Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) on keskeinen entsyymi syntetisoimiseksi ja ylläpitää telomeres päissä kromosomit, ja se on välttämätön solujen lisääntymisen. Tämä on tehnyt hTERT painopiste onkologian tutkimukseen ja houkutteleva kohde syöpälääkkeen kehittämiseen. Tässä tutkimuksessa olemme suunnitelleet Sirna (siRNA) kohdistaminen katalyyttinen alayksikkö hTERT ja testattiin sen vaikutukset kasvuun telomeraasia positiivisia ihmisen paksusuolen karsinooma SW480-solujen in vitro, sekä sen tuumorigeenisyyteen näiden solujen nude-hiirissä . Ohimenevä ja pysyvä transfektointi hTERT siRNA otetaan paksusuolen syövän SW480-solujen tukahdutetaan hTERT ilmaisua, vähentää telomeraasiaktiivisuus ja esti solujen kasvua ja proliferaatiota. Kaatamalla hTERT ilmentyminen SW480 kasvaimissa ksenosiirrettyjä nude-hiiriin merkittävästi hidastanut kasvaimen kasvua ja edistää tuumorisolun apoptoosia. Tuloksemme viittaavat siihen, että hTERT osallistuu karsinogeneesi ihmisen paksusuolen syöpä, ja he korostavat terapeuttista potentiaalia hTERT knock-down lähestymistapa.

Citation: Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, Cai YL Ye XQ, et al. (2014) hiljentäminen hTERT geenin shRNA Estää Colon Cancer SW480 Cell Growth

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e107019. doi: 10,1371 /journal.pone.0107019

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 lokakuu 2013; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu 10 syyskuuta 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Natural Science Foundation of Guangxi (avustus 2010GXNSF013238, https://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) ja ohjelmat Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Joukkueet University (No. IRT1119). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kolorektaalisyöpää on kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa ja neljänneksi yleisin kuolinsyy [1] – [2]. Pelkästään vuonna 2008 noin 1,23 miljoonaa uutta tapausta ja peräsuolen syöpä todettiin ympäri maailmaa, ja 608000 ihmistä kuoli tautiin [3]. Standardi hoito tähän syöpään on kirurginen, mutta tulokset ovat kaukana tyydyttävästä, jopa 50%: lla potilaista, jotka kärsivät uusiutumisen tai kuoleman 5 vuoden kuluessa leikkauksesta [4].

kohdistaminen telomerase paksusuolen syöpä voi tarjota tehokas vaihtoehto tai täydentää leikkaushoitoa. Telomeraasi, joka on ribonukleoproteiini kompleksi, joka sisältää sisäisen RNA-templaatin (hTR) ja katalyyttinen proteiini, jolla on telomeerien-spesifinen käänteistranskriptaasin aktiivisuutta (hTERT), ulottuu telomeres lopussa eukaryoottisten kromosomien, mikä estää solujen vanhenemista ja kuolemaa. Telomerase näyttää olevan keskeisessä osassa kasvaimen kasvun ja lisääntymisen: ilmaisun ja entsyymin aktiivisuus on poikkeuksellisen koholla useimmat syövät [5] – [6], ja alaspäin säätäminen entsyymin estää kasvun ja lisääntymisen [7]. Vaikka hTR on konstitutiivisesti läsnä normaaleissa ja tuumorisoluissa, hTERT on nopeutta rajoittava komponentti telomeraasikompleksin, ja sen ilme korreloi telomeraasiaktiivisuutta [8]. Normaaleissa somaattisten kudoksissa, hTERT toiminta on tukahdutettu, mutta sekä hTERT ilmentyminen ja telomeraasiaktiivisuus on kohonnut useimmissa ihmisen kasvaimissa [9] – [10]. Useat tutkimukset osoittavat, että telomeraasin voi olla avain kuolemattomiksi soluihin tarpeellinen askel kasvaimen synnyssä [11] – [12], joten hTERT mahdollisesti hyödyllinen kliininen biomarkkereiden [13] ja tavoitteeksi syövän vastaisen tutkimuksen [14].

kolorektaalisyövässä, jopa 85% soluista sisältävät aktiivisia telomeraasin, kun taas vain noin 5% normaalista peräsuolen solut sisältävät aktiivista entsyymiä. Siksi kohdistaminen ekspressiota tai aktiivisuutta telomeraasin voi aikaansaada uudenlainen hoito ja peräsuolen syöpään. Koska mitään hyvin valikoiva telomeraasiestäjät ovat käytettävissä hoitoon syöpä, keskityimme geenihoitolähestymistavat. Geeniterapia odotetaan olevan keskeisessä asemassa seuraavan sukupolven syövän hoidossa yhdessä tavanomaisten hoitojen, kuten leikkaus, kemoterapia, ja sädehoidon [15]. Yksi geeniterapia on RNA-interferenssi (RNAi), jotka voivat alas-säädellä ( ”knock-down”) ilmentymistä spesifisten geenien, jolloin toiminnot geenejä voidaan analysoida tai estää terapeuttisiin tarkoituksiin [16] – [18].

Tässä tutkimuksessa, suunnittelimme uudenlaisen hTERT sirna (siRNA) ja ilmaisi vastaavan lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ihmisen peräsuolen soluissa in vitro ja nude-hiirissä. Huomasimme, että kaatamalla hTERT ilmaus estivät ihmisen paksusuolen syöpä solujen kasvua, nostaa mahdollisuus geenihoitolähestymistavat että tavoite hTERT.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja SW480, DLD-1, ja HT29 (Academia Sinica Cell Bank, Shanghai, Kiina) kasvatettiin matalan glukoosin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (SW480) tai RPMI-1640-alustassa (DLD-1 ja HT29) (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% (v /v) naudan sikiön seerumia, 100 IU /ml penisilliiniä ja 10 mg /ml streptomysiiniä. Viljelmiä inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä ja eläimet

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Eläimet Yhdysvaltain National Institutes of Health, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Guangxi Medical University. Kaikki leikkauksia tehtiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja kärsimys oli minimoidaan niin pitkälle kuin mahdollista. Kateenkorvattomiin karvattomia hiiriä (BALB /ca nu /nu) ikäinen 4-5 viikkoa (Guangxi Institute of Materia Medica, Nanning, Kiina) pidettiin steriilissä häkeissä alle laminaarinen ilmavirtaus huput tietyllä patogeenittomassa huone 12 h: 12 h light-pimeäjaksoilla. Eläimiä ruokittiin autoklavoitiin ruokaa ja vettä ad libitum.

RT-PCR mitata hTERT mRNA: n ekspressio eri solulinjoissa

Kokonais-RNA uutettiin SW480, DLD-1 ja HT29-soluihin käyttämällä Trizol ( Bio Basic Inc., Kanada) mukaan valmistajan ohjeiden. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin 2 ug RNA: ta kustakin solulinjasta, ja Moloney-hiiren leukemiaviruksen RT (MMLV-RT; MBI Fer-, Amherst, NY, USA), monistettiin sitten 50 ul reaktioseosta, joka sisälsi 50 mM kutakin neljää dNTP: tä, 3 U Taq-DNA-polymeraasia (Promega), ja 0,5 mM alukkeita (Sangon Co, Shanghai, Kiina). Alukkeilla 5′-GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3 ’ja 5′-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3′ käytettiin monistamiseen 252 emäsparin alueen sisällä hTERT-geenin. Sisäisenä kontrollina, ilmentyminen glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) määritettiin käyttäen alukkeita 5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 ’ja 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’ monistamaan 450 bp: n alue. Monistusreaktiot suoritettiin 30 sykliä 94 ° C 30 s, 56 ° C: ssa 45 s ja 72 ° C: ssa 45 s. PCR-tuotteet erotettiin 2,0% agaroosigeelissä, joka värjättiin nukleiinihapon tahra I (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa), valokuvattu ja analysoidaan puolittain määrällisesti käyttäen GeneTools Analysis Software (Syngene-, Cambridge, UK). Solu viiva, joka osoittaa korkeimman hTERT mRNA valittiin jatkotutkimuksiin.

Suunnittelu siRNA: iden kohdistaminen hTERT

kolme hTERT siRNA sekvenssit suunniteltiin kuvatulla [19]. Sekvenssit olivat seuraavat, jossa nukleotidin alkuasemia perustuu NCBI merkintä hTERT (liittymistä NM_198253): hTERT-966, 5′-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 ’;

hTERT-2862, 5′-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT-3 ”; ja hTERT-2985, 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ’. Samanaikaisesti, suunnittelimme liity järjestyksessä negatiivisena kontrollina siRNA spesifisyys: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’. Kaikki neljä sekvenssit on jätetty BLAST haku vastaan ​​ihmisen genomin sulkea pois mahdollisuutta saada merkittäviä homologia muita geenejä. Sekvenssit syntetisoitiin kemiallisesti (GenePharma Co, Shanghai, Kiina) ja transfektoitiin lyhytaikaisesti SW480 viljelmiä, jotka oli viljelty yön yli, jolloin 40-60% konfluenssiin täydellisessä väliaineessa ilman antibiootteja. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine-reagenssia (GenePharma Co, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen, kun 48-tunnin transfektion, käänteistranskriptaasi (RT) -PCR käytettiin mittaamaan hTERT mRNA: n ilmentymisen. HTERT-2985 sekvenssi havaittiin alentaa hTERT mRNA suuressa määrin ja sen vuoksi, valittiin lisätutkimusta varten.

rakentaminen sellaisen hTERT-shRNA eukaryoottisia ekspressioplasmidin

RNA oligonukleotidit 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ’(sense) ja 5′-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3′ (antisense) syntetisoitiin kemiallisesti (GenePharma Co, Shanghai, Kiina) ja päästetty muodostamaan dupleksin symmetrinen uloke kaksi deoxythymidines 3′ end (hTERT-siRNA). SiRNA duplex sisältävä etuyhteydettömän sekvenssi 5’- GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’(NC-siRNA) syntetisoitiin myös negatiivisena kontrollina siRNA spesifisyyden. Rakentaa ekspressoivan plasmidin NC- tai hTERT-siRNA tä stabiilia transfektiota varten, oligonukleotidit 5’-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 ’ja 5′-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3’ (kohdesekvenssejä isoilla kirjaimilla) subkloonattiin PGPU6 /GFP /Neo vektori (GenePharma). Tämä vektori ilmentää koralli vihreä fluoresoiva proteiini (cGFP) valvonnassa CMV-promoottorin, jotta voitaisiin seurata transfektion tehokkuutta. Ilmentävien plasmidien NC- ja hTERT-siRNA nimettiin vastaavasti PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (jäljempänä NC-shRNA) ja PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA (jäljempänä hTERT-shRNA).

Ohimenevä transfektio SW480-solujen

Cultures 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä 90% konfluenssiin ja transfektoitiin 100 nM NC-shRNA tai hTERT-shRNA käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Samanaikaisesti solut transfektoitiin samalla määrällä Lipofectamine 2000 ilman shRNA plasmidi kontrollina. Viljelmät kerättiin kolmena kappaleena transfektion jälkeen 24, 48 ja 72 h.

RT-PCR mitata hTERT mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun transfektio

Kunakin ajankohtana edellä on mainittu, kokonais-RNA uutettiin transfektoitujen SW480-soluihin käyttäen Trizol ja alistettiin RT-PCR: llä kuten edellä on kuvattu.

Immunosytokemia mitata hTERT-proteiinin ilmentymisen

SW480-solut maljattiin 2,5 cm peitelaseille tiheydellä 5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. Transfektion jälkeen 24, 48, tai 72 h, peitelasit poistettiin ja immuno- värjättiin kaniinin polyklonaalista anti-hTERT-vasta-ainetta (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ja Maxvision Kit (Maixin, Fuzhou, Kiina). Jokaisena peitelasi, viisi näkymät valittiin sattumanvaraisesti ja tallentaa käyttämällä kuva-analyysi-ohjelmisto (Leica, Saksa). Kussakin mielestä harmaasävy- intensiteetti mitattiin 10 satunnaisesti valittua pistettä ja keskiarvo. Keskimääräinen harmaasävy voimakkuus oli kääntäen verrannollinen proteiiniin tasolle.

TRAP määritys telomeraasiaktiivisuuden

Telome- aktiivisuus määritettiin käyttäen kaupallista Telomerase PCR ELISA Kit (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Tukholma, Ruotsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Tämä määritys perustuu telomeerisesti toista vahvistusta protokolla [20]. Sen jälkeen, kun SW480-solut oli transfektoitu 48 tunnin Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA, tai jättää transfektoimattomia kasvatusväliaineeseen nollaverrokkina, koko solun proteiinit uutettiin käyttäen CHAPS lyysipuskuria, ja 0,5-ug näyte oli analysoitiin. Määritys koostui telomeraasia alukkeen pidennysreaktio, jota seurasi 26 PCR-sykliä. PCR-tuotteet todettiin käyttäen ELISA-pohjainen värireaktio [20].

Telomeraasiaktiivisuus ilmaistiin mukautetun absorbanssi ja jonka absorbanssi mielivaltaisina yksikköinä 450 nm miinus absorbanssi viittaus aallonpituudella 690 nm . Mukaan valmistajan ohjeiden suurin oikaistu absorbanssi negatiivisen kontrollin tulisi olla 0,25, kun taas oikaistu absorbanssi positiivisen kontrolli reaktion toimitetaan pakki pitäisi olla 1,5 20 minuutin kuluttua reaktion. Näytteet määriteltiin telomeraasia positiivinen, jos säädetty absorbanssi oli 0,2.

Virtaussytometria mitata solujen kasvua ja lisääntymistä

SW480-soluja transfektoitiin 48 h Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA, tai vasemmalle transfektoimattomia kasvatusväliaineeseen nollaverrokkina, otettiin talteen, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin yön yli 66% etanolilla. Solut sentrifugoitiin ja pestiin PBS: llä, sitten inkuboitiin 50 ug /ml propidiumjodidia ja 2,5 ug /ml RNaasi PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla klo emissioaallonpituutena 488 nm Multicycle ohjelmistoa (BD Biosciences, USA) [21]. Leviämisen indeksi (PI) laskettiin seuraavan kaavan mukaan:

PI = [S + (G2 /M)] /{(G0 /G1) + [S + (G2 /M)]} x 100 %.

Virtaussytometria apoptoosin mittaamiseksi

apoptoosi mitattiin kaksinkertainen värjäys solujen anneksiini V ja DNA (propidiumjodidin) ja analysoimalla niitä virtaussytometrialla. SW480-soluja transfektoitiin 48 h Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA viljeltiin kun läsnä on ilmoitettua pitoisuudet pristimerin, talteen, pestiin PBS: llä, ja inkuboitiin anneksiini V Binding Buffer (BD Pharmingen), joka sisälsi 0,3% FITC-konjugoitua anneksiini V: ssa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen anneksiini V Binding Buffer. Propidiumjodidia lisättiin juuri ennen virtaussytometria [21] – [22]. Aineisto analysoitiin FACSDiva Software (BD Biosciences).

TUNEL määritys apoptoosin mittaamiseksi

umpikuja Kolorimetrinen TUNEL System (Kaiji, Nanjing, Kiina) käytettiin mittaamaan apoptoosin SW480 kulttuureissa transfektoiduissa Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA, samoin kuin nude-hiiriä, joihin injektoitiin suolaliuosta, NC-shRNA tai hTERT-shRNA plasmideja (katso alla). In vitro kokeissa, SW480-solut maljattiin 2,5 cm peitinlaseille ja transfektoitiin 48 tuntia, jonka jälkeen peitelasit poistettiin ja vahvistettu TUNEL määrityksen mukaan valmistajan protokollaa. In vivo -kokeita varten, kasvainkudoksen viipaleet (5 pm paksu) valmistettiin. Levyjä kiinnitettiin 10% PBS-puskuroituun formaliiniin (Kaiji, Nanjing, Kiina) ja tehtiin läpäiseviksi proteinaasi K (Kaiji). Sitten objektilasit käsiteltiin, kuten valmistaja on kuvannut.

Objektilasit analysoitiin apoptoottisten solujen seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, rekombinantti-terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi käytettiin lisätä biotinyloidun nukleotidin DNA, natriumkloridi ja natriumsitraatti lisättiin reaktion pysäyttämiseksi, minkä jälkeen levyt inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimatulla streptavidiinilla. Lopuksi laseja inkuboitiin seoksen kanssa, vetyperoksidin, diaminobentsidiini kromogeeni, ja peroksidaasin substraattia, jotta värjäytyvät tumat tummanruskea. Stained dioja analysoitiin sitten valomikroskoopilla käyttämällä kuvien ottamista järjestelmä (Leica, Saksa). Vähintään 3 suurentavan kenttiä tutkittiin kukin dia ( 500 solua yhteensä), ja apoptoottisen indeksi (AI) laskettiin prosenttiosuutena havaittu solujen värjäystä TUNEL-positiivisia.

Transmissioelektronimikroskopia ( TEM) arvioida apoptoottinen morfologia

SW480-soluja transfektoitiin 48 tuntia Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA ja sitten korjattu. Solut pelletoitiin, heti kiinnitettiin 3% (v /v) glutaraldehydiä, jälkikiinnitettiin 1% (v /v) osmiumtetroksidin ja värjättiin 4,8% uranyyliasetaatilla. Dehydraation jälkeen luokiteltujen sarjojen läpi alkoholia liuoksia, näytteet huuhdottiin propyleenioksidin ja kyllästetty epoksihartsilla. Ultraohuen osat käsiteltiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla säätää kontrastia TEM, joka suoritettiin käyttämällä JEM-1230 (JEOL, Japani).

mittaus mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) arvioida apoptoosin

MMP mitattiin rodamiini 123 fluoresoivan väriaineen indikaattorina (CAS 83702; Sigma, Shanghai, Kiina) kuten aiemmin on kuvattu [23]. Tämä väriaine on heräte maksimi 488 nm ja emission maksimi on 526 nm. Tämän lähestymistavan, MMP oletetaan vaihdella käänteisesti rodamiini 123 fluoresenssi. SW480-soluja transfektoitiin 48 h Lipofectamine 2000 yksin, NC-shRNA tai hTERT-shRNA, sitten pestiin kahdesti PBS: llä poistamaan kuolleita soluja ja inkuboitiin rodamiini 123 (0,1 ug /ml) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Rodamiini 123 mitattiin fluoresenssi-intensiteetti konfokaali skannaus mikroskopia (NIKON-AE, Japani). Jokaisen koetilalle, fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo määritettiin 500 solua.

hTERT knock-down nude hiiren kasvain malli

SW480-solut injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen nude-hiirten klo annoksella 5 x 10

7 solua per hiiri 200 ul: ssa DMEM laimennettu 1:02 PBS: ssä, [24]. Kun kasvain kyhmyt oli kasvanut 7 mm, hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään, 8 eläintä, jossa kukin ryhmä sai yhteensä 6 kasvaimensisäisellä injektioita fysiologista suolaliuosta, 20 ug NC-shRNA tai 20 ug hTERT-shRNA välein 2 päivää . Eläimiä tarkkailtiin 6 päivän kuluttua viimeisestä shRNA injektio [25]. Kasvaimen pituus (L), leveys (W) ja halkaisija mitattiin kahdesti viikossa; kasvaimen tilavuus (cm

3) laskettiin käyttämällä kaavaa W

2 × (L /2) [26]. Hiiret tapettiin ja neutraali formaliinikiinnitetyt kasvain näytteet värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla ja tutkittiin valomikroskoopilla.

Tasot hTERT mRNA ja proteiini kolmeen nude-hiirten määritettiin vastaavasti by RT PCR: llä ja immunohistokemiallisesti, kuten edellä on kuvattu. Telomeraasiaktiivisuus ja laajuus apoptoosin TUNEL määritystä mitattiin myös kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 16.0 (IBM, USA). Erot käsittelyolosuhteet arvioitiin tilastollisen merkitsevyyden käyttämällä yksisuuntaista ANOVA, jonka jälkeen LSD tai Dunnettin t-testiä menetelmällä. Kynnys merkitys määriteltiin

P

0,05.

Tulokset

Endogeeninen hTERT ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjaa

Ensin seulottu SW480 , DLD-1, ja HT29 linjat mitkä oli riittävän korkea hTERT mRNA ilmaisun helpottamiseksi RNA-interferenssi ja analyysi vaikutukset solujen kasvuun. RT-PCR osoitti, että hTERT mRNA-tasot olivat tuskin havaittavissa DLD-1-soluissa ja merkitsevästi suurempi SW480-soluissa kuin HT29 (0,827 ± 0,037

vs.

0,705 ± 0,051,

P

0,05; Fig. 1A). Näin ollen SW480-solut valittiin lisätutkimuksia varten.

(A) Endogeenisen hTERT mRNA: n ekspression SW480, DLD-1 ja HT29-solulinjat. Oli huomattavia eroja SW480, HT29 ja DLD-1-solut (

#

P

0,01), ja välillä SW480 ja HT29 (*

P

0,05). (B) Teho hTERT siRNA: iden in SW480-soluissa. HTERT: in mRNA oli merkittävästi pienempi transfektoiduissa soluissa hTERT siRNA: t kuin transfektoiduissa soluissa negatiivisen kontrollin (NC) shRNA tai Lipofectamine yksinään (Lipo). *

P

0,05,

#

P

0,01, verrattuna NC-shRNA ja Lipo ryhmiä. Tulokset ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Seulonta voimakkaimpia hTERT siRNA SW480 kulttuureissa

kolme hTERT-siRNA (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) ja liity siRNA negatiivisena kontrollina (NC-siRNA) transfektoitiin väliaikaisesti osaksi SW480 soluihin tunnistaa siRNA että voimakkaimmin tukahdutti hTERT mRNA-tasolla, sekä vahvistaa hTERT spesifisyys meidän siRNA lähestymistapaa. Ohjaus solut transfektoitu lipofektamiinireagenssia yksin ( ”Lipo”) tai NC-siRNA osoitti samanlaista hTERT: in mRNA (0,823 ± 0,025 ja 0,815 ± 0,043, vastaavasti;

P

0,05). Transfektiota tahansa kolmesta hTERT-siRNA: t johtivat huomattavasti alhaisempi hTERT mRNA kuin transfektoimalla NC-siRNA tai Lipo yksinään (Fig. 1 B): hTERT-966, 0,395 ± 0,075; hTERT-2862, 0,650 ± 0,064; hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (kaikki

P

0,05). Kolmen hTERT siRNA testattujen sekvenssien, hTERT-2985 todettiin tehokkain, ja näin ollen käytettiin rakentamaan hTERT-shRNA eukaryoottinen ekspressioplasmidin edelleen in vitro ja in vivo tutkimuksissa.

Expression of hTERT-shRNA in SW480 solut alas-säätelee mRNA ja proteiinin ilmentyminen

Transfektoimme SW480-solujen kanssa hTERT-shRNA tai NC-shRNA 24, 48 ja 72 tuntia, sitten mitataan ilmaus hTERT mRNA ja proteiini. 48-h transfektion kontrolliviljelmiä osoittivat samanlaisia ​​mRNA: pelkästään viljelyalustassa (Blank), 0,530 ± 0,032; Lipofectamine yksin (Lipo), 0,483 ± 0,075; NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. MRNA oli merkittävästi pienempi, kun 48-tunnin transfektion hTERT-shRNA (0,322 ± 0,030;

P

0,05 tai

P

0,01; Fig. 2A). Itse asiassa, väheneminen hTERT mRNA oli jo havaittavissa sen jälkeen, kun 24-tunnin transfektion jälkeen. Kuitenkaan mitään eroja hTERT mRNA: n ilmentymisen havaittiin ryhmien kesken jälkeen 72-h transfektion (Fig. 2A).

(A) RT-PCR-analyysi hTERT mRNA ilmaisun SW480 kulttuureissa jälkeen mock-transfektion kulttuuri keskipitkän yksin (Blank), Lipofectamine yksinään (Lipo), negatiivinen kontrolli siRNA (NC-shRNA), tai hTERT-shRNA. MRNA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuluttua 48-h transfektion hTERT-shRNA kuin jälkeen kont-.

▴

P

0,05,

#

P

0,01 verrattuna Blank; *

P

0,05 verrattuna Lipo ja NC-shRNA. (B) Immunosytokemia hTERT-proteiinin ilmentymisen. (A) tyhjät solut, (b) Lipo-solut, (c) NC-shRNA soluja, ja (d) hTERT-shRNA soluja. Kaikki näkemykset, × 400. Korkeampi harmaasävy arvo osoittaa alemman proteiinin tason. Proteiini tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuluttua 48-h transfektion hTERT-shRNA kuin jälkeen kont-.

#

P

0,01, verrattuna muihin ryhmiin; *

P

0,05 verrattuna Blank. (C) hTERT alassäätöä estää telomeraasiaktiivisuutta. Telomeraasiaktiivisuus [oikaistun absorbanssi (450 nm-630 nm)] oli merkitsevästi pienempi transfektoiduissa soluissa hTERT-shRNA kuin verrokeilla soluissa. *

P

0,05 verrattuna Lipo ja Blank valvontaa. Tulokset ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun tutkittiin hTERT-proteiinin ilmentymistä. Ja kolme kont- johti vahva keltainen tumakalvon värjäytyminen runsaasti ruskeaa hiukkasten ytimet, transfektio hTERT-shRNA johti paljon heikompi värjäytymistä (Fig. 2B, a-d). Kvantitoimiseksi greyscale intensiteettiä, joka vaihteli kääntäen tason kanssa hTERT-proteiinin, osoitti, että 48-h transfektion hTERT-shRNA johti paljon alhaisempi proteiinin tasot (209,600 ± 17,101) kuin transfektio pelkästään viljelyalustassa (146,500 ± 22,325), Lipofectamine yksin (151,800 ± 24,478) tai NC-shRNA (167,350 ± 37,754) (

P

0,01; Fig. 2B). Sen jälkeen, kun 72-tunnin transfektion, vaikka merkittävä ero säilyi välillä hTERT-shRNA ja nollakoe (239,500 ± 9,546 vs. 223,950 ± 10,259,

P

0,05, Fig. 2B), ei ollut merkittävää eroa välillä hTERT-shRNA ja NC-shRNA. Nämä tulokset todennäköisesti kuvastavat sitä, että meidän ekspressiovektori on tarkoitettu lyhytaikaiseen ilmentymisen tutkimukset, koska se ei integroidu isäntäsolun genomiin. Siksi teimme kaikki edelleen in vitro kokeissa ulos 48 h.

hTERT alassäätöä estää telomeraasiaktiivisuus SW480-soluissa

Samankaltaisia ​​tasoja telomeraasiaktiivisuuden havaittiin SW480 transfektoiduissa soluissa 48-h jossa pelkästään viljelyalustassa (2,756 ± 0,089), Lipofectamine yksin (2,693 ± 0,225) tai NC-shRNA (2,691 ± 0,119). Sen sijaan 48-h transfektion hTERT-shRNA johti merkitsevästi pienempi telomeraasiaktiivisuutta (2,242 ± 0,284;

P

0,05, Fig. 2C).

hTERT alassäätöä vähentää kasvua ja leviämisen SW480-solujen

osuus solujen G0 /G1 vaihe oli merkittävästi korkeampi, kun 48-tunnin transfektion hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) kuin transfektion jälkeen pelkästään viljelyalustassa (42,27 ± 2,76%) , Lipofectamine yksin (42,43 ± 4,67%) tai NC-shRNA (37,07 ± 1,53%, P 0,05). Samaan aikaan, leviämisen indeksi oli paljon pienempi transfektion jälkeen hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) kuin transfektion jälkeen NC-shRNA (59,03 ± 5,86%, P 0,05); indeksi oli samanlainen kaikissa kolmessa kontrolliryhmissä (Fig. 3A).

(A) hTERT-shRNA vähentää kasvun ja lisääntymisen SW480-solujen. Osuus solujen G0 /G1 vaihe oli huomattavasti korkeampi ja leviämisen indeksi oli paljon pienempi transfektion jälkeen hTERT-shRNA jälkeen kuin kont-. *

P

0,05, verrattuna muihin kolmeen ryhmään;

#

P

0,05, verrattuna NC-shRNA. (B) hTERT-shRNA lisää apoptoosia SW480-soluja. Solut transfektoitiin (a) hTERT-shRNA tai (b) NC-shRNA, värjätään diaminobentsidiinillä (ruskea) ja vasta-värjättiin hematoksyliinillä (sininen) leimaamiseen ytimeksi. Kuvat ovat edustavia Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. Suurennos, × 400. Apoptoottista indeksiä (AI) oli merkitsevästi korkeampi soluissa, jotka on transfektoitu hTERT-shRNA.

#

P

0,01, verrattuna muihin kolmeen ryhmään. (C) Transmissioelektronimikroskopia analyysi SW480-soluja transfektoitiin (a-c) hTERT-shRNA tai (d) NC-shRNA. Apoptoottinen morfologia oli nähtävissä transfektoiduissa soluissa hTERT-shRNA. Suurennos, × 3800. (D) rodamiini 123 fluoresenssin voimakkuus analyysi SW480-soluja transfektoitiin (a) pelkästään viljelyalustassa (tyhjä), (b) Lipofectamine yksinään (Lipo), (c) NC-shRNA tai (d) hTERT-shRNA. Värjätään solut analysoitiin konfokaalisella pyyhkäisymikroskoopilla; suurempi fluoresenssin voimakkuus ilmaisee alempi mitokondrion kalvon potentiaalia. Suurennos, × 400. Transfektoiduissa soluissa hTERT-shRNA osoittivat merkittävästi korkeampia rodamiini 123 fluoresenssi kuin teki kontrolli soluja. *

P

0,05, verrattuna NC-shRNA tai Lipo;

#

P

0,01 verrattuna Blank. Tulokset ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

hTERT alassäätöä lisää apoptoosia SW480-solujen

Toisin kuin Ctrl-transfektoituja soluja, jotka on transfektoitu hTERT-shRNA olivat näivettynyt ulkonäöltään; ne osoittivat syvän ruskea värjäytyminen solukalvon, solulimassa tai tumassa; ja ne joskus sisälsivät apoptoottisia kappaleita (Fig. 3B, a-b). TUNEL värjäys osoitti, että osuus apoptoottisten solujen oli paljon suurempi transfektion jälkeen hTERT-shRNA [Apoptosis indeksi (AI) = 22,2 ± 4,25%] kuin transfektion jälkeen pelkästään viljelyalustassa (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine yksin (2,2 ± 1,20 %) tai NC-shRNA (2,4 ± 1,25%; kaikki

P

0,01; Fig. 3B). TEM-analyysi osoitti myös, että suuri osa transfektoitujen solujen hTERT-shRNA oli apoptoottisia morfologia, mukaan lukien pienentynyt tilavuus, vähensi määrä ulokkeita ja mikrovillus, ja epätasainen chromatin kertymistä alle tumakalvoa (Fig. 3C, a). Jotkut soluytimet oli puolikuun muotoinen, pyöreä tai paksu, ja monet solut sisälsivät lukuisia vakuoleihin (Fig. 3C, b-c). Sitä vastoin kontrolli-transfektoidut solut osoittivat normaalia sisäinen rakenne (Fig. 3C, d).

lisätoimenpiteenä apoptoosin, käytimme rodamiini 123 indeksinä MMP (Fig. 3d, a-d) ; Tässä määrityksessä, suurempi värin intensiteetti osoittaa alemman MMP, joka liittyy apoptoosiin. Transfektoiduissa soluissa hTERT-shRNA osoittivat merkittävästi korkeampia rodamiini 123 fluoresenssi (719,998 ± 17,083) kuin solut transfektoitu pelkästään viljelyalustassa (545,833 ± 6,811,

P

0,01), NC-shRNA (585,361 ± 51,781,

P

0,05) tai Lipofectamine yksinään (632,169 ± 65,635,

P

0,05) (Fig. 3d).

hTERT-shRNA estää kasvaimen solujen kasvua

in vivo

ksenografti kasvainmuoto perustettiin injektoimalla nude hiiriä SW480-solujen ja sitten ruiskuttamalla tuloksena kasvainten NC-shRNA tai hTERT-shRNA. Määräajoin tuumorin koon mittaus osoitti, että 31 päivä, käsitellyt kasvaimet hTERT-shRNA (0,248 ± 0,102 cm

3) olivat merkittävästi pienempiä kuin tuumorit, käsiteltiin suolaliuoksella (0,543 ± 0,230 cm

3

P

0,05) tai NC-shRNA (0,580 ± 0,293 cm

3

P

0,01; Fig. 4A).

(A) hTERT-shRNA estää kasvain solujen kasvua. Kasvaimen kasvua 31. päivänä oli huomattavasti hitaampaa käsitellyt kasvaimet hTERT-shRNA kuin käsitellyt kasvaimet suolaliuoksella (*

P

0,05) tai NC-shRNA (

#

P

0,01). (B) histopatologinen tutkimus SW480 kasvainkudoksen oksastettu paljaisiin hiiriin ja käsiteltiin hTERT-shRNA. Kasvainkudos koepala 31 päivää ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla. Nuoli (a) osoittaa levyn kuolion; nuoli (b) osoittaa käännellen nucleoplasm sytoplasmaan tilavuus yhdessä mitoosi patologian. Suurennos, × 200. (C) RT-PCR-analyysi mitata hTERT mRNA ilmentyminen kasvainkudoksessa käsiteltiin suolaliuoksella (kaistat 1-8), NC-shRNA (kaistat 9-16), tai hTERT-shRNA (kaistat 17-24). M, 100-bp DNA-molekyylipainomarkkeri. Suhteellinen ilmentyminen hTERT mRNA oli merkitsevästi pienempi hTERT-shRNA hiirillä. *

P

0,05, verrattuna suolaliuoksella ja NC-shRNA ryhmiä. (D) Immunosytokemia hTERT-proteiinin (värjätty ruskea) kasvainkudoksessa käsiteltiin (a) suolaliuosta, (b) NC-shRNA, tai (c) hTERT-shRNA. Suurennos, × 200. Korkeammat harmaasävyt arvot osoittavat alempia proteiinin tasoja. Suhteellinen ilmentyminen hTERT-proteiinin oli merkitsevästi pienempi hTERT-shRNA hiirillä. # P 0,01, verrattuna suolaliuoksella ja NC-shRNA ryhmiä. (E) vaikutus hTERT-shRNA on telomeraasiaktiivisuutta in vivo. Oikaistu absorbanssi (450 nm – 630 nm) oli merkitsevästi pienempi käsitellyt kasvaimet hTERT-shRNA kuin käsitellyt kasvaimet suolaliuoksella (*

P

0,05) tai NC-shRNA (

#

P

0,01). (F) Effects of hTERT-shRNA apoptoosiin. Kasvaimia injektoitiin säännöllisesti (a) suolaliuosta, (b) NC-shRNA tai (c) hTERT-shRNA, sitten biopsia ja värjättiin diaminobentsidiini (ruskea); ytimet olivat vasta-värjättiin hematoksyliinillä (sininen). Kuvat ovat edustavia tuloksia kolmen erillisen kokeen. Suurennos, × 200. Apoptoottista indeksiä (AI) oli merkitsevästi suurempi kasvaimia käsiteltiin hTERT-shRNA kuin käsitellyt kasvaimet suolaliuoksella tai NC-shRNA.

#

P

0,01, verrattuna kahteen kontrolliryhmiin.

hTERT-shRNA estää hTERT ilmaisun ja telomeraasiaktiivisuuteen

in vivo

Kun 31 päivää ennen hoidon suolaliuoksella, NC-shRNA tai hTERT-shRNA, suhteellinen ilmentyminen hTERT mRNA oli merkitsevästi pienempi hTERT-shRNA hiiriä (0,388 ± 0,093) kuin suolaliuos (0,809 ± 0,335) tai