Krooninen sairaus

tiivistelmä

Von Hippel-Lindaun tuumorisuppressorigeeni (VHL) katoaa useimmissa selkeän solun munuaiskarsinoomia (ccRCC). Folliculin (FLCN) on tuumorisuppressori, jonka tehtävänä on menetetty Birt-Hogg-Dubé oireyhtymä (BHD), häiriötä, jolle munuaissyövän useita histologisia tyyppejä, mukaan lukien kirkas cell carcinoma, ihon fibrofolliculoma, ja ilmarinta. Täällä tutkimme onko yhteys VHL ja FLCN selvällä solussa munuaisten sinoomasolulinjoja ja kasvaimia. Osoitamme, että VHL säätelee ilmentymistä FLCN mRNA ja proteiini tasot RCC solulinjoissa, ja että FLCN proteiinin ilmentyminen on vähentynyt ihmisen ccRCC kasvaimissa

VHL

menetys, verrattuna vastaaviin normaaleihin munuaisessa. Knockdovvn FLCN johtaa lisääntyneeseen muodostumiseen kasvainten RCC-solujen villityypin VHL in potilaalle tehdä nude-hiirissä, osoitus siitä, että FLCN on rooli kasvaimen alentava aktiivisuus VHL. Mielenkiintoista, FLCN, samoin kuin VHL, on tarpeen aktiivisuuden LC3C-välitteisen autophagic ohjelma, olemme aikaisemmin tunnettu edistävän kasvaimen estävä aktiivisuus VHL. Tulokset osoittavat, että on olemassa toiminnallinen ylikuulumisen kahden suuren tuumorisuppressoreilla munuaisten syövän, VHL ja FLCN, yhdentyvät sääntelyä autophagy.

Citation: Bastola P, Stratton Y, Kellner E, Mikhaylova O, Yi Y, Sartor MA, et ai. (2013) Folliculin Auttaa VHL Kasvain estävä vaikutus munuaisten Cancer kautta sääntely Autophagy. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10,1371 /journal.pone.0070030

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 29 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Bastola et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Myrovlytis Trust , Research Grant; NIH /NCI CA122346; BLR UC P30-ES006096CEG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munuaisten syöpä vastaa 2%: sta 3% kaikista aikuisten pahanlaatuisten Yhdysvalloissa. Vuonna 2011 yli 64770 uutta tapausta ja 13000 kuolemantapausta raportoitu, ja esiintyvyys kasvaa tasaisesti 2,5% vuodessa. ccRCC edustaa enemmistöä (85%: sta 90%) aikuisten munuaisten syöpiä ja on kaikkein pahanlaatuinen muoto. Tämä syöpä on tunnusomaista varhainen menetys VHL tuumorisuppressorin lyhyen varren kromosomin 3 useimmissa kasvainten (80%). Se on vakiintunut, että menetys VHL johtaa lisääntyneeseen keskittymisen ja aktiivisuus hypoksian indusoituvaa transkriptiotekijä (HIF), joka kääntyy aktivoi geenien ilmentymisen, jotka edistävät kasvaimen kasvua. Näiden joukossa ovat angiogeenisten tekijöiden, joka johtaa lisääntyneeseen veren virtausta kasvaimiin, mikä parantaa toimitus ravinteita ja happea syöpäsoluja. Geenit, jotka stimuloivat anaerobista Glykolyysivaiheen aktivoidaan myös, ja tämä tukee mukautumista vähennetään ravinteiden saatavuuden ja siirtyy syöpäsoluja kohti metaboliareitit jotka edistävät kasvaimen kasvua. Viime aikoina olemme havainneet, että toinen kasvaimeen tukahduttamalla reitin säädellään VHL. Olemme havainneet, että VHL on tärkeä säätelijä prosessin macroautophagy (autophagy) [1]. Olemme todenneet, että VHL, indusoimalla microRNA-204, inhiboi LC3B-välitteinen autophagy, joka on tarpeen ccRCC kasvaimen kasvua. Lisäksi VHL, estämällä HIF, indusoima ja aktiivisuuden LC3B paralogi, LC3C. Toisin kuin LC3B, LC3C toimii tuumorisuppressorina [1].

hakuprosessi uusia VHL aiheuttama geenien, jotka voisivat osallistua kasvainta estävä aktiivisuus VHL, olemme havainneet, että käyttökuntoon luonnonvaraisen -tyyppinen VHL RCC solujen menetetään

VHL

indusoi spesifejä ja merkittäviä rikastamiseen geenejä ilmennetään Smith-Magenisin lokus (SM) on lyhyen varren kromosomin 17p11.2. Smith-Magenisin oireyhtymä on monimutkainen hermosolujen häiriö ominaista älyn heikkeneminen, kraniofasiaalisen ja luuston poikkeavuuksia, ja unihäiriöt [2]. Kiinnostavaa kyllä, tämä lokus sisältää toisen munuaisen kasvainta estävä geeni, folliculin (FLCN), jonka toiminta on menetetty geneettisen autosomaalinen hallitseva häiriö, Birt-Hogg-Dubén oireyhtymä (BHD) [3]. BHD on ominaista ihon fibrofolliculomas, keuhkojen kystat, ja spontaani ilmarinta, sekä munuaissyövän sekoitettu histologiset tyypit, mukaan lukien kromofobista leikettä, oncocytic, kirkas solu, ja papillaarinen type [3]. Tämän työn tavoitteena oli selvittää, FLCN edesauttaa kasvaimen tukahduttava aktiivisuus VHL. Osoitamme, että FLCN edistää VHL-välitteistä kasvaimen kasvun estoa vaikuttamalla LC3B ja LC3C autophagic polkuja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelymenetelmät ja hoidot

Menetelmä tuottavan altaat ihmisen VHL (-) ja VHL (+) 786-O, A498, ja Caki-1-solut kuvannut meitä ennen [1], [4], [5]. RCC4 solut olivat lahjoitus tri Jamie Kairo (Jefferson University) ja kuvattiin yhteyttä ennen [6]. Autophagic vuot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [1]. Proteiinin tai RNA: n uutto, solut maljattiin 24 tuntia myöhemmin väliaine vaihdettiin, että joko 10% tai 0,1% seerumia, ja solut kerättiin 48 tuntia myöhemmin. Sitten solut lyysattiin RIPA-puskurissa proteaasilla, fosfataasi ja proteasomaalisten estäjien PAGE-analyysillä, tai TRI Reagenssi RNA. RNAi-kokeissa, pLKO.1-pohjainen shRNA rakentaa ja FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970, ja TRCN0000010979, Open Biosystems) olivat VSV-G-vaipan pakattu (Cincinnati Lasten Hospital Medical Center Viral vector Core) ja infektoitiin soluihin, jotka sitten käsiteltiin plasmidi-sopiva valinta reagenssit. VHL shRNA konstruktit edellä on kuvattu [5]. Transductions lentivi- hiukkasia suoritettiin käyttäen 2 ug /ml polybreeniä.

Human RCC Kasvaimet

tuore pakastetut näytteet ccRCC kasvain (n = 128) ja sovitettu normaalia munuaisen näytteitä (n = 114 ) saatiin ja analysoitiin

VHL

sekvenssin ja proteiinin ilmentyminen, kuten aiemmin on kuvattu [4]. Näytteet analysoitiin proteiinin ekspressio ja mRNA: n, myös kuten edellä on kuvattu.

Kvantitatiivinen RT-PCR

mRNA analyysin näytteet ensimmäisen käänteiskopioitua käyttäen TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), ja määrällisesti reaaliaikaista PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time CRSystem. qRT-PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, ja käyttäen alukkeita esitetään taulukossa S4. Kuvaus RNA microarray annetaan kirjettä Methods.

Western blot -analyysi

Yhteensä solulysaateista saatiin hajottamalla solut RIPA-puskurissa, joka sisälsi proteinaasi ja fosfataasi-inhibiittorit. 5-30 ug uutteet erotettiin 4%: sta 12% tai 10% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF kalvoja. Puolikvantitatiivinen immunoblottauksella ihmisen RCC kasvaimia ja vastaaviin normaaleihin munuaisiin suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [4]. Seuraavat polyklonaalisia vasta saatiin Cell Signaling Technology (Danvar, MA): anti-FLCN, anti- S6-kinaasi 1 ja T

389 fosforylaatioon; anti S6 ja S

240/244 fosforylaatioon; anti 4EBP ja T

37/46 tai S

65 fosforylaatiota. Polyklonaalinen anti-LC3B (Abcam, Cambridge, MA), ja anti-LC3C (Abgent, San Diego, CA) käytettiin. Seuraavat hiiren monoklonaalisia vasta-aineita käytettiin: anti-VHL (Pharmingen, San Jose, CA), anti-hemagglutiniini (Boehringer Ingelheim, Itävalta); ja anti-GAPDH (Abcam, Cambridge, MA).

Mouse vierassiirrekokeissa

sisäistä munuaisen injektiot, 30000 solut suspensoitiin Matrigel lopulliseen tilavuuteen 30 ui, ja sitten injektoitiin hitaasti muutaman millimetrin alle munuaisten capsula 4- 5 viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiirissä. Sen jälkeen 10-12 viikko hiiret tapettiin, kasvaimista munuaiset kerättiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, parafiiniin, ja H 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Ethics lausunto

Kaikki kokeet hiirillä tehtiin tiukka mukaisesti protokollaan hyväksynyt University of Cincinnati Institutional Animal Care ja käyttö komitea (Protocol Number: 06-07-21-01). Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluraanianestesiassa ja yritettiin minimoida kipua. Kaikki ihmisen näytteet olivat anonyymejä ja vapauttaa University of Cincinnati Sisäinen Review Board protokollan vaatimuksia.

Tulokset

ilmentyminen FLCN indusoidaan VHL

tunnistamaan VHL aiheuttama geenien jotka voisivat osallistua kasvainta estävä aktiivisuus VHL, suoritimme mRNA microarray kokeita, joissa me verrattuna geenin ilmentymistä ihmisen RCC 786-O VHL (-) solut ja saman solujen ennalleen, villityypin VHL (786-O VHL (+)). Tilastollinen analyysi tunnistettu 1310 selostukset ilmentyvät differentiaalisesti kahden solutyypeissä (FDR 0,1 ja 50%: n muutos ekspressiotason) (taulukko S1).

Mielenkiintoista, joukossa 588 selostukset aiheuttama käyttökuntoon VHL, löysimme merkittävän rikastamisen geenit sijaitsevat lyhyen varren kromosomin 17 (10,71% kaikista merkittävästi aiheuttama geenit), ja erityisesti cytoband 17p11.2, joka sisältää SM-lokus (1,7% kaikista merkittävästi indusoi geenejä) (taulukko 1 ja S2). Oli myös pitoisuus geenien aiheuttama VHL kromosomissa 14 (7,85% kaikista merkittävästi indusoi geenejä), joiden pääasiallisena cytoband on 14q22.1. VHL-välitteisen induktion useiden SM geenien vahvistettiin edelleen kvantitatiivisen RT-PCR: llä (Fig. S1). Sen sijaan, geenit, jotka olivat tukahdutettu VHL rikastettiin kromosomissa 7 (63 geenejä, 9,75% kaikista merkittävästi tukahdutettu geenejä) ja kromosomissa 9 (42 geenejä, 6,5% kaikista tukahdutettu geenejä) (taulukko S3).

SM lokus sisältää geenin, joka koodaa toisen munuaisen munuaisten kasvaimia estävä, FLCN. Analyysi FLCN mRNA: ta ja proteiinia paljasti lisääntyneen ilmentymisen sekä 786-O ja A498-solujen saatettu VHL, verrattuna emo-VHL (-) solut (Fig. 1A ja B). Lisäksi FLCN mRNA ja proteiinin ilmentyminen oli tukahdutettu Caki1 munuaissyöpäsoluissa jossa me pudotettiin endogeenisen VHL ilmaisua käyttäen shRNA (Fig. 1 C ja 1 D). Muutos FLCN mRNA: n ekspressio oli alueella 1,5-2-kertaiseksi, samanlainen kuin muut SM geenien (vertaa Fig. S1). Kuitenkin induktio tasolla proteiinin oli 3- 4-kertainen alue, osoitus siitä, että posttranskriptionaalisella mekanismien merkitystä tässä asetuksessa. Näissä tutkimuksissa myös havaittu VHL-välitteisen induktion p53, toinen geeni sijaitsee kromosomissa 17p13.1 läheisyyteen SM lokuksen, mikä validointi toteamisen on aiemmin kuvattu muut [7].

Liuottaminen of VHL in 786-O ja A498 solut johti induktion FLCN ja p53 mRNA: t (A) ja proteiineja (B). Knockdovvn VHL in Caki-1-soluissa johti vähentynyt FLCN mRNA (C) ja proteiini (D) tasolla; *** P 0,001, ** P 0,01. Scr- ryntäily ohjaus virus.

Koska VHL on menetetty satunnaista kirkas cell munuaissyövän (ccRCC), mittasimme ilmentymistä FLCN lysaateissa ihmisen ccRCC kasvaimissa verrattuna viereisiin munuaisten kudoksen näytteissä joilla tiedetään

VHL

tila. Olemme aiemmin kuvattu väestön ihmisen ccRCC normaalia munuaisen paria, että me käyttää tässä analyysissä [4]. FLCN proteiini analysoitiin puolikvantitatiivinen immunoblottauksella, kuten aikaisemmin on kuvattu [4] ja mRNA: n määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Expression of FLCN proteiini oli merkittävästi vähentynyt ccRCC kasvaimissa verrattuna normaaliin munuaisten väestössä ccRCC kanssa

VHL

poistetaan (Fig. 2A ja 2B). Sitä vastoin emme nähneet merkittäviä eroja FLCN tasoilla verrattaessa ccRCC villiin

VHL

vastaavaan normaaliin munuaiskudosnäytteillä (Fig. 2C). Mielenkiintoista tasot FLCN mRNA ei ollut eroa kasvain-munuainen paria kummassakaan ryhmässä kasvaimia (Fig. 2D), joka tukee rooli posttranskriptionaalisella mekanismeja säätelyssä FLCN ilmaisun.

analyysi FLCN proteiinin (A -C) ja mRNA (D) näytteitä ihmisen ccRCC joilla tiedetään

VHL

asema, verrattuna viereiseen munuainen kudosta. A. Edustava western blot-analyysi FLCN proteiinin pareittain munuaisen (K) ja kasvain hävisi

VHL

(VHL-DEL) erotettiin 10% PAGE. Alempi kaista voi edustaa hajoamista tai posttranslationaalinen muuttaminen FLCN. B ja C. kvantifiointi FLCN proteiinin ilmentymisen kasvaimia, jotka olivat menettäneet

VHL

(VHL-DEL) ja kasvainten villiin

VHL

(VHL-WT). Laatikot ovat alhaisemmat ja yläkvartiilit erottaa mediaani (paksu vaakasuora viiva) ja viikset asti ulottuvilla minimi- ja maksimiarvot, lukuun ottamatta kohtia, jotka ovat ulkopuolella 1,5 kvartiiliväli laatikosta (merkitty ympyrät). Keinot ± SD jokaisen jakelun osoitetaan suljetun pisteillä ja ristiä viikset, vastaavasti. D. Kvantitatiivinen RT-PCR mittaus FLCN mRNA tasojen munuaisissa ja ccRCC VHL-DEL ja VHL-WT kasvaimia.

FLCN Auttaa VHL välittämää tuumorisuppressiogeeneksi

Voit selvittää, oli toiminnallinen yhteys FLCN ja kasvain-estävä aktiivisuus VHL, me pudotti ilmentymistä FLCN in 786-O VHL (+) solut käyttämällä kolmea erilaista shRNAs (Fig. 3A). Sitten ruiskutetaan näitä soluja munuainen kapselit nude-hiirten, mikä johti lisääntyneeseen kasvaimen esiintymistiheys ja suurempi kasvaimen koko, verrattuna kasvaimia, jotka ovat peräisin injektoitiin kontrolli-solut, jotka oli transdusoitu lentivirukset, joka sisältää sekoituskoodin sekvenssin (Fig. 3B). Kasvaimet kanssa FLCN knockdown oli erittäin pahanlaatuisten, dedifferentoituneiden fenotyypin (Fig. 3C).

ShRNA aiheuttama knockdovvn FLCN edistää kasvainten muodostumista 786-O-solujen saatettua VHL. A. Western blot osoittavat laskua FLCN proteiinin ilmentymistä soluissa stabiilisti ilmentävät kolme erilaista FLCN shRNAs verrattuna soluihin transfektoitu scramble (SCR) kontrolli. B. kvantitointi esiintyvyys ja painon kasvainten muodostaman ilmoitetun solun rivit potilaalle tehdä ksenografteissa. NK keskipaino normaalien munuaisten. C. H & E-värjäys edustavan osiot kasvaimia kasvanut VHL (+) /ryntäily ohjaus soluja ja VHL (+) solujen FLCN knockdowns. Mittaviivat = 50 um.

Koska FLCN on osoitettu estävän aktiivisuuden mTORC1 väylän UOK257 soluissa ja hiiren malleja BHD munuaissyövän [8], [9], analysoitiin vaikutuksia FLCN pudotus aktiivisuudesta tämän reitin soluihin käytettiin näihin potilaalle tehdä ksenograftit. Tärkeää on, että pudotus on FLCN alensivat mTORC1 aktiivisuuden (Fig. 4A), mitattuna fosforylaatio S6K, S6 ja 4EBP, viljellyissä soluissa. Olemme myös päättäneet ilmaus S6 ja S6-P on osastoja ksenografteista kasvaimista muodostama VHL (+) /scramble transfektoitujen solujen vs. kasvaimia muodostuu näiden solujen kanssa FLCN tippuu alas. Johdonmukaisesti saadut tulokset soluviljelmäkokeita, osastoja VHL (+) /FLCNKD kasvaimet osoittivat pienem- värjäytymistä S6-P kontrolliin verrattuna kudoksiin, kun taas värjäystä yhteensä S6 oli samanlainen (kuvio. 4B). Tämä tulos viittaa siihen, että lisätyn aktiivisuus mTORC1 reitin ei osaltaan edistää kasvaimen kasvua näissä soluissa.

. Western blot-analyysi mTOR loppupään tavoitteiden 786-O VHL (+) soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti joko ryntäily tai kaksi erilaista FLCN shRNAs. GAPDH lastaus ohjaus on esitetty kullekin ryhmälle Immunoblottien jalostettujen samasta geelistä. B. Edustavia osat osoitti kasvainten värjättiin S6 ja S6P. Asteikko bar = 50 um.

Viime aikoina olemme kuvanneet, että VHL estää LC3B-välitteisen, pro-onkogeenisen autophagy, kun se stimuloi uuden kasvaimen tukahduttaa autophagic ohjelman, välittävät LC3C [1]. LC3s ovat vakiintuneita autophagic sääntelyviranomaisten tarpeen muodostumista kaksinkertainen kalvo autophagosomes ja hankintaan lastin. Niinpä tutkimme jos FLCN voi käyttää kasvaimen estävä vaikutus alavirtaan VHL säätelemällä LC3C tai LC3B autophagy. LC3C indusoi nälänhätää VHL (+) soluja, mikä näissä kokeissa, VHL (+) 786-O ja RCC4 soluja ilman ravintoa 0,1% seerumissa 48 tunnin ajan ja sitten sitä käsiteltiin 1 tunnin ajan klorokiinin, lysosomaalista estäjä järjestyksessä estää autophagic virtauksen ja kerääntymisen nopeammin vaeltavat, lipidoitunut muoto (LC-II) LC3B ja LC3C mitattiin western-blottauksella. Olemme havainneet, että pudotus on FLCN johti huomattavaan vähenemiseen kertyminen LC3C kasvun kanssa LC3B molemmissa solulinjoissa (Fig. 5). Muutos LC3B in VHL (+) RCC soluihin ei liittynyt muut yhtäpitävät miR-204 (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos osoittaa, että FLCN säätelee autophagy samalla VHL, ja siten vaikutukset autophagy voi olla osittain vastuussa osuus FLCN kasvaimen estävä aktiivisuus VHL.

knockdovvn FLCN (shRNA 3) in 786- O (A) tai RCC4 (B) VHL (+) solujen vähentää kertymistä tuumoria tukahduttavan LC3C-II, mutta indusoi onkogeenisten LC3B-II. Western-blotit, joissa mainituilla vasta-aineilla. C. kvantitointi 3 itsenäisen kokeen kuten esitetään A-kuvassa ja B. LC3 proteiinin tasot mitattiin optisella tiheydellä ensin normalisoitiin GAPDH. Sitten suhde LC3 laskettiin välillä LC3 mitatut tasot klorokiini käsiteltyjen näytteiden solujen FLCN tippuu alas ja ohjaus solut (vertaa kaista 6 kaistaa 3 paneeleissa A ja B). D. malli asetusehdotuksen.

Keskustelu

Tässä raportoitu, että VHL säätelee ilmentymistä FLCN ja jotka puolestaan ​​FLCN osallistuu kasvainta estävä aktiivisuus VHL. Havaitut vaikutukset FLCN Knockdown kasvaimen kasvuun ovat sopusoinnussa negatiivinen vaikutus FLCN ilmentymisen vaikutus muodostumista kasvainten 786-O VHL (-) solut, kuten muiden nähtävillä [10]. Tärkeää on, FLCN säätelee LC3B ja LC3C autophagic ohjelmia samalla tavalla kuin VHL, eli FLCN estää LC3B ja stimuloi LC3C autophagic aktiivisuutta (kuvio. 5D). Koska me osoittaneet, että sekä LC3B ja LC3C liikunnan tärkeä ja päinvastaisia ​​vaikutuksia kasvuun ccRCC kasvainten [1], ehdotamme, että panos FLCN kasvaimeen-estävä aktiivisuus VHL tuloksia, ainakin osittain, sen vaikutukset autophagy (kuvio . 5D). Sääntely LC3B mukaan FLCN todennäköisesti edustaa mekanismi lisäksi aiemmin kuvanneet meille VHL estoa LC3B kautta miR-204, koska emme mitata johdonmukainen vaikutuksia FLCN Mir-204. Samaan aikaan sekä tuumorisuppressoreilla voisi indusoi LC3C kautta tukahduttaminen HIF, koska LC3C on HIF-inhiboi geenin. VHL on hyvin tunnustettu sen kyky estää HIF-aS proteiinin ilmentymisen ja aktiivisuuden. Viime aikoina FLCN on myös raportoitu vähenevän HIF toimintaa, vaikka se ei vaikuta kertymistä HIF-aS alayksiköstä [11].

erityinen rooli FLCN säätelyssä autophagy tukee lisäksi äskettäin tunnistettu läsnäolo DENN domeenin karboksipään alueen FLCN [12]. Tämä motiivi on läsnä myös folicullin liittyvä proteiini-1 ja 2 (FNIP1 ja FNIP2 [13]), ja mielenkiintoisesti toisessa proteiinia ilmennetään SM-lokuksen SMCR8 [13], joka on myös löysimme indusoida VHL (kuvio . S1). Näitä proteiineja toimii GDP-GTP vaihto tekijät (GEFs) varten RAB GTPaaseja, mahdollisesti tarvittavista autophagy liittyvän ihmiskaupan ja fuusio [11], [13].

SM lokuksen ei ole yhdistetty ccRCC. Aikaisemmin vain yksi geeni tästä lokuksesta, TNFSF13 (tuumorinekroositekijä superperheen jäsen 13), oli tutkittu tässä suhteessa. Se havaittiin olevan vähentynyt mRNA tasoilla ccRCC verrattuna normaaliin munuaisen. Lisäksi korkeampi tämän reseptorin osoitettiin korreloivan paremmin yleistä ja tautivapaan elinajan [14]. On kuitenkin mahdollista, että lisäanalyysi paljastaa lisää autophagy liittyviä toimintoja geenien ilmennetään SM lokukseen.

FLCN edistää VHL aiheuttaman kasvaimen suppression mekanismilla, joka ei näytä liittyvän aktivoitumisen mTOR kautta. Itse asiassa 786-O solujen saatettua VHL ja FLCN tippuu alas, me todellakin osoitti vahvan väheneminen useilla fosforylaatiotapahtumien, joita käytetään indikaattoreina mTOR toimintaa. Johdonmukaisesti mTOR me mitataan lisääntynyt kertyminen LC3B, laajalti käytetty autophagic lukema, ja tämä lisääntynyt LC3B-välitteisen autophagy voi edistää kasvaimen kasvua. Havaitut vaikutukset FLCN on mTOR aktiivisuus ovat yhdenmukaisia ​​useita julkaisuja raportointi positiivinen korrelaatio tasojen FLCN ja mTOR in U251, HEK293, HK-2, ACHN, 786-O VHL (-) solut [15]. Kuitenkin nykyinen kanoninen käsitys FLCN-mTOR-yhteys on se, että FLCN negatiivisesti säätelee mTOR reitti [8], [9], [16]. Tältä osin ihmisen UOK257 solulinja on peräisin BHD potilas, joka ei ilmennä VHL, osoittaa korkeaa mTOR aktiivisuuden, ja hiiriä FLCN Knockout osoittavat korkeita S6 fosforylaation [8], [9]. Syynä tähän ristiriita ei tällä hetkellä tunneta, mutta ehkä tiedot osoittavat kohti lokeroitu vaikutus FLCN on mTOR joka vaikuttaa solujen yhteydessä kuten toiminta VHL. Kuitenkin kytkentä VHL tuumorisuppressoriin joka sääntelee metaboliareitti munuaisten syöpä voi paljastaa uusi piirre VHL kasvaimeen estävä vaikutus, joka täydentää sen roolit angiogeneesin säätelyyn ja autophagy.

Tärkeää , FLCN proteiini tasot pienenivät ihmisen ccRCC kanssa

VHL

menetys, mikä edelleen tukee rooli tämän tuumorisuppressoriproteiinia kasvuun ccRCC. Tähän mennessä ei ole FLCN mutaatioita tai muutoksia mRNA-tasot on mitattu ccRCC. Tämä lähentyminen toiminnot VHL ja FLCN on erityisen kiinnostavaa ottaen huomioon, että selkeä cell carcinoma voi olla osa multihistological tyypin munuaissyövän, jota esiintyy BHD oireyhtymä.

luonne suoraan molekyylitason mekanismi joka VHL indusoi FLCN munuaisten tuumorisuppressoreilla vielä ratkaistava, mutta todennäköisesti liittyy useita mekanismeja. Koska mittasimme vaikutuksena VHL on FLCN mRNA vakaan tilan tasot RCC solulinjoissa, odotamme jonkin verran transkription induktion tai stabilointi FLCN mRNA. Tältä osin emme löytäneet vaikutuksia p53 Knockdown on FLCN ilme. Koska emme löytäneet muutoksia FLCN mRNA-tasojen välillä ihmisen munuaisen kasvain paria vaikka löysimme eroa vakaan tilan FLCN proteiinia, ehdotamme, että on myös tärkeä translaatiota komponentti tämän asetuksen, mahdollisesti riippuen spesifisyyden eri munuaisten solupopulaatioiden. Yksi selitys on, että VHL voi tukahduttaa spesifisten MikroRNA, mikä puolestaan ​​tukahduttaa FLCN käännös.

Yhteenvetona nykyisen tutkimuksen, olemme tarjonneet ensin näyttöä suora yhteys VHL ja FLCN kasvaimen tukahduttava väyliä yhdentyvät sääntelyä autophagy munuaisten syöpään.

tukeminen Information

Kuva S1.

VHL indusoi useiden geenien ekspression ilmennetään Smith-Magenisin lokukseen 786-0 ja A498-soluissa. Kaavio näyttää muutokset ilmentyminen yksittäisten mRNA: iden perustuva kvantitatiivinen qRT-PCR mittauksia. Kertainen muutos edustaa eroa ilmentymistä mRNA VHL (+) vs. VHL (-) solut. Sekvenssi alukkeiden annetaan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070030.s001

(PDF) B Taulukko S1.

Luettelo geenien merkittävästi tukahdutettu tai aiheuttama VHL in 786-O-solut. Kertainen muutos merkitsee VHL (+) /VHL (-) suhde.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070030.s002

(DOCX) B Taulukko S2.

Geenit merkittävästi aiheuttama VHL ja rikastettu tiettyjen kromosomi tai cytoband.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070030.s003

(XLS) B Taulukko S3.

Geenit merkittävästi vähentää VHL ja rikastettu tiettyjen kromosomi tai cytoband.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070030.s004

(DOCX) B Taulukko S4.

sekvenssi alukkeiden osoitettujen geenien käytetty qRT-PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070030.s005

(DOCX) B

Kiitokset

kiitos G. Doerman valmisteluun kuvioiden ja tohtori M. Daston muokkausta käsikirjoituksen.