Krooninen sairaus

tiivistelmä

lisäravinteena seleenin ja vihreää teetä lupaava syövän ehkäisyyn. Tässä tutkimuksessa arvioimme tehokkuudet seleenin ja vihreää teetä annettiin erikseen ja yhdessä vastaan ​​peräsuolen syövän käytettäessä azoxymethane (AOM) aiheuttaman rotan paksusuolen syövän synnyn malli ja määrittää taustalla olevien mekanismien suojeluun. Neljän viikon ikäisiä Sprague-Dawley rotille syötettiin ruokavalion sisälsi 0,5% vihreän teen uutetta, 1 ppm seleeniä seleeni-rikastettu maitoproteiini, tai yhdistelmä 1 ppm seleeniä ja 0,5% vihreän teen uutetta. Eläimet saivat 2 AOM (15 mg /kg) hoidot indusoivat paksusuolen kasvaimen synnyssä. Rotat tapettiin 8 tai 30 vk myöhemmin, kun viimeinen AOM tutkia vaikutusta ruokavalion intervention poikkeavaan crypt pesäkkeitä (ACF) muodostuminen tai kasvainten kehittymistä. On uhri, kaksoispisteet tutkittiin ACF ja kasvaimia, mRNA tasot

SFRP5

ja

sykliini D1

, ja proteiinit tasot beta-kateniinin, COX-2, Ki-67, DNMT1 ja asetyyli histoni H3. Yhdistelmä seleenin ja vihreää teetä johti merkittävään lisäaine esto suurten ACF muodostumista, tämä vaikutus oli suurempi kuin joko seleenin tai vihreää teetä yksin,

P

0,01; yhdistelmä oli myös merkittävä additiivinen eston vaikutus kaikkiin kasvain päätepisteitä vaikutus yhdistelmän ruokavalion kasvaimen esiintymistiheys, moninaisuus ja koko oli suurempi kuin seleeniä tai vihreää teetä yksin,

P

0,01. Rottia ruokitaan yhdistelmä ruokavalio osoitti selvää vähenemistä DNMT1 ilmaisun ja induktio histoni H3 asetylointi, joka oli liitetty palauttaminen

SFRP5

mRNA normaalipainoisilla esiintyvät paksusuolen crypts. Yhdistelmä ruokavalio vähensi merkitsevästi myös SS-kateniinin tumaansiirtymiseen,

sykliini D1

ilmaisun ja solujen lisääntymistä. Nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että yhdistelmä seleeni ja vihreää teetä on tehokkaampi tukahduttamaan peräsuolen oncogenesis kuin kummallakaan aineella yksinään. Ehkäisevä vaikutus liittyy sääntely geneettisten ja epigeneettiset biomarkkereita sekaantunut paksusuolen syövän syntymistä.

Citation: Hu Y, McIntosh GH, Le Leu RK, Nyskohus LS, Woodman RJ, Young GP (2013) yhdistelmä Seleeni ja Green Tea Parantaa teho kemopreventioon rotan peräsuolen syövän Malli moduloimalla Genetic ja Epigeneettiset Biomarkers. PLoS ONE 8 (5): e64362. doi: 10,1371 /journal.pone.0064362

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 joulukuu 2012; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 23, 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki toimitti National Health ja Medical Research Council apurahan ja Syöpä neuvoston South Australia (hanke numero 1007501 ja 525925). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syövän (CRC) on yksi johtavista syistä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti; eri muihin syöpiin, että on tärkeää ympäristön altistuksen (erityisesti ruokavalio) etiologiassa CRC korostaa se, että 50%: n syy johtuu familiaalinen tekijät, kun taas ravinnon tekijät vaikuttavat jopa 70% [1] . Erityisiä ruokavaliostrategiat saattaa osoittautua arvokkaiksi suojaamaan syöpää [2]. Tässä suhteessa yhdistysten ruokavalion ja elintapojen on perustettu CRC ehkäisyyn, ja on arvioitu, että 30-50% CRC voitaisiin potentiaalisesti ehkäistävissä vievää terveellistä ruokavaliota [3].

Viime vuosina , luonnossa esiintyviä aineita esiintyy mitä syömme tai juoda ovat kiinnittäneet paljon huomiota niiden kyvystä syövän ehkäisyyn ja /tai hoitoon, koska niiden eri terveysvaikutuksia ja laaja turvamarginaali [2], [4]. Seleeni (Se), tärkeä jäljittää hivenaine, ja vihreä tee, yleisin juoma kulutetaan maailmassa on todettu kemopreventiivisiä aineita erilaisiin syöpiin. Epidemiologisia, kliiniset ja prekliinisissä tutkimuksissa ehdottaa käänteinen suhde seleenin saanti, vihreää teetä kulutuksen ja riski tiettyjen syöpien [5] – [7]. Tutkimukset eläinmalleja ovat myös osoittaneet, että seleeni ja vihreä tee on laaja valikoima ennaltaehkäiseviä tehoaa CRC [8] – [10]. Huolimatta lupaavia tuloksia prekliinisissä asetuksista, nykyinen kliininen tutkimus liittyvien tietojen Se ja vihreää teetä ravintolisistä eivät ole vakuuttavia riittävän yleinen suositus käyttää sellaisenaan tai vihreää teetä tehokas aine kemopreventioon syöpää [11] – [13] . Rajoitus Yksittäisen ruokavalion aineena tehokkaan ehkäisyn saattaa johtua heikompina ravinnon aineita, kun taas luonnollinen yhdisteet ovat osoittaneet suurempaa aktiivisuutta, kun niitä on läsnä seoksessa [14]. Voisi olla mahdollista saavuttaa lisäaineen tai synergistisiä ehkäiseviä vaikutuksia yhdistämällä ravinnon aineita, jotka aiheuttavat täydentäviä mekanismeja niiden anti-syöpää aiheuttaville [2], [15], [16]. Huomattavia tietoja ihmisten ja eläinten tutkimukset osoittavat, että yhdistelmät ravinnon aineet ovat tehokkaampia kuin yksi edustaja [17], [18]. Esimerkiksi vihreä tee on osoitettu synergistisesti tai additiivisesti tehokkuuden lisäämiseksi muiden lääkkeiden tai ruokavalion aineet

in vitro

ja

in vivo

[19] – [22].

kasvusta huolimatta korot chemopreventive rooli seleenin tai vihreää teetä, ei tiedetä, onko yhdistelmä se ja vihreä tee on suotuisa chemopreventive vaikutus CRC. Vaikka prekliinisiä ja kliinisiä raportteja yhdistämällä Se ja vihreää teetä puuttuu, yhdistelmä lähestymistavat Se tai vihreää teetä on tutkittu paksusuolen syöpää ja muita syöpää malleja [23]. Esimerkiksi yhdistelmä Se ja genisteiinin on osoitettu estävän rintasyövän rottamallissa [24]; yhdistelmä Se ja E-vitamiinia on tarjonnut suurempaa suojaa ruokatorven syövän syntymistä rotilla [22]. Yhdistelmä vihreää teetä ja kurkuma tai yhdistelmä vihreää teetä ja sulindaakki on johtanut synergistinen chemopreventive vaikutus käytettäessä AOM CRC malli [25], [26].

Se ja vihreää teetä ovat erityisen kiinnostavia yhdistelmänä ei vain koska ne voidaan helposti samanaikaisesti ravinnossa, vaan koska ne ovat potentiaalisesti toisiaan täydentävät vaikutusmekanismit. Apoptotic poisto ja DNA korjaus entsyymi O

6-alkylguanine DNA alkyltransferase (MGMT) -välitteisen DNA korjaukseen kaksi tärkeää luontainen soluvasteiden ympäristö- karsinogeeni aiheuttama onkogeenisiä DNA vaurioita. Vihreä tee on osoitettu säätää ylös MGMT aktiivisuus rotan paksusuolessa aikaisemmassa tutkimuksessa (julkaisematon data) mukaan epigeneettisestä mekanismia, jonka odotetaan korjata adduktin tyypistä aiheuttama azoxymethane (AOM) [27]. Ruokavalion Se on osoitettu tiimimme aktivoimaan apoptoottisen poiston AOM-vaikuttanut solujen [28]. Olemme hypoteesin, että riski CRC vähennetään yhdistämällä aineita, jotka kohdistuvat eri näkökohtia luontaisia ​​soluvasteiden kasvaimia DNA vaurioita. Tätä perustellaan sillä, että CRC on pitkä aluksi latenssiaika, liittyy useita vaiheita ja polkuja, ja monimuotoiset lähestymistapa voi samanaikaisesti säädellä useita molekyyli- ja solutason tavoitteita mukana prosessissa CRC [29].

lisääntynyt ymmärrys CRC klo epigeneettiset /geneettinen tasoilla avaa mahdollisuuksia myös keskeyttää ja kääntää taudin alkamisen ja etenemisen CRC ja tarjoaa monia kohteita ruokavalion intervention [30]. AOM-indusoitu CRC mallia on käytetty laajalti sekä mekanistisiin ja chemepreventive tutkimuksia [31], koska se on yhteenveto monia kliinisiä, patologisia, ja molekyyli- ominaisuudet ihmisen CRC, kuten preneoplastiset leesiot, poikkeava crypt foci (ACF), mutaatioita

K-ras

onkogeeni, ja sääntelyn purkaminen signalointireiteissä WNT /SS-kateniinin ja tulehdus [31], [32]. Vaikka roolit WNT-antagonistit (kuten eritetyt frizzled liittyvät proteiinit (SFRP: t)), DNA: n metyylitransferaaseja (DNMT) ja histoni deasetylointi ihmisen paksusuolen syövän synnyssä on hyvin dokumentoitu, ilmaus DNMT1, SFRR5 ja asetylointi histoni H3 tässä mallissa ovat suurelta osin tuntemattomia; joka pelaa ratkaiseva rooli kehittymistä ja etenemistä ihmisen paksusuolen syövistä [33] – [35]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida chemopreventive vaikutusta yhdistämällä ravinnon tekijöiden seleenin ja vihreää teetä vastaan ​​paksusuolen syövän synnyn käyttämällä ACF ja paksusuolen kasvainten päätepisteitä. Tämän vaikutukset yhdistelmä geneettisiä /epigeneettiset biomarkkerit tutkittiin.

Methods

reagenssit

AOM ja vihreän teen uutetta ostettiin Sigma-Aldrich Pty. Ltd. Vihreä teen uutetta (P1204) sisältää 65% catechin lukien 34,5% epigallokatekiinigallaatti (EGCG). Maitoproteiinia (0.34ppm Se) ja Se-rikastettu maitoproteiinia (5 ppm Se) toimitti Tatura Milk Industries (VIC, Australia) [28]. Se rikastetun maidon proteiini sisältää 83% selenometioniini, 5% selenokysteiini ja 4% tuntemattomia komponentteja [36].

Eläimet

yhteensä 160 Sprague-Dawley-rottia saatiin Animal Resource Centre, Adelaide University, Australia. Tutkimuksen hyväksyi Animal Welfare komitean Flinders University (# 651/07). Suoritettiin kaksi koetta, 60 rotat ACF-kokeen ja 100 pitkän aikavälin kasvaimen kokeessa.

Kutakin koetta varten rotat jaettiin satunnaisesti 4 yhtä suuri kuin koe-ryhmässä (verrattavissa alkuperäisen painon), joka sijaitsee muovihäkkeihin (neljä häkkiä kohti) ja pidettiin lämpötila ja kosteus-ohjattu eläin laitos, jossa on 12 tunnin valo /pimeä sykli 22 ± 2 ° C lämpötilassa ja 80 ± 10%: n kosteudessa. Rotille annettiin vapaasti vettä, punnitaan viikoittain ja seurattiin tarkasti kliinisten sairauden merkit koko tutkimuksen ajan. Rotat näkymisen sairas tapettiin välittömästi.

Ruokavalion

koedieettejä perustuivat modifioitu AIN-76A ruokavalion ja sisälsi 19% auringonkukkaöljyä paino- jotta ”inhimillistää” rasvan osuus energian saanti ~35% [28]. Maitoproteiini käytettiin proteiinin lähde ohjaus ja vihreää teetä ruokavalion; Se-rikastettu maitoproteiini käytettiin proteiini sekä täydentävän Se lähde korkea Se ruokavalion ja yhdistelmä ruokavalio; ohjaus ruokavalio ei sisältänyt Se eikä vihreää teetä. Valittavana 0,5% vihreää teetä perustui aikaisemmassa tutkimuksessa, että tämä saanti huomattavasti MGMT ilmaisu (mRNA ja aktiivisuus) rotan kaksoispisteet (julkaisematon data). Tämä annos sisältää 172,5 mg EGCG /100 g ruokavaliosta ja antaa 25,9 mg EGCG /rotta /päivä, joka silloin, kun lasketut ruumiinpainoon antaisi vastaava saanti aikuisen ihmisen 3-4 kupillista vihreää teetä päivässä. Tämä ruokinta hoito oli hyvin siedetty eläimillä [37]. 1 ppm Se valittiin sillä aiemmat tutkimukset osoittivat, että seleeni-rikastettu maito proteiinia 1ppm merkittävästi suojattu koolonsyöpien hiirissä [28]. Ruokavalion valmistettiin tuoreena 4 viikon välein, pelletoitiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Tiedot ruokavalion annetaan taulukossa 1.

Koe 1 (ACF tutkimus) B

Alkaa 5 vk iässä rotat (15 /ryhmä) syötettiin kutakin neljää ruokavalion . Sen jälkeen 2 vk ruokavalion, rotat saivat 2 AOM injektiota (15 mg /kg) yhden wk toisistaan. Rotat pysyivät ruokavalion koko tutkimuksen kunnes tappoivat CO

2 tukehtumisen 8 vk kuluttua viimeisestä AOM injektio (kuvio 1A). Kaksoispisteet avattiin tasainen yön hibond C paperille ACF analyysiä. Kun analyysi, distaalinen segmentti normaali-näkymästä paksusuoli (2 cm) leikattiin ja värjättiin Ki-67, COX-2 ja β-kateniinin aineita (12 /ryhmä).

ACF tutkimus (A): rottaryhmiä (n = 15) olivat ravintokontrolliryhmä, Se, vihreä tee tai ruokavalion sisältävien Se ja vihreät vuotiaana 5 vk. 2 wk myöhemmin rotille annettiin 15 (mg /kg /kehon painoa) AOM, kerran viikossa 2 vk. 8 vk kuluttua viimeisen AOM hoidon, rotat tapettiin ja kaksoispisteet arvioitiin ACF; normaali-näkymästä crypts tutkittiin myös β-kateniinin, COX-2 ja Ki-67 ilme. Kasvaimen tutkimus (B): rottaryhmiä (n = 25) syötettiin ohjaus, Se, vihreä tee tai ruokavalion sisältävien Se ja vihreät vuotiaana 5 vk. Rotille annettiin kaksi viikoittaista AOM hoitoja samanlainen ACF tutkimus. 30 vk jälkeen AOM hoidon, rotat tapettiin ja kaksoispisteet olivat historiallisesti arvioitiin kasvaimen tuloksia; normaali-näkymästä crypts tutkittiin myös β-kateniinin, DNMT1, Ac-H3 sekä

SFRP5

ja

sykliini D1

ilme.

Koe 2 ( kasvaimen tutkimus) B

5 wk ikäisille rotille (25 /ryhmä) syötettiin kutakin neljää ruokavalion, samanlainen ACF tutkimuksessa. Rotat saivat 2 viikoittaista AOM injektiota (15 mg /kg), mutta kuoli 30 vk kuluttua viimeisestä AOM (kuvio 1 B). Kaksoispisteet tutkittiin kasvaimen päätepisteitä ja jatkojalostetaan histopatologiselle. Distaalinen segmentti normaali-näkymästä paksusuoli (2 cm) ilman kasvainten leikeltiin immunohistokemiaan of β-kateniinin, DNMT1 ja asetyloidut histoni H3 (Ac-H3) (12 /ryhmä) tai jäädytettiin nestetyppeen western blot-analyysi (6 /ryhmä) tai sijoittaa RNAlater (Ambion) kvantitatiivista RT-PCR-analyysi (6 /ryhmä).

kvantifiointi ACF

Colons värjättiin 0,1% metyleenisiniliuoksella ja arvioidaan × 40 suurennus käyttäen preparointimikroskooppia sokea scoring menettely. Kokonaismäärä ACF koko paksusuoli pisteytettiin distaalisesta proksimaaliseen päähän paksusuolen. ACF oli erotettavissa ympäröivään terveeseen crypts niiden suurempi koko, kohonnut ulkonäkö ja raon kuten muoto luminal aukon. Crypt moninaisuus määriteltiin määrä kryptissa kussakin keskittyä, ja luokiteltu pieni (1-3 crypts /tarkennus) ja suuret ACF (4 tai enemmän crypts /tarkennus).

histopatologia kasvainten

lukumäärä, sijainti ja koko kunkin kasvaimen pisteytettiin riippumaton tarkkailija tietämätön ravinnon hoidon. Kasvaimet luokiteltiin ja -adenokarsinoomien kuten aiemmin on kuvattu meidän [28]. Endpoints olivat paksusuolen kasvaimen esiintymistiheys (eli osuutta rottien kanssa kasvaimia, joissa adenoomia tai adenokarsinoomat), kasvainten lukumäärää (kasvainten määrä /rotta) ja kasvaimen koko (kasvaimen koko /rotta). Kasvaimen koko lasketaan kaavalla: log

10 [Σ (π (diameter1 + läpimitta 2))

2/2] [38].

immunohistokemiallinen analyysi

ensisijainen vasta-aineita Ki-67 (MIB-5, # M7248) hankittiin Dako, Australia; COX-2 (M-19-R, # SC-1747-R), β-kateniinin (E5, # SC-7963) ja DNMT1 (H-300 # SC-2701) Santa Cruz Biotechnology, Australia ja Ac-H3 (Lys9 /Lys14, # 9677) Cell signalointi, USA. Yksityiskohtaiset menettelyt immunohistokemiallista analyysiä raportoitu aiemmin [28]. Lyhyesti, antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla osiot 0,1 M sitraattipuskuria painekeittimeen muovialtaassa 1 tunnin ajan. Leikkeitä inkuboitiin Ki-67-vasta-aine (1:1000), COX-2-vasta-aine (1:500), β-kateniinin-vasta-aine (1:1,000), DNMT1 vasta-aine (1:2,000), ja Ac-H3-vasta-ainetta (1: 5000) yli yön inkuboinnin jälkeen 3% H

2O

2 20 min. Detection Ki-67: n ja COX-2 on biotinyloidun sekundaarisen kanin anti-hiiri-vasta-aine (1:200) (Dako) 30 min ja avidiini /biotinyloitu peroksidaasi-kompleksia (Signet Laboratories) 20 minuuttia. Detection DNMT1 ja β-kateniinin suoritettiin HRP polymeeriä linkin. Objektilasit visualisoitiin inkuboimalla 3′-diaminobenzamine alustaan ​​ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Positiivinen värjäys tunnistettiin punaruskea sakka tumaan Ki-67, DNMT1 ja Ac-H3, sytoplasmaan COX-2 ja kalvo /ytimenä β-kateniinin. 20 ehjä kohtisuorassa hyvin suuntautunut normaali-näkymästä crypts (ulottuu lihaksikas limakalvon paksusuolen onteloon) tutkittiin jokaista paksusuolen näytteestä. Indeksi paksusuolen imukerässoluista ilmentävät Ki-67, COX-2, DNMT1 ja Ac-H3 laskettiin useita myönteisiä solua krypta sarake jaettuna solujen lukumäärä kerrottuna 100. Kalvon ja ydin- värjätään β-kateniinin solut laskettiin erikseen. Epänormaali ilmentyminen β-kateniinin, DNMT1 ja Ac-H3 tutkittiin myös kasvaimen kudoksissa.

Western Blot analyysi

alikvootteja normaali-näkymästä paksusuolen kudokset Kuudesta rotasta ryhmää kohti yhdistettiin ja homogenoitiin jääkylmässä lyysipuskuria (50 mM Tris, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF ja proteaasi-inhibiittoreita) ja sentrifugoitiin (14000 x g 25 minuutin ajan 4 ° C: ssa) . Pitoisuus proteiinia supernatanteissa määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä. Yhtä suuret määrät proteiineja (30 ug) erotettiin 4-20% SDS-PAGE-geeleillä, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle käyttäen puolikuiva ja membraani blokattiin kuoritun maidon 5%, tutkittiin β-kateniinin, DNMT1 ja Ac-H3-vasta-aineita ja värjättiin sekundäärisellä vasta-aineella (piparjuuriperoksidaasi-leimattua anti-kani-IgG- tai vuohen anti-hiiri-IgG). Western blot toistettiin kolme kertaa kullekin näytteelle. Immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin valoa ilmaiseva kit. Kukin kalvo uudelleen tutkittiin anti-β-aktiini-vasta-aine (Sigma) tai anti-histoni H3-ainetta (# 4499, Soluviestintä). Band intensiteetit β-kateniinin, DNMT1were kvantifioidaan Image J ja normalisoitu β-aktiini, kun taas bändi intensiteetti Ac-H3 normalisoitui H3 histoni. Tulokset on esitetty suhteessa p-aktiini tai H3 histoni.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin rotan kaksoispisteet käyttäen QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Saksa). Pitoisuus ja puhtaus kokonais-RNA arvioitiin käyttämällä NanoDrop® ND-1000 UV-Vis-spektrofotometrillä mittaamalla absorbanssi 260 ja 280 nm: ssä. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin 0,3 ug kokonais-RNA: ta jokaisesta näytteestä käyttäen QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit.

SFRP5

ja

sykliini D1

geenejä yhteistyössä monistettiin

GAPDH

geeni, joka toimi taloudenhoito geeni. Alukkeet

SFRP5

geeni hankittiin Qiagne, Rn_Sfrp5_1_SG QuantiTect Primer määritykset (NM_001107591, XM_001055342, XM_219887, XM_347305- Cat # QT01624056). Alukkeet

sykliini D1

geenin (NM_171992) olivat 5′-ATGAGAACAAGCAGATCATCC-3 ’(forward-aluke) ja 5′-TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTG-3’ (Reverse Primer). Alukkeet

GAPDH

geenin (NM_017008) olivat 5′-AACATCATCCCTGCATCCAC-3 ’(forward-aluke) ja 5′-TTGAAGTCRCAGGAGACAAC-3’ (Reverse Primer). Reaaliaikainen PCR suoritettiin QuantiTect SYBR Green PCR Kit on Roottorin Gene 3000 Cycler (Corbett, Australia). Pyöräily olosuhteet 40 sykliä oli 94 ° C /15 s, 55 ° C /30 s ja 72 ° C /30 s. Kukin näyte ajettiin kolmikon toista ja normalisoidaan

GAPDH

. Kunkin PCR aikavälillä ei-mallin Reaktio Negatiivisina verrokkeina mukaan. Kaikki PCR analysoitiin Q-Gene ohjelmistoja kuten aiemmin on kuvattu [36], [39].

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS versio 17.0 (SPSS Inc., Chicago , Illinois) ja Stata versio 11.1 (StataCorp, Texas). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvosta normaalisti jakautunut tietoja. Välillä-ryhmä vertailuja painon, Ki-67, COX-2, β-kateniinin, DNMT1, Ac-H3,

SFRP5

ja

sykliini D1

suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA korjaus monimuuttujille Tukeyn post hoc testi,

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti ryhmien välillä. Välillä-ryhmä vertailuja ACF laskee ja kasvainten toimenpiteiden arvioitiin mukaan 2 x 2 Faktorisuunnitelmat vihreää teetä ja asetu koska kaksi päätekijää. Binary logistinen ja negatiivinen binomiselle regressiomalleja käytettiin testata tärkeimmät vaikutukset vihreää teetä ja Se ja mahdollisten vuorovaikutuksia välillä vihreää teetä ja Se. Post-hoc-vertailut kullekin 3 intervention ruokavalion kanssa verrokkiruoalla kuin vertailuryhmä, sekä vertailua varten yhdistelmä ruokavalion kanssa Se yksinään tai vihreää teetä yksin suoritettiin myös.

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä kullekin pääasiallinen vaikutus ja vuorovaikutus.

Tulokset

Yleinen huomautus

Ruokavalion otettiin hyvin vastaan ja kuluttavat neljä rotta ryhmää. Kaikki rotat riippumatta ruokavalion intervention ryhmä osoitti normaalia painonnousua aikana kahdessa kokeessa (tuloksia ei esitetty); ei ollut merkittävää eroa ravinnon kulutuksen välillä ravinnon ryhmiä. Tutkiminen ohutsuolessa, maksan ja munuaisten ei havaittu poikkeavuuksia kummassakaan tutkimuksessa, mikä osoittaa ruokavaliota täydennettiin 1ppm Se eli 0,5% vihreää teetä, tai yhdistelmä Se ja vihreä tee ei aiheuta minkäänlaista avointa myrkyllisyyttä. Kuusi sairas rotat tapettiin ennen päättämistä kasvain tutkimuksen; ne jaettiin poikki kolmessa hoitoryhmässä ja kasvaimen päätepisteet nämä rotat eivät pystyneet sisällytetä.

Yhdistelmä ruokavalio estää tehokkaasti ACF muodostumista AOM mallissa

AOM aiheuttama ACF havaittu etupäässä distaalisessa ja keskimmäinen paksusuolen. Vaikutukset seleenin, vihreää teetä ja yhdistelmä ruokavalion ACF muodostumiseen on esitetty taulukossa 2. Vaikka kokonaismäärä ACF /rotta meidän Tutkimus hieman pienempi kuin muut aiemmin julkaistut tutkimukset [40], rotille syötettiin vihreä tee yksin oli mitään vaikutusta koko ACF ja pieni ACF /rotta, vaikka se vähensi suuri ACF /rotta,

P

0,05, verrattuna syötetään verrokkiruoalla. Sen sijaan kaikkien luokkien ACF crypt moninaisuus (yhteensä, pienten ja suurten ACF /rotta) oli merkitsevästi pienempi Se yksinään (

P

0,05) ja yhdistelmä ruokavalio (

P

0,05 yhdistelmälle ruokavalio verrattuna kunkin vihreää teetä ja Se).

yhdistelmä ruokavalio estää tehokkaasti kasvaimen muodostumista AOM mallissa

merkittävä määrän vähentyminen ACF ovat sopusoinnussa alemman kasvaintaakat havaittiin rotat saivat yhdistelmähoitona ruokavalio (taulukko 3). Oli merkittävä vuorovaikutus Se ja vihreää teetä,

P

0,05, jossa yhdistelmä ruokavalio osoittaa lisäaine estävä vaikutus kaikissa kasvaimen päätepisteitä suhteessa yhden ruokavalion ainetta vihreää teetä tai Se,

P

0,01. Kasvain esiintyvyys, moninaisuus ja kasvaimen koko vähennettiin 73,9, 80,4%, 73,4% vs. vihreää teetä ruokavalio, ja 65,2%, 72,7%, 63% vs. Se ruokavaliosta, tässä järjestyksessä. Vihreä tee yksin ei merkittävästi vaikuta kasvain päätepisteen, kun taas Se yksin oli vähemmän tehokas kuin yhdistelmä ruokavalion. Analyysi vaikutusta ruokavalion intervention syövän syntymisessä konkreettisesti suoritettu jälkeen histopatologinen tutkimus kasvaimia. Ilmaantuvuus adenooma valvonnassa, vihreää teetä, Se ja yhdistelmä ruokavalion olivat 26,1%, 20,8%, 16,7% ja 4,3%, tässä järjestyksessä. Oli merkittävä väheneminen rotilla ruokki yhdistelmä ruokavalio, se väheni 79,3% vs. vihreää teetä ruokavalio, ja 74,2% vs. Se ruokavalio,

P

0,01, tässä järjestyksessä. Ilmaantuvuus adenokarsinooman pienennettiin samanlaista mallia; 17,4% rotilla ruokittu ohjaus ruokavalio verrattuna 4,3% näissä syötetty yhdistelmä ruokavalio, kun taas vihreä tee yksin ilmaantuvuus oli 12,5% ja seleenin yksin ilmaantuvuus oli 8,3%. Huomattavaa on, että yhdistelmä ruokavalio vähensi adenokarsinooman 65,6% vs. vihreää teetä ruokavalio, ja 48,2% vs. Se ruokavalio, mutta luvut olivat pieniä ja tulokset eivät saavuttaneet merkitystä.

yhdistelmä ruokavalio ehkäisee AOM aiheuttama ß-kateniinin tumaansiirtymiseen, COX-2: n ilmentymisen ja solujen lisääntymistä

Effects seleenin, vihreää teetä ja yhdistelmä ruokavalion ß-kateniinin, COX-2 ja Ki-67 ilmentyminen tutkittiin histologisesti normaali-näkymästä crypts päässä ACF tutkimuksessa. Ensin verrataan värjäysrintamaan ß-kateniinin välillä AOM-käsittelemättömän normaalia kryptat ja AOM-käsitelty crypts. ß-kateniinin värjäytyminen normaalissa kryptissa käsittelemättömien rotilla oli alhainen beta-kateniinin värjäys rajoitettu solukalvon, rajoitettu tumavärjäystä (kuvio 2A), kun taas kryptissa mistä AOM-käsiteltyjen rottien osoittivat lisääntynyttä värjäys beta-kateniinin tumassa (kuvio 2B). Vertailu beta-kateniinin kalvo ja tumavärjäystä soluja varten 4 ravinnon ryhmät esitetään kuviossa 2B ja kuviossa 2C. Se yksin, vihreä tee yksin ja yhdistelmä ei vaikuttanut solujen prosenttiosuus positiivisia ß-kateniinin solukalvojen värjäytymistä. Mutta Se yksin (

P

0,05) ja yhdistelmä ruokavalio (

P

0,01) vähensi merkittävästi solujen prosenttiosuus positiivisia ß-kateniinin tumavärjäystä, kontrolliin verrattuna, ilman merkittävää eroa Se yksinään ja yhdistelmä ruokavalio, kun taas vihreä tee yksin ei vähentänyt ß-kateniinin tumavärjäystä. Solujen prosenttiosuus näytetään Ki-67 tumavärjäystä alennettiin samalla ohjeeseen Se yksinään (

P

0,05) ja yhdistelmä ruokavalio (

P

0,01), vihreä tee yksinään ei vaikuttanut solujen lisääntymistä (kuvio 2B ja 2D), jossa on alhainen Ki-67 värjäytymisen AOM-käsittelemätöntä normaalia crypts (kuvio 2A). Vertasimme myös värjäyskuvion COX-2 välillä AOM-käsittelemättömän normaalia kryptat ja AOM-käsitellyn normaali esiintyvät crypts. AOM käsittelemättömän rotilla oli alhainen sytoplasmista värjäytymistä COX-2 paksusuolessa (kuvio 2A), kun taas AOM-käsitellyillä rotilla oli kohonnut värjäytymisen COX-2 (kuvio 2B). Huomasimme, että kaikki kolme ruokavaliot estivät merkittävästi COX-2 sytoplasmista värjäytymistä (

P

0,05) verrattuna ohjaus, ei ollut merkitsevää eroa koe ruokavalion (kuvio 2B ja 2D).

edustaja osassa immunohistokemiallisella värjäyksellä β-kateniinin, Ki-67and COX-2 in AOM-käsittelemätöntä normaalia crypts (A), AOM-käsiteltyjen normaali esiintyvät crypts kontrollista, vihreä tee, Se ja yhdistelmä ruokavalio (B ); merkintöjä indeksi β-kateniinin (kalvo ja ydinvoima positiivisia soluja, laskettuna määrä positiivisia soluja kohti krypta sarake jaettuna solujen lukumäärä ja kerrottuna 100 (n = 12) (C), merkintöjä indeksi COX-2 ja Ki-67 (n = 12) (D). β-kateniinin ja Ki-67 tumavärjäystä väheni merkittävästi yhdistelmä ruokavalion ja Se yksin, mutta ei vihreää teetä. COX-2 sytoplasminen värjäys väheni merkittävästi vihreää teetä, Se ja yhdistelmä ruokavalio. tilastollinen merkitys ruokavalion intervention ryhmien välillä analysoitiin ANOVA, arvot eri yläindekseiksi kussakin sarakkeessa olivat tilastollisesti erilainen (

P

0,05), Bars: keskiarvo ± SEM.

vieressä verrattuna värjäyssarjaan varten β-kateniinin välillä AOM-käsiteltyjen normaali-näkymästä kryptat ja AOM aiheuttama kasvain. Lisääntynyt ß-kateniinin värjäys, erityisesti vahvempi tumavärjäystä oli merkitsevästi korkeampi koolontuumoreissa kuin normaalissa -appearing kryptissa sopusoinnussa translokaatio beta-kateniinin (kuvio 3B). Mikään ruokavalion vaikuttanut merkittävästi kalvon värjäytymistä β-kateniinin normaaleissa-esiintyvät crypts kasvain tutkimuksessa, mutta Se pelkkä ruokavalio (

P 0,05

) ja yhdistelmä ruokavalio (

P 0,01

) olivat pysyvästi estovaikutusta β-kateniinin tumakertymään (kuvio 3C). Vaikutus ruokavalion intervention β-kateniinin ilmentymistä tuki lisäksi western blot-analyysi, joka osoittaa koko β-kateniinin oli huomattavasti alemman normaalipainoisilla esiintyvät kryptissa rottien syötetty yhdistelmän ruokavalion tai Se yksinään (kuvio 3E ja 3F).

edustavaa osaa immunohistokemiallisella värjäyksellä β-kateniinin, DNMT1 ja Ac-H3 AOM-käsittelemätöntä normaalia crypts (A), AOM-käsiteltyjen normaali esiintyvät crypts ohjauspaneelista, vihreää teetä, Se ja yhdistelmä ruokavalio (B) ja kasvaimet; merkintöjä indeksi β-kateniinin (kalvo ja ydinvoima positiiviset solut) (n = 12) (C) ja merkintöjä indeksi DNMT1 ja Ac-H3 (n = 12) (D). Western blot-analyysi β-kateniinin, DNMT1 ja Ac-H3 paksusuolen näytteitä (n = 6) (E), ilmentyminen β-kateniinin ja DNMT1 normalisoitiin että β-aktiinin ja ilmentyminen Ac-H3 on normalisoitu H3, tiedot on esitetty precent valvonta (F). Lisääntynyt vahva β-kateniinin tumavärjäystä ja DNMT1 yli-ilmentyminen oli esillä AOM aiheuttaman kasvaimia, kun taas heikompi Ac-H3 ilmentymisen todettiin paksusuolen kasvaimia. β-kateniinin tumavärjäystä väheni merkittävästi yhdistelmä ruokavalion ja Se yksin, mutta ei vihreää teetä; DNMT1 väheni merkittävästi yhdistelmä ruokavalion ja vihreä tee yksin, mutta ei Se; Ac-H3 tumavärjäystä lisääntyi merkitsevästi yhdistelmä ruokavalion ja Se yksin, mutta ei vihreää teetä. Tilastollinen merkitys ruokavalion intervention ryhmien välillä analysoitiin ANOVA, arvot eri yläindekseiksi kussakin sarakkeessa olivat tilastollisesti erilainen (

P

0,05), Bars: keskiarvo ± SEM.

yhdistelmä ruokavalio estää DNMT1 ilmaisun ja nousi histoni H3 asetylointi

DNA metyylitransferaasien DNMT ja histonimodifikaation tärkeä rooli DNA: n metylaatio, yliekspressioon DNMT1 ja deasetylaation histoni H3 tai H4 raportoitu paksusuolensyöpä [33]. Tässä mielessä tutkimme värjäysrintamaan DNMT1 ja Ac-H3 AOM aiheuttama koolontuumoreissa verrattuna AOM-käsittelemätöntä normaalia crypts sekä AOM hoidetuista normaali-näkymästä crypts. Vahva tumavärjäystä on DNMT1 ja vähemmän voimakas tuman värjäytymisen Ac-H3 havaittiin AOM-tuumoreita (kuvio 3B); suhteessa normaaliin crypt (kuvio 3A) ja normaalin esiintyvät crypts (kuvio 3B), jossa DNMT1 ja AC-H3-positiiviset solut ovat pääasiassa sijaitsee proliferatiivinen osastossa (kuvio 3B).

Sen määrittämiseksi, onko DNMT1 ja Ac- H3 normaalipainoisilla esiintyvät crypts säädeltiin Se yksin, vihreä tee yksin ja yhdistelmä ruokavalion, mittasimme prosenttiosuus DNMT1 ja Ac-H3 positiivisia soluja varten 4 ruokavalion ryhmää (kuvio 3D). Merkitsevän eston DNMT1 havaittiin rotilla syötetty yhdistelmä ruokavalion ja vihreä tee yksin,

P

0,05 verrokkiin nähden, kun taas Se yksinään ei ollut merkittävää vaikutusta DNMT1 ilme. Verrattaessa Ac-H3 välinen ravinnon ryhmien vahvin induktio Ac-H3 Rotilla todettiin syötetty yhdistelmä ruokavalio, Se-yksin lisääntyi myös merkittävästi Ac-H3,

P

0,05 verrattuna vertailuruokavalio , mutta vihreä tee ei ollut vaikutusta (kuva 3D).