Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Uusi syöpälääkkeiden, jotka kohdistuvat yhden solun pinnan reseptoriin, säädelty tai ulkoiset geenituotteen, tai mutatoitunut geeni, ovat saaneet jonkin verran menestystä hoitoon pitkälle edenneitä syöpiä. Kuitenkin potilaiden kasvaimet edelleen lopulta edetä näitä hoitoja. Jos olisi mahdollista tunnistaa useampia kohdistettavista haavoittuvuuksia yksilön kasvain, useita tavoitteita voitaisiin hyödyntää käyttämällä erityisiä terapeuttisia aineita, mikä mahdollisesti olevan potilaan toteuttamiskelpoisia hoitovaihtoehtoja.

Experimental Suunnittelu

tässä valmistelevassa tutkimuksessa käytimme seuraavan sukupolven sekvensointiteknologioihin (NGS) mukaan lukien koko Genomikartoituksen (WGS), ja mahdollisuuksien mukaan koko transcriptome sekvensointi (WTS) tunnistaa genomista tapahtumiin ja liittyvät ilme muutoksiin kehittynyt syöpäpotilailla.

tulokset

WGS pariksi kasvain ja normaali näytteitä yhdeksästä kehittynyt syöpäpotilaille ja WTS kuusi näistä potilaiden kasvaimia valmistui. Yksi potilaan hoitoon perustui tavoitteisiin ja reitit tunnistetaan NGS ja potilas oli lyhytikäinen PET /TT vaste vähennetään merkittävästi hänen kasvaimeen liittyvä kipu. Suunnitellaan hoitosuunnitelmia tietojen perusteella keräsi NGS, useita haasteita on kohdattu: NGS raportointi viiveitä, viestintä tulosten out-of-state osallistujien ja niiden hoitoon onkologit, ja puun alkuperän käsittelyä tuoreen biopsianäytteissä for Clinical Laboratory Improvement Muutokset ( CLIA) tavoite validointi.

Johtopäätös

Vaikka ensimmäinen yritys oli hitaampi prosessi odotettua johtuen erilaisia ​​ongelmia, me osoittavat mahdollisuutta käyttää NGS pitkälle syöpäpotilailla jotta hoitoja potilailla, joilla on edennyt kasvaimia voidaan parantaa.

Citation: Weiss GJ, Liang WS, Demeure MJ, Kiefer JA, Hostetter G, Izatt T, et al. (2013) esitutkimuksessa Next-Generation Sequencing in Advanced Syövät: toteutettavuus ja haasteet. PLoS ONE 8 (10): e76438. doi: 10,1371 /journal.pone.0076438

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 30 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Weiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli saatiin National Foundation of Cancer Research (www.nfcr.org) ja Lee T. Hanley rahaston Haimasyöpä Research (https://www.tgenfoundation.org/netcommunity/page.aspx?pid=1196). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Potilaat, joilla on edennyt syöpä usein pakokaasujen hoitovaihtoehtoja. Ne voivat osallistua vaiheen I tai vaiheen II kokeissa uusien syöpälääkkeiden, jos ne täyttävät yleensä tiukat kelpoisuusvaatimukset ja saada keskuksia, jotka voivat hallinnoida tutkimuslääkkeiden aineita. Kun potilaat osallistua näihin tutkimuksiin, uudet aineet, keskimäärin antavat hoitovasteen välillä 5% ja 10% vaiheen I asetus ja 12% II-vaiheen asetus [1] – [3]. Potilaat on myös vaihtoehto oireenmukaista hoitoa yritetään puuttua niiden oireita.

Viime aikoina on kasvanut räjähdysmäisesti kiinnostusta kehittää uusia syöpälääkkeiden, jotka ovat paremmin kohdennettuja, yleensä vasten solupintareseptorikomplekseihin tai up-säännellään tai monistetun geenin tuotteen tai mutatoitunut geeni. Tämä lähestymistapa on tapaaminen jonkin verran menestystä (esimerkiksi trastutsumabi HER2 /

neu

rintasyöpäsoluissa, erlotinibi vastaan ​​EGFR-mutantti ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jne.). Kuitenkin potilaiden kasvaimet edelleen lopulta edetä näihin hoitomuotoihin, koska ne sisältävät useita genomista poikkeavuuksia, ja kohdentamalla yksi poikkeavuus ei riitä estämään etenemistä. Jos olisi mahdollista tunnistaa useampia tavoitteiden yksilön kasvain kun on olemassa aineita, jotka voivat kohdentaa, useita tavoitteita voitaisiin tarkastella käyttämällä erityisiä terapeuttisia aineita, ja ehkä vähentää mahdollisuuksia etenemiseen. Loppujen lopuksi useimmat tutkijat envision käyttämällä useita aineita lyödä useita kohteita läsnä potilaan kasvain. Kuitenkin määrittämiseen ja soveltamiseen sopiva terapeuttisten edelleen haasteellista.

aiemmin tehty prospektiivinen monikeskustutkimus hyödyntämällä molekyyli- profilointi kasvainten immunohistokemiallinen (IHC), fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH), ja DNA-siru löytää mahdollisia lääkkeiden tavoitteet ja valitut hoitoja vastaavasti [4]. Kuusikymmentäkuusi 84 potilasta hoidettiin perustuu molekyylien profilointia niiden kasvain. 18 näistä 66 potilasta, hoidon johdettu molekyyli profilointia, johti ilman taudin etenemistä suhde ≥1.3, mikä viittaa hoidon hyöty. Molecular profilointi kannatti osoitus uuden hoito ei tarkasteltu aluksi tutkijan, potilaspopulaatiossa, joka oli voimakkaasti esikäsitelty ja reagoinut aiempaan hoitoja.

perustat tähän ensimmäinen askel kohti henkilökohtaista hoitoa, käytimme Next- sukupolvi sekvensointiteknologioihin (NGS) mukaan lukien koko Genomikartoituksen (WGS), ja mahdollisuuksien mukaan koko transcriptome sekvensointi (WTS) tunnistaa genomista tapahtumiin ja liittyvät ilme muutoksiin kehittynyt syöpäpotilailla. Käytimme WGS sekvensoida Tuumorinäytteiden DNA ja Hyväksytty ituradan DNA yhdeksästä kehittynyt syöpäpotilaille tunnistaa keskeiset somaattisten muutoksia. Ituradan DNA otettiin näytteitä valkosoluista ja kasvaimen DNA otettiin näytteitä kasvainsoluista. Kuusi näistä potilaista, käytettiin myös WTS sekvensoida kokonais-RNA eristettiin kasvain, yhdessä ei-potilaan kokonais-RNA valvontaa. Koska geeni-ilmentymisen profiilit eroavat kudostyyppien, ja terve kudos ei voitu koepala potilaasta vertailun hankkia kaupallisesti normaali RNA vastaavan kudoksen verrattiin RNA eristettiin kasvain. Sitten arvioitiin transcriptomic muutoksia ja suorittaa integroitu genomiikka analyysit [5] kanssa WGS tiedoista mahdolliset druggable tavoitteita. Täällä osoittaa toteutettavuus ja korosta haasteisiin käyttää NGS teknologioiden prospektiivisessa tavalla kehittynyt syöpäpotilailla.

Methods

Ethics lausunto

Tutkimus suoritettiin mukaisesti kanssa Helsingin julistuksen ja hyväksyi Länsi Institutional Review Board (WIRB® Protocol # 20101288) (NCT01443390). Kirjallinen suostumus saatiin potilailta, mukaan lukien kirjallinen suostumus julkaisemiseen kliinisen yksityiskohtia ja kuvia.

Tutkimus Tavoitteet

ensisijaisena tavoitteena oli selvittää mahdollisimman monta genomista muuttuu mahdollisimman edenneisiin syöpiin, jotta laajentavat potentiaalisten käytännöllisiä tavoitteita hoitoihin, jotka olivat kaupallisesti saatavilla tai kliinisissä kokeissa. Toissijaisena tavoitteena oli kehittää työnkulun prosessin Tuumorinäytteiden hoitoon; todellakin, tämä prosessi on tapahduttava riittävän pieni ajassa, jotta potilaat voivat hyötyä tästä lisätietoja kehittämään hoitosuunnitelma. Tämä sisältyi mittaamalla aika kudosnäytteistä loppuun ja kädessä NGS potilaiden kasvain ja ei-kasvain näytteet, tutkimalla taajuus, jolla käyttökelpoista sekvenssi data saadaan funktiona prosentin etäispesäkkeitä että koepala, ja arvioitaessa korrelaatio anti -tumor aktiivisuus hoitojen tunnistaa NGS.

Tutkimusasetelma

perusteluna tämän tutkimuksen että NGS voitaisiin käyttää tunnistamaan ole vain yksi, mutta monet genomista poikkeavuuksia, jotka voitaisiin kohdistaa käyttäen mahdollisesti käytettävissä hoitomuotojen pitkälle syöpäpotilailla. Tämä yksittäinen keskus, prospektiivinen, yksihaarainen pilottitutkimus tehtiin potilailla, joilla on edennyt syöpä, joka eteni vakio systeemistä hoitoa tai jos hänen kasvaintyyppi ei ole vakio systeemistä hoitoa. Tutkimus oli valmistelevassa luonnossa. Jos haluat osallistua, potilaiden on pitänyt ikä ≥18 ja halukas käymään koepalan tai kirurgisen toimenpiteen saada kudosta, ellei jäätynyt kasvain kerättiin alle 8 viikkoa ennen ollut saatavilla. Kiinnostunut osallistujat olivat tietoisia, että saadakseen uuden koepala voi olla osa potilaan rutiinihoitoa heidän maligniteetti. Muita kelpoisuusvaatimukset sisältyvät: perustason laboratoriotuloksia ilmaisevat hyväksyttävät luuydinreservi, maksa- ja munuaistoiminnan, Karnofsky: n suorituskyvyn ≥80%, ja elinajanodote 3 kuukautta. Osallistumista toisessa kliinisessä tutkimuksessa, jossa hoitoa ennen tai sen aikana osallistua tähän tutkimukseen sallittiin. Tärkeimmät poissulkukriteereitä olivat oireisen tai käsittelemättömiä keskushermoston (CNS) etäpesäkkeitä, joka tunnetaan aktiivisena vaativien infektioiden suonensisäisen Mikrobilääkehoidossa raskaana tai imettäville naisille, tai kasvain, joka oli poissa käytöstä koepala. Yksilöt, joilla tiedetään HBV, HCV tai HCV-infektion (t) vaativat viruslääkitystä myös ottaa huomioon, koska väestön jätetään usein first-in-ihmisen syöpätautien kliinisistä tutkimuksista; mikä rajoittaa mahdollisuuksia mahdollisia hoitovaihtoehtoja tälle ryhmälle. Kaikki kelvolliset potilailla oli kokoveren ja tuore kasvain näyte kerätään ja lähetetään analyysejä varten. Nämä menetelmät ja tietoa raaka sekvenointitulosten kuvataan tarkemmin Lisärahastolle osiossa. Me ennakoitua noin 100 päivän tuoreista Tuumorinäytteiden loppuun NGS. Sen jälkeen NGS analyysi tehtiin, pääasiallinen tutkijat tarkastelivat tuloksia, ja jos kliinisesti sopivaa, valitsi tavoitteet validointi jota CLIA-sertifioitu (Clinical Laboratory Improvement muutos) laboratorio. Viiden potilaan näytteiden pieni kasvain prosenttiyksikköä, exome sekvensointi lisättiin tunnistamaan mahdolliset käytännöllisiä tavoitteita. Sen jälkeen kohde validointi, raportti toimitettiin hoitoon onkologi potentiaalisten hoitosuosituksia, joita voidaan käyttää hänen /hänen harkintansa mukaan.

Tulokset

Potilastiedot

Kaikki potilaat nähtiin ja arvioitiin sisällytettäväksi tässä tutkimuksessa välillä lokakuussa 2010 ja helmikuun 2012 yhden keskuksen. Välttämiseksi työnkulku viivästyksiä käytettävissä NGS, seulontalaitteistot potilaille oli sijoitettu sallimaan enintään kahden mahdollisia ehdokkaita kuukaudessa. Koska keskus tutkimuksen tekemiselle saa siirtäneet koko maassa vaiheen 1 tutkimuksia, jotkut yksilöt tuli ulos tilassa aikataulun seulonta ja suostumus arviointi, ja vahvistamisen jälkeen kelpoisuuden, eteni raikas Tuumorinäytteiden 24 tunnin kuluessa. Tämä tehtiin potilaiden mukavuutta, jotta matka kotiin pian alustavan arvion kanssa. Se teki luo logistisia haasteita seurannan ja välittää tulokset takaisin hoitavan lääkärin. Potilaille elävät ajomatkan päässä, ilmoittautuminen prosessi oli samankaltainen, vaikka biopsia ei aina suunniteltu seuraavana päivänä.

Taulukossa 1 luetellaan ominaisuudet 11 potilaalla suostunut tähän tutkimukseen. Valtaosa potilaista oli miehiä, mediaani-ikä 59 vuotta (vaihteluväli 20-69 vuotta). Huomattavaa on, että aikaan suostumuksen, kaikki paitsi yksi potilas (potilas 9) oli edennyt vähintään yksi aikaisempi systeeminen hoito edenneen taudin (3, alue 0-8). Potilas 9, diagnosoitu kehittyneitä adenosquamous syöpä haima, tehtiin systeemistä hoitoa ja sen jälkeen edennyt jälkeen NGS tulokset saatiin käyttöön.

Kuva 1 tiedot konsolidoidun standardit Raportointi Trials (CONSORT) kaavion havainnollistaen kulkua 11 potilaalla suostunut ja arvioitiin tutkimuksessa. Kaksi potilasta (potilaat 1 ja 5) tehtiin Tuumorinäytteiden ja ollut riittävästi DNA saatavilla NGS analyysin puutteen vuoksi riittävä kasvaimen soluihin havaittu kerätyt näytteet (taulukko 1 ja taulukko S1). Jäljellä yhdeksän joilla on pitkälle edennyt syöpä, suoritimme WGS molemmilla kasvaimen DNA, samoin kuin ituradan DNA eristettiin kokoverestä, jotta löydetään sekä somaattisia muutoksia; vastaavasti. WGS mittarit ja yhteenveto tilastot kunkin yhdeksän potilasta on esitetty taulukossa S1. Kuudella potilaalla oli saatavissa kasvain-RNA että onnistuneesti analysoitiin WTS. Viimeiset kolme potilasta (potilaat 9, 10, ja 11) ilmoittautunut tässä tutkimuksessa olemme sitoutui enemmän mukana biologinen analyysi koottu genomista data erottaa merkittäviä biologisia polkuja, jotka voivat vaikuttaa potilaan syöpä tunnistaa mahdollisia terapeuttisia kohteita.

* – Prospective rikastamiseen analyysi tehtiin ennen keskustella tuloksia potilaan ja hoitavan onkologi kolmen viimeisen osallistuneista potilaista.

Näistä 9 potilaalla on WGS ja /tai exome sekvensointi ja /tai WTS analyysi käytettävissä tunnistimme mahdollisia kohteita ja reittejä kaikille, mutta potilas 2 (88,9%) (taulukko 1). Meidän toissijaisia ​​tavoitteita, mediaani aika koepala loppuun ja kädessä NGS potilaiden kasvain ja ei-kasvain näytteissä oli 91 päivää (vaihteluväli 46-243 päivää). Tärkeimmät syyt vieraat havainnot olivat joko sekvensointi välineenä ongelmia tai seurauksena pieni kasvain prosenttiosuus näytteessä vaativat exome sekvensointi tunnistaa mahdolliset käytännöllisiä tavoitteita. Sillä käytetty protokolla, exome sekvensointi tarvitaan enemmän input DNA (3 ug) kuin WGS (1 ug) ja antoi tietoja koodaavat alueet ja reunustavat transloimattomat genomin alueita. Seitsemän tapauksissa, alkuperäisen kasvaimen näytteet lähetetään suoraan laitokselta patologian arvioinnissa niin, että kasvaimen prosentuaalinen voitu todeta. Pienin kasvain soluihin sisältöä onnistuneen NGS oli 30% (taulukko 1).

Koko Genomikartoituksen

Täydellinen pilottitutkimus, sekvensointi suoritettiin synteettisesti teknologian ja 100 emäsparin pariksi-end kemia . Me tuotti yli 19 miljardia yhteensä lukee WGS keskimääräisen kartoitettu peittojen välillä 17 × 71 ×. SNP (yhden nukleotidin polymorfismi) kutsuvan suoritettiin käyttäen kahta erillistä soittajat vähentää väärien negatiivisten tulosten osuus. Arvioida yleistä laatua variantin tietojen ituradan SNP kutsuttiin ja siirtymistä transversiosta ja dbSNP (yhden emäksen monimuotoisuus Database) [6] 129 konkordanssin suhteet laskettiin. Kaikille potilaille, siirtyminen /transversio suhteet olivat välillä 2,01-2,24, ja dbSNP 129 concordance vaihteli 86,0-89,4 (taulukko S1). Näiden analyysien ei harhat havaittu osalta nukleotidisubstituutioita, SNP tunnistettu vahvasti korreloivat yhteisiä geneettisiä variaatioita, ja korkea laatu variantti kutsumus tehtiin. Kaikille potilaille oli yhteensä 5778 koodaus genomista yksilöidyt (mediaani = 15,5). Potilas 2, naispuolinen koskaan tupakoi metastasoitunutta keuhkoadenokarsinooma, kanna suurin osa näistä koodausta genomista tapahtumia (n = 4137), joka sisältää nonsynonymous TP53 mutaatio (G226V) 100% mutantti alleeli erityinen ilmaisu, ja interstitiaalinen 8q CNV (kopiomäärä vaihtelu) saavat kattaa MYC. Potilas 11, naispuolinen metastasoitunutta keuhkoputken karsinoidi, oli vähiten koodaus genomista tapahtumia (n = 4). Exome sekvensointi suoritettiin kasvaimen näytteitä potilaista 6, 7, 8, 10, ja 11, joissa muuttujat esitetään taulukossa S1. CNV tulokset on esitetty taulukossa S2.

Koko transcriptome sekvensointi

WTS suoritettiin kuudella potilaalla (taulukko 1 ja taulukko S1) ja vastaavat ei-potilaan normaalia kudosta RNA perustuu primaarikasvaimen alkuperää . Koska normaali viereinen kudos ei kerätty potilailta aikana koepala, kokonais-RNA asianomaisen kudos kaupallisesti ostettu. RNA kirjastot valmistettiin näiden näytteiden ja sekvensoitiin kunkin kasvaimen RNA kirjastoissa. Kasvaimen WTS tietoja verrattiin vastaaviin normaalia kudosta WTS data tunnistaa ilmentymisen muutoksia kasvainbiopsioissa. Kukin analysoitu kasvainten oli geenit merkittäviä ilme muuttuu q 0,05, korjattu useita testaus (mediaani määrä geenejä differentiaalisesti ilmaisi 1731, alue 495-2,323) (taulukko S3).

Kopioi numero vaihtelu

Amplifikaatiot ja poistot havaittiin tunnistamalla alueet, joilla oli delta (+/-) in log2FC (kuten edellä on kuvattu) on suurempi kuin 2 standardipoikkeamaa mediaani log2FC poikki varren kromosomin kuulustellaan. Delta laskettiin vähentämällä päätepisteissä noin 1 Mt liukuikkuna. Lisäksi havaitut alueet, joita tarvitaan vähemmän kuin 14 MB pituus on merkitty keskeinen tapahtuma. Taulukko S2 sisältää kaikki polttoväli tapahtumista, jotka sisältävät KOSMINEN geenit Potilaita 2, 3, 4, 7, ja 8. Potilaat 9 ja 11 ei ollut mitään polttoväli tapahtumia, jotka sisälsivät KOSMINEN geenejä. Potilaat 6 ja 10 ei ollut yhtään polttoväli tapahtumia (katso taulukko S3 ja kuvio S7) B

Mahdollisten rikastus Analysis

Viimeisen kolmen potilaasta suoritimme rikastaminen analyysi WGS ja /tai exome sekvensointi ja WTS. Tiedot kunkin yksittäisen potilaan ovat seuraavat:

Patient 9 adenosquamous syöpä haiman

Yhdeksän potilasta, joilla oli kasvaimia analysoitiin NGS, potilas 9 (adenosquamous haimasyöpä) on vain yksittäisiä joiden hoito perustuu tavoitteisiin ja reitit tunnistetaan NGS. Vain kaksi oli saatavilla analyysiä tämän potilaan kudoksissa, yhden nukleotidin vaihtelut (SNV) ja WTS. Mitään merkittäviä alueita muutos havaittiin kopioluku data.

Top 20 kanoninen karttoja rikastettu WTS tiedot näkyvät kuvassa S1. Yhteinen biologiset mekanismit, jotka liittyvät näihin top 20 rikastettua kartat sisältävät tarttumista, solun tukirangan remontin ja immuuni /kemotaksista prosesseja. Tällainen rikastusta merkitsevät yleisen aktivaation soluväliaineen remodeling, jotka voivat liittyä fenotyyppi tätä harvinaista kasvaimen tyypistä. Kaksi karttoja huomautuksen kahdenkymmenen parhaan reitin kartalla rikastusta erityisiä haimasyöpä karttoja rakennettu nimenomaan talteenottoprosesseista muuttunut haimasyöpä. Nämä kartat otsikolla ”Tumor-stroomavuorovaikutuksiin haimasyövän” ja ”Role of tähtisolut etenemisessä haimasyövän”, korostaa entisestään mahdollisia strooman /ECM vuorovaikutus tämän kasvain. The ’rooli tähtisolut etenemisessä haimasyövän ”kartta on esitetty kuvassa S2.

Lisähavainto tarkastus päällekkäin WTS dataa signalointi karttoja on mahdollista osallistumista TGF-beeta välittämää epiteelin ja mesenkymaalitransitioon tässä kasvain. The ’kehittämistä koskevan asetuksen epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ”kartta (kuva S3), korostetaan WTS tietojen päälle edustama lämpömittarit vieressä solmut kaaviossa. Punainen lämpömittari tarkoittaa, että geenin yli-ilmentyy ja sininen tarkoittaa, että geeni on ali-ilmentynyt.

kaksi ligandeja, TGF-beeta-1 ja TGF-beeta-2 ovat molemmat voimistunut yhdessä niiden vastaavan reseptorin, TGF-beeta-reseptorin tyyppi II. Yhdistetty säätelyä kasvutekijöiden /reseptori paria pistettä mahdollisille tärkeyttä signalointi parin olla ”aktiivinen” tässä kasvain. Lisänäyttöä yhdistää TGF beta signalointi EMT on korostettu säätelyä Lef-1, TCF8 ja E2A transkriptiotekijöiden. Nämä transkriptiotekijät toimivat myötävirtaan TGF beta signaalin EMT. Muita todisteita niiden aktivointi on alas-säätely E-kadheriinin, joka on tunnusmerkki EMT fenotyypin. Läsnäolo EMT fenotyypin olisi portend suhteessa kestävyys lukuisia terapeuttisia aineita ja merkitsevät etäpesäkekasvainkudoksen.

Lisäksi tarkastus WTS tietojen paljastaa yli-ilmentyminen mahdollisia kohteita interventioon. Kuten edellä on mainittu, ligandi /reseptori-pari asetus viittaa aktivointi ja säätelyä Neuropiliini 1 ja VEGF-A. Tämä voi edustaa haavoittuvuuksia antiangiogeenisestä hoitoja. Muita tavoitteita, jotka olivat voimistunut ovat ESR1, ABL1, GART, VDR ja erbB2.

Patient 9 kasvain oli huomattava mutaatiot KRAS (G12R) ja PIK3CA (R93W). Molemmat mutaatiot säätele signalointia kasvua ja leviämistä. Nämä yhtäaikaisen mutaatiot osoittavat, että yhdistetty kohdistaminen MEK /ERK ja PI3K /AKT hoitoon tämän kasvain olisi tehokkaampi kuin kohdistaminen vain yksi kaksi mutaatiota. Vaikka KRAS-mutaatio oli vahvistanut CLIA testauksen sisältävä alue PIK3CA mutaation ei ollut osa kaupallista testin ja siten vahvistamaton alle CLIA olosuhteissa. Toinen merkittävä SNV on geenissä RAD50 (Q737R), joka koodaa proteiinia, joka on osallisena DNA double-lohkon murtuma korjaus. Virheellisestä toiminnasta RAD50 on yhdistetty herkistymisen sisplatiinin ja lisääntynyt herkkyys PARP-inhibiittorit [7].

Potilasta hoidetaan aluksi sisplatiinin ja gemsitabiinin ja sitten eteni. Tuolloin WGS /WTS tulokset oli saatavilla ja potilas otettiin kiinni vaiheen I PI3K-estäjä ja MEK estäjän yhdistelmä tutkimus. Potilaalla oli lyhytikäinen PET /TT vastausta tämän tutkimuksen (kuvio 2), ja tämä oli myös mukana dramaattinen väheneminen kipunsa kohtalainen vailla (4/10 ja 0/10 visuaalisen kipujanalla).

18-fluorideoksiglukoosi positroniemissiotomografia /tietokonetomografiaa (PET /TT) kuvaavan (A) aksiaalinen viipale lähtötilanteessa ja (B) aksiaalinen viipale 30 päivän kuluttua hoidon. Keltainen nuolen osoittamaan kaksi hypermetabolista imusolmukkeet B ja C. B, standardi oton arvo (SUV) vasemman imusolmuke on 9.8 ja imusolmuke oikealla on 7,5, kun taas SUV vasemman imusolmuke on 3.1 ja imusolmuke oikealla on 3.5 C.

Patient 10 metastasoitunut papillaarisen munuaissyövän

Data analysoitavaksi tälle potilaalle koostui vain SNVs ja WTS koska mitään kopiomäärä poikkeavuuksia havaittu. Top 20 kanoninen kartat paljastavat yhteisiä teemoja ympäri solusyklin, kromosomi /kara-toiminto, soluadheesiota, ja EMT siirtyminen. Yksi polun seteli on ”Cell cycle kehräkokoonpanon ja kromosomi erottelu” kartta (kuva S4). Useita geenejä mukana tämän kartan on yliaktiivista tämän kasvaimen, mukaan lukien druggable kohde AURKB (log2ratio = 6,3). Karan kokoonpano ja kromosomi erottelu ovat elintärkeitä solujen jakautumisen useiden syöpätautien lääkekohteita liittyy tähän prosessiin. Kaksi SNVs esiintyvät myös geeneissä (STAG1 (F802Y) ja NuMA1 (L1400P)) on tämän reitin ja ehdottavat, että kyseisten muutosten tässä kasvain.

Muut reitit kanssa tilastollista merkittävyyttä, jotka sisältävät tärkeitä havaintoja, jotka liittyvät biologia tämän kasvain ja mahdollisia terapeuttisia vaihtoehtoja ovat huomattava. The ’EGF- ja HGF-riippuvainen stimulaation etäpesäkkeiden mahasyövän ”kartta paljasti säätelyä HGF ja sen reseptori MET. Tämä kartta rakennettiin mahasyöpä erityisiä tietoja, vaikka monet syövät samankaltaiset signalointireittejä ja molekyylejä. Joilla on sekä reseptori ja ligandi voimistunut ehdottaa autokriini merkinantomekanismi. Kuten kuviossa S5, alfa-6 /beeta-4 integriinin komponentit upregulated ja toiminta yhteistuumin MET aktivoida alavirtaan signaalitransduktion. Mahdollista osallistumista MET on tärkeä havainto, koska se on tällä hetkellä houkutteleva onkologian huumeiden tavoite.

lisätarkastuksia data paljasti, että läsnä muutoksia RNA-tasolla mahdollisten lääkekohteita. Angiogeeninen signalointia ligandin VEGFA, TOP2A, ja ASNS mRNA: t voimistunut. Nämä kolme geeniä ovat tavoitteita nykyisten onkologian aineita. Lisäksi, MGMT mRNA, joka on DNA: ta korjaavan geenin, joka välittää resistenssiä temotsolomidi on vaimentua, mikä viittaa siihen, temotsolomidi hoitovaihtoehtona. Lopuksi tämä kasvain on SNV geenissä APTX joka koodaa proteiinia, joka liittyy DNA: n korjaukseen, joka voi välittää herkkyyttä irinotekaani [8].

Patient 11 metastasoituneen keuhkoputken neuroendokriini syöpä

Kolmenlaista genomista tietoa saatavilla analyysi tämän potilaan kudoksiin sisältyvät WTS, CNV (taulukko S2), ja SNV tiedot. Vain neljä SNVs vuonna kaksi geeniä, KRT4 ja GOLGA6L10, tunnistettiin, jolloin WTS ja CNV data ajo biologinen kerronta tämän kasvain. Kuva S6 näyttää top 20 kanoninen polku karttoja rikastamiseen analyysin potilaan 11: n tietoihin. Teemat edustaa otsikot nämä kartat eivät ole niin tiivis kuin potilaalla 10, mutta jälleen kerran, me tarkkailla solun tukirangan ja liiman karttoja hallitseva. Huomattavaa on, että ei solusyklin tai kromosomi keskeinen kartat rikastetaan mahdollisesti viittaa minimaalisesti mitoottisiin kasvain. Mitä geenikohteet, oli useita erityisiä ilmentynyt geenejä kuten KIT, PDGFRB, EGFR, FGFR1 ja SPARC. On huomattava, että ei kopiomäärä vaihteluita havaittiin näiden geenien.

Keskustelu

Tässä valmistelevassa esitutkimus, rakensimme kun meidän aiempaa kokemusta mahdollisten molekyylien profilointia. Koska tämä on kehitteillä oleva teknologia, siellä odotettiin ja ennakoimattomia haasteita kohdanneet aikana tutkimuksen käyttäytymistä. Väestö potilaiden arvioida tällä pilotti oli edennyt syöpiä taudin etenemistä ja valitettavasti varten kaksi henkilöä, tulokset tulivat jälkeen merkittäviä kliinisiä heikentymisen tai kuoleman (potilaat 2 ja 3). Vaikka tutkimus oli meneillään, kustannukset sekvensointi väheni edelleen, ja välineiden parantaminen WTS ja integrointi WGS kanssa WTS syntynyt. Siten WTS lisättiin takautuvasti potilaasta 7 eteenpäin. Potilaan 2, WTS oli mahdollista, koska ei ollut saatavilla kasvaimen RNA uuttamalla. Lisäinformaation WTS potilas 2 sitten välitetään hoitavan onkologi. Lisäksi riittämätön kasvain DNA (potilaat 1 ja 5), ​​tekniikan ja työnkulun näytteen käsittelyn parannettava, jos pystyimme sisällyttämään exome sekvensointi (potilasta 6, 7, 8, 10, ja 11), kun kasvain pitoisuus osuus oli riittämätön näytteestä biopsia . Tämä lisätään koko sekvensointi ja analyysi aika näillä potilailla (taulukko 1) [9] – [12]. Huomaa, että WGS oli suositeltava toimintamalli suorittamisen aikana tämän tutkimuksen. WGS tarjoaa paremman kopiomäärä resoluutio ja kyky tunnistaa uudelleenjärjestelyihin kuten käännellen, jotka kattavat yhden eksonin kasvainsuppressorigeenin. Tämän tyyppinen inversio, ei lukukehyksen ja tuumorisuppressorigeenin ilmentyy normaalilla tasolla. Ilman isoformi tai liittämiseen analyysi, tämä muutos jäisi IHC koska se on vielä ilmaistu proteiinitasolla, vaikka proteiini on aktiivinen johtuen puuttuva aminohapot [5]. Myönnämme, että exome sekvensointi tarjoaa syvemmälle kattavuus tunnistaa koodausta mutaatioita. Uudempi strategiat voivat kaapata paras sekä WGS ja exome yhdistelmätila kuuluu pitkä laita matala koko genomien ja syvä exome sekvensointi kaapata monimutkaisia ​​uudelleenjärjestelyihin ja saavuttaa korkeampi herkkyys kaappaamiseen koodausta mutaatioita.

Toinen haaste toteutuu kokeen jälkeen oli käynnissä oli alkuperäketjun käsittelyn tuoreen biopsianäytteissä. Koska alkuperäisen kasvaimia analysoitu ei tapahtunut DNA /RNA käsittely klo CLIA Laboratoriossa seuraaviin suunniteltuihin validointi tavoitteiden samasta tuore näyte ei tarkastettava CLIA-sertifioitu testi. Lisäksi suunnilleen 2 viikkoa viive CLIA validointi yhdistettynä mediaaniaika 91 päivää NGS tuloksia tulee saataville oli ongelmallista. Potilaan 9 kasvain KRAS (G12R) mutaatio validoitiin käyttäen CLIA-sertifioitu testi. Kaikkien paitsi yhden potilaan (potilas 2), mahdollisesti druggable kohde joko kaupallisesti saatavilla tai tutkimustarkoituksiin hoitoa tunnistettiin. Potilaan 11, WGS ei tuottanut kohde, ja vain WTS auttoi tunnistamaan druggable tavoitteita. Integrointi Epigenomics analyysi voisi myös tekijä kuin toinen kerros kohti helpottaa tunnistamista druggable tavoitteet olemassa oleviin hoitomuotoihin.

Vaikka ei ole teknisiä tai looginen viiveet NGS, tulkintaa ja soveltamista tämän tiedon kliinistä käytäntöä on äärimmäisen epävarmaa. Ei kaikki SNVs tunnistetaan WGS on haitallinen vaikutus proteiinin toimintaan. Joten pelkkä tunnistaminen SNVs, vaikka validoitu CLIA-sertifioitu testiä, ei takaa, että kohdistaminen se johtaa vakauttamiseen tai väheneminen kasvaintaakkaa. Meidän on myös tunnustettava, että kasvaimensisäisellä heterogeenisyys ja klonaalinen kehitys voi hankaloittaa meidän suunnitellaan hoitostrategioiden potilaiden tulosten perusteella yhdestä Tuumorinäytteiden [13], [14].

aikana käyttäytyminen Tämän tutkimuksen, huomasimme, että mediaani aikataulu 91 päivää raportoida NGS tuloksista, potilailla, joilla on erinomainen suorituskyky ja joilla alhainen kasvaintaakkaa ovat todennäköisemmin tavoitteita tunnistettu, jotka voivat olla toiminnan. Parantuneiden tehokkuutta, jotka vähentävät aika saada NGS tuloksia ja kohtuulliset kustannukset, voimme kuvitella NGS voidaan soveltaa maailmanlaajuisemmin pitkälle syöpäpotilaille. Jopa suhteellisen lyhyen ajan, että tämä tutkimus ilmoittautumalla, havaitsimme merkittäviä parannuksia sekvensointi analyysien ja alensi reagenssia kustannuksia. Toiset äskettäin raportoitu melko vaikuttavia tuloksia 27% vaste kohdennettua hoitomuotojen käyttää enemmän rajallinen sekvensointitekniikan tunnistaa druggable tavoitteet [15]. Kaiken kaikkiaan olemme osoittaa toteutettavuus suorittaa NGS teknologioiden mahdollisille tavalla kehittynyt syöpäpotilailla. Arvioimme, että ei kaukaisessa tulevaisuudessa NGS teknologiat tulevat helpommin saatavilla sisällytettäväksi rutiinihoitoa kehittyneiden syöpäpotilaat.

Johtopäätös

Vaikka ensimmäinen yritys oli odotettua hitaampaa prosessin takia erilaisia ​​asioita, me osoittavat, että NGS voidaan hyödyntää kliinisissä tilanteissa olipa tämä lähestymistapa johtaa todellisen ja jatkuvan potilaan etu on vielä todistettu.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

Täydentäviä tietoja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s001

(DOCX) B Kuva S1.

Potilaan 9 WTS tiedot kanoninen karttoja. Tämä kuvio kuvaa top 20 kanoninen karttoja rikastettu WTS tietoja potilaan 9.

doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s002

(TIFF) B Kuva S2.

rooli tähtisolut etenemisessä haimasyövän. Tämä kuvio kuvaa roolia tähtisolut haiman syövän etenemisessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s003

(TIFF) B Kuva S3.

kehittämisasetus epiteelin ja mesenkymaalitransitioon. Tämä kuva havainnollistaa mahdollista osallistumista TGF-beeta välittämää epiteelin ja mesenkymaalitransitioon.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s004

(TIFF) B Kuva S4.

Valitut kanoninen kartan Patient 10: Cell cycle kehräkokoonpanon ja kromosomi erottelu. Tämä kuva havainnollistaa solusyklin kehräkokoonpanon ja kromosomi erottelu, kuten ilmen- tymisen lisääntymisen ja druggable kohde, aurora-B (AURKB).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s005

(TIFF) B Kuva S5 .