Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on tappavin naistentautien maligniteettien johtuu osittain sen kliinisesti okkultismin etäpesäke. Siksi ymmärtäminen mekanismit EOC levittämistä ja hyökkäys voi antaa uudet tavoitteet haarapesäkkeiden hoitoja tai uusia menetelmiä havaitsemiseksi etäpesäkkeitä. CAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin (PKA) on usein väärin säädellystä in EOC. Lisäksi PKA aktiivisuuden ja solunosasijaintia A-kinaasin ankkurointi proteiinit (AKAPs) ovat tärkeitä säätelijöitä solun tukirangan dynamiikkaa ja solujen vaeltamiseen. Niinpä pyrimme roolin tutkimiseksi PKA ja AKAP toiminto molemmissa EOC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Käyttämällä solukalvon ohjaama PKA bioanturin, pmAKAR3 ja parannettu muuttoliike /invaasiomääritys, osoitamme, että PKA aktivoituu kärjessä muuton SKOV-3 EOC soluja, ja että estäminen PKA aktiivisuuden lohkojen SKOV-3 solumigraation. Lisäksi osoitamme, että vaikka PKA toimintaa etureunan näiden solujen välittävät ankkurointiin tyypin II sääntelyyn PKA alayksiköstä (RII), esto ankkurointi joko RI tai RII PKA alayksikköjen estää solujen vaeltamiseen. Mikä tärkeintä, me osoittavat myös – ensimmäistä kertaa – että PKA toiminta on ajan säänneltävä etureunassa SKOV-3-solujen aikana hyökkäyksen kolmiulotteisen soluväliaineen ja katsottuna maahanmuuton estäminen joko PKA aktiivisuuden tai AKAP -välitteisen PKA ankkurointi lohkot matriisi hyökkäystä. Nämä tiedot ovat ensimmäinen osoittaa, että hyökkäys soluväliaineen syöpäsolujen saa aikaan aktivoinnin PKA sisällä invasiivisia etureuna ja että molemmat PKA aktiivisuuden ja ankkurointi tarvitaan matriisin hyökkäystä. Nämä havainnot viittaavat rooli PKA ja AKAP aktiivisuutta EOC etäpesäkkeitä.

Citation: McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) proteiinikinaasi A: Activity ja ankkurointi tarvitaan munasarjasyöpäsolu Migration ja Invasion. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10,1371 /journal.pone.0026552

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 28 syyskuu 2011; Julkaistu: 19 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 McKenzie et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustusta # R01GM074204 (ja AKH) National Institutes of Health /National Institute of General Medical Sciences (https://www.nigms.nih.gov) ja siitä tutkijatohtorin (SLC) päässä Vermont Cancer Center ja Champlainjärvi Cancer Research Organization (https://www.vermontcancer.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on viidenneksi yleisin syy syöpäkuolemista naisten Yhdysvalloissa ja on korkein kuolleisuus kaikista gynecologic syövistä [1]. Noin 80%: lla potilaista esiintyy myöhään taudin ja vähemmän kuin 25% näistä naisista paranee. EOC muodostaa valtaosa ( 90%) munasarjojen maligniteettien ja on ainutlaatuinen kliinisesti okkultismin levittämistä ja etäpesäkkeiden [2]. Toisin kuin useimmat muut tyyppisiä syöpä, levittäminen EOC verisuoniston läpi ja muodostumista todella distaalisen etäpesäkkeitä on harvinaista. EOC-solut irtoa primaarikasvaimen pinnalla munasarja ja kuorivat vatsaonteloon. Anatominen sijoittaminen munasarjat helpottaa paikallisen leviämisen EOC, mikä voi tapahtua suoraan muuttoliike ja invaasion syöpäsolujen ja viereisiin elimiin, kautta sekä kuljetukseen hilseillyttä kasvainsolujen koko vatsaonteloon normaalilla peritoneaalinestettä virtaus [2] , [3]. Koska tämä ainutlaatuinen ja furtive tila levittämistä, kehittämistä on menetelmiä varhaisen havaitsemisen EOC ovat pääosin hävinnyt [4], [5], [6]. Huolimatta sytoreduktiivisen leikkaus, yhdistelmä solunsalpaajahoitojen ja strategioita määrittämiseksi seerumista biomarkkereita, paikalliset ja levitetään solunsalpaajaresistentti solujen jatkuisivat ja mahdollisesti kukoistaa, johtaa korkea toistuminen ja 25% viiden vuoden eloonjäämisaste potilaalla on EOC [3], [5], [7], [8], [9]. Siten ymmärtää paremmin solu- ja molekyylitason mekanismit EOC levittäminen ja invaasio on mahdollisuus olla merkittävä vaikutus sairauden kulkuun.

Koska riippuvuus EOC levittämistä ja etäpesäkkeiden solu- muuttoliikettä ja invaasio , meidän laboratorio on pyrkinyt ymmärtämään mekanismeista näitä prosesseja EOC. Solumigraation on erittäin määräsi prosessi, joka vaatii koordinoidusti yhteistyössä lukuisten proteiinien erillisiä subsellulaarisia alueilla [10], [11], [12]. Olemme aiemmin osoittaneet, että cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin (PKA) on tärkeää, että solujen vaeltaminen ja etureuna dynamiikka on määrä soluja [13], [14], [15]. PKA on heterotetrameerisia kinaasi, joka voi esiintyä kaksi isoformia, tyypin I ja tyypin II riippuen isoformin sääntelyn (RI ja RII) alayksikkö liittyy holoentsyymin. PKA on lukuisia tavoitteita, jotka liittyvät actomyosin perustuu solujen liikkumista [16] ja varhainen tutkimukset osoittivat, että hyper-aktivointia tai estoa PKA esti kemotaktinen solujen vaeltamiseen [16], [17], [18]. Tämä näennäisesti ristiriitaiset PKA selkeytettiin osoitus siitä, että lisäksi yleistä toimintaa, lokalisointi PKA vuonna subcellular tilaan, joka välittyy sitomisesta PKA R alayksiköiden A kinaasi ankkurointiin proteiinit (AKAPs; [19], [20]) , säätelee solujen vaeltamiseen [13], [21], [22]. Erityisesti on osoitettu, että PKA alayksiköt ja toiminta ovat molemmat rikastettu protrusive rakenteissa kärjessä vaeltavia solujen [13], [21], [22]. Lisäksi laaja esto tyypin I ja tyypin II ankkurointi (

eli

ankkurointi kautta RI tai RII alayksiköiden) yleensä [13], [21], tai spesifinen esto yksittäisen ankkuroinnin proteiineihin (

esim

AKAP-Lbc; [22]), estää muuttoliike. Nämä ja muut raportit (tarkistetaan [23], [24]), vahvistaa, että on tärkeää paikallistamiseksi PKA aktiivisuuden selvä subsellulaariseen paikkoihin normaalin solun vaeltavia prosesseja.

korostaen mahdollista merkitystä PKA munasarjasyövän synnyssä ovat havainnot, että PKA aktiivisuuden ja alayksikköä ilmaisun usein väärin säädellystä in EOC. Expression of PKA katalyyttisen alayksikön [25] ja sääntelyn RI alayksikköä [26], [27], [28] korreloi pitkällä, ja /tai aggressiivisempaa EOC. Lisäksi mRNA tasot AKAP3 (

alias

AKAP110 tai kuitumainen tuppi proteiinia 90 kDa (FSP90)) ovarioiden positiivisesti korreloivat taudin vaiheessa ja huonon ennusteen [29], [30], kun taas kaksi muuta AKAPs – AKAP1 (

aka

AKAP149) ja AKAP13 (

aka

AKAP-Lbc) – näyttävät myös olevan säädellään ylöspäin mucinous EOC (A. Howe, julkaisemattomia havaintoja Oncomine). Huolimatta Näiden havaintojen toiminnallinen merkitys PKA ja AKAP signalointi metastaattisessa EOC soluissa ei ole hyvin tutkittu.

Kun otetaan huomioon PKA ja AKAP toiminto solujen vaeltamiseen ja niiden dysregulation in EOC, tutkimme spatiaalinen sääntely PKA aktiivisuuden siirtymiseen EOC soluissa ja määrätietoisesti, ovatko PKA aktiivisuuden ja ankkurointi tarvitaan EOC solujen vaeltamiseen. Täällä me raportoimme että PKA toiminta on säädelty vahvistavasti etureunassa EOC solujen paitsi muuton aikana vaan myös aikana soluväliaineen invaasion, samoin. Edelleen, esto PKA aktiivisuuden ja AKAP toimilohkot EOC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Nämä havainnot osoittavat, ensimmäistä kertaa, että on tärkeää PKA ankkurointia varten matriisi hyökkäyksen ja vahvistaa, kuinka tärkeää on paikallisesti säädeltyä PKA toimintaa maahanmuutto- ja hyökkäys – ja siten kenties etäpesäke – of EOC soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Cell Culture

SKOV-3 ja COS-7-solut saatiin American Type Culture Collection ja ylläpidetään antibiootti Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% (vol /tilavuus) naudan sikiön seerumia (FBS). HIO-80-solut olivat antelias lahja tri Andrew Godwin (Department of Molecular Oncology, Fox Chase Cancer Center), ja niitä ylläpidetään 01:01 seos antibiootti vapaan Medium 199: MCDB-105, jota oli täydennetty 4% FBS: ää ja 0,2 U /ml sian insuliinia. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. DMSO, sytokalasiini D ja trypaanisininen ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). GM6001 saatiin Millipore (Billercia, MA). Fenolipunaista matrigeeliä ja ihmisen fibronektiiniä hankittiin BD Biosciences (Bedford, MA). Farmakologinen esto PKA aktiivisuuden saavutettiin käyttämällä H89 tai mPKI (Biomol). H89 on isokinoloni joka kilpailee ATP sitoutumisesta PKA; huolimatta laaja käyttö ja huomattava teho, sillä on vain vaatimaton spesifisyys PKA [31]. mPKI, erittäin erityisiä PKA-inhibiittori, on Myristoylated, solun läpäisevä peptidin, joka käsittää inhibitorista pseudo-alustan alue (aminohapot 14-27) endogeenisen proteiinikinaasi A: n inhibiittori-proteiini (PKI) [14]. Farmakologinen esto PKA ankkurointia saavutettiin käyttämällä StHt31 (Promega), joka on stearated peptidi, joka sisältää PKA R-alayksikön sitovan domeenin Ht31 (

aka

AKAP-Lbc); Näin ollen, StHt31 toimii solun läpäisevä kilpaileva estäjä vuorovaikutusta endogeenisen AKAPs ja sekä RII, on jonkin verran suurempina pitoisuuksina, RI PKA alayksiköt [32], [33]. Genetic inhibiittorit PKA aktiivisuuden ja tyypin I tai tyypin II PKA ankkurointi on kuvattu alla.

Plasmidit ja transfektio

koodaavalla plasmidilla mCherry-fuusioitunut PKA-inhibiittorin proteiinin PKI (katso edellä ) on kuvattu aiemmin [14], kun taas plasmidit koodaavat GFP fuusioitiin tyypin I tai tyypin II ankkurointi estäjät (RI ankkurointiin häirintäaine (RIAD; [34]) ja superAKAP

in silico

(sAKAP

on

, [32], vastaavasti), samoin kuin niiden vastaava salattu (

scr

) negatiivisia kontrolleja, jotka on luotu käyttäen 5 ’fosforyloitu oligonukleotidien (Invitrogen) on lueteltu taulukossa S1. Erityisesti, täydentävä oligot olivat hehkutettu, tuottaa 5 ’

Sal

I ja 3′

BamHI

I tarttuvat päät, liitettiin sitten suoraan

Sal

I /

BamHI

I-pilkottu pEGFP-C1 (Clontech). mCherry versioita RIAD ja sAKAP

on

muodostettiin korvaamalla

Nhel

I-

BamHI

fragmentti, joka koodaa EGFP että vastaavat plasmidit

Nhel

I-

BamHI

-fragmentti pmCherry-C1. Transfektioon ja proteiinien lyhytaikaista ekspressiota varten, solut transfektoitiin käyttäen Fugene6 (Roche) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 6 ui Fugene6 lisättiin 100 ui seerumia ja antibioottia DMEM: ää, vorteksoitiin lyhyesti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 min. Yhteensä 1,5 ug DNA: ta lisättiin seokseen, vorteksoitiin lyhyesti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Sitten seos lisättiin tipoittain 35 mm: n astiaan, joka sisältää solujen välillä 80-90% konfluenssiin, annettiin seistä huoneenlämpötilassa 2-3 minuuttia, sitten takaisin inkubaattoriin. Kaikki kokeet tehtiin välillä 24-48 tuntia transfektion jälkeen.

Immunofluoresenssikoe

Visualisointiin aktiini, fibronektiinin, paksilliini ja PKA RIα ja RIIα alayksiköistä, solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydiin PBS 10 min, tehtiin läpäiseviksi 10 minuutin ajan PBS: ssä, joka sisälsi 0,25% triton x 100, estettiin PBS: llä, joka sisälsi 3% BSA: ta joko 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa tai yli yön 4 ° C: ssa inkuboitiin sitten anti-fibronektiinin (1:400, BD Transduction) , anti-paksilliini (1:500, BD Transduction), anti-PKA RIα tai RIIα (Genetex 1:200 ja BD Transduction 1:200 vastaavasti) ensisijaisen vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 3 x 5 min PBS: llä, soluja inkuboitiin Alexa-594 on kytketty aasin anti-hiiri-vasta-ainetta (Invitrogen, 1:400) ja Alexa-488 konjugoitu phalloidin (Invitrogen, 1:100) 1 tunnin ajan RT: ssä. Peitinlasit kiinnitettiin lasista mikroskooppiobjektilaseille (Fisher) käyttäen pientä tilavuutta Permafluor peittausainetta (Thermo Scientific). Epifluoresenssilla kuvat otettiin kiinni vaikka 10, 20, 40, ja 60X Plan Apo tavoitteita Nikon Eclipse TE-2000E käänteismikroskooppi käyttämällä asianmukaista fluoroforileimattuja erityisiä suodattimia (Chroma Technology Corp., Rockingham, VT) ja CoolSnap HQ kamera (Photometrics, Tucson , AZ) ohjataan elementit (Nikon) ohjelmisto.

haavanparantumis- migraatiokokeessa

lasipeitinlevyjä steriloitiin peräkkäisen liotus 30 min välein kasvavien pitoisuuksien (70, 95, 100%) EtOH: a. Peitinlasit poistettiin EtOH: lla ja kuivattiin ilmassa, että kudosviljelykaapissa. Kun kuivattu, steriili peitelasit päällystettiin 20 ug /ml ihmisen fibronektiiniä laimennettiin steriilissä PBS: ssä joko yli yön 4 ° C: ssa tai 2 tuntia 37 ° C: ssa. Yksisolukerroksena solujen ympättiin ECM konjugoitu peitinlaseille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Haava tehtiin yksikerroksista kaapimalla steriili P200 pipetin kärki poikki soluja, ja peitinlevyjä pestiin kerran steriilillä PBS poistamiseksi solu roskat. Kuvat otettiin käyttäen 10x Plan Apo tavoite Nikon Eclipse TE-2000E käänteismikroskooppi edellä kuvatulla tavalla.

trypaanisinieksluusiolla Pitoisuus

arvioimiseksi solujen elinkykyä, joka on 01:01 sekoitus trypaani sininen (0,4%, Sigma) ja seerumitonta alustaa, joka sisälsi 1% BSA: ta lisättiin soluihin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan heti joko poistamalla donitsin tai luomalla haava yksikerroksen. Kuvat on otettu kehän donitsin ja pitkin koko marginaali haavan käyttäen 10X Plan Apo tavoitteena Nikon Eclipse TE-2000E, kuten aiemmin on kuvattu.

valmistustekniikka silikonitiivisteillä

neljäkymmentä g Sylgard 184 silikonielastomeeriä (Ellsworth Adhesives) ja 4 g Sylgard 184 elastomeerin kovetin olivat tiukasti sekoitettiin kunnes samea ja kuplia. Samea seos kaadettiin steriiliin 10 cm: n kudosviljelymaljaa syvyyteen 2-4 mm korkea. Kuplat poistettiin asettamalla astia 850 ml desi-Vac säiliö (Fisher) ja evakuointi kammion 60 kertaa ja mahdollistaa kammion seistä 10 minuuttia. Tämä vaihe toistettiin kahdesti, tai kunnes seos oli vapaa kuplia. Silikoni Seoksen annettiin kovettua huoneen lämpötilassa 48 tuntia tai tunnissa 84 ° C: ssa kuumalla levyllä, kunnes täysin polymerisoitua. Silikoni templaatti poistettiin varovasti lautasen ja asetettiin puhtaalle kuivalle pinnalle voidaan leikata. Valmistaa donitsin muotoinen tiiviste, joka on 6 mm, biopsian avulla muodostettiin silikoni sylinteri, ja 2 mm, biopsian käytettiin tekemään pienempi reikä keskellä 6 mm sylinteriin. Silikoni ”donitseja” pestiin sitten Liquinox (laimennettu suhteessa 1:10 Nanopure vettä) 15 minuutin ajan, huuhdeltiin 10 kertaa Nanopure vedellä, pestiin 70% EtOH: ssa 15 minuuttia, sitten tallennetaan tuoretta 70% EtOH, kunnes sitä tarvitaan.

donitsi Migration /Invasion Pitoisuus

Steriilit lasipeitinlevyille päällystettiin 20 ug /ml fibronektiiniä, kuten edellä on kuvattu. Puhdas, steriili silikoni donitseja annettiin kuivua ennen kuin asetat päälle päällystetty peitelaseja. Muutos taittuminen on donitsin peitelevy käyttöliittymä voidaan nähdä donitsien tarttuu mukaan conformal yhteystiedot. Aliyhtyvät soluja seerumin puutteessa yönä ennen määritystä. Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen sopivaan seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi 1% BSA: ta ja laskettiin hemosytometrillä. Solut maljattiin yhtymäkohdassa (6000 solua /donitsi varten SKOV-3, COS-7, ja HIO-80) kanssa 10 ul: n tilavuudessa käyttäen steriiliä geeli-loading kärki keskelle donitsin muotoisen tiivisteen siten, että se sisältää ne sisällä suljetussa tilassa. Solujen lukumäärä muodostamiseen tarvitaan yksisolukerroksena riippuu ECM valittu halkaisija sisemmän hyvin donitsi, ja levittää kyky solujen, ja näin ollen sitä voidaan määrittää empiirisesti kullekin solulinjassa. Steriilissä PBS: ssä lisättiin noin tiivisteen haihtumisen estämiseksi pienen määrän media. Sen jälkeen kiinni yhdessä yössä, PBS imettiin, ja munkkeja poistettiin huolellisesti käyttäen steriilejä pihtejä. Tumat värjättiin käyttäen Hoescht 33342 tumaväriä (Invitrogen, 1:2000 media) 15 min ajan 37 ° C: ssa. Värjäytyminen media poistettiin ja korvattiin joko täydellinen media tai median sisältäviä farmakologisia aineita, kuten on kuvattu kuvassa legendoja. Invaasiolle määrityksiä Hoescht-värjättiin yksikerroksinen peitettiin fenolipunattomalla matrigeeliä ja inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, jotta polymeroinnin. Sulautettu Sitten solut täydennettiin täydellinen tai käsitellä mediaa kuten migraatiokokeessa. Initial kuvat hankittiin 2X PlanApo tavoite Nikon Eclipse TE-2000E käännettyä mikroskooppia, kuten edellä on kuvattu. Soluja joko käsiteltiin 10 ng /ml EGF tai korkea seerumin (10%) edistää muuttoliikettä. Lisäkuvia hankittiin jälkeen ilmoitettu ajat ja alku- ja lopputila kuvapareista analysoitiin käyttämällä oletusasetuksia mukautetun kirjallinen ImageJ makro (DonutQuant saatavana Text S1). Lyhyesti, makro keskukset ja kynnykset sekä alku- ja lopputila kuvia sitten poistaa pitkälle harha soluja,

eli

solujen ulkopuolella pyöreä yksisolukerroksia jotka ovat liian pitkälle johtua maahanmuuttoa (

esim

soluja jotka ovat löystyneet ja leijaili toiselta alueella lautasen). Maski on keskitetty, alustava kuva luodaan sitten ja päälle lopullinen tila kuva ja kaikki ytimet ulkopuolella rajan alkuperäisen kuvan maskin lasketaan siirretty soluihin.

FRET Imaging

SKOV-3-solut ilmentävät PKA aktiivisuuden bioanturin, pmAKAR3 [35], [36] huuhdeltiin ja ylläpidetään Leibovitz L-15 väliaineessa FRET kuvantamiseen. Solut kuvattiin Nikon Eclipse TE-2000E mikroskooppi 60 × /1,4 NA Plan Apo öljy-upotus objektiivilinssi ja jäähdytetään CCD-kamera. CFP, YFP ja FRET kuvat hankittiin 10 tunnin alkamisen jälkeen määrityksen. Yrityskauppa oli asetettu 700 ms altistuksen ja 2 x 2 binning kaikkien kolmen yritysostoja. Kuvat kunkin kanavan alistettiin taustan vähentäminen, ja suhteet keltainen-to-syaanin värin laskettiin FRET Analyzer ImageJ plugin. Pseudovärin kuvat muodostettiin käyttämällä ImageJ ”suhde” etsiä taulukosta. Kuvat olivat tausta vähennetty käyttämällä ”Vähennä tausta” ominaisuus ImageJ, jossa on liikkuva pallo säde 500.

Tulokset

PKA aktiivisuus lisääntyy kärjessä satunnaisesti siirtyvät SKOV-3 solut

Edellinen työ oli osoittanut erillisten aktivointi PKA muuttolintujen etureuna monien [13], [21], [22] mutta ei kaikki [37] solutyyppejä. Sen määrittämiseksi, PKA aktivoitui kärjessä muuttavia EOC solujen SKOV-3 ihmisen EOC solut transfektoitiin pmAKAR3, solukalvon suunnatun FRET Biosensori PKA aktiivisuuden [21], [36], sen jälkeen levitettiin FN-pinnoitettu lasipeitinlevyille, stimuloidaan 10 ng /ml EGF 4-6 tuntia (edistää satunnaisia, kemokineettiset muuttoliike), ja seurattiin elävien solujen kuvantamiseen. PKA aktiivisuuden (kuten kohonneet FRET tunnusluvut) oli todellakin huomaamattomasti ja dynaamisesti kohonnut sisällä etureuna siirtymässä SKOV-3-soluissa (kuvio 1 ja Movie S1). Tämä viittasi siihen, että paikalliset lisäykset PKA aktiivisuuden rooli säätelyssä etureunan dynamiikkaa, ja siten kulkeutumista aktiivisesti vaeltavat EOC soluja. Tämä hypoteesi tukivat aikaisin, valmisteleva kokeita, joissa SKOV-3-soluja kohteena haavan paranemista tai naarmu muuttoliikkeen määrityksissä puuttuessa tai läsnä laajalti käytetty estäjiä PKA aktiivisuuden (H89 ja mPKI, katso materiaalit ja menetelmät)) ja ankkurointi (StHt31, katso Materiaalit ja menetelmät). Tutkiminen solumorfologian pian alkamisen jälkeen näistä määrityksistä osoitti merkittäviä vaikutuksia näiden estäjien etureunan morfologia ja muuttoliike (kuva S1). Tarkemmin, käsittelemättömät solut muuttivat haavoittui alueille tehokkaasti ja laaja, ruffling lamellipodioihin (kuvio S1A ja D). Sitä vastoin solut, joissa PKA aktiivisuuden estyi ei-selektiivinen PKA estäjä H89 tai erittäin selektiivinen mPKI eivät muuttaneet tehokkaasti ja tuskin tuli haava tila, jolla etureuna rakenteita vailla röyhelöt mutta pullollaan paikallisessa tarttumisessa – muistelemalla liima, leviää fenotyyppi useampia maahanmuuton (Kuva S1B ja D). Solut, joissa PKA ankkurointi sekoitti StHt31 tuli haavan tilaa enemmän kuin H89- tai mPKI käsiteltyjä soluja, mutta toisin kuin kontrollisolut, näytteillä useita, epäsäännöllisesti rivinvälillä ruffling reunat solua kohden (kuvio S1C ja D). Yhdessä nämä tulokset edelleen tukevat oletusta, että EOC solujen vaeltamiseen saattavat edellyttää PKA aktiivisuuden ja ankkurointi sekä aiheen lisätutkimuksiin käyttämällä kehittyneempiä lähestymistapoja ja erityisiä reagensseja.

SKOV-3-solut transfektoitiin pmAKAR3, maljattiin fibronektiini-pinnoitettu astiat yössä, stimuloidaan 10 ng /ml EGF 4-6 tuntia, ja sitten kuvattiin FRETillä mikroskoopilla. Kuvat otettiin joka 30 sekuntia, sitten pseudocolored mukaan FRET suhde (väriskaala näkyy kehyksessä 0 ’): tämä montage kuvaa kehysten 2 min välein. Jotta koko sekvenssi, katso video S1. Asteikko bar = 5 mikrometriä.

EOC migraatiota säätelevät toimintaa ja ankkurointiin PKA

haavanparantumis- muuttoliike määrityksissä, kun taas edullinen ja helppo toteuttaa, kärsivät useista rajoituksista, ei vähiten, jotka ovat Hengenvaara soluihin pitkin määritys etu- ja poistamalla taustalla soluväliaineen (ECM). Siten kokeellinen tila, joka aiheuttaa tehotonta muuttoliikkeen tässä määrityksessä voidaan ottaa huomioon esimerkiksi ymmärtäväisesti sivullisten vahinkoa tai epäonnistuminen tuottaa

de novo

matriisi, johon siirtyä. Siksi edelleen ja paremmin tutkia vaatimus PKA aktiivisuuden ja ankkurointia nimenomaan EOC solujen vaeltamiseen kehitimme parannettu versio aikaisemmin kuvatun migraatiokokeessa [38], että helposti ja tarkasti mittaa liikkuvien solujen lukumäärä säteen tavalla alkaen määritelty pyöreä yksikerroksista (kuvio 2, katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja). Meidän määritys – loi ”donitsi määrityksessä”, kun donitsin muotoiset silikonitiivisteillä käytetään osoittamaan yksikerroksista – on luotettava, edullinen, helppo toteuttaa, jota sovelletaan lähes mitä tahansa solutyyppiä, ja skaalautuva saavuttaa suhteellisen korkea suoritusteho ja tilastollista merkittävyyttä käyttämällä pieni määrä soluja (~6000), verrattuna muihin vastaaviin ”release” määritykset (

esim

arpeutumisprosessit määritykset). Lisäksi toisin kuin haavan paranemista määrityksissä, lähestymistapamme merkittävästi vähentää sekä denuding ECM proteiinin kattaa siirtyminen pinta (kuva S2) ja kohtalokas vahinkoa solujen määrityksessä reuna (kuva S3). Lisätä hyödyllisyys ja helppous täytäntöönpanon määrityksen kehitimme ImageJ makro (DonutQuant ”; katso teksti S1) nopeasti ja automaattisesti määrällisesti muuttoliike. Lyhyesti, makro vähentää alustavan, ”aika = 0 ’kuva (ottaa heti donitsi poisto) myöhemmästä tai lopullisen kuvan ja laskee ytimet ulkopuolella’ aika = 0” alue (kuvio 2C ja D). Kokeissa, joissa käytettiin sytokalasiini D estää aktiinin dynamiikkaa (kuvio 2C ja D), samoin kuin mitomysiini C: solusyklin etenemisen (tietoja ei näytetty) ovat vahvistaneet, että määritys mittaa muuttoliikettä eikä ainoastaan ​​siirtymän yksikerroksista solunjakautumisen. Olemme käyttäneet tätä määrityksessä mittaamaan muuttoliikettä erilaisia ​​solutyyppejä (mukaan lukien CHO-K1, COS7, HIO-80, HUVEC, MCF7, MCF10A, MDA-MB-231, MDCK, NIH3T3, REF52 ja SKOV-3) vertailukelpoisia helposti ja vaikutus (A. McKenzie, S. Campbell, A. Howe, julkaisemattomia havaintoja).

(A) kaavamainen esitys donitsi migraatiokokeessa, jossa solut siirrostetaan konfluenssiin soluväliaineen -päällystettyihin lasipeitinlevyn sisällä donitsin muotoinen silikonitiiviste. Sen jälkeen, kun solut ovat vakaasti kiinnittynyt, tiiviste poistetaan, jolloin solut siirtää säteittäin. Kuvia Yksikerrospaketin ovat kiinni heti donitsi poiston ja milloin tahansa vaiheessa sen jälkeen, joka on sopiva sallimaan kulkeutumista tietyn solulinjan. Custom ImageJ makro käyttää alkuperäisen kuvan Vähentävässä maski määrittää kuinka monen solujen lopullinen kuva otettu lopussa määritystä. Tiedot annetaan Materiaalit ja menetelmät. (B) kuva viisi donitsi tiivisteitä yhteen 25 mm: n peitelasi; Tämä mahdollistaa helpon asennuksen rinnakkaisten määritysten lisätä läpäisyä ja tuottaa tilastollisesti merkittävää tietoa. (C) COS-7-soluissa olivat alaisia ​​donitsi migraatiokokeessa, kun läsnä on 2 uM sytokalasiini D (cytoD) tai DMSO: ta kuin ajoneuvon ohjaus. Edustavat kuvat otetaan alussa (0 h) ja lopussa (20 h) määrityksen sekä naamioitu (lopullinen miinus alkuperäisen) esittäviä kuvia siirtyi solujen on esitetty. (D) määrä on siirtynyt COS-7-soluissa laskettiin käyttäen ImageJ makro, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.E. Viiden munkkeja kohti peitelasi kolme erillistä peitinlasit käsittelyä kohti. (* = P 0,001).

Käyttäen tätä määritystä, tutkimme vaikutuksia estämällä PKA tai AKAP toiminnon EOC migraatiota transfektoimalla SKOV-3-soluja plasmideilla, jotka koodaavat fluoresoivat proteiinit (EGFP, mCherry ) fuusioitu peptidi-inhibiittorit PKA aktiivisuuden tai ankkuroituvat (katso materiaalit ja menetelmät). Erityisesti, käytimme fluoresoiva proteiini mCherry fuusioituna PKA-inhibiittorin proteiinin PKI (mCherry-PKI) inhiboida PKA toimintaa [14], ja EGFP fuusioitu RI ankkurointi Disruptor (RIAD) [34] ja superAKAP

on

(sAKAP

on

) [32] peptidit spesifisesti häiritä tyypin I ja tyypin II PKA ankkurointia, vastaavasti. Plasmideja, jotka koodaavat mCherry yksin tai EGFP fuusioitunut salattu RIAD tai sAKAP

on

sekvenssejä käytettiin negatiivisina kontrolleina. Nämä geneettisesti koodattu reagenssit sallivat hieno spesifisyys eston PKA aktiivisuuden [14] tai esto ankkurointi kautta sekä RI ja RII alayksikköjen [32], [34] samalla mahdollistaa havaitsemisen ja seurannan käsiteltyjen solujen kautta fluoresenssimikroskopian. Erotella tyypin I ja tyypin II ankkurointi on tarpeellista, kuten tyypin I ja tyypin II PKA aktiivisuutta voidaan säädellä erilliset signalointireitteihin [19], [20], ja vaikka molemmat PKA ovat sekaantuneet maahanmuuton muut järjestelmät [13], [21] – [23], [39], ei ole arvioitu yhteydessä munasarjasyöpä muuttoliikettä.

Kun transfektiosta solut altistettiin donitsi migraatiokokeessa ja sen jälkeen 24 tuntia, määrä transfektoituja soluja, jotka kulkeutuivat sekä kokonaismäärä transfektoitujen solujen määrä sekä siirtyneet (transfektoitujen ja ei-transfektoituja soluja) kvantitoitiin (kuvio 3). Hankinta näistä kolmesta numerosta sallii sellaisten maahanmuuton prosenttiosuus siirtynyt, transfektoitujen solujen päälle koko siirtynyt solujen ( ”MX /TM) tai ohjaamaan erot transfektion tehokkuuden välillä plasmidien prosenttiosuus siirtynyt, transfektoitujen solujen päälle kokonaismäärä transfektoitujen solujen ( ”MX /TX). Käyttämällä tätä menetelmää, SKOV-3 Migraatio vaimensi merkittävästi, kun joko PKA aktiivisuuden (kuvio 3A ja B) tai ankkuroituvat (kuvio 3C) estyi käyttäen geneettistä reagensseja on kuvattu edellä. Mielenkiintoista, muuttoliike estyi lähes yhtä rikkomalla ankkurointi joko RI tai RII alayksiköt (kuvio 3C), yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien perustamisesta, että sekä tyypin I ja tyypin II PKA ankkuroituvat migraatio muiden solutyyppien [13] , [21], [22], [39]. Yhteenvetona, nämä tiedot vahvistaa tarpeellisuutta PKA aktiivisuuden ja ankkurointia varten muuttoa EOC soluja.

(A) SKOV-3-soluja transfektoitiin joko tyhjiä mCherry plasmidiin tai mCherry-PKI, sitten sovelletaan donitsi maahanmuuttoa määrityksiä. Edustavia kynnysarvo kuvia siirtynyt solujen (Siirtyvät, jossa ytimet pseudocolored vihreä), koko väestöstä transfektoitujen solujen (Transfektoituja), ja päällekkäin nämä kaksi kuvaa näytetään. Sisäkkeet kuvaavat laajentumiset alueet merkitty neliöt alkuun paneelit. Siten koko siirtynyt solujen (TM) on kuvattu vihreällä, koko transfektoidut solut ( ”TX”) on kuvattu punaisella, ja keltainen ytimet kuvaavat transfektoituja soluja, jotka vaelsivat, eli siirtynyt ja transfektoidut solut (MX ’) . (B), jotka on transfektoitu joko tyhjiä mCherry (MCH) tai mCherry-PKI (PKI), keskimääräinen prosenttia (± S.E.) Siirretyn transfektoitujen solujen päälle kokonaismäärästä siirtynyt solujen ( ”MX /TM) laskettiin. Normalisoimaan transfektion tehokkuutta, keskimääräinen prosenttia (± S.E.) Siirretyn transfektoitujen solujen yli kokonaismäärä transfektoitujen solujen ( ”MX /TX) laskettiin myös. (* = P 0,05) (C) SKOV-3-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat EGFP fuusioitunut estäjiä tyypin I (RIAD) tai tyypin II (SAIS) PKA ankkurointi, tai niiden sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla (RIAD scr, Sais scr), sitten sovelletaan donitsi maahanmuuttoa määrityksiä ja analyysi kuvatulla (A ja B). (** = P 0,001)

Type-II PKA vastaa etureunan PKA aktiivisuuden muuton aikana

Koska PKA aktiivisuus rikastettu etureunan vaeltavia SKOV- 3 soluja ja että estäminen PKA aktiivisuuden ja ankkurointi kautta sekä RI ja RII kitukasvuinen muuttoliike, etsimme onko etureunan PKA aktiivisuuden välittämä joko tyypin I tai tyypin II ankkurointia. Arvioida vaikutuksen RI tai RII-AKAP ankkurointi häiriintymisen lokalisoinnin PKA aktiivisuuden aikana EOC muuttoliike, SKOV-3-solut kotransfektoitiin pmAKAR3 ja ilmentävien plasmidien geneettinen estäjiä tyypin I ja tyypin II R-alayksikön ankkurointi (RIAD ja sAKAP

on

, vastaavasti) fuusioitunut mCherry. MCherry fluoresenssispektrejä ei päällekkäin niiden kanssa joko YFP tai CFP ja siten mahdollistaa nämä fluoresoivasti leimattu ankkurointi haitta voidaan käyttää yhdessä FRET mikroskoopilla. Kun transfektoidut solut olivat kohteena donitsin migraatiokokeessa 10 tunnin kohdalla, jolloin kun solut kuvattiin kautta FRET mikroskopialla kuten edellä on kuvattu. Solut, jotka ilmentävät sekä ankkurointi disruptor ja PKA toimittaja transfektoidut plasmidit kuvaamisen ja CFP, YFP, FRET, ja mCherry kuvat hankittiin. Kvantifioimiseksi solujen prosenttiosuus, joilla etureunan PKA aktiivisuuden keskimääräinen FRET suhde kärjessä (FRET

LE; mitattuna 5-25 um edestä solun) mitattiin suhteessa FRET suhde sytoplasmassa (FRET

cyto; mitattuna 25-50 um edestä solun (kuvio 4E)). Suhde arvot binned osaksi korkea (FRET

LE /FRET

cyto ≥1.5), kohtalainen (FRET

LE /FRET

cyto välillä 1,2 ja 1,5), eikä (FRET

LE /FRET

cyto 1,2) etureunan PKA aktiivisuuden.