Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotta tuottaa genomista signaaleja, androgeenireseptorin (AR) on oltava kulkeutuu tumaan androgeeni ärsykkeitä. Kuitenkin on havaittu,

in vitro

kokeiluja, että kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) soluja AR pystyy translokoituvat tumaan ligandista riippumattomalla tavalla. Äskettäinen havainto, että esto glykogeenin-syntaasi-kinaasi 3β (GSK-3β) sai aikaan nopean tumasta AR androgeeni stimuloiman syöpäsolujen sai meidät analysoimaan vaikutuksia GSK-3β inhibition kastraatio vastustuskykyisten LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaP-SSR. Molemmat solulinjat osoittavat korkeita ydinvoiman AR ilman androgeeni ärsykkeitä. Näiden solujen altistaminen on maleimidi SB216763, voimakas GSK-3β estäjä, johti nopeaan tumasta AR jopa androgeenin riistää olosuhteissa. Lisäksi kyky C4-2 ja LNCaP-SSR solut voivat kasvaa ilman androgeenien väheni jälkeen farmakologinen GSK-3β

in vitro

. Kyky SB216763 moduloida AR signalointia ja toimivat CRPC

in vivo

oli lisäksi osoitettiin modifioitu poikasen korioallantoiskalvoon ksenografti määrityksessä jälkeen systeemistä kuljettamista SB216763. Tuloksemme viittaavat siihen, että GSK-3β auttaa kohdistamaan AR vientiä tumasta siten vähentää vaikutuksia väärässä paikassa AR CRPC soluissa. Siksi GSK-3β voisi olla mielenkiintoinen uusi strategia hoitoon CRPC.

Citation: Schütz SV, Schrader AJ, Zengerling F, Genze F, Cronauer MV, Schrader M (2011) esto glykogeenin taasikinaasi-3β Ehkäisee Ligandivälitteinen Riippumaton aktiivisuus androgeenireseptorin vuonna kastraatio Kestää eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (9): e25341. doi: 10,1371 /journal.pone.0025341

Editor: Vladislav V. Glinsky, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2011; Julkaistu: 29 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Schütz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli antamat Action Lions Vaincre le Cancer, Luxemburg (ja MVC). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Transcriptional sääntelyä tumareseptoreihin on keskeinen rooli kehityksen ja kasvun eturauhassyövän (PC) soluja. Tämä on hyvin esimerkkinä roolia androgeenireseptorin (AR), ligandi-aktivoidun transkriptiotekijän, jotka kuuluvat steroidi superperheen. Puuttuessa androgeenien, AR on pääasiassa sijaitsee sytoplasmassa vakiinnutettuna multichaperone kompleksi [1]. Sitoutumisessa androgeenien, AR ajatellaan läpi konformaatiomuutos johtaa homodimerisaation toisen AR proteiinin jälkeen irtaantuu osista multichaperone-kompleksin [2]. Sen jälkeen, AR aktiivisesti kuljetetaan tumaan, jossa se sitoutuu spesifisiin DNA-sekvensseihin kutsutaan androgeenien vaste-elementit (ARE) tavataan promoottori tai tehostaja alueiden AR-kohdegeenien [3] siten aktivoimaan yleisen transkription laitteen [4].

Ensimmäinen androgen riippuvuus syöpäsolujen on syy, miksi useimmat PC reagoivat androgeeniablaatio hoitoa. Valitettavasti hyöty androgeeniablaatio on vain ohimenevä. Kauden jälkeen noin kaksi vuotta, PC lähes poikkeuksetta edetä tilaan taudin kutsutaan kastraation vastustuskykyisiä eturauhassyöpä (CRPC) jossa kasvainsolut voivat kasvaa ja hengissä alle kastraattimäärät kiertävän androgeenien. Vaikka

in vitro

kehittämisessä androgeenista riippumaton fenotyyppi perustuu lähinnä menetys AR tuumorisoluissa, on näyttöä useista kliinisistä tutkimuksista että AR on harvoin menetetään CRPC soluissa

vuonna vivo

[5], [6]. Lisäksi nämä tutkimukset viittaavat siihen, että vastustuskyvyn tavanomaisilla hormonihoidon ei johdu menetystä androgeenireseptorin herkkyyden vaan voi olla seurausta vapautetuilla AR-signalointi akseli [7].

Jotta genomisten signaaleja hormoniriippuvaiset PC soluja AR on kuljetettava tumaan kun androgeeni ärsykkeitä. On vahvoja todisteita

in vitro

kokeissa, että osajoukko CRPC solujen, AR hankkii kyky läpikäydä ligandista riippumatonta shuttling sytoplasmasta tumaan [8]. Mitä mielenkiintoisinta, näissä soluissa AR näyttää korkeatasoinen konstitutiivinen, androgeenista riippumaton aktiivisuus [9]. Koska ydinvoiman läsnäolo reseptori on edellytys AR signalointi, sääntely tumaansiirtymiseen voisi paljastaa uusia strategioita hoitoon sekä androgeeniriippuvaisen PC sekä CRPC.

Useat tutkimukset ovat tarjonneet oivalluksia ydin- tuonti AR. Kaksiosaisen tumalokalisaatiosekvenssiai- (NLS) on tunnistettu DNA: ta sitovan domeenin (DBD) ja sarana-aluetta AR [10]. Tämä NLS hyödyntää klassisen Importiini koulutusjakson kulkeutuminen tumahuokonen monimutkainen [11], [12]. Lisäksi vähemmän määritelty NLS on läsnä ligandia sitovan domeenin (LBD) ja AR: [13], [14]. Toisin kuin ydinvoiman tuonnin AR, liittyviä mekanismeja AR tumasta tunnetaan huonosti. DNA sitovien domeenien (DBD) Erilaisten steroidireseptorit on ehdotettu toimia tumasta signaaleja (NES) on kalretikuliini välittämä tumasta [15]. Kuitenkin AR nämä tiedot on käsitelty controversially [16], [17]. Äskettäin Saporita et ai. raportoitu tunnistamisen uusi NES (aminohapot 743-817) sijaitsevat LBD AR [18]. Tunnistaminen NES vuonna LBD AR on yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa ryhmämme tutkii tumasta AR androgeeni stimuloiman PC soluja jälkeen estämällä glykogeenin-syntaasi-kinaasi 3β (GSK-3β) [19 ].

havainto, että GSK-3β indusoi nopean tumasta AR androgeeni stimuloiman PC soluissa sai meidät vaikutusten analysoimiseksi GSK-3β esto in kastraatio kestävä LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaP-SSR [20], [21], molemmat tiedetään olevan korkea ydinvoiman AR puuttuessa androgeeni ärsykkeitä. Molemmat

in vitro

sekä

in vivo

esitetyt tiedot tämän aiheen olettaa, että induktio nucleocytoplasmic AR vienti voi olla hyödyllinen strategia vähentää AR signalointi, varsinkin kehittyneiden CRPC.

tulokset

AR ja GSK-3β ovat säädellään ylöspäin CRPC solulinjoissa

jotta vaikutusten analysoimiseksi GSK-3β estäjien AR-aktiivisuuden CRPC soluissa ensin määritettävä endogeenisen AR: n tai GSK-3β tasot kokosoluekstraktien PC-soluja kasvatettiin ilman DHT. AR-positiivinen LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaP-SSR, tiedetään lisääntyä ilman androgeenien, toimi malleina CRPC [20], [21]. Andro- herkkien LNCaP sekä AR-negatiivinen PC3-solut toimivat kontrolleina. Kuten kuviossa 1A, AR oli havaittavissa kaikissa LNCaP rivit kasvatettiin ilman, että AR-stabiloivan androgeenien DHT. Solunsisäiset AR tasot lisääntyivät merkitsevästi AR-positiivisten CRPC soluja (C4-2 + 177%, LNCaP-SSR + 126%) (taulukko 1). Kasvu AR-proteiinin kastraatio kestävä LNCaP alalinjoja rinnastettiin kasvu PSA (C4-2 + 337% ja LNCaP-SSR + 110%, vastaavasti), jälkimmäinen viittaa siihen, että AR on erityisen aktiivinen näissä soluissa ( Kuvio 1A, B, taulukko 1). Western blot-analyysi solunsisäisen GSK-3β-proteiinin paljasti merkittävästi korkeampi solunsisäisen GSK-3β tasoilla C4-2 (+ 361%) ja LNCaP-SSR (+ 150%) soluja, verrattuna emo-LNCaP-solujen (kuvio 1A, taulukko 1) .

(A) Solunsisäiset AR ja GSK-3β-proteiinin tasot PC solulinjoja kasvatettiin ilman androgeenien. AR-positiivinen LNCaP, LNCaP-SSR ja C4-2 solujen sekä AR-negatiivinen PC3-soluja kasvatettiin 48 tuntia androgeenin riistää olosuhteissa. Sen jälkeen solut lyysattiin ja solulysaateista analysoitiin Western-blottauksella AR ja GSK-3β. p-aktiini bändejä toimi latauskontrollina. (B) Solunsisäiset PSA tasot CpRC soluissa kasvatettu androgeenin riistää olosuhteissa. AR-positiivisia LNCaP, LNCaP-SSR ja C4-2 soluja kasvatettiin ja käsiteltiin kuten on kuvattu. Suhteellinen PSA-tasot määritettiin vastaavalla solulysaateista Western blottauksella kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. β-aktiini bändejä toimi latauskontrollina.

Maleimidiyhdiste SB216763 vähentää GSK-3β-aktivoivan fosforylaation tyrosiini 216

Useat tutkimukset raportoitu, että suurin osa GSK- 3β molekyylit ovat inaktiivisia LNCaP seurauksena fosforylointi seriinin 9 (S9) [26], [27]. On kuitenkin olemassa kokeellista näyttöä, että GSK-3β aktiivisuus ei ole täysin estyy LNCaP-solujen [28], [29], [30], [31], [32]. Sen jälkeen DHT hoidossa, fosforylaatio GSK-3β at tyrosiini 216 (GSK-3β

Y216), GSK-3β aktivoiva fosforylaatiokohdan, lisättiin LNCaP ja C4-2-soluissa (kuvio. 2). Inhiboimiseksi jäljellä GSK-3β aktiivisuus LNCaP ja C4-2-soluja, soluja käsiteltiin maleimidi SB216763, GSK-3β estäjä äskettäin osoitettu estävän fosforylaatio GSK-3β

Y216 [33]. Lisäksi kyky SB216763 estää GSK-3β aktiivisuus C4-2-soluissa varmistettiin muutokset fosforylaation tilan β-kateniinin, joka on prototyyppiä alavirran kohde GSK-3β (kuvio S1).

LNCaP solut ja C4-2-solut ympättiin T25-pulloihin ja annettiin kiinnittyä yön yli. Tämän jälkeen alusta korvattiin steroidi-elatusaineella ja soluja kasvatettiin vielä 24 tuntia. Sen jälkeen, SB216763 (lopullinen konsentraatio 5 uM) lisättiin 30 minuuttia ennen DHT (10 nM) hoitoon. 4 tunnin kuluttua solulysaateista analysoitiin GSK-3β

Y216 ja GSK-3β

S9 fosforylaation kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät.

Kuten odotettua, inkubointi SB216763 esti fosforylaatio GSK-3β

Y216 molemmissa solulinjoissa, on selvin androgen riippumaton C4-2-soluissa (kuvio. 2). Mitä mielenkiintoisinta, joka on SB216763 aiheuttamaa laskua GSK-3

Y216 fosforylaatiota DHT saaneilla C4-2 solujen rinnastettiin kasvu S9 fosforylaation (kuvio. 2).

Unliganded AR on lokalisoitu tuman CRPC LNCaP-alalinjoja

Nuclear lokalisoinnin AR on edellytys genomista signalointi. Kuten nähdään kuviosta 3, CRPC alilinjat LNCaP-SSR ja C4-2 näytteille ydinvoiman AR ilman androgeeni ärsykkeitä. Kun käsitelty DHT, ydin- AR dramaattisesti lisääntynyt hormoniriippuvainen LNCaP, kun taas kasvu ydinvoiman AR LNCaP-SSR ja C4-2 pysyi marginaalinen (Fig. 3, taulukko 2). Analysoida edelleen ligandista riippumaton ydinvoiman tuonti AR LNCaP ja kastraatio kestävä C4-2, solut transfektoitiin ekspressiokonstruktio koodaavat vihreän fluoresoivan AR villityypin-Eos fuusioproteiini (AR-EosFP) [19]. Toisin kuin LNCaP-solut, joissa AR-EosFP oli vain ydin- läsnä ollessa DHT, AR-EosFP oli havaittavissa ytimet C4-2-solujen puuttuessa androgeenien (Fig. 4). Tämä havainto viittaa siihen, että vallitseva ydinvoiman lokalisoinnin AR C4-2 soluissa ei johdu itsenäinen toiminta reseptorimolekyylin vaan riippuu sääntelyn solun tekijöitä C4-2 soluissa.

Soluja kasvatettiin alle steroidi-vapaa olosuhteissa 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin 10 nM DHT ja inkuboitiin vielä 30 min. Sen jälkeen, SB216763 lisättiin (loppupitoisuus 5 uM) ja solujen annettiin kasvaa vielä 210 min. Tämän käsittelyn ydin- uutteet valmistettiin ja analysoitiin AR ja Lamin A on esitetty materiaalit ja menetelmät. AR ja lamiinivektori kvantitoitiin densitometrillä. AR tasot ilmaistaan ​​kertamuutosta AR /Lamin kasvatettujen solujen puuttuessa DHT ja SB216763, joka oli asetettu 1.

LNCaP ja C4-2-solut transfektoitiin par-t1EosFP ja kasvatettiin 24 tunnin ajan ilman androgeenien. Sen jälkeen soluja käsiteltiin /ilman DHT (lopullinen pitoisuus 10 nM). 4 tunnin kuluttua ydin- tai sytoplasmisen lokalisaatio AR-EosFP seurattiin fluoresenssimikroskopialla.

hoito kastraation vastustuskykyisten LNCaP alalinjoja kanssa SB216763 laukaisee CRM1 välittämää tumasta AR vuonna Koska androgeenien

androgen-stimuloitujen PC-solujen, lyhyen aikavälin GSK-3β aktiivisuus eri pienimolekyylisten estäjien osoitettu aiheuttavan nopean CRM1 riippuvainen nucleocytoplasmic sukkuloinnin AR. Ydin- vienti oli riippumaton toimintatavan inhibiittorin käytetty eri tutkimuksissa [32], [19]. Selvittääkseen vaikutusten GSK-3β-estoa androgeenisäädellyn riippumaton ydinvoiman kertyminen AR, CRPC solulinjat LNCaP-SSR ja C4-2 hoidettiin GSK-3β estäjä SB216763. Vanhempien androgeeniriippuvaisissa LNCaP-solut toimivat kontrolleina (kuvio 3). Hoito C4-2 solujen SB216763 aiheutti nopean tumasta AR puuttuessa /androgeenien läsnäolon esitetyllä densitometrialla kolmen itsenäisen Western blotit (AR-vienti kurssi puuttuessa DHT = 64%; läsnäollessa DHT = 75%) (taulukko 2). Androgeenista riippumaton ydinvoiman kertymistä AR kastraation kestävä LNCaP-SSR alalinja oli myös vähentynyt seuraavat SB216763 hoidon: kuitenkin, vaikutukset olivat vähäisempiä kuin vuonna C4-2 soluissa (41% puuttuessa DHT; 46% läsnäollessa DHT) (taulukko 2). N ydinalan viennin AR LNCaP kasvatettiin ilman androgeenien pysyi marginaalinen mutta oli silti havaittavissa (17% puuttuessa DHT, 7% läsnä ollessa DHT) (taulukko 3). Mielenkiintoista, tumasta AR proteiinin C4-2 kasvatettujen solujen puuttuessa DHT jälkeen SB216763 hoidon voitiin estää leptomycin B vahvistetaan aiemmin CRM1 riippuvaisen vienti mekanismi (Fig. 5).

C4- 2-soluja kasvatettiin ilman androgeenien inkuboitiin /ilman CRM1 inhibiittoria leptomycin B (LMB) 30 min ennen SB216763 hoitoa. 4 tunnin kuluttua, ydin- uutteet valmistettiin ja analysoitiin AR ja Lamin A on esitetty materiaalit ja menetelmät.

hiljentäminen ja pitkän aikavälin GSK-3β in C4-2 soluissa

käyttäen kaupallista validoitu shRNA suunnattu GSK-3β (32), pystyimme vähentämään merkittävästi solunsisäistä GSK-3β tasoja C4-2 soluissa (Kuva. 6A). Tämä alassäätöä rinnastettiin ehtyminen ydinvoiman AR proteiinin C4-2 soluissa. Nuclear ehtyminen AR-proteiini oli vähemmän selvä, kun C4-2-soluja kasvatettiin läsnä AR-stabiloivan hormoni DHT (Fig. 6A). Pitkäaikainen hoito androgeenin stimuloiman LNCaP ja 22Rv1 soluja erilaisilla farmakologinen GSK-3β estäjillä on toistuvasti osoittanut, että GSK-3β osallistuu AR vakaus [27], [32]. Se, että C4-2-solut ilmentävät korkeita sytoplasmisen sekä ydin- AR ilman androgeenien sai meidät analysoimaan vaikutuksia SB216763 solunsisäisiin AR tasoilla. Kuten nähdään Fig. 6B, pitkäaikainen hoito SB216763 johtaa alas-säätely AR proteiinin C4-2 kasvatettujen solujen puuttuessa androgeenien.

(A) hiljentäminen GSK-3β in C4-2 soluissa. C4-2-soluja transfektoitiin ohimenevästi pKD-GSK-3β-v1 tai pKD-NegCon-v1. 48 tuntia transfektion jälkeen, 10 nM DHT lisättiin toisin mainita. 24 tunnin jälkeen, tumauutteita valmistettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. (B) Pitkäaikaiset GSK-3β käyttäen SB216763. AR-positiiviset C4-2-soluja käsiteltiin kasvavia määriä SB216763 48 tuntia ilman androgeenien. Solut hajotettiin ja solujen lysaatit analysoitiin Western-blottauksella AR. p-aktiini bändejä toimi latauskontrollina.

AR-positiivisten CRPC solujen C4-2 ja LNCaP-SSR ovat herkempiä kasvua estäviä vaikutuksia on GSK-3β estäjän SB21676 kuin LNCaP tai AR -negatiivinen PC3-solut

inhibitio GSK-3β on osoitettu estävän leviämisen AR-positiivisten solujen kasvatettiin läsnäollessa fysiologisten androgeenien [27], [32]. Jossa keskitytään CRPC soluissa, tutkimme vaikutuksia SB216763 proliferaatioon PC solulinjojen kasvatettu androgeenin riistää olosuhteissa. Kuten nähdään kuviosta 7A, AR-positiivisia CRPC soluja kasvatettiin ilman androgeenien olivat alttiimpia kasvua estäviä vaikutuksia SB216763 (C4-2 LNCaP-SSR LNCaP). Eräässä ajan myötä kokeessa (Fig. 7B), leviämisen AR-positiivisten CRPC solulinjoja LNCaP-SSR ja C4-2 kasvatettiin 96 h, kun läsnä oli 1 uM SB216763 estyi 26% ja 35% vastaavasti. Sen sijaan leviämisen nopeus vanhempien LNCaP ja AR-negatiivinen PC3 pieneni vain 19% ja 8% viljeltynä samoissa olosuhteissa. Yhteenvetona, AR-positiivisia LNCaP-soluja herkempiä SB216763 hoitoon kuin AR-negatiivinen PC3-soluissa. Vaikutus SB216763 solu- proliferaatioon PC soluja kasvatettiin androgeenista riistää olosuhteissa oli voimakkainta AR-positiivisten CRPC soluja (C4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3) (Fig. 7A, B).

AR-positiivisia LNCaP, LNCaP-SSR ja C4-2-soluja sekä AR-negatiivinen PC3-soluja, käsiteltiin kasvavia määriä SB216763 48 tunnin ajan (A) tai /ilman 1 uM SB216763 0, 24 ja 96 tuntia (B). Proliferaatio mitattiin käyttäen MTT-määritystä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset esitetään alla (A) ilmaistaan% käsittelemättömien kontrollien ± keskihajonta. Tulokset esitetään alla (B) ilmaistaan ​​prosentteina SB216763 käsitellyn /käsittelemätön kontrolli, joka asetettiin 100%, että ajankohtana nolla ± keskihajonta.

GSK-3β säätelee AR-signalointi moduloimalla solunsisäistä lokalisoinnin AR

in vivo

jotta simuloida vaikutuksia GSK-3β esto

in vivo

, käytimme modifioitua poikasen rakkokalvossa ( CAM) malli [25]. SB216763 ruiskutettiin CAM-vein mahdollistaa systeemistä leviämistä yhdisteen kanan alkion-CAM-järjestelmä. Vaikutukset SB216763 annetun Siirto tehty kasvaimen kyhmyjä seurattiin 48 tunnin kuluttua immunohistokemiallisesti. Toisin kuin

in vitro

havainnot paitsi C4-2 vaan myös LNCaP ilmaisi korkea ydinvoiman AR

in vivo

(ydin- AR: LNCaP: 74,6 ± 25,8%, C4-2: 63,4 ± 10%). Sen jälkeen SB216763 käsittely ydinvoiman AR tasot C4-2 soluissa vähenivät 57% 63,3-27,1% 48 tunnin kuluttua (Fig. 8, taulukko 1). Nuclear AR tasot LNCaP pysyi lähes vaikuta SB216763 (LNCaP: käsittelemätön 74,6 ± 25,8%, SB216763 saaneista 76,5 ± 18%) (taulukko 3). Prosenttiosuus PSA-positiivisten solujen oli suurempi C4-2 solulinjassa verrattuna vanhempien LNCaP-solulinjasta (% soluista värjäämällä PSA: LNCaP 3 ± 3,3% vs. C4-2 16,8 ± 10,6%), mikä viittaa siihen, että AR C4-2 on aktiivinen. Sen jälkeen SB216763 hoito lasku ydinvoiman AR C4-2 rinnastettiin väheneminen PSA-positiivisten solujen (hoitamaton C4-2: 16,8 ± 10,6% vs. 3,8 ± 4,7% SB216763 hoidetuilla C4-2) (Fig. 8, taulukko 3).

CAM-määritys suoritettiin C4-2-soluja. Tämän jälkeen ydinvoiman lokalisointi AR ja solunsisäinen PSA jakelu käsittelemättömissä ja SB216763 käsitellyn kasvaimen kyhmyjä (suurennos 400x) suoritettiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. AR-positiivisten solujen on merkitty tähdillä.

Keskustelu

läntisissä teollisuusmaissa, PC esittelee vakava terveysongelma ja on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista iäkkäillä miehillä. Vaikka PC on hyvin heterogeeninen sen etiologiassa, androgen signalointi on keskeinen tekijä kehittymistä ja etenemistä PC. Aluksi PC solut riippuvat pitkälti androgeenien kasvua ja selviytymistä. Tämän seurauksena hormonaalisen hoidon joissa androgeenireseptorin ehtyminen kirurginen tai kemiallinen kastraatio, samoin kuin saarto androgeenireseptorin kanssa antiandrogeenit, on tullut tavallinen hoito pitkälle tai etäpesäkkeitä. Kuitenkin hyötyvät hormonitoimintaa hoitoja kehittyneiden PC on vain ohimenevä. Kuluessa noin 2 vuotta, lähes kaikki eturauhassyövät edetä kastraatiotasolle kestävä tila sairaus, jossa ne eivät enää vastaa standardin hormonitoimintaa hoitoja. Aiemmin on oletettu, että tila CRPC johtui kloonivalinnan AR-negatiivisia soluja. Tämä olettamus perustuu pääasiassa Dunning rotan kasvain malli, jossa kehitystä androgen-tunteeton tilaan liittyy menetys AR tuumorisoluissa aikana androgen peruuttamista. Kuitenkin kliiniset tutkimukset osoittivat, että AR on harvoin menetetään mutta usein lisääntynyt CRPC kasvain näytteet ja niiden etäpesäkkeiden [5], [6], [34], [35]. Se, että koska androgeeni ärsykkeiden monia samoja geenejä, jotka korotetaan androgeenien androgeeniriippuvaisissa PC tulee koholla CRPC tukee käsitystä konstitutiivisesti aktiivisen AR proteiinien CRPC soluihin [36]. Tätä olettamusta tukee myös havainto, että häiriöt Jälleenkytkentätoiminto estää leviämisen CRPC soluja kasvatettiin ilman androgeenien [37].

Tässä raportissa käytetyt AR-positiivisten LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaP-SSR jotka molemmat tiedetään kasvaa ja hengissä alle androgen-riistää edellytyksin kuin

in vitro

kasvain malli CRPC [21], [20]. Pystyimme osoittamaan, että toisin kuin androgeeniriippuvaisen vanhempien LNCaP, kastraatio kestävä LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaR-SSR näytteillä korkea AR ja PSA kun kasvatettiin ilman androgeenien. Mitä mielenkiintoisinta, kasvu solunsisäisen AR proteiinin tasot rinnastettiin kasvu GSK-3β, kaikkialla läsnä seriini treoniinikinaasi osoitettu olevan tärkeä säätelijä AR vakauden

in vitro

[32], [27]. Vaikka tällä hetkellä emme pysty sanomaan, että dysregulaatio GSK-3β tasot vastaa taipumus PC solujen lisääntyminen solunsisäisiä AR-tasolla ja tulossa kastraation kestävä, meidän

in vitro

havainnot ovat sopusoinnussa tuoreen kliinisessä tutkimuksessa osoittaa kertymistä GSK-3β soluissa kastraatio vastustuskykyisten kasvainten [38]. Havaitseminen solunsisäinen korkea PSA tasot C4-2 ja LNCaP-SSR vailla androgeeni ärsykkeitä viittaa siihen, että AR on toiminnallisesti aktiivinen näissä soluissa jopa androgeeni- riistää olosuhteissa.

Jotta tuottaa genomista signaaleja, AR on kuljetettava tumaan. Tässä tutkimuksessa, AR havaittiin olevan pääasiassa ydinvoiman LNCaP-SSR solujen ja C4-2-solujen puuttuessa androgeenien. Syynä androgen riippumaton tumakertymään täyspitkän AR CRPC soluissa edelleen suurelta osin tuntemattomia. Normaaliolosuhteissa tumaansiirtymiseen AR on lisääntynyt dramaattisesti kun hormonia sitova osoitettu LNCaP. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että jotta menevän tuman, AR on käytävä sisäisen konformaatio muutos, joka tuo N- ja C-päät on molekyylin lähellä. Tämä molekyylin sisäisiä konformaation muutoksen avulla aktivointi ja ydinvoiman translokaatiota AR monomeerin, ennen AR dimerointiin, yleensä aiheuttama ligandin sitoutumisen ja tapahtuu vain elävissä soluissa, ei solulysaateista [39], [40], mikä viittaa siihen, että tämä molekyylin sisäisiä uudelleenjärjestelyä AR ei ole proteiini-itsenäisiä, mutta riippuu solutekijöitä. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme transfektoidaan sen jälkeen C4-2 ja LNCaP-solujen ekspressiokonstrukti, joka koodaa villityypin AR fuusioitu vihreä EOS fluoresoiva proteiini (EosFP) [41]. Läsnä ollessa DHT AR-EosFP oli havaittavissa ytimet sekä LNCaP ja C4-2. Kun kasvatettiin ilman DHT, AR-EosFP oli havaittavissa vain ytimet kastraation-resistenttien C4-2 soluissa, mutta ei ytimet androgeeniriippuvaisen LNCaP-soluissa. Tämä havainto on sopusoinnussa Samanlaisessa kokeessa osoittaa vahvaa ydinvoiman lokalisoinnin GFP-leimatun AR transfektoitiin C4-2 soluihin [42]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että ydinvoiman lokalisointi täyspitkän AR CRPC ei välttämättä edellytä hormoni sitovia ja voidaan sen sijaan säädellä muut tekijät.

Kuten viime aikoina osoittanut ryhmämme, lyhyen aikavälin estyminen seriini /treoniini-kinaasi GSK-3β pienmolekyylisalpaajilla indusoi nopean, CRM1 riippuvainen nucleocytoplasmic sukkuloinnin AR androgeeni-käsitellyissä soluissa [19]. Koska GSK-3β yliekspressoituu CRPC soluissa

in vivo ja in vitro

, me arveltu, että entsyymi voi olla osa oletetun proteiinin kompleksin mukana tumakertymään AR. Tätä hypoteesia tukee aiemman havainto osoittaa, että GSK-3β on erittäin fosforyloitu tyrosiini 216 (Y216), aktivointi entsyymin toiminnalle, vuonna C4-2 soluissa [30]. Kasvu GSK-3β

Y216 fosforylaation LNCaP-soluissa DHT hoidossa (Fig. 2) Lisäksi ehdotetaan tärkeä rooli GSK-3β AR signalointi normaaliolosuhteissa. Yrittäessään häiritä hallitseva ydinvoiman lokalisoinnin AR CRPC soluissa, käsittelimme kastraatio kestävä C4-2 ja LNCaP-SSR sekä vanhempien LNCaP kanssa maleimidi SB216763. Tämä erittäin potentti yhdiste tiedetään estävän molekyylin sisäinen tyrosiinikinaasin aktiivisuuden GSK-3β-molekyylin, joista jälkimmäinen on vastuussa sen autofosforylaatiota on Y216 [33]. Kuten kuviosta 2 nähdään, GSK-3β-inhibiittori SB216763 voi vähentää Y216-fosforylaatio GSK-3β LNCaP sekä C4-2-soluissa. Hoidon jälkeen SB216763, ydinvoiman kertyminen AR on castration- kestävä LNCaP alalinjoja C4-2 ja LNCaP-SSR väheni dramaattisesti läsnä, ja mikä tärkeintä puuttuessa, DHT, on voimakkainta C4-2 soluissa (Taulukko 2). Nucleocytoplasmic sukkuloinnin AR jälkeen GSK-3β-inhibitio C4-2-soluja kasvatettiin ilman DHT voitaisiin kumota leptomycin B (LMB), mikä viittaa CRM1 riippuvainen vienti mekanismi (Fig. 5). Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme tunnistaneet CRM1 sidoskohdan C-päähän AR [19]. Koska sen läheisyydessä ligandia sitovan domeenin, me arveltu, että hormoni sitovaa voisi säädellä saavutettavuus CRM1 sitoutumiskohdan, mikä moduloimalla tumasta AR. Havainto, että AR voidaan viedä tumiin CRPC kasvavien solujen puuttuessa androgeenien on tärkeä uusi havainto, mikä osoittaa selvästi, että tumasta AR seuraavista GSK-3β esto ei johdu modulaation hormoni sitovat ominaisuudet reseptorin.

se, että lyhyen aikavälin GSK-3β (max. 4 tuntia), johtaa nopeaan vienti AR sai meidät analysoimaan vaikutuksia pitkän aikavälin estää entsyymin AR positiivisia CRPC-soluissa. Hiljentäminen GSK-3β käyttämällä erityisiä shRNA johti ehtymiseen ydin- AR C4-2 soluissa. Nuclear ehtyminen AR-proteiini oli vähemmän ilmeinen C4-2 kasvatettujen solujen läsnä ollessa AR-vakauttava hormoni DHT. Vaikka nämä tulokset tukevat oletusta, että GSK-3β laukaisee nucleocytoplasmic sukkuloimisen AR, datan johdettu pitkän aikavälin shRNA-kokeissa on tulkittava huolellisesti. Lyhytaikainen GSK-3β aktiivisuutta pieniä molekyylejä kuten SB216763 toistuvasti osoitettu aiheuttavan nopean, CRM1 riippuva tumasta AR PC-soluissa [19], [32]. Toisin kuin nämä tulokset pitkän aikavälin GSK-3β aiheutti proteasomaalisten hajoamista AR proteiini [32]. Koska GSK-3β laukaisee AR lokalisointi sekä AR vakautta oletamme, että dramaattinen ehtyminen ydin- AR C4-2 soluissa GSK-3β hiljentäminen johtuu yhdistelmä tumasta ja proteasomaalisten hajoamista reseptorin molekyylin.

se, että GSK-3β vaikuttaa Jälleenkytkentätoiminto sekä AR vakaus sai meidät analysoimaan vaikutuksia GSK-3β estoa leviämisen PC-solujen

in vitro

. Hoitovaste PC solujen SB216763 oli voimakkainta AR-positiivisten CRPC soluja (solujen kasvun esto: C4-2 LNCaP-SSR LNCaP PC3). Kyky SB216763 inhiboida solujen lisääntymistä rinnastettiin sen kyky indusoida CRM1 riippuvainen vienti AR PC-soluissa.

Jotta tehokkuuden testaamiseksi GSK-3β-inhibiittorit mahdollisina terapeuttisina aineina, me laajensi tutkimukset CAM-ksenograftimallissa. Yllätykseksemme AR oli pääasiassa ydinvoiman LNCaP ksenografteissa sekä C4-2 ksenografteissa. Mahdollinen selitys tälle voisi olla tuotantoa androgeenien jonka isäntäorganismi. Lisäksi AR LNCaP ja sen johdannaiset on mukana pistemutaatio (T877A) johtaa avoimeen AR, joka voi, ainakin osittain, voidaan aktivoida erilaisia ​​ei-androgeenisten steroidien [43], [44]. Kuitenkin AR C4-2 verrattuna AR että vanhempien LNCaP on aktiivisempi CAM-ksenograftimallia, minkä osoittivat solunsisäisten PSA-arvot (positiivisten solujen PSA: LNCaP 3,1% ja C4-2 16,8% ). Jälkeen 48 tunnin hoidon SB216763, ydin- AR tasot C4-2 solujen väheni merkitsevästi, joka rinnastettiin huomattavaa vähentämistä solunsisäisiä PSA tasolla. Toisin kuin tulokset C4-2-soluissa vaikutukset AR ja PSA: n LNCaP-soluissa on jäänyt vähäiseksi.

Yhdessä meidän tutkimus osoittaa, että (1) yliekspressio AR CpRC soluissa rinnan lisääntyminen solunsisäisen GSK-3β, (2) vaikutukset GSK-3β on AR signalointi eivät johdu modulaation DHT sitoutumisen AR, (3) ydin kertyminen AR CRPC soluissa ei ole itsenäinen toiminto mutatoitunut AR-reseptorin mutta välittyy vapautuneilla cellular tekijät, kuten GSK-3β, (4) GSK-3β ja CRM1 ovat osa oletetun kompleksin ohjaamiseksi lokalisoituminen tumaan AR CRPC soluissa, ja (5) GSK-3β aktiivisuutta pienmolekyylisalpaajien sai aikaan nopean tumasta AR CRPC soluissa

in vitro

ja

in vivo

siten moduloi AR signalointi.

riippuvuus CRPC on kopiointia ajatellen aktiiviseen AR on resurged kiinnostusta Inhibiittoreiden kohdistaminen AR tai androgen akselilla. Seuraavan sukupolven hormonihoitojen tunnistaa siitä, että CRPC AR voidaan aktivoida luontainen pehmopaperin androgeenien sekä peptidi kasvutekijöitä. Niistä hormonaaliset aineet testataan parhaillaan ovat CYP17 estäjiä kuten abirateronin, TAK-700 ja TOK-001 tai toisen sukupolven antiandrogeeninen MDV-3100 [45]. Pienmolekyylisalpaajien kuten EPI-001 ja sintokamide kohdistaminen transaktivaatiodomeenin N-päähän AR ovat osoittaneet rohkaisevia tuloksia in vitro sekä eläinkokeissa [46], [47].