Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme aiemmin raportoitu, että tehostettu excitability dorsaalijuurigangliat (DRG) neuronien mukana kehittämässä luusyöpä kipua, joka vakavasti heikentää elämänlaatua syöpäpotilaiden. Nav1.8, joka on tetrodotoksiiniin kestävä (TTX-R) natrium-kanava, vaikuttaa useimmissa natriumvirtaa taustalla aktiopotentiaalin upstroke ja osuus useimmat nykyiset myöhemmin piikkejä junassa. Me spekuloida, että Nav1.8 natrium kanava on mahdollinen ehdokas vastaa tehostetun excitability DRG neuronien rotilla luun syöpä kipua. Täällä käyttäen elektrofysiologia, Western blot ja käyttäytyminen määritykset, me dokumentoitu, että nykyinen tiheys TTX-R natriumkanavien erityisesti Nav1.8 kanava, kasvoi merkittävästi DRG neuronien rottien syöpään aiheuttama luukipu. Tämä kasvu voi johtua lisääntyneen ekspression Nav1.8 kalvolla DRG neuronien. Accordantly, saarto Nav1.8 natriumkanavien sen selektiivinen esto A-803467 merkittävästi lievittää syövän aiheuttama mekaaninen allodynia ja terminen hyperalgesia rotilla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että toiminnallinen säätelyä Nav1.8 kanavien kalvo DRG neuronien edistää syövän kehittymistä aiheuttaman luukipua.

Citation: Liu XD, Yang JJ, Fang D, Cai J Wan Y, Xing GG (2014) toiminnallinen lisääntymisen merkkejä Nav1.8 natriumkanavien kalvolle on dorsaalijuurigangliat neuronit edistää syövän kehittymistä aiheutetun Luukipu. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10,1371 /journal.pone.0114623

Editor: Joseph Charles Glorioso, University of Pittsburgh School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 elokuu 2014; Hyväksytty: 11 marraskuu 2014; Julkaistu 11 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (81371237, 31171063,81072951), Beijing Natural Science Foundation (7112079), erityinen pohjan kansalaisten hyvinvoinnin ammatin tieteellinen tutkimus ohjelman terveysministeriön kansantasavallan Kiinan (+201.302.013-01) ja ”973” ohjelma ministeriön Science and Technology of China (2013CB531905). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bone syövän johtuva kipu ensisijainen kasvaimia tai kasvaimia, jotka etäispesäkkeitä luut on yksi vakavimmista ja hankala syöpien kipua, mikä vähentää elämänlaatua potilailla [1]. Mekanismit kehitystä luun syöpäkivun edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

Viime aikoina olemme ja muut ovat havainneet, että terminen hyperalgesia ja mekaaninen yliherkkyys hiiren malleissa luun syöpäkivun liittyy parannettu excitability ensisijainen nociceptive DRG neuronien [ ,,,0],2], [3]. Vastaukset nociceptors haitallisille vaikutuksille koodataan aktiopotentiaalien joiden synty ja eteneminen ovat riippuvaisia ​​jännite ohjattujen natriumkanavien. Näin ollen poikkeava ekspressio kuviot näistä kanavista ja periytyvät natrium- channelopathies on yhdistetty neuropaattista ja tulehduksellista kipua [4]. Aikuisten DRG neuronit voidaan ilmaista sekä tetrodotoksiiniin herkkiä (TTX-S) ja tetrodotoksiiniin kestävä (TTX-R) natrium-kanavia. Jälkimmäisten joukossa, TTX-R natrium- kanavan Nav1.8 on ilmentyy spesifisesti aistihermoilla [5], [6]. Näin ollen, Nav1.8 on yksi houkuttelevia kohteita uusien farmaseuttisten aineiden kivun hoitoon.

Nav1.8 tuottaa hitaasti inaktivoiva, nopean pohjustavia TTX-R natrium tasalla depolaroiduissa aktivointi ja inaktivoituminen änniteriippuvuutta [6], [7]. Nav1.8 vaikuttaa useimmat natriumvirtaa taustalla aktiopotentiaalin upstroke hermosoluissa, joka ilmaisee kanavan [8], [9]. Biofyysisten ominaisuuksien Nav1.8, sen keskeinen rooli toistuvat impulssit, ja sen läsnäolo vapaa hermopäätteitä, jossa kipu signalointi aloitetaan, viittaavat siihen, että Nav1.8 voivat vaikuttaa huomattavasti nociceptors ärtyvyyttä, mikä osaltaan kipua. Rooli Nav1.8 vuonna neuropaattista ja tulehduksellista kipua on hyvin tarkistaa Dib-Hajj et al. [4]. Kuitenkin, onko Nav1.8 edistää syövän kehittymistä aiheuttama luukipu on suurelta osin tuntematon. Äskettäin Qiu ja kollegat [10] on havaittu lisääntyneen ilmentymisen Nav1.8 sisällä DRG rottamallissa Walker 256 kasvainsolun aiheuttama luusyöpä kipua, mikä viittaa mahdollisen osallistumisen Nav1.8 kehittämiseen syövän aiheuttaman luun kipu. Tässä tutkimuksessa käytetään elektrofysiologia, Western blot ja farmakologinen käyttäytyminen menetelmiä, voimme esittää näyttöä siitä, että toiminnallinen säätelyä Nav1.8 kanavien kalvo DRG neuronien edistää syövän kehittymistä aiheuttaman luukipua.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Aikuisille Sprague-Dawley painavat 180-220 g alussa kokeet tarjoamia Department of Experimental Animal Sciences, Peking University Health Science Center. Rottia erillisissä häkeissä vapaasti ruokaa ja vettä. Huoneen lämpötila pidettiin 24 ± 1 ° C: ssa luonnonvaloa /pimeä sykli. Kaikki koe-eläin menettelyjä tehtiin suuntaviivojen mukaisesti International Association for Study of Pain [11] ja hyväksyttiin eläinten hoidon ja käytön komitea Pekingin yliopisto.

Siirrostus kasvainsolujen

MRMT-1 rotan rintarauhasen karsinooma-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi RPMI 1640 (Hyclone, USA) ja 10% naudan sikiön seerumia. Solut vapautettiin muovista lyhyellä altistuksella 0,25% (paino /tilavuus) trypsiiniä (Gibco, USA), ja sitten valmisteltu injektiota varten seuraavalla tavalla: solut ensin talteen sentrifugoimalla 10 ml elatusainetta 3 minuuttia 1000 rpm: llä . Saatu pelletti suspendoitiin sitten uudelleen 1 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), ja solut laskettiin käyttämällä hemosytometriä. Seuraavaksi solut laimennettiin saavuttaa lopullinen konsentraatio injektiota varten ja pidettiin jäissä, kunnes injektoidaan eläimiin. Rotan luun syöpäkivun perustettiin sääriluunsisäinen injektio syngeenisten MRMT-1-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun nukutettiin kloraalihydraatilla (0,3 g /kg, i.p.), rotan vasen sääriluu oli huolellisesti alttiina, ja 23 gaugen neulaa työnnettiin luuydinkanava luun. Se poistettiin sitten ja korvattiin pitkä ohut tylppä neula on kiinnitetty 10 ui Hamilton ruisku, joka sisältää väliaine ruiskutetaan. Tilavuus 4 ui MRMT-1 rotan rintarauhasen karsinooma-soluja (4 x 10

4) tai vehikkeliä (PBS) injektoitiin sääriluun luuontelosta. Injektion jälkeen sivusto suljettiin luun vaha, ja haava suljettiin lopullisesti. Yksikään eläimistä osoitti merkkejä liikehäiriö implantoinnin jälkeen tuumorisolujen.

Koko-solu-patch clamp tallennus

neuronit eristettiin L4 ja L5 DRG täysikasvuisten rottien käyttämällä menetelmiä, kuten on kuvattu meidän aikaisemmat tutkimukset [3], [13]. Lyhyesti, juuri leikellään ganglioissa jauhettiin ja pestiin kylmällä, happipitoista Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma), ja alistettiin sitten kollagenaasia (3 mg /ml, tyypin IA, Sigma) hoitoa 45 minuuttia, minkä jälkeen trypsiini (2 mg /ml, tyyppi II-S, Sigma) 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Entsymaattinen reaktio lopetettiin pesemällä soluja DMEM, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, ja jäljellä olevat hermosolmujen hellävaraisesti trituroitiin käyttämällä palo kiillotettu lasi Pasteur-pipetillä ja läpi 40 um: n solusiivilän. Sitten suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 800 rpm 3 minuuttia, ja solupelletti suspendoitiin uudelleen tuoreeseen DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Dissosioidut solut pantiin poly-D-lysiini (0,1 mg /ml, Sigma) hoidettujen lasipeitinlevyille sisältyvät 4-hyvin steriilit kudosviljelylevyihin ja pidettiin 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 2 3 tuntia ennen tallennusta.

Kokosolun patch clamp tallenteita akuutisti erottaa DRG neuronien suoritettiin käyttäen EPC-10 vahvistin ja Patchmaster ohjelmisto (HEKA, Freiburg, Saksa). Patch-pipetit vedettiin borosilikaattilasista kapillaareja kärjellä vastus 5-8 MQ täytettynä sisäinen ratkaisu, joka sisältää seuraavat (mM): 135 CSF: n, 10 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA ja 2 Na

2ATP. PH säädettiin arvoon 7,3 käyttäen CsOH. Ulkoisen sisälsi seuraavat (mM): 30 NaCI, 20 TEA-Cl, 90 koliini-Cl, 3 KCI, 1 CaCI

2, 1 MgCI

2, 10 HEPES, 10 glukoosia ja 0,1 CDCI

2. PH säädettiin arvoon 7,3 käyttäen Tris-emästä. Kalvo virrat mitattiin pipetillä ja kalvo kapasitanssi peruutus suodatettuna 2 kHz ja digitoidaan 10 kHz.

Under jännite-clamp tallennustila, solut kiinnitettiin -70 mV, ja sarja vastus kompensoivat 70 % -90%. Kalvo kapasitanssi hankittiin vahvistimen Patchmaster ohjelmisto määrittämiseksi solujen koko ja laskemalla virrantiheys. Kaikki tallenteet tehtiin pk-halkaisija (20-35 um) DRG neuronit, joiden tiedetään ilmentävän sekä TTX-S ja TTX-R natriumvirtojen [14], [15]. TTX-R virtaukset herätti tilalta potentiaali -120 mV Testipulssit vaihtelevat -80-45 mV askelin 5 mV taajuudella 0,2 Hz läsnäollessa TTX (300 nM) estää kaikki TTX -S-kanavia. Nav1.8 välittämää natriumvirtaa aikaansaatiin jännitesäätöisellä clamp käyttämä protokolla Rush ja Waxman [16] ja Berta et al. [17], kun läsnä oli 300 nM TTX. Testipulsseja vaihtelevat -80-40 mV askelin 5 mV taajuudella 0,2 Hz, edelsi 500 ms pre-pulssin vaihe -40 mV, inaktivoimiseksi TTX-R Nav1.9 välittämää nykyinen. Maksimaalinen huippuvirta eri jännitteillä käytettiin virrantiheyttä analyysiä. Normalisoitu aktivointi käyrät (I /I

0) sovitettiin käyttämällä seuraavaa Boltzmannin jakauma yhtälöä: I /I

0 = 1-1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, jossa I

0 on maksimaalinen huippuvirran eri testijännitteiden, V

m on testi potentiaali, V

1/2 on kalvon potentiaalia puolet maksimaalisesta I, ja k on kulmakerroin. Jännite riippuva vakaan tilan inaktivaation arvioitiin mittaamalla piikin virran amplitudi aikaansaama 100 ms testipulssia -10 mV jälkeen 500 ms ennen pulssi potentiaalisille annosalueella -80-10 mV 20-s inter-pulssin aikana. Normalisoitu inaktivaatio käyrät (I /I

0) sovitettiin käyttämällä seuraavaa Boltzmannin jakauma yhtälöä: I /I

0 = 1 /{1 + exp [(V

1/2-V

m) /k]}, jossa I

0 on huippuarvo natrium virta testattu pulssi mitattuna kielteisimmin esivakautus- pulssi potentiaali, V

m on vakauttamisen pulssi potentiaali, V

1/2 on kalvon potentiaali puoli-maksimaalinen I, ja k on kulmakerroin. Tietojen analysointi ja sovitus suoritettiin käyttäen Alkuperäinen ohjelmistoa 8,5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).

Western blot

Rotat syvä anestesia 10% kloraalihydraattia (0,3 g /kg, ip) ja sitten L4 ja L5 DRG poistettiin ja homogenisoitiin välittömästi protokollan mukaan kuvattu edellisessä raportissa [18] täydellistä proteiiniuutto ja määritys. Sillä sytosoliin tai kalvon proteiinin uutto ja erotus, DRG-kudokset leikeltiin ja hajotettiin homogenisoimalla Nucl-Cyto-Mem kittiä (Applygen, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden ja määritettiin sitten käyttäen menetelmiä, on kuvattu julkaisussa Black et ai. [19]. Kymmenen mikrogrammaa kokonais-proteiinin sekoitettiin 4 x latauspuskuria ja sitten SDS-PAGE: lla. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja Tween (TBST, 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl ja 0,05% Tween-20) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, PVDF-kalvoja inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet 4 ° C: ssa yön yli: kanin anti-rotta-Nav1.8-vasta-ainetta (1:1000, Alomone Labs), hiiren anti-β-aktiini (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), tai hiiren anti-rotta-transferriini-reseptori- (TfR) vasta-aine (1:2000, Invitrogen). Blotit pestiin TBST: ssä ja sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani /hiiren IgG sekundääristä vasta-ainetta (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Pierce) ja sen jälkeen autoradiografialla käyttämällä Hyperfilm MP (Santa Cruz Biotechnology). Blotit skannattiin tykki skanneri (Cannon, Inc., Japani), ja bändi tiheydet tunnistettiin Määrä yksi ohjelmisto (Bio-Rad, USA). Tiedot viisi rottaa käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Istuttaminen intratekaalisen katetrin ja injektio huumeiden

farmakologinen saarto Nav1.8 kanavia, katetrit istutettiin samaan aikaan kanssa MRMT- 1 kasvainsolujen tai PBS: ää inokulaation. Under kloraalihydraatilla (0,3 g /kg, i.p.) anestesia, istuttaminen intratekaalisen kanyylin suoritettiin kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa [20]. Lyhyesti, PE-10 polyeteeni katetri istutettiin välillä L5 ja L6 nikaman päästä puutavaraa laajentuminen selkäytimen. Ulompi osa katetrin tukittiin ja kiinnitetty ihon sulkemista haavan. Kaikki kirurgiset toimenpiteet suoritettiin steriileissä olosuhteissa. Rotat osoittaa neurologisia puutoksia jälkeen katetrin implantoinnin suljettiin.

tutkia vaikutuksia farmakologinen saarto Nav1.8 kanssa selektiivinen A-803467 (TOCRIS, UK) luusyöpä rotilla, A-803467 (50, 100 ja 150 nmol) tai sen vehikkeliä (1% DMSO), intratekaalisesti toimitettiin MRMT-1 rottien päivänä 14 rokotuksen jälkeen tuumorisolujen kun kivun yliherkkyyden näkyviin. Kontrollina, suuri annos A-803467 (150 nmol) tai sen vehikkeliä (1% DMSO), myös intratekaalisesti hallinnoi PBS siirrostettiin sham eläimistä 14. päivänä sen jälkeen, kun PBS siirrostuksen. Drug tai ajoneuvo oli intratekaalisesti injektoidaan läpi implantoidun katetrin 10 ui liuosta jälkeen 10 ui normaalia suolaliuosta (NS) huuhteluun. Kukin injektio kesti vähintään 5 min. Injektion jälkeen neula jää in situ 2 minuuttia ennen peruutettu. Sekä kipu käyttäytymistä ja motorisen funktion eläinten arvioitiin 15, 30, 60, 90 ja 120 minuutin kuluttua lääkkeen sovellus.

Arvio mekaaninen allodynia

Mekaaninen allodynia, kuten käyttäytymisen merkkinä luun syöpäkivun, arvioitiin mittaamalla 50% käpälän poisvetämisen kynnys (PWT) kuten kuvattu aiemmissa raporteissa [3], [21]. 50% PWT vastauksena Von Freyn filamentit (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) määritettiin ylös ja alas menetelmä [22]. Rotat sijoitettiin metalliverkolla lattia peitetään käänteinen kirkas muovi häkin (18 x 8 x 8 cm) ja annettiin 20 minuutin ajaksi tottumista. Kahdeksan von Frey säikeiden suunnilleen yhtä logaritminen inkrementaalinen (0,224) taivutusvoimia valittiin (0,41, 0,70, 1,20, 2,00, 3,63, 5,50, 8,50, ja 15.10 g). Jokainen tutkimus alkoi von Frey voima 2,00 g toimitettu kohtisuoraan jalkapohjan pintaan vasemman takakäpälän noin 2-3 sekuntia. Äkillinen peruuttaminen jalka stimulaation aikana tai välittömästi sen jälkeen karvan poistamisen jälkeen kirjattiin myönteisen vastauksen. Aina oli positiivinen tai negatiivinen vaste, seuraava heikompia tai vahvempia hehkulamppuja on sovellettu, vastaavasti. Tämä menettely tehtiin vasta kuusi ärsykkeiden jälkeen ensimmäinen muutos vastauksena oli havaittu. 50% PWT laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: 50% PWT = 10

(X

f

+ kδ), jossa X

f on arvo lopullisen von Frey hehkulanka käytetään (in matkayksiköitä), k on arvo mitataan rakenteessa positiivisten /negatiivisten vasteiden, ja δ = 0,224, mikä on keskimääräinen aikaväli (log-yksikköä) välillä von Freyn filamentit [23]. Jos eläin reagoi alimman von Frey filamentti, jonka arvo on 0,25 g on määritetty. Jos eläin ei vastannut korkein von Frey hehkulamppuja, arvo kirjattiin 15,0 g. Testaus istuntoja tehtiin 0, 15, 30, 60, 90 ja 120 minuutin kuluttua lääkeaineen injektiosta.

arviointi terminen hyperalgesia

Terminen hyperalgesia ja takakäpälän testattiin, kuten on kuvattu edellisessä raportissa [20]. Rottien annettiin sopeutua vähintään 30 minuutin kuluessa akryyli kotelot selkeään lasilevy pidettiin 30 ° C: ssa. Säteilylämmittimillä lämmönlähde, kohdistettiin jalkapohjan pinnalle takakäpälän. Mittaukset käpälän poisvetämisen latenssi (PWL) on ottanut ajastin, joka käynnistettiin aktivoimalla lämmönlähteen ja pysäytettiin, kun peruuttaminen käpälän havaittiin valoilmaisimella. Maksimaalinen cut-off aika 30 s käytettiin estämään tarpeettomia kudosvaurioita. Kolme mittaukset pwl otettiin kunkin takakäpälän ja laskettiin keskiarvot seurauksena kunkin testin aikana. Takakäpälälle testattiin vuorotellen yli 5 minuutin välein peräkkäisten testien.

Arvio motorisen funktion

Kalteva-levy testi suoritettiin arviointia varten motorisen funktion rotat saivat A-803467 (150 nmol). Rotta asetettiin poikittain pituusakseliin nähden kaltevan levyn. Alkuperäinen kulma kaltevalle levylle oli 50 °. Kulma sitten säätää 5 asteen välein. Suurin kulma levy, johon rotta säilytti kehon asento 5 s putoamatta määritettiin menetelmän mukaisesti raportoitu aiemmin [24].

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin kanssa GraphPad Prism 5.0 paketti (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Dunnettin monivertailutesti tai kaksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin post-hoc testiä käytettiin monilukuisten vertailujen. Erot P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

lisäys TTX-R natriumvirtaa DRG neuronien rottien luusyöpä kipu

Tutkitaan onko TTX- R natriumin kanavia edistää syövän aiheuttama luukipu, ensin mitataan TTX-R natriumvirtojen tallennettu akuutisti eristetty DRG neuronien rottamallissa luusyöpä kipu, lisäämällä TTX (300 nM) haudeliuokseen lohkoon kaikki TTX herkkien kanavat [25]. Jännite-protokollaa käytimme on esitetty kuviossa. 1A. Olemme havainneet, että tiheys TTX-R natriumvirtaa kasvoi asteittain, kun siirrostuksen kasvainsolujen aika-riippuvaisella tavalla. Päivänä 7 ymppäyksen jälkeen, ei havaittu merkittävää eroa tiheydestä TTX-R natriumvirtaa neuronien välillä lla käsitellyistä rotista MRMT-1 kasvainsoluja (96,67 ± 8,2 pA /pF, n = 14) ja näiden välillä rotilla, joita hoidettiin PBS: llä (97,08 ± 5,8 pA /pF, n = 15) (P 0,05, kaksisuuntainen ANOVA, kuviot. 1C, D ja G), joka on yhdenmukainen aiempien käyttäytymiseen havainnot osoittavat ei ollut mekaanisia tai lämmitys- tai kipua yliherkkyys tuohon aika [3]. Kuitenkin 14. päivänä istutuksen jälkeen, tiheys TTX-R natriumvirtaa kasvoi merkittävästi MRMT-1-käsitellyillä rotilla (181,34 ± 17,2 pA /pF, n = 19) verrattuna PBS: llä käsiteltyjen rottien (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA, kuviot. 1E-G). Edustaja jälkiä TTX-R natrium- virta naiivi, PBS-käsitellyn ja MRMT-1-käsitellyillä rotilla, tallennettu DRG-neuronien 7 ja 14 päivää siirrostuksen jälkeen kasvainsolujen tai PBS: on esitetty kuvioissa. 1B F.

(A): Jännite protokolla tallentamiseen käytettävää TTX-R natriumvirtaa 300 nM TTX kylvyssä ratkaisu. (B-F): edustaja jälkiä TTX-R natriumvirtaa aiemmin hoitamattomilla (B), PBS-käsiteltyjen (C ja E) ja MRMT-1-käsiteltyjen (D ja F) rotilla, kirjataan DRG neuroneja 7 (C ja D) ja 14 (E ja F) päivää inokulaation jälkeen kasvainsolujen tai PBS: ää. (G): Tilastollinen analyysi virrantiheyden huippuarvo. Huomaa, että tiheys TTX-R natriumvirtaa merkittävästi lisääntynyt DRG neuronien luusyöpä rotilla.

***

P

0,001, verrattuna PBS-ryhmään, kaksisuuntainen ANOVA, n = 19 (MRMT-1) ja 15 (PBS).

lisäys Nav1.8 natriumia virta DRG neuronien rottien luusyöpä kipu

eristämiseksi Nav1.8 natriumvirtaa total TTX-R natriumvirtaa, käytimme toinen jännite protokolla 500 ms pre-pulssi -40 mV inaktivoimiseksi Nav1.9 kanava kuvattua edellisessä raportissa [17] (Fig. 2G). Tulokset osoittivat, että tiheys Nav1.8-välitteisen natriumvirtaa 14 päivää inokulaation jälkeen kasvoi merkittävästi MRMT-1-käsitellyillä rotilla (136,11 ± 10,4 pA /pF, n = 17) verrattuna PBS: llä käsiteltyihin rottiin (74,09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA, kuviot. 2D F). Samanlainen tiheys TTX-R natriumin virtaa, Nav1.8-välitteinen virrantiheyden pysyi muuttumattomana päivänä 7 sen jälkeen, kun siirrostuksen tuumorisolujen (P 0,05, vs. PBS, kaksisuuntainen ANOVA, n = 11 MRMT- 1 ja 12 PBS, kuviot. 2B, C ja F). Sen tutkimiseksi, onko luontaiset ominaisuudet Nav1.8 natrium- kanavan muutettiin inokulaation jälkeen kasvainsolujen, tutkimme sekä aktivaatio ja inaktivaatio käyrät Nav1.8-välitteisen natrium- virtojen naiivi, PBS-käsitellyn ja MRMT-1-käsitellyillä rotilla . Kuten kuvioissa. 2H ja minä, mitään merkittävää muutosta ei havaittu myöskään aktivointi (Fig. 2 H) tai inaktivaatioon (Fig. 2 I) käyrät kolmesta ryhmästä, mikä osoittaa, että luontaiset ominaisuudet Nav1.8 natriumkanava- pysyi ennallaan siirrostuksen jälkeen kasvaimen solut. Edustaja jälkiä Nav1.8-välitteisen natrium- virta naiivi, PBS: llä ja MRMT-1-käsitellyillä rotilla, tallennettu DRG-neuronien 7 ja 14 päivää siirrostuksen jälkeen kasvainsolujen tai PBS: on esitetty kuvioissa. 2A E.

(A-E): edustaja jälkiä Nav1.8 välittämää natriumvirtaa aiemmin hoitamattomilla (A), PBS: llä (B ja D) ja MRMT-1-käsiteltyjen (C ja E) rotat, kirjataan DRG-neuroneja 7 (B ja C) ja 14 (D ja E) päivää inokulaation jälkeen kasvainsolujen tai PBS: ää. (F): Tilastollinen analyysi virrantiheyden huippuarvo. Huomaa, että tiheys Nav1.8-välitteisen natrium virtaa merkittävästi lisääntynyt DRG neuronien luusyöpä rotilla.

***

P

0,001, verrattuna PBS-ryhmään, kaksisuuntainen ANOVA, n = 17 (MRMT-1) ja 16 (PBS). (G): Jännite protokolla tallentamiseen käytettävää Nav1.8 välittämä natriumvirtojen 300 nM TTX kylvyssä ratkaisu. 500 ms ennen pulssin -40 mV käytettiin inaktivoimaan Nav1.9 natrium- kanavia. (H ja I): aktivaatio ja inaktivaatio käyrät Nav1.8-välitteisen natrium- virta naiivi, PBS-käsitellyn ja MRMT-1-käsitellyillä rotilla on 14 päivää inokulaation jälkeen kasvainsolujen tai PBS: ää. Huomaa, että mitään merkittävää muutosta ei havaita joko aktivointi (H) tai inaktivaation (I) käyrät kolmesta ryhmästä. Aktivointi käyrät sovitettiin käyttäen samaa protokollaa käytetään tallennukseen Nav1.8 natriumvirtaa. Huomaa, että käyrät Naiivi ja PBS ryhmiä limittäin lähes kokonaan. Inaktivoinnin käyrät sovitettiin käyttäen protokollaa kuvattuja menetelmiä.

lisäys kalvo ilmentymistä Nav1.8 proteiinin DRG rottien luusyöpä kipu

Lisäksi tutkimme ekspressio Nav1.8 proteiinin DRG rottien syövän aiheuttama luun kipua, erityisesti, kanavat solukalvon, joka edustaa funktionaalisia kanavia. Käyttäen Western blot -määritys, olemme havainneet, että ilmentyminen Nav1.8 proteiinin kokonaismäärän ipsilateral L4 ja L5 DRG pysyi päivästä 7 päivään 14 MRMT-1-käsitellyillä rotilla verrattuna PBS-käsitellyillä rotilla (P 0,05, kaksi- tapa ANOVA, n = 4 /ryhmä, Fig. 3A). Tämä oli odottamatonta, koska elektrofysiologia kokeissa paljasti lisääntynyttä virrantiheydellä Nav1.8 in MRMT-1-käsitellyillä rotilla (ks. 2). Spekuloida, että tällainen lisäys Nav1.8 natriumvirtaa johtuu luultavasti lisääntyneen ekspression Nav1.8 solukalvon koska luontaiset ominaisuudet Nav1.8 natrium- kanavan pysyi muuttumattomana inokulaation jälkeen tuumorisolujen (katso kuviot. 2H ja I). Selventää tätä hypoteesia, olemme edelleen havainneet kalvon ilmaus Nav1.8 käyttäen suurinopeuksista sentrifugointia menetelmä eristää kalvofraktio DRG-soluja, kuten on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [19]. Kuten odotettua, 14 päivää inokulaation jälkeen kasvainsolujen, bändi tiheys Nav1.8 proteiinia ilmentyy solukalvossa kasvoi merkittävästi MRMT-1-käsitellyillä rotilla (1,45 ± 0,06, n = 6) verrattuna PBS: llä käsiteltyihin rottiin ( 0,87 ± 0,07, n = 6) (P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA, Fig. 3B). Samaan aikaan kaistan tiheys Nav1.8 proteiinin sijaitsee sytosolissa väheni merkittävästi MRMT-1-käsitellyillä rotilla (0,57 ± 0,04, n = 3) verrattuna PBS: llä käsiteltyihin rottiin (1,09 ± 0,02, n = 3) (P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA, Fig. 3C).

(A): Yhteensä Nav1.8 proteiinia. Ylä: edustaja Western blot nauhat; Alempi: tilastollinen analyysi Nav1.8 koko proteiinin ilmentymisen. Mitään merkittävää eroa ei havaittu ilmentymistä Nav1.8 kokonaisproteiinia kolmesta ryhmästä.

P

0,05, kaksisuuntainen ANOVA, n = 4 /ryhmä. (B): Nav1.8 membraaniproteiini. Ylä: edustaja Western blot bändejä. Transferriinireseptori (TfR) käytetään sisäisenä kontrollina. Alempi: tilastollinen analyysi Nav1.8 kalvon proteiinin ilmentymisen. Huomaa, että ilmaus Nav1.8 solukalvon on lisääntynyt merkittävästi DRG neuronien MRMT-1-käsitellyillä rotilla verrattuna PBS-käsitellyillä rotilla.

***

P

0,001, kaksisuuntainen ANOVA, n = 6 /ryhmä. (C): Nav1.8 proteiini sytosoliin. Huomaa, että ilmaus Nav1.8 sytosolissa on merkittävästi vähentynyt DRG neuronien MRMT-1-käsitellyillä rotilla verrattuna PBS-käsitellyillä rotilla.

***

P

0,001, kaksisuuntainen ANOVA, n = 3 /ryhmä.

A-803467 lievittää mekaanisen allodynia ja terminen hyperalgesia luusyöpä rotat

Lopuksi tutkimme, A-803467, selektiivinen salpaaja Nav1.8 [26] voisi lievittää syövän aiheuttaman luun kipua rotilla. Testasimme PWT ja pwl päivänä 14 rokotuksen jälkeen tuumorisolujen tai PBS perusviivasta. Sitten A-803467 tai ajoneuvon DMSO: ta, intratekaalisesti toimitettiin MRMT-1 siirrostettiin syöpäkivun rotilla sekä PBS inokuloitiin huijausta rotilla, ja sekä PWT ja PWL mitattiin 15, 30, 60, 90 ja 120 min sen jälkeen, kun lääkkeen hakemuksen. Annostus ja injektio juuri A-803467 mukaan oli aiemman raportin osoittaa, että intratekaalinen anto A-803467 (50-150 nmol) vähentää sekä viitannut ja spontaani päästöjä laajan dynaamisen alueen (WDR) neuronien selkäytimen takasarvessa [27 ]. Kuten on esitetty kuviossa. 4, intratekaalinen anto A-803467 (sekä 100 ja 150 nmol) voisi näkyvästi palauttaa luusyöpä aiheuttama lasku molemmissa PWT (P 0,05-0,001, vs. ajoneuvo /syöpää rotilla ryhmä, kaksisuuntainen ANOVA, n = 7-8 /ryhmä, Fig. 4A) ja pwl (P +0,05-+0,001, vs. ajoneuvo /syöpää rotilla ryhmä, kaksisuuntainen ANOVA, n = 6-9 /ryhmä, Fig. 4B) syövän rotilla. Sitä vastoin jopa suuri annos A-803467 (150 nmol) ei ollut merkittävää vaikutusta pwl ja PWT lla PBS ympätty sham rottia (P 0,05, vs. ajoneuvo /huijausta rottien ryhmä, kaksisuuntainen ANOVA, n = 6 /ryhmä, kuviot. 4A ja B). Jotta poistetaan kaikki mahdolliset liikehäiriö aiheuttama A-803467, tutkimme myös vaikutusta A-803467 (at maksimaalinen annoksella 150 nmol) on liikuntaelimistön toiminto rottien avulla kaltevan levyn testi. Kuten odotus, mitään merkittävää liikehäiriö havaittiin milloin tahansa pisteen jälkeen suonensisäisten huumeiden (p 0,05, yksisuuntainen ANOVA, n = 7 /ryhmä, Fig. 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio Nav1.8 A-803467 voi pelastaa kasvaimen aiheuttaman mekaanisen allodynian ja termaalisen hyperalgesian luun syövän rotilla.

(A, B): Effects of A-803467 (50 , 100 ja 150 nmol) mekaanisiin (A) ja terminen (B) kipu käyttäytymisen rotilla arvioitiin päivänä 14 jälkeen rokottaminen MRMT-1 kasvainsolujen tai PBS. Huomaa, että A-803467 huomattavasti palauttaa kasvainsolujen aiheuttama väheneminen PWT ja pwl syövässä mallissa rotilla mutta ei ole merkittävää vaikutusta pwl ja PWT PBS ympätty huijausta rottia.

* /#

P

0,05,

** /##

P

0,01,

***

P

0,05, yksisuuntainen ANOVA, n = 7 /ryhmä.

Keskustelu

toiminnallinen säätelyä Nav1.8 natriumin kanavia DRG neuronien rotat luusyöpä kipu

yhdenmukainen aiempien havaintojen että ilmaus Nav1.8 mRNA ja proteiini lisääntynyt lannerangan 4-5 DRG eläinmallissa luusyöpä kivun [10], meidän nykyinen tutkimus antaa lisää suoria todisteita, jotka osoittavat toiminnallista ylössäätely jänniteherkkiin natriumkanava- alatyypin Nav1.8 kalvolle DRG neuronien rotan syöpäkipuihin malli, joka on osoittautunut vaaditaan syövän kehittymisen aiheuttama luukipua.

biofysikaalinen ja farmakologiset tutkimukset ovat totesi neljän reuna-erityisiä natriumkanavien lukien TTX-S kanavien NaV1.3 ja NaV1.7 sekä TTX-R-kanavat NaV1.8 ja NaV1.9 ensisijassa ilmentyy ensisijaisesti aistien DRG neuronit ja pelata tärkeä rooli patofysiologiassa eri kivun oireyhtymät [18], [28], [29]. Niistä Nav1.8 natrium- kanava on osoitettu olevan tarpeen monen tyyppisiä krooninen tulehduksellinen ja neuropaattista kipua [26], [30], [31]. Kuitenkin rooli Nav1.8 natrium- kanavan patogeneesissä luusyöpä kipu on vielä tuntematon. Vaikka Qiu et ai. [10] ovat havainneet lisääntynyttä ilmentymistä Nav1.8 sisällä DRG rottamallissa luusyöpä kipua, he eivät varmasti vetää johtopäätös siitä, onko lisääntynyt Nav1.8 natrium kanava edistää syövän aiheuttama luukipu. Toisessa tutkimuksessa, Miao ja työtovereiden [32] ovat raportoineet merkittävän downregulation Nav1.8 ilmaisun DRG rotan syöpäkivun malli. Kuitenkin käyttämällä antisense oligodeoksinukleotidejä (ODN) vastaan ​​Nav1.8, he huomasivat, että knock-down of Nav1.8 ilmaisun DRG hermosoluissa saattaa lievittää perustettu syöpäkipusi käyttäytymistä kasvain rotilla, mikä merkitsee mahdollista roolia Nav1.8 kehittämisessä ja ylläpito luusyöpä kipua. Epäjohdonmukaisesti, tuore tutkimus ehdollisen knock-out hiirillä ovat osoittaneet, että kumpikaan Nav1.7 tai Nav1.8 vaaditaan syövän aiheuttama luukipu [33]. Meidän nykyisessä tutkimuksessa esittelemme electrophysiological ja biokemialliset todisteet siitä, että tiheys Nav1.8 välittämä natriumvirtaa merkittävästi lisääntynyt DRG neuronien rottien kanssa luuta syöpäkivun ja että tämä lisäys johtuu todennäköisesti lisääntyneen ilmentymisen toiminnallisen NAV1 0,8 natrium- kanavien solukalvon sijaan muutokset luontaisten ominaisuuksien tai kokonaan proteiinin ilmentymisen kanavia, koska se yhdessä parannetun tiheys sekä TTX-R- ja Nav1.8-välitteisen natrium- virtoja, ilmentymistä membraaniproteiini