Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human bocavirus on toinen riippumaton ihmisen parvoviruksen kanssa oletetaan patogeenisen potentiaalia. Muita parvoviruksiin tiedetään jatkuvat ja jopa integroida isännän genomiin, lopulta edistää monivaiheinen syövän kehittymiseen. Ihmisen bocavirus myös itsepintaisesti tuntematon prosenttiosuuden kliinisesti oireettomilla potilailla lisäksi niille, joilla ensisijainen infektio. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli analysoida rooli Human bocavirus keuhkoissa ja peräsuolen syöpiä. Näin ollen, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut, arkistoidut kasvaimen näytteet seulottiin ihmisen bocavirus DNA: sta PCR, Southern-blottaus, ja sekvensointi. Positiiviset kudokset alistetaan edelleen fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi spesifisesti tunnistaa ihmisen bocavirus DNA: n tartunnan saaneiden solujen. Kaikkiaan, 11 60 (18,3%), keuhkojen ja 9 44 (20,5%) ja peräsuolen kasvaimia positiivisen ihmisen bocavirus DNA PCR: llä ja vahvistettiin sekvensoimalla ja fluoresenssi in situ -hybridisaatiota varten. Näin ollen, ihmisen bocavirus DNA on läsnä infektoituneiden solujen tumissa, joko yhden tai useita kopioita, ja näyttävät muodostavan concatemers. Esiintyminen Näiden ihmisen bocavirus DNA rakenteet tukee olemassaolon oletetun σ- tai muun liikkuvan hiusneula replikoinnin mekanismia. Lisäksi fluoresenssi in situ -hybridisaatio kuvioita innoittamana hypoteesia, että ihmisen bocavirus DNA joko jatkuu niin cccDNA tai on integroitu isännän genomiin. Tämä havainto viittaa siihen, että tämä virus voi välillisesti edistää joidenkin peräsuolen ja keuhkosyövässä, samoin kuin muut DNA-virukset, kuten ihmisen hepatiitti B-virus, tai se voi olla aktiivinen rooli syövän vuorovaikutuksessa isännän genomiin.

Citation: Schildgen V, Malecki M, Tillmann RL, Brockmann M, Schildgen O (2013) The Human bocavirus liittyy Jotkut Lung ja kolorektaalisyövissä ja jatkuu kiinteitä kasvaimia. PLoS ONE 8 (6): e68020. doi: 10,1371 /journal.pone.0068020

Editor: Amit Kapoor, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2013; Hyväksytty: 24. toukokuuta 2013 Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Schildgen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rajoittamattoman tutkimus avustusta Else Kröner-Fresenius Stiftung, Saksa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska sen löydön vuonna 2005 Tobias Allander [1], on yhä enemmän näyttöä siitä, että laajalle levinnyt ihmisen bocavirus (HBoV) on merkittävä rooli hengitystieinfektiot (alatyyppi 1) ja ruoansulatuskanavan infektioiden (alatyyppejä 2- 4) [2-6]. Lisäksi, HBoV on neljänneksi yleisin virus havaitaan hengitysteiden infektiot [7], ja sen oletetaan olevan toisen parvovirus, joka kykenee infektoimaan ihmisillä voi aiheuttaa kliinisen taudin. Kuitenkin sen rooli ruoansulatuskanavan infektiot on nyt epävarma romaaniin perustuva tutkimus Britanniasta [8].

Aikaisemmin ryhmämme tunnistettu DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät ”head-to-tail” genomin fragmentteja yhdistetty vastikään tunnistettu linkkeri venyttää. Julkistuksen jälkeen havainto, että ”head-to-tail” sekvenssit esiintyä HBoV alatyypin 1 varmistettiin Kapoor ja kollegat, jotka yksilöivät ne rakenteet episomaalisena kovalenttisesti suljettu pyöreä (ccc) DNA potilailla tartunta HBoV alatyypin 3 [9]. Kapoor ja työtovereiden sekä ryhmät Kiinasta [10,11] ja Yhdysvalloissa [12], todettiin, että nämä cccDNA rakenteet voivat olla virus- genomien jatkuvat näissä soluissa. Tämä johtopäätös tukee oletusta, että HBoV voi säilyä tartunnan isäntä ja voi esiintyä oireeton mutta tuottotilassa, mikä puolestaan ​​voisi selittää suhteellisen suuri osuus oireettomilla potilailla, jotka irtoa virusta.

Toinen esimerkki DNA-virus, joka jatkuu joka kovalenttisesti suljettu rengasmainen rakenne ja aiheuttaa kudosvaurioita on ihmisen hepatiitti B-virus (HBV). Kaikissa kroonisen HBV-infektioita vastaan, cccDNA on läsnä maksasoluissa, ja tämä cccDNA pysyvyys aiheuttaa kroonista tulehdusta, joka ei vaikuta potilaan tilan pitkän aikaa, mutta hitaasti johtaa maksan fibroosi, kirroosi, ja lopulta syövän merkittävä osuus kroonisen HBV-infektiot [13-17].

Koska muut parvoviruksiin pystyvät integroitumaan isännän genomiin [18], ja ensimmäinen tunnettu patogeeninen ihmisen parvovirus, parvovirus B19, liittyy useita syöpiä, kuten lymfoomat [ ,,,0],19], kiveskasvaimia [20], papillaarinen ja anaplastinen kilpirauhasen karsinoomat [21,22], ja krooniset tulehdussairaudet, kuten Hashimoton [23], kardiomyopatia ja sydänlihastulehdus [24], joka on samanlainen mekanismi HBoV liittyvän synnyssä näyttää mahdolliselta.

tauti aikana HBoV lähimmät sukulaiset, eli naudan parvovirus (BPV) ja minuutti-viruksen koiran (MVC, CNMV, joka tunnetaan myös CPV-1), tulokset alkuperäisestä infektio hengitysteiden, jonka jälkeen infektio suolistossa ja myöhempi irtoaminen kautta hengitysteiden /suoliston reitillä [25]. Hypoteesit että HBoV voivat säilyä tahansa kohde-elimessä ja että ne vaikuttavat kudokset kokevat pitkäaikaista vahinkoa olisi siis testata.

Niinpä käsiteltiin kysymystä siitä HBoV, analogisesti hepatiitti B-virus, voi havaitaan kasvaimia. Ottaen huomioon, että patogeneesin HBoV infektioiden alkaa hengitysteissä ja päättyy ruoansulatuskanavassa, analysoimme ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvaimet ja peräsuolen kasvaimia. Molemmat ovat syöpiä, joissa kasvainten kehittymiseen ymmärretään huonosti ja jossa viruksen osuus ei ole suljettu pois toistaiseksi [26-29].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki menettelyt suoritettiin noudattaen Helsingin julistuksen ja mukaan äänestää eettisen komitean Private yliopiston Witten-Herdecke (äänestää. 73/2012). Tämä äänestys oli nimenomaan hyväksytty Nykyisessä tutkimuksessa. Johtuen taannehtivuus ja plasebokontrolloitu potilaan näytteitä käytetään tutkimuksessa, eettinen komitea totesi, ettei kirjallinen lupa vaadittiin. Tutkimus kohortti koostui yksinomaan aikuisilla potilailla.

Potilasnäytteet

Kuusikymmentä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) keuhko tuumorisektioiden ja 44 Kolorektaalituumorien valittiin satunnaisesti arkistoituja näytteitä meidän rutiinia kliinisen laboratorion. Keski-ikä potilailla oli 69,21 vuotta, mediaani 71 vuotta. Tutkimus tehtiin takautuvasti. Ei muita kliinisiä tietoja, kuten lääkitys, nikotiiniriippuvuus, tai syövän hoidossa, käytettiin koska tieto ei olisi ollut vaikutusta tutkimuksen tulokseen. Kuten valvonta, kasvaimettomina kudosta alueen kunkin kasvaimen analysoitiin HBoV aina käytettävissä. Lisäksi 10 kasvain-free, terve keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen kudosten näytteet analysoitiin ihmisen bocavirus DNA. Lisäkontrolleina, näytteet 10 ihmisen papilloomaviruksen (HPV) positiivinen kohdunkaulan kasvaimia ja 10 HPV negatiivisia kohdunkaulan kasvaimet sekä 10 rintasyövistä seulottiin HBoV DNA. Kaikki kliiniset näytteet kerättiin vuosina 2011 ja 2012.

PCR ja reaaliaikainen PCR analyysit

DNA FFPE kudosnäytteistä eristettiin käyttäen Maxwellin 16 FFPE kudoksen Kit (Promega, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. PCR ja reaaliaikainen PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30,31].

Sequencing

Näytteet, että positiivisen reaaliaikaisella PCR ihmisen bocavirus tehtiin tavanomaisella PCR: llä käyttäen alukkeita HBoV-LC-Ku-1 ja HBoV-LC-Ku-2 [30,31]. PCR-monistettu DNA ladattiin 1,5% agaroosigeelillä TAE-puskurissa, ja se oli geeli uutettiin ennen sekvensointia. Geeli uutto suoritettiin käyttäen Qiagen Gel-puhdistuskittiä (Qiagen, Hilden, Saksa) tiukasti seuraavat pakkausseloste. Sekvensointia varten, puhdistettua PCR-tuotteet esisekoitetaan joko HBoV-LC-Ku-1 pohjamaali tai HBoV-LC-Ku-2 pohja- ja lähetetään Eurofinsille MWG (München, Saksa) kapillaarisen Sangerin sekvensointia. FASTA Saadut sekvenssit alistettiin sekvenssianalyysit ja linjaus Vector NTI ohjelmiston 12,0 (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Sekvensointi suoritettiin kaikille kasvain, joka positiivisiksi HBoV PCR (n = 20).

FISH Analyysit

FISH analyysit tehtiin oleellisesti kuten on kuvattu muiden yleisesti testattu biomarkkerit, kuten HER2neu ja EML4-ALK, kuten aiemmin on julkaistu [32], kanssa, sillä muutoksella, että HBoV- ja GAPDH-koettimia käytetään, ne kontrollina. Koettimet on suunniteltu hybridisoitumaan lähellä kaksi terminaalista alueiden HBoV genomiin tai sekä 5′-pään ja 3′-pään ohjaus geenin (GAPDH).

testausmenetelmä oli samanlainen kuin break-toisistaan ​​FISH lähestymistapa havaitsemiseen EML4-alk. Kun kaksi koettimet sitoutuvat lähellä toisiaan, punaisen ja vihreän signaalit ovat tarpeeksi lähellä näkyvät yhtenä keltaisena signaalia. Tämä tilanne voi syntyä, jos HBoV genomit esiintyvät kovalenttisesti suljettu rengasmainen DNA, kuten ovat kuvanneet Kapoor ja työtoverit [9]. Sen sijaan, erillistä signaalia erottaa toisistaan ​​ainakin kaksi signaalia pituudet osoittavat, että koettimet hybridisoidaan eri paikoissa, kuten lineaarinen muodossa bocavirus genomin.

koettimet on lueteltu taulukossa 1. FISH suoritettiin seuraavasti : FFPE tuumorikudoksia, ympäröivän kasvainta kudoksiin, ja kontrollisilkkipaperia leikattiin 3 um paksuiksi viipaleiksi ja kiinnitetty dioja. Kontrolleina ihmisen HepG2-soluja viljeltiin kammion dioja kuten aikaisemmin on kuvattu [33], ja transfektoitu ihmisen bocavirus plasmidit p5TRHBoV [34] ja PTA-RSV pCR II-TOPO: plasmidi, joka sisältää osittaisen RSV N-geenin sekvenssi) käyttäen Lipofectamine (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa).

Target

fluorokromi-

Emission

Sequence

T

M

muutos

GAPDH StartRhodamine GreengreenTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATG (40) 75 ° C5′-RGR , 3′-RGRGAPDH StopRhodamine RedredCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGG (40) 74,6 ° C5′-RRE, 3′-RREBoca Head SRhodamine GreengreenTCAGACTGCATCCGGTCTCCGGCGAGTGAACATCTCTGGG (40) 75 ° C5′-RGR, 3′-RGRBoca Tail SRhodamine RedredGTTCCTCTCCAATGGACAAGWGGAAAGAAAAGGGTGACTG (40) 72,5 ° C5 ’ -RRE, 3’-RRETable 1. FISH koettimia käytetään havaitsemiseen HBoV ja GAPDH geenien FFPE dioja peräsuolen ja keuhkokasvaimet.

Kaikki koettimet on kytketty fluorokromeihin niiden 3′- ja 5′-päät parantaa fluoresenssisignaalien. CSV Lataa CSV

Kalvot käsiteltiin mukaisesti ZytoLight SPEC ALK /EML4 TriCheck

TM koetin protokolla (ZytoVision, Bremerhaven, Saksa) noudattaen valmistajan suosituksia. Koettimilla pitoisuuksissa neljätoista jokaisen. Mikroskooppinen analyysit ja dokumentointi suoritettiin Zeiss Axioplan mikroskoopin avulla AxioVision 4.8 ohjelmisto (Zeiss, Jena, Saksa). Kaikki HBoV kasvain näytteet altistettiin FISH analyysejä (n = 20).

Tulokset

Yhteensä 11 60 (18,3%) keuhkojen ja 9 44 (20,5%) Kolorektaalituumorien positiivisen HBoV DNA tavanomaisilla päätepisteen PCR seuraavalla geelielektroforeesilla (tuloksia ei ole esitetty) ja qPCR (taulukko 2). Loppupiste ja qPCR tulokset olivat yhtä mieltä, eli näytteet, jotka testattiin positiiviseksi päätepiste PCR olivat myös positiivisia reaaliaikaisella PCR ja päinvastoin, kun taas näytteet, jotka olivat negatiivisia yhdellä menetelmällä pysyivät negatiivisina toisen määrityksen. Lisäksi HBoV DNA ei havaittu mitään kontrolliryhmän näytteiden (10 rinta- kasvaimia, 10 HPV-positiiviset kohdunkaulan kasvaimet, ja 10 HPV-negatiivinen kohdunkaulan kasvaimet). Sekvensointi PCR-tuotteiden ja myöhemmän linjauksia vahvisti, että HBoV DNA monistettiin kasvainnäytteet (kuva 1a). Kuitenkin, ei ole korrelaatiota HBoV kopioiden määrä ja kasvaimen vaiheessa.

Potilaan nro

seksi

Kasvaimen alkuperää

HBoV päätepiste PCR

HBoV päätepiste PCR kasvaimen ympäristö

HBoV FISH

HBoV kopiota /ug kokonais-DNA

Tasaus-nro. (kuvio 1)

CR1femaleappendixpositivenegativepositive120656CR2Malecaecumpositivenegativepositive284915CR3femalecaecumpositivenegativepositive885failed sequencingCR4Malecolonpositivenegativepositive125CR5Malecolonpositivenegativepositive14182CR6femalecolonpositivenegativepositive70failed sequencingCR7femalerectumpositivenegativepositive1710failed sequencingCR8Malerectumpositivenegativepositive65failed sequencingCR9femalerectumpositivenegativepositive1failed sequencingL1femalelungpositivenegativepositive9480413L2femalelungpositivenegativepositive156314L3Malelungpositivenegativepositive37L4Malelungpositivenegativepositive119594L5femalelungpositivenegativepositive33L6Malelungpositivenegativepositive3361L7femalelungpositivenegativepositive17285712L8femalelungpositivenegativepositive619012L9femalelungpositivenegativepositive25400011L10Malelungpositivenegativepositive163008L11femalelungpositivenegativepositive110379Table 2. Potilaat, kasvaintyyppeihin ja qPCR tuloksia kasvainkudoksista.

CR = peräsuolen; L = Lung CSV Lataa CSV

Kuten viitesekvenssit seuraavat GenBank käytettiin: HBoV-1 = FJ858259 (Bonn-1 ) a. linjassa PCR-tuote saatuja sekvenssejä kasvain kudosnäytteitä. yhteensä 15 näytettä oli tarpeeksi läsnä olevan DNA: PCR-monistuksen jälkeen suoraan sekvensointiin. sekvenssit hiekkapuhallettu ja tasataan viittaus kanta Bonn-1. on selvää, että kaikki sekvenssit olivat erittäin konservoitunut ja täysin sovitettu viittaus sekvenssiin. kolme sekvenssit oli lisäksi ei-HBoV ylävirtaan linjassa alueiden (esitetty kuviossa 1 b). b. rinnastus ylävirran sekvenssin läsnä kolme HBoV genomien eristetty kasvainkudoksista. ylävirran Lisätään sekvenssi oli havaittiin kolme näytettä, jotka olivat itsenäisesti DNA-uutetaan ja analysoidaan PCR: llä ja sekvensoimalla kolmessa riippumattomassa kulkee, mikä sulkee pois yhden esineen tai ristikontaminaation tapahtuma. Yllättäen alleviivattu sekvenssit kokonaan sovitettu ihmisen DNA-sekvenssin kromosomista 5, viitesekvenssit AC008698.6 (

Homo sapiens

kromosomi 5 klooni CTB-70H11, emäkset 76065-76026) ja AC025156.2 (

Homo sapiens

3 BAC RP11-494C5 välille Roswell Park Cancer Institute, perustelee 130245-130284), mikä osoittaa, että HBoV pystyy rekombinaatiokyvyssä sen isäntä.

kaikissa HBoV-positiivisten potilaiden kasvaimia (taulukko 2), terveiden ympäröiviin kudoksiin näiden kasvainten testattiin myös HBoV DNA: sta PCR (n = 30; 2 kasvainta FFPE korttelin päässä ympäröivä alue kunkin HBoV-positiivisen kasvaimen). HBoV DNA ei havaittu mitään kasvaimen vapaan kudosnäytteet tutkittiin (kaksi vierekkäistä FFPE lohkojen potilasta kohden, yksi kummallakin puolella kasvaimen lohko). Ei myöskään HBoV DNA: ta löydettiin FFPE kudoksissa potilailla, joilla ei keuhko- tai peräsuolen kasvain (10 terveillä verrokeilla keuhkoihin ja 10 terveillä verrokeilla peräsuolen kudoksiin). Viisitoista isolaattia läpäissyt Sangerin sekvensoinnilla laadunvalvonta ja paljasti hyvin säilyneitä HBoV-1 NP1 geenisekvenssit.

Yllättäen kolmessa tapauksessa NP1 DNA-sekvenssi reunustavat ylävirran sekvenssin, joka sisälsi konservoituneen osan ihmisen kromosomin 5 ( 1b). Koska nämä kolme näytettä saatettiin riippumaton DNA: n uutto, PCR ja sekvensointi kulkee, sitä mahdollisuutta, että tämä havainto johti ristikontaminaatiolta kolmesta näytteet voidaan sulkea pois.

Kuten on aiemmin osoitettu, että HBoV voi säilyä episomaalisena DNA muoto, joka määritellään kemiallisesti kovalenttisesti suljettu pyöreä (ccc) DNA, tutkimme, missä muodossa HBoV DNA jatkuu näissä kasvain näytteissä.

Voit vastata tähän kysymykseen, fluoresenssin in situ (FISH ) määritys kehitettiin. Ihmisen HepG2-solulinja transfektoitiin p5TRHBoV [34] plasmidi, joka sisältää lähes koko pituudeltaan kopio HBoV genomin. Kontrolleina, transfektoimme HepG2-soluja, joissa on plasmidi, joka sisältää osittaisen RS-virus (RSV) sekvenssin ja mock-transfektoituja soluja. Nämä tiedot on esitetty kuviossa 2a.

a. Rivit 1-3 osoittavat kudokset värjättiin HBoV koettimia ja DAPI; rivit 4-6 positiivisia ja negatiivisia kontrolleja. LEH ja REH vastaavat vasempaan päähän (5′-pää) ja oikea pää (3′-pää) virusgenomin tai GAPDH-geenin. Ihmisen solut, jotka on transfektoitu plasmideilla tai ilman ihmisen bocavirus genomien sekä valetransfektoidut-soluja käytettiin kontrolleina. Rivi 7 esittää HepG2 solut värjättiin koettimien spesifisiä terminaaliset sekvenssit GAPDH-geenin. b. Laajentuminen yhdistetyn kuvan HepG2 solujen kaksinkertainen värjätään koettimien spesifisiä ihmisen GAPDH-geenin. Tämä kuvio osoittaa, että etäisyys kahden eri koettimien 5′-päässä ja 3′-päässä on riittävän suuri johtaa erilliset signaalit (split-signaali). c. Sulautunut kuvia HBoV DNA positiivinen kudoksiin, mukaan lukien negatiivinen kontrolli kudoksen.

FISH antureista kohdistaminen alueille lähelle vasemman pään hiusneula (LEH) ja oikea pää hiusneula (REH) käytettiin. Yksi koetin leimattiin vihreällä fluoresoivalla värillä, ja muut leimattiin punaisella fluoresoivalla värillä (taulukko 1).

Transfektoidut soluviljelmissä analysoitiin fluoresenssimikroskopialla osoitti, että käytettyjen koettimien havaitsemiseen HBoV genomisen DNA: olivat erittäin spesifisiä; vain ne solut, jotka transfektoitiin p5TRHBoV plasmidi ja kumpikaan valetransfektoiduilla eivätkä solu- transfektoitu ohjaus plasmidin signaalit (kuvio 2a, soluviljelmässä). Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

kaikki kasvain näytteet, jotka testattiin positiiviseksi PCR: llä, HBoV havaittiin myös FISH-analyysillä (n = 20, taulukko 2). Useita signaaleja per solu havaittiin 3 peräsuolen kasvaimet ja 4 keuhko- kasvainten, ja yksi signaaleja havaittiin muissa 6 peräsuolen ja 7 keuhkojen kasvain näytteitä. Kuvio 2a esittää kuvia, jotka edustavat kunkin kasvaintyyppi havaittu FISH analyyseissä. HBoV DNA ei havaittu negatiivisesta kontrollinäytteestä. HBoV-FISH signaaleja sekä LEH ja REH havaittiin. Yllättäen niiden värjäyskuvion ollut homogeeninen: Joissakin näytteissä esiintyi yksi REH ja LEH signaali kohti tartunnan solua, ja useita signaaleja havaittiin muissa näytteissä. Useita signaaleja per solu havaittiin joissakin keuhkojen ja paksusuolen ja peräsuolen kudoksiin (keuhko: n = 4, peräsuolen: n = 3), mikä osoittaa, että useita kopioita HBoV DNA ovat läsnä soluissa johtuen replikaation tai useita genomien jatkuva episomeina tai on integroitu isännän DNA. Nämä havainnot ovat yhteneviä sen kanssa, että HBoV replikoituu polttovälin tavalla. Lisäksi, nämä signaalit eivät aina tumassa; Joissakin näytti olevan sytoplasmassa, kuten yhdistämällä eri väriä kanavia.

Lisäksi mikroskooppisia FISH analyysit GAPDH-geenin osoittaa, että etäisyys pää ja pyrstö signaalit GAPDH-geenin on riittävän suuri selvästi erillään molemmat signaalit (kuvio 2a, viimeinen rivi, kuvio 2b suurennettu kuviosta 2a). Yhdistämisellä fluoresoiva kuvat HBoV kasvaimia osoittaa, että päätelaite HBoV signaalit sijaitsevat lähellä toisiaan joissakin tapauksissa, kuten vihreät /punainen signaaleja pieni keltainen välialue, kun taas punaiset ja vihreät signaalit erottuivat selvästi toisissa (split signaalit), mikä osoittaa, että genomi tapahtuu ei-pyöreä muoto. Keltainen signaalit tukevat aikaisemmin havainnon Kapoor ja työtovereiden että HBoV genomit jatkuu niin cccDNA [9]. Edustavia fluoresoiva kuvat esitetään kuviossa 2c.

Keskustelu

Meidän esitutkimus, johon kuului 60 keuhkokasvaimia ja 44 Kolorektaalituumorien tunnistimme HBoV DNA 18,3% (n = 11) kaikki keuhkokasvaimia ja 20,5% (n = 9), kaikkien peräsuolen kasvaimia. Esitetyt tiedot viittaavat siihen, että HBoV liittyy joitakin keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen kasvaimet ja vahvistaa oletuksen, että HBoV pysyvyys on lisääntynyt syöpäpotilailla [35]. Esiintyminen useiden FISH signaalien yhden soluissa on yhteensopiva hypoteesia, jonka HBoV jäljittelee jonka rengasreplikoitumismekanismin tai vaihtoehtoisen liikkuvan hiusneula monistusmekanismi. Tutkimaan asian, lisätutkimuksia käyttäen konfokaalimikroskopia, menetelmä, joka ei ole vielä osoitettu laboratoriossamme, voi olla hyödyllistä.

HBoV kannat tunnistettu Tuumorinäytteissä tässä tutkimuksessa kaikki kuuluivat genotyyppi 1, joka on yleisin genotyyppi Euroopassa; ei ole epätavallista, että mikään muu alatyyppejä todettiin, koska muihin alatyyppeihin ovat yleensä harvinaisia ​​ja niihin liittyy akuutti vatsatauti, kliininen sairaus, joka ei tutkittu tutkimuksessamme.

Onko HBoV DNA jatkuu kasvaimissa episomeina vai onko se integroitu ihmisen perimän vielä tutkittava. Tuloksemme osoittavat, että HBoV genomi löytyy lineaariseen muotoon (split signaaleja) tai ”head-to-tail” muoto (keltainen sulautunut signaali tai välittömässä läheisyydessä vihreä ja punainen signaalit). Tämä havainto on tulkittava huolellisesti ilman muihin analyyseihin. Ei-erotetut signaalit voivat edustaa ”head-to-tail” replikointi välituotteita, cccDNA, kuten havaittiin aikaisemmin [9,10,36], tai useita genomin kopioiden itsepintaisesti infektoiduissa soluissa. Jaettu signaaleja voitaisiin spekulatiivisesti tulkita liikkuvan hiusneula lisääntymään välituotteiden tai lineaarisen genomista DNA. Lisäksi DNA ole läsnä tumassa voisi sijaita sytoplasmassa tai pakataan solunulkoiseen viruspartikkeleihin.

Havainto, että HBoV voi kestää joillakin tartunnan kudoksissa muodossa cccDNA tapaan muista syöpää viruksia, voitaisiin tulkita useilla eri tavoilla. Ensinnäkin, HBoV voisi edistää joidenkin keuhko- ja peräsuolen kasvaimia, tunnustaa, että on edelleen epäselvää, HBoV on aktiivinen tai passiivinen rooli kehityksen näistä kasvaimista. Tämä hypoteesi kuuluu edelleen spekulointia vaan tukee ihmisen DNA-fragmentteja kromosomista 5 löytyy kolme täysin itsenäistä tapausta, mikä viittaa rekombinaation tapahtuman isännän DNA (kuva 1b). Vaikka on epätodennäköistä, on vähäinen riski, että tämä tulos on PCR artefakti. Olipa HBoV pystyy integroitumaan ihmisen kromosomi DNA tai rekombinaatiokyvyssä ihmisen genomin vielä tutkittava. Vuonna seurata tutkimuksen, tämä hypoteesi voitaisiin tutkia käyttämällä tuoretta kasvainkudoksen ja RFLP analyysiä seurasi Southern-blottauksella, mikä johtaisi bändi muutos sisällyttämisen tapauksessa isännän genomiin. Valitettavasti tämä oli teknisesti mahdotonta tutkimuksessamme, koska FFPE kudosta käytettiin takautuvasti. Lisäksi on tarpeen analysoida ekspression virusproteiineja vastaaviin kasvaimia ja niiden vuorovaikutus solun proteiinien kanssa, menetelmää, jota ei voida suorittaa ilman laajalti saatavilla vasta-aineita.

Toiseksi jotkut keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen kasvaimet voisi tarjota optimaalinen ympäristö HBoV ja tukea HBoV replikointi. Toinen oletus ensisijaisesti näyttää todennäköisemmältä, koska muut parvoviruksiin mieluummin jakamalla ja jakautuviin soluihin [37,38].

rooleja ihmisen parvoviruksiin kuin ruokamyrkytysepidemian syövän tai avustajat karsinogeneesiin on keskusteltu laajasti ensimmäistä tunnettujen ihmisen parvovirus B19. Vuonna 2007, kiinalainen ryhmä havaittu parvovirus B19 in 81,1% ja paksusuolen adenokarsinoomien in situ hybridisaatio- ja vahvisti tämän tuloksen 78,4% heistä immunohistokemiallisesti havaitsemalla virus- proteiinien ISH-positiivisten kudosten [39]. Tämä tutkimus tuettu aiemmassa kliinisessä seurannassa, jossa B19 liittyi keuhkosyöpä on japanilainen potilas [40]. Lisäksi, kuten edellä johdannossa, parvovirus B19 epäiltiin olevan aiheuttava tekijä muiden syöpien ja saattavat aiheuttaa krooninen tulehduksellinen prosessien infektoituneen kudoksen [19-24]. Samanlaisia ​​mekanismit voivat olla rooli HBoV tartunnan kudoksissa; tulevissa tutkimuksissa tulisi näin ollen keskittyä tulehduksellinen liittyviä prosesseja HBoV. Yhdessä nämä havainnot johtavat hypoteesiin, että ihmisen parvoviruksiin, erityisesti HBoV ja parvovirus B19, saattaa olla aktiivinen rooli ihmisen syövissä. Siksi lisätutkimukset perustuu tulevaisuudentutkimuksista tuoreista tuumorikudoksista tai uusia CuFi-8 soluviljelmässä [7] ovat erittäin toivottavia ja voi valaista rooli näiden virusten ihmisen syövissä.