ja WT kanta tarvitaan noin 32 tuntia. Scopularide tuotantonopeus oli 50 kertaa suurempi mutanttikanta siirtymävaiheen aikana. Vuonna paikallaan kasvuvaiheessa, kerroin laski noin 10. Tässä vaiheessa (

i

.

e

. 52 h ja 72 h viljelyn LF580-M26 ja LF580, vastaavasti) tuottavilla scopularides pysähtyi WT-kantaa, kun taas tuotanto mutanttikanta edelleen lisätään, kunnes noin 100 h viljelyn, jonka jälkeen lasku keskittyminen molempien scopularides. Ominaista kompakti pelletti muodostumista WT-kantaa ei havaittu, että mutanttikanta LF580-M26. Pelletti muodostumista WT-kantaa alkoi päivänä kaksi istutuksen jälkeen; päivänä kolme noin 90% pellettien saavuttanut koko 2-3 mm halkaisijaltaan; päivänä neljä pelletti muodostumista päätyi halkaisijat 3-4 mm. Mitään merkittävää lisäystä pelletin määrää voitiin havaita neljän päivän jälkeen. Sen sijaan, LF580-M26 oli kasvava sameus kulttuurin, jossa rihmamaisia ​​kasvu muuttumassa kehittämiseen karvainen pellettejä (halkaisija noin 1 mm). Viskositeetti kulttuurien lisääntynyt päivään viisi viljelyä.

Kun otetaan huomioon havaitut erot, pH, biomassan ja scopularides tuotanto käytettiin markkereita määrittämään vastaavat näytteenottopisteiden: Niinpä solut kerättiin kuluttua 68 h (WT kanta LF580) ja 44 h (mutanttikanta LF580-M26). Näinä aikoina, kantoja otaksuttiin olevan vertailukelpoisessa kasvun tilassa, kuten pH (LF580: 4,62 ± 0,13; LF580-M26: 4.95 ± 0,17) ja biomassa (LF580: 2,5 ± 0,2 mg ml

-1; LF580-M26: 2,6 ± 0,1 mg ml

-1) arvot olivat samaa luokkaa.

Quantitative Protein Extraction edellytyksenä Proteome Studies

kun kyseessä meren non -malli sieni

M

.

brevicaulis

kanta LF580 Tämän tutkimuksen lisäksi metodologisia lähestymistapoja ja validointimenettelyissä oli välttämätöntä saada korkealaatuista proteomiin tiedot. Yksinkertainen standardi uutto- perustuu solujen häiriöitä sonikoimalla eivät johtaneet samanlaatuista (kuvio) ja määrä (intensiteetti) proteiinien WT ja mutanttikanta, joka osoittaa epätäydellinen louhinta. Siksi mukautettu proteiiniuutto protokolla kehitettiin ja validoitu. Painopiste asetettiin solujen rikkomisen ja liukenemista proteiinien (kuvio 2). Kahden solun häiriöitä menettelyjä verrattiin: jauhamalla nestetypessä ja soveltaminen helmiä. Lisäksi, painopiste on asetettu liukeneminen liukenemattoman proteiinifraktion, joka pelletoitiin aikana alkuerotuksen.

kaksi erilaista solun häiriöitä menetelmiä verrattiin lukumäärän suhteen proteiinin ryhmien tunnistetaan käyttämällä nano-LC-MS /NEITI. Lisäksi painopiste on asetettu liukenemisen tuskin liukoista fraktiota (H) vieressä liukoisen fraktion (S).

Kun tätä sovitettu protokollaa, verrattavissa uuttamalla arvosana WT ja mutanttikanta oli osoittautunut SDS-PAGE ennen digest lopullisen proteiinin uute (tuloksia ei esitetty). Jotta vertailla louhinta laadut eri näytevalmisteita (kuvio 2), proteomia analysoitiin näytteestä näyte käyttäen nano-LC-MS /MS. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että koko genomin

M

.

brevicaulis

on kooltaan noin 32 Mt, joka sisältää 16,298 geenejä. 1,33%: n genomin edusti toistot [7, 24]. Täällä, 4759 proteiinit tunnistettiin (FDR 0,01 ja 1 ≥ peptidejä proteiinia kohti) käyttäen kehitetty uuttomenettelyjä molemmissa kannoissa. Tämä heijastaa kattavuus noin 30% teoreettisesta proteiinin määrä. Proteiinit saatiin nestemäistä typpeä uuttamalla kattoi 92,2% näistä 4759 proteiineja. Verrattuna kattavuus 88,1% käyttäen helmi-pohjainen louhinta, nestemäinen typpi louhinta siis johtanut kasvoi 4,1% proteiineja piiriin. Noin kolme kertaa suurempi kasvu (11,4%) saavutettiin liukenemisen ”tuskin liukeneva” proteiinit (92,2%), keskittymisen sijasta vain ”helposti liukeneva” proteiini murto (80,8%). Tämä kasvu oli riippumaton alkuperäisestä solusta häiriöitä menetelmä.

vertailu proteomeja villityyppiseen kantaan LF580 ja sen UV mutanttikanta LF580-M26

analyysi polkuja ja proteiinin toimintoja.

yhdistelmä kaikkien fraktioiden nestemäisellä typellä käsiteltyjä soluja käytettiin kvantitatiivista vertailtavaksi iTRAQ merkintöjä. 3526 keskinäinen proteiinit luotettavasti tunnistettu ja määrällisesti WT ja mutanttikanta LF580-M26 (FDR 0,01 ja 2 ≥ peptidejä proteiinia kohti). 318 proteiinit säädellään eri tavalla: 129 proteiinit voimistunut ja 189 olivat vaimentua siinä mutanttikanta verrattuna WT rasitusta. Tunnistamiseksi molekyyliprosessien ja solujen toimintaa, joukko säädellään eri tavalla proteiinien alistettiin GO analyysi [25] (Kuva 3). Entsyymi toiminnallisuudet paljastui käyttäen Kegg [26], ennustavat vaikutuksia mutaation solujen ja aineenvaihdunnan tasoa (kuvio 4).

3526 proteiinit kvantitoitiin käyttäen iTRAQ merkintöjä. 318 (9%) osoitti merkittävää sääntelyn mutanttikanta. 129 (3,7%) on voimistunut ja 189 (5,3%) oli vaimentua. Pylväskaaviolla näyttää prosentteina ylä- ja vaimentua proteiineja lajitellaan eri luokkiin perusteella GO huomautusta.

Tummanharmaa kaavioita edustaa vaimentua proteiinit mutanttikanta, vaaleanharmaa, toisin The upregulated niistä. Numerot heijastavat sekvenssit entsyymien lajiteltu eri luokkiin.

arviointi GO tietojen suoritettiin käyttäen joukko laajennetun luokkiin,

i

.

e

. alatasoa of GO luokkien [27]. Tärkeimmät erot havaittiin luokat hajoamista, pelletin muodostuminen ja replikointi. Kahden jälkimmäisen ryhmän tulos oli selvästi säätelyyn ylöspäin mutantti tekijät 3,2 (pelletin muodostuminen) ja 3,5 (replikointi), tässä järjestyksessä. Kuitenkin pelletin muodostuminen edustaa tiettyä pienellä tietojen joukko proteiineja (1,6% ylä- ja 0,5% vaimentua). Selvä downregulation nähtiin proteiinien ryhmien liittyvät kategoriat hajoamista, varastointi, stressin vastaus ja kuolema. 18,6% proteiineista, jotka liittyvät luokan kataboliaa oli voimistunut ja 33,3% vaimentua. Luokkaan anaboliaa, suunnilleen sama määrä proteiineja oli ylä- tai vaimentua: 10,1% ja 9,5%, tässä järjestyksessä. Pienet erot voitiin nähdä luokkien soluseinän (suhde 1,5) ja liikenne (suhde 1,3). Ryhmien sisällä varastointi (0,5%), stressin vastaus (4,2%) ja kuolema (2,1%) vain vaimentua proteiineja havaittiin. Määrä tuntemattomien proteiinien oli lähes sama ylä- ja vaimentua datajoukon (17,8% ja 16,9%, tässä järjestyksessä). 12,4% (0,8% voimistunut, 11,6% vaimentua) säänneltyjen proteiinien ei voitu sijoittaa johonkin luokista.

Kegg koulutusjakson analyysi mahdollisti pätevyys kaikki tarvittavat entsyymit keskeisten aineenvaihduntaan (ks alla). Yleensä ekspressiotasot useimpien entsyymien vaimentua on mutanttikanta (kuvio 4). Kun on ”biosynteesiä sekundäärimetaboliitteja” yhtä monta entsyymien oli ylä- ja vaimentua. Niissä luokissa rasva-aineenvaihduntaan, aineenvaihduntaan kofaktoreita ja vitamiineja, metabolia terpenoids /polyketidien ja kääntäminen, suurempi määrä entsyymien paljasti suurempia ilmennystasoissa mutanttikanta.

Kegg ja GO tietoja käytettiin yksityiskohtaisen vertailun WT-kantaa ja mutanttikanta LF580-M26.

katabolia.

GO luokan hajoamista osoittivat suuremman määrän proteiineja vaimentua siinä mutanttikanta (kuvio 3). Kuitenkin, downregulation ei vastaa yleistä hidastumisesta katabolian. Esimerkiksi peptidaasi estäjä i9 (g7795), estäjä catabolic prosesseja, osoitti downregulation on mutanttikanta, mikä osoittaa parantaminen catabolic prosesseja. Arvioinnin Kegg tiedot vahvistivat tämän oletuksen, koska downregulation pääasiassa nähty entsyymitasolla ylimääräisiä reittejä ja isoentsyymejä on mutanttikanta, luultavasti johtaa suurempiin valovirran Keski väyliä.

Kaikki entsyymit klassisen Embden-Meyerhof reitin (glykolyysin) olivat läsnä ja aktiivisia, mahdollistaa kasvu glukoosi odotetusti tyypillisen eukaryootti. Lisäksi kaikki entsyymit ovat tarpeen alkuperäisen hajoamisen muiden mono- ja disakkarideja voitaisiin kuvata. Kasvualusta sisälsi glukoosia hiilihydraatin lähteenä, mutta soijapeptonia ja hiivauute oli lähteitä ylimääräisiä monomeeriset sokerit (mukaan toimittajien todistukset analyysit). Ilmaisu Kaikkien glykolyyttisten entsyymien oli sama WT rasitusta ja mutanttikanta LF580-M26.

pentoosifosfaattireitistä (PPP) voitaisiin määritellä. Useimmat entsyymit vaimentua siinä mutanttikanta, kuten fruktoosi-biphosphatase (EY 3.1.3.11). WT käytetty kanta sekä fruktoosi-biphosphatase (EY 3.1.3.11) ja 6-phosphofructokinase (EY 2.7.1.11). Osalta hapettavan osan, polku D-glukonaatti-6-fosfaatin d-riboosi-1-fosfaattia vaimentua, että mutanttikanta. WT saattavat hyötyä käynnissä PPP, koska se tuottaa ylimääräisiä NADPH, jota tarvitaan ammonium oton sekä proteiinien biosynteesiä. Yleensä suurempi kysyntä NADPH kasvaa vuon kautta PPP [28]. Korkeampaa proteiinin ilmentymisen PPP WT ilmoitti tällainen korotus flux [29].

odotetusti eukaryoottiorganismi, pyruvaattia tuotetaan Glykolyysivaiheen oli kanavoidaan klassisen pyruvaattidehydrogenaasikompleksi osaksi tricarbonic acid cycle (TCA). Täydellinen TCA oli toimintansa catabolic suuntaan molemmissa kannoissa. Kuitenkin mutanttikanta LF580-M26 osoitti downregulation joidenkin entsyymien: Ensimmäinen askel kondensaation oksaloasetaatin ja asetyyli-CoA: n sitraatti katalysoi sitraatti-syntaasi (EY 2.3.3.8) on mutanttikanta.

M

.

brevicaulis

kanta LF580-M26 käyttää askeleen isositraattidehydrogenaasin isoformin (EY 1.1.1.41) tuottaa NADH. WT lisäksi ilmaissut kaksivaiheinen isositraattidehydrogenaasin (EY 1.1.1.42) tuottaa NADPH. Hyödyntämällä tätä entsyymiä, WT voisi nostaa NADPH tasoa,

e

.

g

. lisäämiseksi ammonium ottoa tai korkeampia käännös. Sama ilmiö havaittiin varten sukkinaattidehydrogenaasi, joka on läsnä WT-kantaa EY 1.3.99.1 ja EY 1.3.5.1. Jälkimmäinen isoformi on kalvoon sitoutunut ja osa hengitysteiden elektroninsiirtoketju. Todettiin samalla käännös tasolla sekä kantoja. Muuntaminen CoA-aktivoitua hiilihapoista (asetaatti, butyraatti, asetoasetaatti) säädeltiin vähentävästi tasolla asetaatti CoA-transferaasi (EY 2.8.3.8), joka johtaa korkeaan tasoon aktivoitu substraattien TCA ja sen jälkeen vuon mutanttikanta .

CoA-transferaasi (EY 2.8.3.8) ja niihin liittyvät entsyymit β-hapetus vaimentua siinä mutanttikanta osoittaa alhaisempi β-hapettumista. Downregulation propionyyli-CoA muuttavien entsyymien, kuten 2-methylcitrate syntaasi (EY 2.3.3.5) ja sitä seuraavan dehydrataasia (EY 4.2.1.79), samaan aikaan alhaisempi β-hapettumista, kuten propionyyli-CoA on muodostettu kautta hajoamisen parittomat rasvahappoja. Sen sijaan, WT: n osoitti suurempia näiden entsyymien, joka voisi selittyä hajoamista varastoinnin yhdisteiden (

i

.

e

. Rasvahapot) indusoi hiili rajoituksen sisällä muodostetaan pellettejä .

Entsyymit hengitysteiden ketjun (oksidatiivisen fosforylaation) olivat päteviä ja osoittanut mitään eroa ekspressiotaso välillä mutantin ja WT-kantaa.

Aminohappo hajoamista ja typen aineenvaihduntaan olivat päteviä, mikä osoittaa, että NADP-glutamaattidehydrogenaasin (EY 1.4.1.4) käytettiin molempien kantojen omaksua vapaa ammonium väliaineesta. Vuonna mutanttikanta, ylimääräisiä ammonium- otto kautta glutamiinisyntetaasi-glutamiinia oksoglutaraatti aminotransferaasi (GOGAT) sykli vaimentua tasolle muuntaminen glutamaatin glutamiini, jonka glutamiinisyntetaasi (EY 6.3.1.2).

NAD erityisiä glutamaattidehydrogenaasin (EY 1.4.1.2, muuntaa glutamaatin ketoglutaraattiin ja ammoniumnitraatin tai taaksepäin) säädeltiin vähentävästi on mutanttikanta. Tällainen downregulation osoitettiin sienisoluihin eivät rajoita niiden typen tai hiilen lähteitä [30, 31]. Päinvastoin, NAD-spesifinen glutamaattidehydrogenaasia olisi käytössä, jos kanta on rajoitettu yhteen näistä lähteistä. Kuten scopularide tuotanto on typpi riippuvainen [9], proteomin tiedot viittaavat siihen, typen rajoitus WT käytetyssä väliaineessa. Sen sijaan kaikki keinot lisää vahvistuksen typen oli vaimentua on mutanttikanta, joka ei näytä olevan typen rajoitettu.

Yleensä aminohappo hajoaminen on aktiivinen, jolloin kantoja kasvatetaan peptoni sisältävässä alustassa . Muuntaminen aminohappojen asetyyli-CoA myöhemmin hengitys oli parannettu tasolla vastaavien asetyyli-CoA C-asyylitransferaaseissa (EY 2.3.1.16). Kuitenkin hajoaminen aminohappojen tarpeen tuotantoa varten scopularides säädeltiin vähentävästi (katso jäljempänä).

Anabolia.

arviointi GO paljastivat saman verran proteiineja ryhmittyneet luokkaan anabolism olla ylä- ja vaimentua. Kegg polku analyysi sallittu yksityiskohtaisemman kuvan.

entsyymit klassisen Embden-Meyerhof (EM) reitin eukaryooteissa yleensä palvelee kahteen suuntaan: glykolyysille ja glukoneogeneesin. Näin ollen, kun läsnä on työ- EM polku ilmaisee glukoneogeneesiin toimivat samaa reittiä. Koska jotkin reaktiot EM reitin ovat peruuttamattomia, muita reaktioita ovat tarpeen glukoneogeneesin: Eukaryoottinen glucogenetic avainentsyymien 1,6-fruktoosi bisphosphatase (EY 3.1.3.11) ja fosfoenolipyruvaattikarboksikinaasi (EY 4.1.1.49) oli pätevä ja osoitettu vaimentua että mutanttikanta. Kolmas entsyymi, glukoosi-6 fosfataasin (EY 3.1.3.9), ei voitu molemmissa kannoissa. Tämä osoitti suoran konversion glukoneogeneesin glukoosi-6-fosfaatin glukoosi-1-fosfaatin muodostumista solun kirjekuoren ja muita polymeerisiä sokerit varastointia varten. Samoin kuin muiden glukoneogeneesin entsyymien vastaavien glukoosifosfaatti foglyseraattimutaasia (EY 5.4.2.2) osoitettiin vaimentua siinä mutanttikanta.

Sisäinen sokeria varastointi (

e

.

g

. glykogeenin muodostumista) ei ollut aktiivinen mutanttikanta. Kaikki käytettävissä olevat glukoosi syöttää suoraan glykolyyttisen reitin kuten on osoitettu downregulation kaikki tarvittavia entsyymejä polymeerisen sokerin hajoamista. Vaimennussäätely glukoosifosfaatti foglyseraattimutaasia (EY 5.4.2.2) kannatti tätä hypoteesia, koska sen toiminta on edellytys muuttamassa sokerien varastoon polysakkarideista.

ketoacids TCA toimivat käynnistin molekyylejä biosynteesiä aminohappojen ja muita molekyylejä. Niiden poistaminen ketoacids päässä TCA anabolic reaktio vähentää vuo catabolic reaktioita ja siten energinen saanto. Niinpä monet anabolisia reaktioita alkaen TCA oli vaimentua siinä mutanttikanta, kuten sukkinaattidehydrogenaasi (EY 1.2.1.16), 4-aminobutanoaatin-transaminaasin (EY 2.6.1.19) ja malaattidehydrogenaasin (EY 1.1.1.38).

Aminohappo biosynteesireittejä luokiteltiin, mutta ei kantojen väliset erot havaittiin. Proteomi tietojen mukaan LF580 käytetty alfa-aminoadipate koulutusjakson lysiiniä biosynteesiä.

Transport.

vastaavaa määrää proteiinien liittyy kuljettaa prosesseihin oli ylä- ja vaimentua. Voimistunut proteiinit olivat mukana kuljetukseen aminohappojen sekä hapen soluihin. Erityisesti proteiini (fosfaatti repressoitavissa fosfaatti permease, g10374) vastaa säännellyn otto fosfori säädeltiin vähentävästi; sen sijaan ei-säännelty fosfori liikenne on läsnä. Sääntely saanti typen (

i

.

e

. Nitraatti) säädeltiin vähentävästi (nitraatti rinnastaminen säätelyproteiinia Nira, g12583) ja on yhdenmukainen sen downregulation kaikki keinot ylimääräisiä voitto typpi mutanttikanta.

proteiinit osallistuvat solunsisäiseen kuljetukseen oli vaimentua siinä mutanttikanta, esimerkiksi proteiineja, jotka kuuluvat Golgin laitteeseen, peroksisomipro- ja rakkulan liikenne.

replikointi, morfologia, solu eheys ja ylläpito.

Kasvuerot heijastuivat selvästi luokkiin replikointi ja pelletin muodostuminen. Verrattuna WT-kantaa kolme kertaa enemmän proteiineja, jotka kuuluvat näihin luokkiin ilmentyivät mutanttikanta (kuvio 3). Jotkin proteiinit vaimentua, kuten solunulkoinen seriini runsaasti proteiinia (g7517), joka liitettiin myöhäisessä vaiheessa kehitystä [32]. Kuitenkin muutokset proteiinien mukana pelletti morfogeneesissä ei havaittu.

mutanttikanta osoitti jonkin verran ilmen- tymisen lisääntymisen osallistuvien proteiinien huoltotoimintoja,

e

.

g

. muuntaminen glysiinin aminolevulinaatin (5-aminolevulinaattisyntaasin, EY 2.3.1.37) myöhempää porfyriini synteesiä. Säätely Tämän entsyymin saattavat liittyä parantaa Hengitysketjun huoltoa. Korkeammalla hengityksen että mutanttikanta sekaantumaan korkeampi suojan oksidatiivisen stressin. Esimerkiksi ydin- proteiinin qri2 nse4 (g3175), joka toimii DNA: n korjaukseen, on yliaktiivista mutanttikanta [33].

kuitenkin osallistuvat geenit stressin vastaus osoittivat korkeampia ekspressiotasoja WT. Kun otetaan huomioon rajoitus tilanne WT takia pelletin muodostuminen (

i

.

e

. Ravinteiden stressi, alhainen pH lopussa kasvun vaiheessa), kuten stressi vastauksia voidaan odottaa [34 , 35]. Yksi esimerkki on korkeampi peroksisomaalisen katalaasin (g8585), joka on vaimentua, että mutanttikanta. Edelleen proteiinit korjaus ja stressin vastaus oli vaimentua:

e

.

g

. Tam verkkotunnuksen metyylitransferaasin (g15885) säilyttäen eheyden polypeptidien päin ikäriippuvainen ei-entsymaattisten reaktioiden [36]; sfmgomyeliini fosfodiesteraasi (g8757) [37] ja selviytymistä proteiini varma kaltainen fosfataasi /nukleotidaasin (g13733). Jälkimmäinen voi olla mukana stressin vastaus, koska solut mutaatiot Toki geeni huonosti hengissä stationaarifaasissa [38].

Toissijainen aineenvaihduntaa.

Yhteensä 39 biosynteettinen entsyymi kompleksit olivat tunnistettu genomin

M

.

brevicaulis

. 17 olivat sidoksissa NRPS, 18 PKS, kaksi rasvahappoa ligaasilla ja yhden edusti PKS /NRPS hybridi [7, 24]. Näistä geeneistä, 9 NRPS ja 7 PKS proteiinit päteviä GO aineisto. iTRAQ kvantifiointi osoitti suuremman ilmentymisen NRPS13 ja PKS15 ja alemman ilmaus PKS 9, 14 ja 18 mutantti. Kuitenkin toiminta näiden entsyymien edelleen epäselvä, koska sekundaarimetaboliittien profiilit WT ja mutanttien ovat hyvin samankaltaisia.

Erityisesti asetuksen vastaavien biosynteesireittejä viiden aminohapon muodostamalla scopularides A ja B verrattiin: reitit L-valiini, L-fenyylialaniini, L-alaniini, d-leusiini ja glysiinin synteesi olivat päteviä, mikä osoittaa, että

M

.

brevicaulis

syntetisoitiin kaikki prekursorimolekyylit varten scopularides. Tätä tukevat aiempaa kasvua tutkimuksia, jotka osoittivat, että aminohappoja ravinnelähteisiin eivät muodosta suoraa esiasteina scopularide tuotantoon [9]. Hajoamisen aminohappojen tarpeen scopularide tuotanto oli merkittävästi vaimentua on mutanttikanta: alaniini hajoamista vaimentua tasolle alaniini-glyoksylaatin transaminaasin (EY 2.6.1.44) ja 4-aminobu–2-oksoglutaraatti transaminaasin (EY 2.6.1.19) . Valiini hajoaminen estettiin tasolla metyylimalonaatti–semialdehydiä dehydrogenaasin (EY 1.2.1.27).