Krooninen sairaus

tiivistelmä

Somaattiset transposonimutageneesi hiirillä on tehokas strategia tutkia geneettisiä mekanismeja kasvaimen. Tunnistaminen kasvaimen ajo transposonin insertion perinteisesti vaatii sukupolven suuri kasvain ikäluokkien saada tietoa yhteisistä insertiokohtia. Kasvain ajo lisäykset on ominaista niiden kloonilaajenemisen kasvainkudoksessa, ilmiö, joka helpottaa hitaasti ja kehittyvä muutosprosessia transposonimutageneesi. Kuvaamme tässä parannettua lähestymistapaa havaitsemiseksi kasvaimen ajo lisäyksiä että arvioidaan kloonilaajenemisen lisäyksiä mittaamalla suhteellinen osuus järjestyksessä lukee saatujen yksittäisten kasvaimia. Tätä varten olemme kehittäneet protokolla asetettavaksi sivuston sekvensointiin, joka hyödyntää akustista leikkaus kasvaimen DNA ja Illumina sekvensointi. Analysoimme erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia syntyy PiggyBac mutageneesillä ja kunkin kasvaimen 10

6 lukee vastaa 10

4 sisäänpanokohdat saatiin. Kussakin kasvain, 9-25 lisäyksiä erottuivat niiden rikastettua järjestyksessä lukea taajuuksia verrattuna taajuuksia saadaan hännän DNA valvontaa. Nämä rikastettu lisäykset ovat mahdollisia kloonaamalla laajentunut kasvain ajo lisäykset, ja näin tunnistaa ehdokas syöpä geenit. Ehdokas syöpä geenit Tutkimuksemme käsitti monia perustettu syöpä geenejä, mutta myös uusia kandidaattigeenit kuten Mastermind-like1 (

Mamld1

) ja Diacylglycerolkinase delta (

Dgkd

). Osoitamme, että kloonilaajenemisen analyysi suurikapasiteettisten sekvensointi on vankka lähestymistapa tunnistamiseksi ehdokas syövän geenien insertiomutageneesiin näytöt yksittäisiin kasvaimia.

Citation: Friedel RH, Friedel CC, Bonfert T, Shi R, Rad R, Soriano P (2013) kloonilaajenemisen analyysi Transposoninen liitännäisiä suuren tuotantotehon Sequencing Tunnistaa Candidate Syöpä Geenit on PiggyBac mutageneesi Screen. PLoS ONE 8 (8): e72338. doi: 10,1371 /journal.pone.0072338

Toimittaja: Andrew C. Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2013 Hyväksytty: 08 heinäkuu 2013; Julkaistu: 05 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Friedel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan HD24875 National Institute of Child Health and Human Development PS, jonka kehittämiseen varoja Tisch Cancer Institute, Mount Sinai School of Medicine, RF ja P.S. sekä DFG avustus FR2938 /1-1 C.F. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

somaattinen mutageneesi DNA transposoneja hiirillä tutkii taustalla genetiikka kasvaimen. Transposoneja kätkeminen geeni-aktivoivia tai geenin sitovan kasetteja voi aktivoida onkogeenejä tai häiritä tuumorisuppressorien, ohjaten näin kasvaimen kasvu [1]. Lisäksi niiden rooli löytämässä uusia syövän geenien transposonimutageneesi helpottaa myös tarkempia tutkimuksia geneettisiä ja solumekanismeja tumorigeneesin hyödyntämällä herkistävän tausta mutaatiot ja solutyyppispesifiselle transposonin aktivointi [2]. Kaksi transposonin järjestelmiä on menestyksekkäästi käytetty syövän näyttöihin hiirellä: Ruususen [2-4] ja PiggyBac [5,6]. Transposonin insertion -alueet määritetään sekvensoimalla risteyksessä fragmentteja transposonin päät ja reunustavan genomisen DNA. Kasvain ajo ehdokas syöpä geenit identifioidaan sitten yhteinen pistokohtaan (CIS) analyysi, prosessi kartoitus insertiot useita kasvaimia ja analyysi geenien, jotka ovat yleisesti osuma itsenäisissä näytteissä. CIS-analyysi on osoittautunut onnistuneeksi lähestymistapa tunnistamiseen kandidaattigeenejä, se vaatii kuitenkin huomattava määrä kasvaimen näytteistä (50-100 useimmissa tutkimuksissa), ja se tarjoaa hyvin vähän tietoa mutaatio malleja yksittäisten kasvaimia.

tärkeä ominaisuus transformaation transposoneista on jatkuva liikkeelle ja ulos insertiokohtia. Tämä mekanismi helpottaa positiivisen valinnan ja kloonilaajenemisen kasvaimeen ajo insertiot aikana kasvaimen kehittymistä ajan neutraali matkustaja lisäyksiä. Kloonilaajenemisen transposoni insertioita voidaan arvioida analysoimalla suhteelliset osuudet sekvenssin lukee saatu insertioita yksittäisten kasvaimia. Kuitenkin edellinen transposoni kasvain näytöt eivät ole käyttäneet kloonilaajenemisen analyysi, todennäköisesti rajoitusten takia määrän sekvenssin lukee saatu 454 pyrosekvensointi lähestymistapaa käytetään näissä tutkimuksissa. Lisäksi Vakioprotokollien kasvaimen DNA: n valmistus liittyy pirstoutumista restriktiopilkkeiden, joka esittelee harhat varten insertiot edustaa lyhyemmät restriktiofragmentit, jotka tehokkaammin monistetaan PCR: llä [7]. Vaihtoehtoinen lähestymistapa DNA pirstoutuminen, akustinen leikkaamista, voi merkittävästi vähentää PCR harhojen, koska jokainen insertiokohtaa edustaa joukko fragmenttien vastaavien pituus alue [8].

Jotta saadaan parannettu kvantitatiivinen edustus sisäänpanokohdat niiden järjestyksessä lukea numeroita, yhdistimme kaksi teknistä kehitysten viimeaikaiset raportit – Illumina sekvensointi saamiseksi 10

6 lukee näytettä kohti [7], ja akustinen leikkaus vähentää PCR harhat [7,8] – ja kehitetään protokolla tehokkaan suurikapasiteettisten sekvensointi transposonin lisäyksiä. Haimme myös protokolla analysointiin yhdentoista erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, että olimme tuottama mutageneesin kanssa PiggyBac transposonin array ATP1-S2 [5]. Jokaisen lisäyksen kuhunkin kasvaimeen, laskimme sukulainen lukea taajuus, jonka avulla voimme tunnistaa välillä 9-25 lisäykset per kasvain edustavat kloonaamalla laajentunut kasvain ajo lisäyksiä. Niistä geenit mutatoitiin kloonaamalla laajentunut lisäyksiä oli lukuisia perustettu syöpä geenit, ja myös useita uusia ehdokas syöpää geenejä.

Osoitamme tässä, että suurikapasiteettisten sekvensointi insertiokohdan kirjastojen yksilöi kloonaamalla laajeni mutaatioita yksittäisissä kasvaimia. Tämä lähestymistapa parantaa merkittävästi laatua ehdokas syövän geeni ennusteita insertiomutageneesin näyttöjä, ja se helpottaa tunnistamista verkostojen yhteistyötä mutaatioiden yksittäisten kasvainten.

Tulokset

PiggyBac transposonimutageneesi

transposonimutageneesi seulonta suoritettiin hiirillä, jotka kantavat läsnä kaikissa PiggyBac transposaasi (ROSA26-PBase) ja siirtogeeninen PiggyBac transposoni array (ATP1-S2) [5]. ATP1-S2 array sisältää 20 kappaletta transposonin ATP1, joka on varustettu liitos vastaanottajia varten pyydystämiseen kasvainten synnyssä ja CAG-promoottorin aktivaation onkogeenien. Nämä elementit mahdollistavat ATP1 aiheuttaa kiinteitä kasvaimia upon osaksi [5]. Me kasvatetaan testi kohortin 27 hiiriä, jotka toteutetaan ROSA26-PBase ja ATP1-S2, ja valvonta kohortin 27 hiirten ATP1-S2 yksin. Ikäluokat olivat vuotiaita, ja vaikka ei havaittu kasvaimia ei havaittu kontrolliryhmässä kohortissa, havaitsimme 11 makroskooppinen kasvaimia joukossa 8 hiiret testissä kohortti välillä 59-85 viikkoa (kuvio 1A). Kolme kuljetettavien eläinten kasvaimia kaksi riippumatonta sivustoja, ja yhdessä tapauksessa, geneettinen analyysi sisäänpanokohdat osoitti, että molemmat kasvaimet yhteinen alkuperä (katso jäljempänä), kun taas kaikki muut kasvaimet ilmeisesti syntyi itsenäisesti. Kasvaintyypeille käsitti okasolusyöpää ihon, kiinteä kasvain keuhkojen ja suoliston, ja follikulaarinen lymfooma perna. Pitoisuus kasvainsolujen leikeltiin näytteissä vaihteli 30-100%, arvioituna histopatologista analyysiä hematoksyliinillä ja eosiini värjätään kohdat (kuva S1). Me eristetty DNA analysoida transposonin sisäänpanokohdat kaikista 11 kasvaimista. Kontrolloimiseksi satunnainen insertioita PiggyBac ei-syöpäkudoksen, me eristää myös DNA 6 hännänpää kasvaimen omaavien hiirten.

A) Kaplan-Meier selviytymisen juoni kohortteja kuljettaa joko PiggyBac array yksinään (ATP1-S2 ) tai PiggyBac array ja konstitutiivista transposaasia (ATP1-S2, R26-PBase). Punaiset nuolet osoittavat kasvaimen esiintyminen. Asteikkomerkkejä tarkoittavat sensuroitu eläimiä (ei kasvain havaittu aikaan uhri).

B) rinnastukset Illumina genomisen sekvenssin lukee päättyy asemissa tuottaman akustisen leikkaus. PB3 /PB5, PiggyBac 3 ’/5’ terminaalinen toisto; SA, akseptorisilmukointikohtien; P, CAG promoottori.

C) Esimerkki kartoitettu järjestyksessä lukee varten PB3 ja PB5 puolille PiggyBac lisäys katsottuna UCSC genomin selain. Huomaa, että akustinen leikkaus aiheuttaa satunnainen DNA taitepisteissä, johon Splinkerette liitetään ligaatiolla, mikä johtaa portaiden kaltainen malli sekvenssirinnastukset. Jatkuva pää linjauksia oikealle ja vasemmalle johtuvat muuttumaton sekvenssi lukea pituus Illumina järjestelmän.

D) kvantitatiivinen yleiskuva järjestyksessä lukee, kartoitettu lukee, ja ainutlaatuinen insertiokohdat hännän ja kasvaimen näytteitä.

Suurikapasiteettinen sekvensointi transposonin lisäyksiä

Hyödynsimme Illumina suurikapasiteettisten sekvensointi kattavien lukea kattavuus transposoni lisäyksiä yksittäisten kasvain näytteissä. Useimmissa edellinen transposonimutageneesilla näytöt, kasvaimen DNA pilkottiin restriktioentsyymeillä, jotka tuottavat fragmentteja vakio koko yksittäisten insertioita. Koska PCR monistaa lyhyempiä fragmentteja tehokkaammin kuin pidempään fragmentteja, bias tuodaan aikana myöhemmin PCR vahvistusta insertiot, joita edustaa lyhyt restriktiofragmentit [7,8]. Jotta saataisiin enemmän suhteellinen edustus lisäyksiä, me hajanainen kasvain DNA akustinen leikkaus hienoksi 200-400 bp koko (katso Menetelmät S1 yksityiskohtainen protokolla). Siten lisäykset edustavat fragmentti allasta samanlaisia ​​kokoluokassa. Leikkauslujuus seurasi DNA loppuun korjaus, A-pyrstön 3′-päistä, ja ligatoimalla Splinkerette sovittimien 3′-T-uloke (kuva S2). Erillisissä reaktioissa risteys fragmentteja 3 ’ja 5’ päät PiggyBac transposoni (PB3 ja PB5) monistettiin sitten kahden peräkkäisen PCR-kierrosta tuottaa PB3 ja PB5 kirjastot kullekin näytteelle. PCR-alukkeet sisälsivät päätesovittimen sekvenssit Illumina kiinteän faasin monistaminen ja sekvensointi ja 6-base viivakoodi erottaa näytteitä multiplex sekvensointi. Valmistimme kaksi altaat PB3 ja PB5 kirjastot, ja kukin allas sekvensoitiin yhdellä kaistalla olevan Illumina HiSeq2000 laitteen 100 emästä lukea pituus. Sequence lukee oli demultipleksoidaan niiden viivakoodi ja kartoitettu hiiren genomiin käyttäen Rusetti algoritmi [9].

Tasaus sekvenssin lukee UCSC genomissa selain vahvisti puolueeton luonnetta DNA pirstoutumista akustisella leikkaus. Satunnaisen jakautuminen DNA taitepisteissä aiheutti järjestyksessä lukee transposonin insertioita yhdenmukaistaa in portaiden kuviona ympäri Keski TTAA sekvenssin PiggyBac paikoilleen (kuvio 1 B, C). Kunkin näytteen, saimme keskimäärin ~ 5×10

6 viivakoodilla lukee, joilla on samanlaiset numerot kasvaimia ja hännän valvonta (kuvio 1D, taulukko S1).

Noin 19,3% ja lukee kasvainnäytteestä voisi kartoitetaan hiiren genomiin. Hännän näytteitä, 15,3% ja lukee voitiin kartoittaa. Nämä lukee edustavat uusia lisäyksiä on ATP1 transposonin ulkopuolella sen luovuttajan array. Tämä kohtalaisen suuri osa siirrettävissä kartalle lukee johtui pääasiassa korkea osa lukee kyseisen sisälsi plasmidin sekvenssi, joka reunustaa unmobilized transposoneja klo luovuttajan array ja siten ei voida sijoittaa. Määrittää osa ATP1 transposoneja, jotka jäävät ATP1-S2 luovuttajan array, teimme Southern blot -analyysi hännät ROSA26-PBase; ATP1-S2 hiiriä ja havaittiin, että noin 40% ATP1-S2 transposoneja ei liikkeelle jonosta (kuva S3). Tämä epätäydellinen mobilisointi ATP1 voi johtua erityinen in vivo chromatin tilan ATP1-S2 array. DNA-metylaation CpG-sivustot voivat inhiboivan PiggyBac osaksi [10], olemme analysoineet metylaatiostatuksen ATP1-S2 Southern blot, jossa metylaatioherkän restriktiopilkkomisen. CpG metylaatio ATP1-S2 array havaittiin, tarjoaa mahdollisen selityksen kohtalainen täytäntöönpanoaste (kuva S3). Ylimääräinen tekijä, joka vähentää uusien transposonin insertion on menetys transposonien aikana osaksi (ts poiston seuraamatta sopeuttaminen), ja aiemman tutkimuksen mukaan noin puolet kaikista ATP1 transposonin kopiot on menetetty osaksi toimintaa [5]. Huolimatta kohtalainen osa siirrettävissä kartalle järjestyksessä lukee, meidän suurikapasiteettisten sekvensointi protokolla pystyimme toipua merkittävä määrä lukee varten päämäärien tutkimuksesta ~ 1×10

6 lukee kartoitettu keskimäärin kasvainnäytteestä ja ~ 0.7×10

6 lukee hännän valvontaa (kuvio 1 D).

yksipuolinen ja kaksipuolinen lukea kattavuus lisäyksiä

Kaikkiaan löydettiin 4210 uusi sisäänpanokohdat kasvaimen ja hännän näytteet yhdistettiin että tuettiin by lukea kuvaukset molemmin puolin PiggyBac transposonin insertion (PB3 ja PB5). Useimmat lisäykset kuitenkin tunnistettiin kartoitettiin lukee vain yhdellä puolella transposoni (314970 insertiot kanssa lukee vain PB3 tai PB5 puolella). Mielenkiintoista on, että suurin osa insertioita tutkimuksessamme, erityisesti ne, joilla on lukee kartoitettu vain yksi puoli transposonin, edustivat pieni lukea numerot (kuvio S4). Samanlainen havainto siitä, että suuri osuus harvinaisten lisäyksiä on tehty jossakin Sleeping Beauty tutkimus [7]. On mahdollista, että nämä harvinaiset lisäykset paeta havaitsemista molemmille puolille transposonin johtuen niiden vähäisessä määrin, jolloin suuri osa lisäyksiä peitetty toiselta puolelta. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu useita lisäyksiä korkean lukea numerot, jotka kuuluivat vain toisella puolella (kuva S4). Mahdolliset syyt yksipuolinen lukea kattavuus näissä tapauksissa sisältää toistensa vieressä toistuvia tai alhainen monimutkaisuus DNA venyy jotka estävät kartoitus, tai pieni DNA uudelleenjärjestelyt (poistot, käännellen) aiheuttama transposonin insertion. Kattava analyysi, me mukana meidän opinto kaikissa sisäänpanokohdat yhdistyvät insertiokohdat yksipuolista ja kaksipuolisella järjestyksessä lukea kattavuus, mikä johti ~ 2×10

4 ainutlaatuinen transposonin insertion keskimäärin per näyte (kuvio 1 D).

PiggyBac mutates genomin tasaisesti

tiedot kromosomi jakamisesta ATP1 lisäyksiä paljasti, että ATP1 PiggyBac transposonin mutates kromosomia tasaisesti suhteessa niiden TTAA sisältöä, sekä kasvaimissa ja hännät (kuvio 2A) . Tämä kuvio on yhtäpitävä aikaisempien raportoimien tietojen lisääminen mallia liittyvien ATP2 transposoni [5]. Poikkeuksena suhteellinen jakautuminen lisäysten oli proksimaalinen pää kromosomin 10, joka suhtautuu ATP1-S2 luovuttajan array. Tässä me havaittu rikastuminen insertioita alueella ~ 2 Mb proksimaaliseen päähän kromosomin 10 (kuvio 2B). Tämä harha on todennäköisesti aiheuttanut paikallisen hopping vaikutus PiggyBac transposonin läheisyydessä luovuttajan array, ja lisäykset tällä alalla jätettiin tämän vuoksi pois tarkempaa analyysiä.

A) suhteellinen jakautuminen PiggyBac insertiokohtia yli kromosomeissa verrattuna osuus TTAA sivustoja kromosomeja. Huomaa yliedustus kromosomin 10, joka kuljettaa transposoni luovuttaja array. Kromosomi Y, joka koostuu pääasiassa erittäin toistuvia elementtejä, oli lievästi parempana PiggyBac insertioita.

B) Paikallinen hyppiminen vaikutus kromosomissa 10. Histogrammi lisäysvaimennuksen tiheys kromosomissa 10 havaita positiivista bias insertiot at proksimaaliseen päähän (nuolet), jossa ATP1-S2 luovuttajan array sijaitsee.

C) jakautuminen PiggyBac insertioita genomialuetta Promoottori (10 kb ylävirtaan TSS), eksonit, intronit, ja geenien välinen alueilla.

Vertasimme myös jakeluun insertiokohtien geeni- alueilla (promoottori, eksoni, introni) ja geenien välinen alueilla. Kaiken kaikkiaan sekä hännän ja kasvain näytteet osoittivat jakauma lisäyksiä, jotka muistuttivat keskimääräinen osuus geenialueisiin hiiren genomissa, vaikka PiggyBac insertioita havaittiin jonkin verran suurempi kuin odotettua luvut intergeenisessä alueilla (kuvio 2C).

kloonilaajenemisen transposonin lisäyksiä

analyysi transposonin lisäyksiä, ei havaittu merkittäviä eroja lisääminen malleja PiggyBac transposonien kasvaimen ja hännän näytteitä kannalta kromosomissa jakelun ja geenialuetta. Me seuraavaksi analysoinut määrälliset erot sekvenssin lukee numerot insertioita yksittäisten näytteiden. Oletuksena on, että kloonaamalla laajennettu insertiot ovat läsnä useimmissa solujen näyte ja tulisi edustaa korkeammat lukea numerot kuin neutraaleja insertiot, jotka ovat läsnä vain pienemmän osa näytteestä.

Sopeuttamiseksi vaihtelut järjestyksessä lukea kattavuutta eri näytteiden, ensin syntyy suhteellinen luku taajuuksia normalisoimalla PB3 ja PB5 puoli lukea numerot kokonaismäärästä lukee kunkin näytteen kirjasto. Kuten PB3 ja PB5 lukea taajuudet olivat peräisin itsenäisesti valmistettu PCR kirjastot, täydellinen korrelaatio PB3 ja PB5 lukea taajuuksia ei voida odottaa. Siitä huolimatta, havaitsimme vahvaa korrelaatiota PB3 ja PB5 lukea taajuuksia PiggyBac insertiot (kuva S5). Yhdistää tiedot luku- taajuuksien PB3 ja PB5 kyljistä insertion, me sitten lasketaan kullekin lisäys keskimääräistä luku- taajuuden sen PB3 ja PB5 lukea taajuuksia. Sillä insertiot että edustivat lukee vain yhdeltä puolelta, keskimääräinen tiheys on yhtä suuri kuin 0,5 vastaavien yksipuolinen taajuus.

vertaileva analyysi luku- frekvenssijakaumat kasvaimen ja hännän näytteet, me piirretään keskimääräinen luku- taajuudet kaikista sisäänpanokohdat in rasiakuvaajan kaavio (kuva 3). Tämä kaavio paljasti, että yli 99% lisäyksiä kasvaimissa ja hännät edustivat pieni osa kuuluu luku- taajuuksilla alle 0,1%. Mielenkiintoista kyllä, kun olemme keskittyneet päällä harha kunkin näytteen, havaitsimme, että kasvain näytteet sisälsivät pienen määrän harha rikastettua lukea taajuudet, jotka olivat selvästi korkeampia kuin vahvin harha hännän näytteitä. Nämä korkean taajuuden lisäykset ovat todennäköisesti kloonaamalla laajennettu insertiot, jotka on valita positiivisesti kasvaimen kasvun aikana.

Box tontin keskimääräinen luku- taajuuksien transposoni lisäyksiä kasvaimissa ja hännän valvontaa. Dots näyttää top 1% lisäyksiä kunkin näytteen, paremmuusjärjestykseen keskimääräinen luku taajuuksilla. Pystyviiva ilmaisee jakautuminen 2-25% prosenttipiste ryhmä, ja laatikot osoittavat jakautuminen alemman 75% lisäyksiä. Kynnys harha (siroteltu vaakasuora viiva) laskettiin keskiarvo lukea taajuudet top 10 lisäykset kunkin hännän näytteestä.

Koska tehokas tilastollinen menetelmä erottaa tosi harha satunnaisesti rikastettu lisäyksiä päätimme määritellä kloonilaajenemisen jonka kynnyksen menetelmällä. Hyödynsimme hännän valvontaa kuin viittaus jakeluun luetun taajuuksien ei-kasvainkudoksessa, ja laskettu kynnys arvojen havaitsemiseen keskiarvoistamalla 60 korkeimmat taajuudet hännän kontrollinäytteiden (top 10 taajuudet kunkin hännän näytettä). Tämä johti kynnys 0,37% meidän aineisto. Havaitsimme välillä 9-25 lisäyksiä kunkin kasvaimen näytteen yli kynnyksen, mutta vain 2-6 insertioita hännän näytteistä (Taulukko S2).

edelleen kuulustelivat toistettavuus ranking sisäänpanokohdat mukaan lukea taajuus sarjassa kontrolli kokeita. Ensin kysytään pistokohtaan laajeneminen vaihtelisi eri puolilla yksittäisen kasvaimen massa (kuva S6). Vertaamalla lukea taajuudet mikropaloitelluista näytteitä yhden kasvainmassoja havaitsimme täydellinen päällekkäisyys kaikkein korkeasti rikastetun lisäyksiä näytteiden välillä ja ottelun enemmän kuin 50% lisäyksiä yli kynnyksen yleistä.

sitten selvittää, jos laajennettu insertiot kasvaimet voivat olla läsnä jo laajennetun insertioita syöpää edeltävän kudoksessa, josta kasvain ilmenee. Tätä tarkoitusta varten olemme verrattuna transposoni insertiot geenien keuhkojen kasvain insertiot vierekkäisten normaalissa keuhkokudoksessa (kuvio S7). Kaikkein korkeasti rikastetun kasvain lisäykset eivät olleet läsnä normaalissa kudoksessa, joissa vahvistetaan lähestymistapamme tunnistaa ehdokas syövän geenien. Kuitenkin 2 ulos 6 laajennettu geenin insertiot kasvain havaittiin myös samalla tasolla normaalissa keuhkokudoksessa, mikä osoittaa, että jotkut kloonaamalla laajennettu insertioita kasvaimet voivat olla peräisin syöpää edeltävän klonaalisia insertioita.

Lopuksi, kysyimme elimiä veisi korkeamman taustan määrä laajeni ennalta syöpä insertiot kuin hännän kudoksen, kuten elimet ovat tyypillisesti yhtenäisempi koostumus solutyyppejä kuin heterogeeninen häntää (kuvio S7). Todellakin, huomasimme, että DNA elimet voivat joissakin tapauksissa olla enemmän laajennettu lisäyksiä kuin hännän kudoksen. Määrä laajeni lisäyksiä vaihteli 3-23 elimissä, joissa on keskimäärin 11 laajennetun lisäyksiä näytettä kohti. Koska kasvain näytteitä meidän kohortin kuljetti keskimäärin 16,4 laajennettu insertioita, arvioimme, että keskimäärin 66% (11 /16,4) laajennettujen insertioita kasvaimissa voi heijastaa laajentunut ennalta syöpä insertiot. Näiden pohjalta ohjaus kokeita, voimme päätellä, että kloonilaajenemisen analyysi on riittävä menetelmää tunnistaa ehdokas syövän geenien yksittäisten kasvaimia. Kuitenkin yksi tärkeä ehto on, läsnäolo laajennetun ennalta syövän insertiot kasvainkudoksessa, ja määrä näitä lisäyksiä voi vaihdella suuresti näytteiden välillä riippuen kasvaimen tyypistä ja isännän kudokseen.

joukossa kloonaamalla laajeni insertioita kasvaimissa, 56,9% havaittiin geenialueisiin (promoottorit, eksonit ja intronit), -A merkitsevästi suurempi kuin kaikkien PiggyBac insertioita kasvaimet (33,4%; katso kuvio 2C) -, ja 43,1% löytyi intergeenisessä alueilla. Kloonaamalla laajeni insertiot intergeenisessä alueet voivat käyttää pitkän kantaman cis-vaikutuksia naapurimaiden geenejä. Koska nykyiset tietokannat eivät sisällä tietoja kasvaimia synnyttävän roolista intergeeniset alueiden rajoitimme meidän edelleen analyysi transposonin lisäyksiä geeni- alueilla.

Clonal laajennuksia tunnistaa ehdokas syövän geenien

kloonilaajenemisen analyysi transposonin lisäyksiä geeni- alueilla tunnistettiin 88 ainutlaatuinen geenejä, jotka edustavat mahdollisten ehdokasmaiden syövän geenien (kuvio 4A). Suostumuksella tämä ennustus, havaitsimme useiden geenien keskuudessa kandidaattigeenejä jotka ovat osallisina syövässä. Esimerkiksi yhdeksän meidän ehdokas syöpä geenit sisältyvät myös Cancer Gene Census lista, joka käsittää 487 geenit olekaan yhteydessä syöpään [11], joka edustaa erittäin merkittävä rikastus (

Abl2

,

Braf

,

Fbxw7

,

Foxp1

,

Ipo11

,

Mllt3

,

Fas

,

PTEN

ja

NF1

; p 0,0002, Fisherin tarkka testi).

A) kloonaamalla laajeni geeni insertioita tuumorinäytteissä, lajiteltu niiden keskimääräinen luku taajuuksilla (

f

) . Kolme hiiristä kanna kaksi kasvaimia kukin (kasvain 01 ja 08, kasvain 05 ja 09, ja kasvaimen 04 ja 10, tässä järjestyksessä). Sininen tähti tarkoittaa geenejä läsnä Cancer Gene Census lista, luettelo 487 geenien kausaalisesti osallisena syövässä.

Mamdl1

ja

Dgkd

joutuivat riippumattomissa Tuumorinäytteissä ja on korostettu punaisella ja vaaleanpunainen, vastaavasti.

B) Cellular prosessit vaikuttavat kloonaamalla laajentunut geeni lisäyksiä. Prosessiluokkien koottiin funktionaalinen geeni tietojen www.omim.org ja www.informatics.jax.org.

Tutkimuksessamme kolme kohortin eläimet suorittaa kaksi kasvaimia kukin (kuva S1). Kiinnostavaa kyllä, kaksi paria kasvaimia ei havaittu päällekkäisyyttä ehdokas syövän geenien (kasvaimia 01 ja 08, kasvaimien 04 ja 10), mikä osoittaa, riippumaton alkuperä kasvaimia. Sen sijaan kasvaimen 05 (kiinteä syöpäkasvain maksassa) ja 09 (follikulaarinen lymfooma) yhteinen 5 ehdokas syöpä geenit, mikä osoittaa yhteinen alkuperä. Koska maksa on yhteinen sivusto hyökkäyksen varten lymfaattinen leukemia [12], on mahdollista, että maksakasvain 09 on metastaattinen kasvain massa, joka on johdettu pernan lymfosyyttinen kasvain 05. On huomioitava, että 5 jaetut ehdokas syövän geenien kasvaimia 05 ja 09 (

PTEN, Fas, Esr1, Abl2, Lrp1b

) on itsenäisesti saatu molemmissa kasvaimissa samanlaisia ​​keskimääräinen luku- taajuuksia, mikä vahvistaa luotettavuutta sekvensointialustamme menetelmää tunnistaa kloonilaajenemisen lisäyksiä.

Tarkasteltaessa kandidaattigeenit merkittävää rikastumista toimintakategorioihin käyttäen DAVID bioinformatiikan resurssi (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [13], löysimme merkittävä rikastuminen proteiinikinaasi liittyvät luokat ja reitit (esim Kegg : MAPK -signalointireitistä, p 0,016; Interpro: proteiinikinaasin, ydin, p 0,016; Benjamini-Hochberg korjattu P-arvo; taulukko S3). Samoin kun manuaalisesti ryhmitelty kandidaattigeenit niiden tunnetun soluprosessiominaisuuksia, huomasimme, että geenit osallistuvat signaalin siirtoon edusti suurimman ryhmän geenien (kuvio 4B). Muut näkyvä soluprosesseissa kandidaattigeenien olivat apoptoosin, kromatiinin remodeling, transkriptio, ja proteiini kuljetus /lajittelu (kuvio 4B). Mielenkiintoista, kun tarkastellaan cellular prosessien yksittäisiin kasvaimia, huomasimme, että kukin kasvain ollut yksi tai useita mutaatioita signalointi geenejä, ja yhdistelmä lisäyksiä, jotka vaikuttavat ainakin kahden muun solun prosesseja. Tämä malli useiden mutatoitunut prosesseja kunkin kasvaimen hyväksyy käsitteen että useiden geneettisten muutosten eri soluprosesseissa ajaa kasvaimen kasvua [14].

Yksi ehdokas syövän geenien määrittelemän kloonilaajenemisen, kaksi geeniä lyötiin itsenäisesti eri TTAA sivustoja useita kasvaimia (pois lukien geenien yhteinen kasvain 05 ja 09, joilla on yhteinen alkuperä): Mastermind-domain kuten 1 (

Mamld1

) ja Diacylglycerolkinase delta (

Dgkd

). Näin ollen, nämä geenit ovat erityisen vahva ehdokas syövän geenejä, koska ne ovat kaksinkertaisesti määritelty sekä kloonilaajenemisen insertioita yksittäisten kasvainten ja riippumaton esiintymisen yhteisen insertiokohdat useita tuumorinäytteissä.

Mamld1

geeni mutatoitunut lisäyksillä on epiteelin kasvaimissa ihon (kasvain 01, 02, ja 03).

Mamld1

on ehdotettu olevan koaktivaattoria ei-kanoninen Notch signalointi [15]. Ihmisen ihon, Notch signalointi komponentit ilmentyy runsaasti, ja de-asetuksen Notch signaali johtaa erilaisten ihosyöpien [16]. Siten

Mamld1

on uusi ehdokas syövän geeni säätelijänä Notch signalointia epiteelikasvaimet.

Dgkd

geeni on löydetty mutatoitunut kiinteissä kasvaimissa 05 (lymfaattinen etäpesäke maksassa) ja 07 (keuhko).

Dgkd

metabolizes 1,2, diasyyliglyseroli (DAG) ja fosfatidihappoa (PA). Sekä DAG ja PA tärkeitä rooleja toisiolähetteinä varten mitogeenisten signaaleja, ja modulaatio niiden tasoa

DGK

proteiinien on ehdotettu olevan potentiaalinen mekanismi syövän [17].

Keskustelu

Osoitamme tässä, että suurikapasiteettisten sekvensointi analyysi leikattua DNA transposoni syntyvän kasvaimet tarjoaa keinot tunnistaa ehdokas syövän geenien kloonivalinnalla laajennus analyysi. Tämä lähestymistapa edustaa parannetun strategian tunnistamiseksi ehdokas syövän geenien transposonin näytöissä, ja mahdollistaa ensimmäistä kertaa tunnistaminen ehdokas syövän geenien tasolla yksittäisten kasvainten.

kvantifiointi kloonilaajenemisen

Nykyinen protokollat ​​käyttävät restriktiopilkkeiden hajottamatta kasvaimen DNA, tuloksena on painottumista insertiot, joita edustaa lyhyt fragmentteja [7] ja siten vähentää määrällinen näkökohta lukea numeron analyysin. Haimme akustinen leikkaus DNA pirstoutuminen minimoida kokoerot insertiokohdan palasia. Tämä parannus, yhdistettynä Illumina suurikapasiteettisten sekvensointi, pystyimme saamaan semikvantitatiivinen arviointi suhteellinen edustus lisäyksiä. Useat havainnot viittaavat siihen, että menetelmä saavuttanut tason määrällisten tarkkuus riittää yksilöimään kloonaamalla laajennettu insertiot, jotka määrittelevät ehdokkaan syöpä geenit. Ensinnäkin vertailu kasvain ja kontrollinäytteiden paljasti selvä rikastumista insertion lukee Tuumorinäytteissä. Toiseksi analyysi liittyviä kasvaimia 05 ja 09 osoittivat vahvan korrelaation luku- taajuuksilla kloonaamalla laajeni lisäyksiä. Lopuksi geenit mutatoitiin kloonaamalla laajentunut lisäyksiä koostuu monista hyvin määritelty syöpä geenit.

kuitenkin tärkeä varoitus on kloonilaajenemisen analyysi on, että elimiä voidaan kuljettaa tiettyjen ennalta syövän insertiot, joita kloonaamalla laajennetaan sattumalta. Kuten valvonta kokeet osoittavat, nämä lisäykset voivat käsittää keskimäärin kaksi kolmasosaa klonaalisesti laajennetun lisäykset. Näin ollen vaikka meidän menetelmä on selvästi tehokas tunnistamaan ehdokas syövän geenien yksittäisten kasvainten syöpä ajo tehtävä kunkin geenin on vielä vahvistavat alterative menetelmillä, kuten CIS analyysiä tai funktionaalisia määrityksiä.

tekijä voi vaikuttaa klonaalisen laajeneminen insertioille on aktiivisuutta PiggyBac transposaasi. Jos PiggyBac osaksi toimintaa lakkaisi elinaikana hiirtä, tämä korjata tiettyjä lisäyksiä, mikä näkyisi klonaalinen laajennukset analyysimme. Me käsitellään jatkuvaa aktiivisuutta PiggyBac transposaasi aikuisten hiirikudoksessa tulevissa tutkimuksissa mukaan immunohistokemialliset.

Useat harhat järjestyksessä lukea edustus meidän kloonilaajenemisen analyysi säilyvät, esimerkiksi otettiin käyttöön eri GC-pitoisuus fragmenttien PCR-monistuksen aikana. Toinen tekijä, joka vähentää määrällinen voima menetelmämme ovat mahdollisesti esiintyy ei-kasvain strooman kudoksen näytteissä, mikä laimentaa klonaalisesti laajennetun kasvain ajo lisäyksiä. Lisäksi varoitus meidän menetelmä on, että epäspesifinen Splinkerette alukkeensitoutumissekvensseistä voi johtaa joissakin tapauksissa hallitseva monistamiseen genomi- sivustoja, jotka eivät ole totta transposonin lisäyksiä. Lisää teknisiä parannuksia tarvitaan, jotta analyysi kloonilaajenemisen absoluuttiseen määrällinen taso.

Suurikapasiteettinen sekvensointi transposonin lisäyksiä

sekvensointi lähestymistapa tuotti 10

6 kartoitettu lukee per kasvain näyte. Useita 10

5 lukee näytettä kohden oli ehdotettu olevan riittäviä paljastaa kaikkia lisäyksiä Ruususen syntyy kasvaimia [7].