Krooninen sairaus

tiivistelmä

genomivahvistuksen of 19q12 tapahtuu useissa syöpätyypeissä kuten munasarjasyöpä, jossa se liittyy ensisijaisesti hoidon epäonnistumisen. Olemme systemaattisesti heikennetty geenien ilmentymistä sisällä minimaalisesti määritellyn 19q12 alueen munasarjojen solulinjoissa käyttämällä lyhyen häiritseviä RNA: t (siRNA) tunnistaa kuljettajan onkogeenin (t) sisällä amplikonin. Knockdovvn

CCNE1

johti G1 /S-vaiheessa pidätys, vähennetään solujen elävyyden ja apoptoosin ainoastaan ​​vahvistusta kuljettavien solujen. Vaikka

CCNE1

Knockdown kasvoi sisplatiinin vastus lyhytaikaisissa määrityksissä, klonogeeniset eloonjääminen estyi hoidon jälkeen. Gain 20q11 korreloi voimakkaasti 19q12 vahvistus ja kohdistettava 2,5 Mb alue mukaan lukien

TPX2

, sentromeerinen proteiinia tarvitaan mitoosisukkulan toimintoa. Expression of

TPX2

oli korreloi geenien monistuminen ja

CCNE1

ilmaisun ensisijainen kasvaimia. siRNA inhibitio

TPX2

vähentää solujen elinkelpoisuus, mutta tämä vaikutus ei ole amplikonin-riippuvainen. Nämä havainnot osoittavat, että

CCNE1

on keskeisessä asemassa 19q12 amplikoni tarvittavat selviytymisen ja kyky muodostaa klooneja soluissa kanssa lokuksen vahvistus. Co-vahvistus on 19q12 ja 20q11 merkitsee läsnäoloa osuuskunnan mutaatiostatuksesta verkkoon. Nämä havainnot vaikuttavat kohdennettujen hoitomuotojen

CCNE1

riippuvainen munasarjojen syöpiä.

Citation: Etemadmoghadam D, George J, Cowin PA, Cullinane C, Kansara M, Australian munasarjasyöpä Study Group , et ai. (2010) Amplicon-Dependent

CCNE1

Expression on kriittinen klonogeeninen Survival jälkeen sisplatiinihoitoon ja korreloi 20q11 Gain munasarjasyövässä. PLoS ONE 5 (11): e15498. doi: 10,1371 /journal.pone.0015498

Editor: Nathalie Wong, Kiinan University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 31 elokuu 2010; Hyväksytty 17. lokakuuta 2010 Julkaistu: 12 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Etemadmoghadam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat National Health ja Medical Research Council (NHMRC) kohdeapuraha 628779 (www.nhmrc.gov.au). Australialainen munasarjasyöpä Study tukee Yhdysvaltain armeijan Medical Research ja Materiaalilaitoksen Esikunta alle DAMD17-01-1-0729, The Cancer neuvosto Victoria, Queensland Cancer Fund, The Cancer neuvosto New South Wales, The Cancer neuvosto South Australia, The Cancer Foundation Länsi-Australian, The Cancer neuvosto Tasmania ja NHMRC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Advanced vaiheessa serous kasvaimia muodostavat suurimman invasiivisen munasarjojen syöpien ja vaikka yleensä hyvä ensimmäinen vastaus sytoreduktiivisen kirurgian ja platinapohjaisen kemoterapian, useimmat naiset kohtaavat suuri riski toistumista ja köyhien pitkäaikainen säilyminen [1 ]. Platina-pohjainen aineet, kuten sisplatiini ja karboplatiini, ovat myrkyllisiä jakautuvia soluja johtuen muodostumista DNA additiotuotteiden joka johtaa kaksinkertaiseen katkeamisen, aktivoimalla DNA-vaurioita välittämää apoptoottisia signaaleja [2]. Vastauksena kemoterapia kuitenkin vaikea ennustaa ja tällä hetkellä ei ole ennustavia biomarkkereita vakavien munasarjasyöpiä kliinisessä käytössä. Olemme aiemmin kartoitettu alue 19q12 vahvistus liittyy hoitoresistenteille serous munasarjojen kasvaimia suorittamalla genominlaajuisten tutkimus kopioluvun muutos [3]. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien vahvistus on yhteydessä huonoon eloonjäämiseen [4], [5]. Vastaavasti, toistuvat monistus 19q12 on raportoitu erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien ruokatorven [6], mahan [7], keuhkosyöpä [8] ja kohdun limakalvon kasvaimet. [9]

19q12 vahvistus on korkean tason polttoväli vahvistus, joka kohdistuu klusterin vasta useita geenejä kromosomissa 19.

CCNE1

(sykliini E) on aikaisemmin ehdotettu tavoite vahvistus munasarjasyövän [4], [10], [11], mutta järjestelmällinen analyysi tunnettujen geenien sisällä amplikoni ei ole suoritettu. Lisäksi vaikka

CCNE1

vahvistus todennäköisesti tarjoaa onkogeenisessä ärsyke aktivoimalla solusyklin, ei ole selvää, miten se voi edistää ensisijainen kemoterapia vastus. Esimerkiksi yli-ilmentyminen

CCNE1 in vitro

tekee munasarjasyöpäsoluja herkempiä platinaa aineita, mikä johtuu oletettavasti lisääntynyt proliferaatio [12]. On mahdollista, että biologinen seuraus 19q12 vahvistusta ei ole rajoitettu yli-ilmentyminen

CCNE1

, ja että muita geenejä amplikonin edistävät kasvaimen kasvua tai etenemistä. Lisäksi muut yhteistyössä nykyisten mutaatiotapahtumaa muualla syövän genomin voivat toimia yhteistyössä tai parantaa kasvaimia synnyttävän vaikutuksen

CCNE1

yli-ilmentyminen.

suorittamansa siRNA pudotus näytön kaikkien selityksin geenien ja heti reunustavan 19q12 amplikonin munasarjasyövän solulinjoissa tai ilman alueellisten vahvistusta. Löysimme

CCNE1

olevan ainoa geeni tavoite sisällä amplikoni, joka vähensi solujen elinkelpoisuuden amplikonin sisältävä OVCAR-3 solulinja jälkeen siRNA knockdown.

CCNE1

Knockdown aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin samalla heikentäen klonogeeniset selviytymisen jälkeen sisplatiinihoitoon kasvusta huolimatta

in vitro

lääkeresistenssin lyhytaikainen sytotoksisuusanalyysin. Taudista ympäristössä, nämä tulokset viittaavat siihen, että hoidon epäonnistuminen

CCNE1

monistettiin kasvaimet voivat liittyä nopeasti harvenneiden kasvaimen kemoterapian jälkeen eikä solujen lääkeresistenssin erikseen. Olemme myös löytäneet

TPX2

vahvistusta ja yli-ilmentyminen voidaan korreloi merkitsevästi

CCNE1

kopiomäärä tila mikä läsnäolo osuuskunnan mutational verkosto näiden geenien.

Tulokset

Focal monistamiseen 19q12 on yhteinen eri kasvaintyypeille

ensimmäinen vertasi minimaalinen alueen kromosomi voitto on 19q12 useille kasvaintyypeille. Saimme tietoja SNP-pohjaisia ​​korkean resoluution kopioluvun Tutkimuksiin 15 kasvaintyypeille [9], [13] sellaisen vertailu havaintomme [3] (kuvio 1A). Vähäinen kohdealueilla vahvistus määritteli synergisillä, analyysi työkalu, joka arvioi tilastollista merkitystä kopioluvun tapahtumia perustuu taajuus ja amplitudi [14]. Merkittävä monistuminen 19q12 oli läsnä kolmasosa syövän tyypit analysoitiin. Kasvaimen tyyppien 19q12 vahvistus, noin 25% yksittäisistä näytteistä osoitti kopio vahvistuksenkertojan, paitsi kohdun limakalvon kasvaimia, joissa on korkeampi taajuus havaittiin (~45%) [9]. Vähäinen amplikoni rajat havaittiin kohdistaa alueelle alle 2 Mb kooltaan, keskitetty suunnilleen 35,0 Mb kromosomissa 19. Molemmissa munasarjakasvain aineistoja analysoitiin [3], [13] minimaalinen kartoitettu alue vahvistuksen sisällytetty samat viisi geenit (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12, CCNE1 ja C19orf2

), joilla on samanlaiset päällekkäisiä alueita havaittiin kohdun limakalvon ja rintasyövän kasvaimia. Sen sijaan vähäinen alue kartoitettu ei-pienisoluista keuhkosyöpää kasvaimia sisällytetty vain

CCNE1

kun laaja alue kartoitettiin ruokatorven kasvainten (~9.5 Mb), joka ulottuu 110 selityksin geenejä. Kopioluvun muutos 19q12-lokuksen osoitti jonkinasteista kasvainspesifisyys, että vahvistusta ei nähty 10 muissa elimissä, joille merkittäviä tietoja oli saatavilla, kuten pienisoluinen keuhkosyöpä, hepatosellulaarinen, peräsuolen ja eturauhasen syöpä (tuloksia ei ole esitetty). Toteamme myös, että monistuminen 19q12 on todettu cDNA array-CGH analyysi mahalaukun kasvaimet [15], [16], mutta tämä kasvain tyyppi ei sisällytetä analyysimme rajoittui korkean resoluution SNP kopioluvun tiedot.

(A) Peak alueilla vahvistus välillä 30-46 Mb kromosomissa 19.

1non-pienisoluinen [8], [13], [40], [41], [42];

2ovarian [3],

3 [13];

4endometrial [9];

5breast [13], [43], [44]; ja

6esophageal kasvaimissa [42]. Esiintymistiheyden ja geenien läsnä huippu rajojen ilmoitettu. (B) Affymetrix SNP 6,0 kartoitus microarray kopiomäärä kromosomin 19 munasarjakasvain solulinjoissa ja (C) välillä 34-36 Mb varten OVCAR-3 ja SK-OV-3 solulinjoissa. Kopioi numero näkyy on keskiarvo liikkuu ikkunan 20 merkkiaineiden kartoitettu ihmisen maaliskuuta 2006 (hg18) genomin kokoonpano (lähde: Sanger Cancer Genome Project arkisto). (D) Geenien ilmentyminen määritettiin qPCR in OVCAR-3 solujen suhteessa SK-OV-3.

Tunnistaa solulinjoja, jotka edustivat primaarikasvainten toiminnallisia tutkimuksia analysoitiin korkean erotuskyvyn SNP kopio numero tiedot 22 munasarjasyövän solulinjoissa kromosomissa 19q12 (Sanger Cancer Genome Project Archive) ja tunnistettiin seitsemän solulinjoissa (OVCAR-3, OVCAR-4, Kuramochi, RMG-I, Caov-4, EFO-21, OVCAR-8) että oli päällekkäistä monistaminen 19q12 (kuvio 1 B ja kuviossa S1). Seitsemästä solulinjat, OVCAR-3 sisälsi polttoväli, korkean tason vahvistus parhaiten toisteta tietojen primääri munasarjojen kasvaimia (kuvio 1 C). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) osoittivat, että viisi geeniä alueella korkean tason vahvistus in OVCAR-3 (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12

,

CCNE1 ja C19orf2

), mutta ei reunustavien geenien (

UQCRFS1

ja

ZNF536

), oli yli-ilmentynyt suhteessa SK-OV-3-ohjaus solulinja, josta puuttuu 19q12 vahvistus ( Kuva 1 D). Viidestä geenit,

PLEKHF1

ja

CCNE1

osoitti korkein ilmaus. 19q12-amplikoni voidaan näin ollen kuvata alueella, joka kattaa 34,4-35,4 kromosomin 19 ja johon 5 selityksin geenejä, joista jokainen on yli-ilmentynyt OVCAR-3.

Solut linjat monistuksen 19q12 ovat erityisen herkkiä että

CCNE1

knockdown

Short häiritsevä RNA (siRNA) käytettiin pudotus ilmentymistä seitsemän geenien ja vieressä korkean tason 19q12 amplikonin OVCAR-3 ja SK-OV- 3 plus

GAPDH

ja ei-hiljentäminen (NS) valvontaa. Kaavio koejärjestelyä, jota käytetään yhdistetyssä siRNA pudotus strategian ja myöhemmin lääkehoito-protokolla on esitetty kuviossa 2A. Transkriptitasot kaikki suunnattu geenejä tehokkaasti ja erityisesti vähentää jopa 96 tunnin kuluttua siRNA transfektion, lukuun ottamatta

ZNF536

, joka reunustaa alueen monistamisen (kuvio 2B). Kyselemällä saadut Aiemmassa tutkimuksessa [17] löydettiin

ZNF536

ilmentyminen on alhainen tai poissa ensisijainen vakavien munasarjojen kasvaimia, jotka voivat selittämään havaitsemattomia vähentäminen geenien ilmentyminen (dataa ei esitetty). Geenin ilmentymistä seurattiin myös, kun läsnä on sisplatiinin, valmisteltaessa toiminnallisia kokeita.

PLEKHF1

,

CCNE1

,

C19orf2

ja

ZNF536

lievästi ajan säädellään sisplatiinihoitoon yhdessä tai molemmissa solulinjoissa kuitenkin siRNA knockdown oli vielä tehokkaita (kuvio 2B).

(A) Kokeellinen kaavamaisen yhdistettyjen siRNA transfektiota ja lääkehoitoa. (B) qPCR heatmap osoittaa log

2-geenin ilmentymisen suhde transfektoimattomiin OVCAR-3 (ylhäällä) ja SK-OV-3 (alhaalla) solusta jokaista siRNA (sarakkeet) at geenikohteet (rivit) kanssa tai ilman sisplatiinihoitoon 72 tuntia transfektion jälkeen. (C) Solujen elävyys normalisoida ei siRNA kontrollisoluihin transfektion jälkeen jokaisen siRNA. Tilastollinen merkitys (t-testi) laskettiin vertaamalla kuin äänenvaimennusjärjestelmän (NS) siRNA samassa solulinjassa käyttäen tietoja kolmesta itsenäisestä MTS määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena kohti kunnossa. Keskimääräiseksi absorbanssi 490 nm: ssä ja SEM piirretty (n = 3), ** p-arvo 0,01. (D) osuus apoptoottisten solujen arvioitiin TUNEL värjäys ei siRNA ohjaus soluja tai transfektion jälkeen NS tai

CCNE1

suunnattu siRNA. Esitetyt tulokset kolmesta itsenäisestä kokeesta kanssa Rinnakkaiskuoppien analysoidaan kohti kunnossa. Keskimääräinen prosenttiosuus apoptoottisten solujen ja SEM piirretty (n = 3). *** P-arvo 0,0001 (khiin neliö) lasketaan vertaamalla koko solumäärää välillä OVCAR-3 soluja käsiteltiin

CCNE1

siRNA kaikki muut olosuhteet. (E) CCNE1 proteiinin ilmentymistä Western blot vahvistaa siRNA-välitteinen

CCNE1

Knockdown kokeelliselle päätepisteen. (F) Solujen elävyys ylimääräisiä solulinjoissa transfektion jälkeen

CCNE1

tai ei-äänenvaimennusjärjestelmien siRNA normalisoitu kullekin solulinjaa ilman siRNA lisätty. Tilastollinen merkitsevyys (t-testi) laskettiin vertaamalla NS siRNA samassa solulinjassa. Keskimääräiseksi absorbanssi MTS-määritys ja SEM piirretty (n = 3); * P-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01.

Näistä geeneistä testattu vain

CCNE1

knockdown osoittivat merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden OVCAR- 3 (noin 60% NS kontrollisolujen; p 0,01; kuvio 2C).

CCNE1

Knockdown ollut vaikutusta SK-OV-3-solut. Koska sen rooli G1 /S siirtymä, odotimme, että ehtyminen sykliini E1-proteiini aiheuttaa G1 pidätys (katso alla) ja johtavat lisääntyneeseen apoptoottisten solujen. TUNEL värjäys käsittelemättömien solujen oli verrattavissa (SK-OV-3, 0,1%, OVCAR-3, 0,2%) (kuvio 2D), mutta

CCNE1

pudotus aiheutti merkittävän apoptoosin lisääntyminen vain OVCAR-3 (p 0,0001). Väheneminen proteiini runsaasti myös validoitu molemmissa solulinjoissa jälkeen geeni taintumisen (kuvio 2E).

ottaa tunnistettu erityinen herkkyys OVCAR-3

CCNE1

Knockdown, pyrimme vahvistamaan tämän löydöksen itsenäinen solulinjojen ja määrittää, onko vaikutus oli amplikonin riippuvainen. Siksi laajensi analyysiin sisällyttää ylimääräinen kolme solulinjoissa vahvistus on 19q12 (OVCAR-4, Kuramochi ja OVCAR-8) ja edelleen unamplified linja (IGROV-1). Tilastollisesti merkitsevä korrelaatio kopioluku ja geenin ilmentyminen

CCNE1

havaittiin kaikissa linjat. Kuitenkin OVCAR-8 ei näytä lisääntynyt

CCNE1

ilmaisun suhteessa geenin monistamisen (kuvio S2 A).

CCNE1

ilmaisun ja sykliini E1-proteiinia tasot tehokkaasti vähennetään kunkin linjan suhteessa perustason ilmentyminen siRNA-välitteisen taintumisen (kuva S2 B ja C). Kuten havaitaan OVCAR-3,

CCNE1

Knockdown nimenomaan vähensi elinkelpoisuus rivejä kanssa 19q12 vahvistus, ja vain marginaalisesti unamplified rivi IGROV-1 (kuvio 2F). Täten munasarjojen kasvainsolujen vahvistus on 19q12 ovat erityisen herkkiä ehtyminen sykliini E1, verrattuna unamplified linjat.

CCNE1

Knockdown vähentää akuutti herkkyyttä sisplatiinin

Koska yhdistys of 19q12 monistuksessa ensisijainen hoito epäonnistui [3] ja huono lopputulos [4], [5] yritimme tutkia vaikutusta geenin knockdown huumeiden herkkyys. Vaikka analyysi oli tunnistanut tietyn riippuvuus

CCNE1

amplifioidussa linjat, ensin arvioida uudelleen kaikki seitsemän amplikoni liittyvien geenien vaikutusta kemoterapiaa vaste OVCAR-3 ja SK-OV-3 käyttäen 72- tunti sytotoksisuusanalyysin. Soluja käsiteltiin hieman yli ennalta määrätyn IC50 (katso Menetelmät S1) ja elinkelpoisuus mitattiin. Knockdown geenien sisällä amplikoni ei merkittävästi vaikuta sisplatiinin herkkyyttä joko solulinjan. Yllättäen, sisplatiinin aiheuttama sytotoksisuuden in OVCAR-3 käsitellyissä soluissa oli heikennetty

CCNE1

inhibitio (kuvio 3A). Suoritimme annos-vaste-analyysi luonnehtia edelleen vaikutusta sisplatiinin hoidon jälkeen

CCNE1

pudotus. Tilastollisesti merkitsevä muutos annos-vaste-käyrä havaittiin OVCAR-3 (p 0,05; kuvio 3B), mutta ei SK-OV-3 edelleen osoittaa vastus OVCAR-3 sisplatiinia, kun

CCNE1

inhibition. Tämän mukaisesti havainnon, sisplatiinin ollut ero vaikutus solujen elinkelpoisuutta

CCNE1

Knockdown soluja verrattuna siRNA tarkastukset kahdessa kolmesta ylimääräistä 19q12 monistetaan linjat (Kuramochi ja OVCAR-4) (kuvio 3C). Sen sijaan geeni pudotus parantanut sisplatiinin vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen molemmissa solulinjoissa, joilla on alhainen perustason

CCNE1

ilmaisu (OVCAR-8 ja 19q12 unamplified ohjausjohdon IGROV-1).

( A) solujen elinkelpoisuus transfektion jälkeen yksittäisten siRNA: t ja sisplatiinihoitoon normalisoida sisplatiini hoidettuun kontrolliryhmään soluja ilman siRNA. Sisplatiini annos 3 uM tai 6 uM käytettiin OVCAR-3 ja SK-OV-3-soluissa. Keskimääräiseksi absorbanssi (490 nm) kolmesta itsenäisestä MTS määritykset (kolmen kuopan per ehto) ja SEM piirretty (n = 3). (B) Cisplatin annosvaste transfektion jälkeen

CCNE1

tai ei-hiljentäminen siRNA in OVCAR-3 ja SK-OV-3 solulinjoissa. Nuoli osoittaa lääkehoidon käytettiin annosta aloitusnäyttö; p-arvo osoittaa merkitys ero asennettu käyriä. Keskimääräiseksi MTS-määritys Absorbanssi soluihin ilman sisplatiinihoitoon, SEM ja neliparametrisella asennettu Hill kaltevuus piirretty (n = 3 kutakin lääkepitoisuus). (D) Solujen elinkelpoisuus transfektion jälkeen

CCNE1

tai NS siRNA ja sisplatiinihoitoon normalisoidaan sisplatiinilla saaneilla ei siRNA ohjaus solusta jokaista solulinjaa. Tilastollinen merkitsevyys laskettiin vertaamalla NS siRNA, sisplatiini-käsitellyissä soluissa samalla solulinjassa. Keskimääräiseksi absorbanssi MTS-määritys ja SEM piirretty (n = 3). Katso taulukko S4 sisplatiinihoitoon annoksilla.

tutkimiseksi sisplatiinin kestävä fenotyyppi havaittiin OVCAR-3 solujen

CCNE1

Knockdown, käytimme virtaussytometria analysoida solusyklin jakelu seuraavien sisplatiinia hoitoon. Sisplatiini hoito OVCAR-3 johti pitkään S-vaiheen (kuvio 4A), kun taas SK-OV-3-solut pidätettiin pääasiassa G2 vaiheen solusyklin (kuvio 4B). Yhdenmukainen vaatimus sykliini E1 G1 /S siirtyminen [18],

CCNE1

siRNA Knockdown aiheuttama G1 pidätys OVCAR-3, selvimmin läsnäollessa sisplatiinin (kuvio 4A). Sitä vastoin, solusyklin jakautumisen SK-OV-3 oli muuttumattomana inhibitio

CCNE1

ilmentymisen kanssa tai ilman sisplatiinin (kuvio 4B). Nämä havainnot olivat yhdenmukaisia ​​

CCNE1

monistettiin Kuramochi ja OVCAR-4-solut (kuva S3). Osittainen G1 pidätys havaittiin myös 19q12 unamplified IGROV-1 soluissa, sen jälkeen

CCNE1

Knockdown kuitenkin vain vastauksena sisplatiinihoitoon. Kuten havaitaan elinkelpoisuuden määrityksessä

CCNE1

täydennetty mutta alhainen ilmentävien OVCAR-8 solua käyttäytyivät samalla hallita linjat. Siksi pääteltiin, että riippuvuus OVCAR-3, Kuramochi ja OVCAR-4 korkeudesta

CCNE1

ilmaus johti solusyklin pysähtymiseen jälkeen geeni knockdovvn, mukaan lukien läsnä ollessa sisplatiinin, todennäköisesti osuus näennäisen sisplatiini vastus havaittu lyhytaikainen luelinkykymäärityksillä.

(A) OVCAR-3-solujen ja (B) SK-OV-3 solukierron profiilin (vasemmalla) ja osuus solujen G1, S tai G2 vaihe ( oikea) PI värjättyjen solujen analysoitiin virtaussytometrialla 72 tuntia transfektion jälkeen, jossa

CCNE1

tai NS siRNA kanssa tai ilman sisplatiinihoitoon (3 uM tai 6 uM OVCAR-3 ja SK-OV-3-soluissa).

Ymmärtääksemme pidemmän aikavälin vaikutukset

CCNE1

ehtyminen solun eloonjäämiseen jälkeen sisplatiinihoitoon me testattiin kyky muodostaa klooneja linjat ja ilman vahvistusta ja 19q12-lokuksen (katso kaavamainen kuva 5A ).

CCNE1

pudotus vähensi täysin klonogeenisten kapasiteettia OVCAR-3, mutta ei SK-OV-3 puuttuessa lääkkeen (kuvio 5B ja 5C). Toisin kuin lisääntyneen resistenssin sisplatiinia lyhyen aikavälin -sytotoksisuusmäärityksiä

CCNE1

vaimennus vähentää klonogeenisten selviytymisen OVCAR-3 soluja sisplatiinin jälkeen hoidon (kuvio 5B). Emme tutustua

in vivo

vaikutukset

CCNE1

Knockdown munasarjojen kasvain linjoihin 19q12 vahvistus, koska emme pystyneet tuottamaan elinkelpoisia linjat vakaat lentiviruksen integraation lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ohjataan

CCNE1

(tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kokeellinen ajan kurssi klonogeenisten -eloonjäämiskoe jälkeen siRNA transfektion ja sisplatiinihoitoon. Edustavia kristalliviolettia värjätty (B) SK-OV-3 ja (C) OVCAR-3 pesäkettä (ylhäällä) ja keskimääräinen osuus erillisiä muodostuneiden pesäkkeiden (alhaalla) verrattuna ohjata soluja ilman siRNA tai 1 tunti sisplatiinihoitoon (3 uM tai 6 uM for OVCAR-3 ja SK-OV-3-soluissa). Virhe palkit osoittavat SEM (n = 3), ** p-arvo 0,001.

CCNE1

vahvistus ennustaa huono tulos primaarikasvainten

CCNE1

kopioluku mitattiin 43 primääri munasarjojen kasvaimia potilailta myöhäisvaiheen, vakavasta invasiivisia sairauksia. Lisäksi olemme mukana tiedot 52 kasvaimista aikaisemmista genomista analyysiä platinaa resistenssin munasarjasyöpään [3] ja saatiin vastaavat geenien ilmentyminen tietoja kaikista näytteistä [17]. Kaikki potilaat saivat ensisijainen leikkaus seurasi platinapohjaisen kemoterapian. Kliiniset tiedot käytetään yhdistämään

CCNE1

aseman säilyminen oli yli kaksi vuotta ylimääräistä kertynyt potilaiden seurantatiedot (kesäkuusta 2010) meidän aikaisemmista tutkimuksista.

Potilaat stratifioitiin perustuvat

CCNE1

kopiomäärä asema arvioidaan qPCR (katso materiaalit ja menetelmät). Mitään eroa välillä todettiin kliinisiä ominaisuuksia kunkin ryhmän lisäksi iästä, nuoremmilla potilailla yliedustettuina

CCNE1

unamplified ryhmä (taulukko 1 ja kuva 6A).

CCNE1

geeniekspressiota olivat vahvasti kopio numero (kuvio 6B) ja molemmat korreloivat ilman taudin etenemistä (PFS) (kuvio 6C F). Merkittävin korrelaatio havaittiin oli aste

CCNE1

voitto ja PFS (kuvio 6C), siten, että kaikissa tapauksissa, joissa korkean tason vahvistus osoitti etenevää tautia kuluessa noin kahdentoista kuukauden diagnoosista (keskiarvo PFS 10,7 kuukautta Taulukko 1 ).

(A) Potilaan ikäjakauma ositettu

CCNE1

vahvistusta tila. Kruskal-Wallis p-arvo ilmoitetaan, palkit osoittavat keskiarvoa ja SEM. (B) välinen korrelaatio

CCNE1

kopioluvun mukaan qPCR ja geeniekspressiota signaali microarray. (C) Kaplan-Meier-analyysi

CCNE1

unamplified (n = 68), saatu (n = 21) ja monistettiin (n = 6), munasarjasyöpä potilaiden ja (D)

CCNE1

alhainen (n = 31), keskipitkän (n = 28) ja korkea (n = 36) ilmentävät näytteitä ilman taudin etenemistä ja (E F) yleiseen eloonjäämiseen. Log-rank testi p-arvojen ilmoitetaan. Jaottelu

CCNE1

kopioluvun tai ilmentymistilanne kuvattu Materiaalit ja menetelmät.

monistaminen 19q12 korreloi vahvistus 20q11

Kartoitettuaan

CCNE1

kriittiseksi kuljettaja sisällä 19q12 amplikonin munasarjasyövän, päättelimme, että muut mutaatiot muualla perimässä saattaa vuorovaikutuksessa sykliini E1 tai liittyä lääkeresistenssin. Esimerkiksi mutaatiot, jotka tehostavat tai mahdollistavat kasvainten sietää

CCNE1

yli-ilmentyminen voi samanaikaisesti esiintyä 19q12 voitto. Saimme molemmat SNP-pohjainen kopiomäärä ja geenien ilmentyminen tietoja 157 korkealaatuista serous invasiivisia kasvaimia The Cancer Genome Atlas Project (TCGA) analysoitavaksi. Ensinnäkin tutkimme geenin ilmentymistä geenejä, joiden proteiini tuotteita tarvitaan käsittelyyn sykliini E1 aktiiviseen pienimolekyylipainoisen muotoja (

ELA2

ja

CAPN2

) [19], [20] tai sen hajoaminen (

FBXW7

) [18]. Ei kuitenkaan ole tilastollisesti merkittävä positiivinen korrelaatio ehdokas geenin ilmentymisen ja

CCNE1

tila havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Sitten korreloi 19q12 voitto kaikkien muiden voitot ja häviöt 0,1 Mb segmenttejä genomista (katso Methods S1). Kolme parasta korreloivat alueilla kopioluvun muutos olivat 20q11, 1p36 ja 6q27 (kuvio 7A). Merkittävin liittyvä voitto oli paikallistettu 2,5 Mt kromosomi 20 (kuvio 7B) ja on validoitu erillisessä puolueeton analyysi genominlaajuisten korrelaatiot voitto ja tappio ovarioiden [21].

(A) Circos käyrä, joka esittää alueiden kopioluvun muutos korreloi merkittävästi

CCNE1

vahvistusta (p-arvo 1 x 10

-5) (B) merkitys kopioluvun korrelaatio

CCNE1

vahvistus koko kromosomin 20 merkitys kynnyksen määrittämiseen käytetään korrelaatiohuipun rajat katkoviivalla. (C)

TPX2

ilmaisu korrelaatio lokuksen kopiomäärä ja

CCNE1

lauseke (lähde: TCGA). (D) korrelaatio

CCNE1

ja

TPX2

geeniekspression itsenäinen tietokokonaisuutta (Tothill et al., 2009).

Jotta kapea geeniä ehdokkaat kolme aluetta todennäköisimmin vuorovaikutuksessa

CCNE1

, seuraavan kerran korreloi geenien kullakin alueella, jossa

CCNE1

ilmentymistä (taulukko 2). Expression of

TPX2

oli eniten merkitsevästi yhteydessä

CCNE1

ilmaisua, ja se myös korreloi oman vahvistus tila (kuvio 7C). Suhde

CCNE1

ja

TPX2

geeniekspressio edelleen validoitu toinen itsenäinen datajoukon (kuvio 7D). Vahva yhdistys välillä

TPX2

ja

CCNE1

monistuminen ja ilmentyminen kiehtova, koska TPX2 on sentromeerinen proteiini tarvitaan sukkularihmaston toiminto solunjakautumisen aikana [22].

20q11 vahvistus tekee soluista resistenttejä TPX2 pudotus

sen testaamiseksi, oliko toiminnallinen riippuvuus

TPX2

solulinjoissa kanssa monistuminen 20q11-lokuksen ja onko se vaikuttaa

CCNE1

, arvioimme

TPX2

asema linjat käytetään meidän knockdown kokeita.

TPX2

monistettiin (kuvio 8A) ja yli-ilmentynyt (kuvio 8B) kaikissa kolmessa

CCNE1

vahvistetaan ja yli-ilmentäviä solulinjoja (OVCAR-3, OVCAR-4 ja Kuramochi) verrattiin valvontaan linja, SK-OV-3. Lisäksi olemme edelleen tunnistettu OAW-28 olevan korkean tason 20q11 vahvistusta (kuvio 8A, dataa Sanger Cancer Genome Project Archive) ja korkein geenin ilmentymisen poikki testattujen solulinjojen (kuvio 8B).

(A) Affymetrix SNP 6,0 kartoitus microarray kopiomäärä kromosomi 20 munasarjojen kasvainsolulinjoissa n sijainti

TPX2

. (B) välinen korrelaatio

TPX2

kopioluvun ja geeniekspressiota qPCR solulinjoissa. (C) Solujen elinkelpoisuus kuvattu normalisoitu MTS absorbanssi (490 nm) kolmesta itsenäisestä määrityksissä käsiteltyjä soluja, joilla ei ole siRNA siRNA kahden pudotus kokeissa. Keskimääräiseksi absorbanssi MTS-määritys ja SEM piirretty (n = 3). (E) TPX2 proteiinin ilmentymistä Western blot vahvistaa siRNA-välitteisen knockdovvn kokeelliselle päätepiste solulinjojen ja CCNE1 in OAW-28-soluissa.

Toisin läheinen suhde

CCNE1

vahvistusta ja solujen herkkyys geeni knockdown, käänteinen suhde havaittiin

TPX2

kopioiden määrä ja vaikutukset

TPX2

siRNA (kuvio 8C). Esimerkiksi SK-OV-3-solut, joilla on alhainen geenin ilmentymistä (kuvio 8B) ja minimaalinen havaittavissa TPX2 proteiinia (kuvio 8D), olivat erittäin herkkiä geeni Knockdown, kun taas OAW-28-solut olivat pääasiassa resistenttejä. RT-PCR (kuva S4) ja western blot (kuvio 8D) analyysit osoittivat tehokasta knockdovvn

TPX2

kuitenkin proteiini oli vielä havaittavissa joissakin solulinjoissa, jotka oli alun perin korkea TPX2 proteiinia. Havaitsimme myös, että knockdovvn

CCNE1

johti vähentynyt

TPX2

geeniekspression 19q12 monistetaan linjat (kuva S4 A) viittaavia että

TPX2

ilmentyminen vaikuttaa alavirtaan sykliini E1 .

Koska korrelaatio

CCNE1

ja

TPX2

vahvistus, me tutki myös samanaikainen knockdown molempien geenien heikentäisi edelleen kannattavuuden solulinjoissa, jotka sisältävät sekä monistuksiin (kuvio 8C ). Kun olemme sallitaan kilpailukykyisen yhdistelmän vaikutuksen siRNA: iden (katso menetelmät) ilman selvää yhteisvaikutuksia havaittu samanaikaisesti knockdovvn

TPX2

ja

CCNE1

. Knockdovvn

CCNE1

oli vain vähäinen vaikutus OAW-28 solujen elävyyden huolimatta tehokas proteiinin väheneminen kaksinkertainen taintumisen kokeissa (kuvio 8D). Tämä havainto on johdonmukainen Alustavat tulokset, kuten OAW-28 solut eivät ole 19q12 vahvistusta (katso kuva S1 OAW-28 kopioluvun tässä lokuksessa).

Keskustelu

Suoritimme ensimmäinen systemaattinen siRNA knockdovvn kaikkien geenien sisällä minimaalisesti määritellyn 19q12 amplikonin munasarjasyövän osoittaa, että

CCNE1

on avain onkogeeninen tavoite. Koska tunnetut roolit sykliini E1 syövässä, kuten de-säätely solusyklin ja edistää perimän epävakaisuuden, se oli todennäköinen kuljettaja 19q12-lokuksen, mutta muiden geenien ei ollut suljettu pois. Esimerkiksi

C19orf2

, joka on välittömässä läheisyydessä

CCNE1

, on hiljattain lisätty huomautusta koodaamaan URI, epäsovinnainen prefoldin proteiinia. Tutkimukset

C. elegans

URI homologi ehdottaa osallistumista chromatin remodeling, estää ja /tai korjaus endogeenisen genotoksinen DNA-vaurioita ja ylläpito genomin eheys [23]. Viime aikoina URI on määritelty keskeiseksi estäjä proteiinifosfataasi 1γ (PP1γ) ja on mukana sääntelyn mTOR /S6K1 selviytymisreittiin perustuu ravinteiden ja kasvutekijän saatavuus [24]. Huolimatta näistä kiehtova biologiset yhdistysten, löysimme mitään todisteita URI kuin kuljettaja 19q12-lokuksen.

Reduction solujen elinkelpoisuuden jälkeen

CCNE1

Knockdown oli nimenomaan solulinjoissa 19q12 vahvistus, rajoitettu tai ei lainkaan vaikutusta ei-monistettu linjat, mikä viittaa ”riippuvuus” [25] ja

CCNE1

purkamista. Meidän havainnot vahvistaa tuore raportti osoittaa vahvistusta erityisiä herkkyys

CCNE1

vaimennus OVCAR-3 ja menettää tavallisesti-29-soluissa [26]. Unamplified linjat näyttivät ohittaa siRNA välittämä G1 /S tarkastuspiste pysähtymiseen ja apoptoosiin, mikä saattaa johtua

CCNE1

riippumattomia mekanismeja solukierron de-sääntelyn ja erillisiä onkogeenisten prosesseja. Mielenkiintoista, lisääntynyt ilmentyminen CCNE1 on äskettäin esitetty serous tubal epiteelinsisäisen karsinooma (STIC), ehdotettu esiaste korkealaatuisesta serous karsinooma [27]. Tämä havainto vahvistaa merkitystä

CCNE1

de-sääntelyn munasarjasyövän ja ehdottaa se on varhainen vaatimus kasvaimen kehittyminen.

19q12 vahvistus liittyy voimakkaasti mekaanisesti epäonnistuminen munasarjakasvainten [3 ] ja on näin ollen sekä mahdollinen ennustetekijöitä merkki ja terapeuttinen kohde. Todettuaan

CCNE1

koska kuljettaja 19q12 vahvistus yritimme ymmärtää, miten se vaikuttaa ensisijaisen hoidon epäonnistumisen. Lyhytaikaisissa -sytotoksisuusmäärityksiä yli-ilmentyminen sykliini E1 lisää herkkyyttä sisplatiiniin [12].