Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat ainutlaatuiset biologiset ominaisuudet HIV-1 Vpr tekevät siitä potentiaalisesti tehokas aine syövän hoitoon. Ensinnäkin, Vpr estää soluproliferaatiota solusyklin G2 pidätykseen. Toiseksi, se indusoi apoptoosia läpi useita mekanismeja, jotka voisivat olla merkittävä, sillä se saattaa pystyä voittamaan apoptoottinen vastus näytteillä monet syöpäsolut, ja lopuksi Vpr valikoivasti tappaa nopeasti kasvava soluja p53-riippumattomalla tavalla. Osoittaakseen mahdollisten hyödyllisyys Vpr kuin solunsalpaajaksi, suoritimme proof-of-concept-tutkimukset

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset Alustavien tutkimukset osoittivat, että Vpr indusoi solusyklin G2 pysähtymiseen ja apoptoosiin eri syöpätyyppien. Lisäksi sama Vpr vaikutukset voitiin havaita myös joissakin syövän solut, jotka ovat resistenttejä syöpälääkkeet, kuten doksorubisiini (DOX). Havainnollistamiseksi edelleen mahdollinen arvo Vpr kasvaimen kasvun estäminen, hyväksyimme DOX kestävä neuroblastooma mallin ruiskuttamalla SK-N-SH-solut C57BL /6N ja C57BL /6J-scid /scid hiirillä. Oletimme, että Vpr kykenee estämään solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia riippumatta lääkeresistenssin tilan kasvaimia. Todellakin, tuotanto Vpr

kautta

adenovirus-toimitus neuroblastoomasoluilla aiheutti G2 pidätyksen ja apoptoosia sekä huumeiden naiivi ja DOX-resistentit solut. Lisäksi ennalta infektio tai kasvaimeen injektio

vpr

ilmentävää adenoviruksen hiukkasia neuroblastoomakasvainten SCID-hiirissä selvästi esti kasvaimen kasvua. Siksi Vpr voitaisiin mahdollisesti käyttää täydentävänä viruksen terapeuttisen aineen selektiivisen eston kasvaimen kasvun syövän hoitoon varsinkin kun muita hoitoja lakata toimimasta.

Citation: Zhao RY, Liang D, Li G, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) syövän vaikutusta HIV-1 Viral Protein R Doxorubicin Kestää Neuroblastooma. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10,1371 /journal.pone.0011466

Editor: Fatah Kashanchi, George Mason University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 toukokuu 2010; Hyväksytty: 8. kesäkuuta 2010 lähtien Julkaistu: 07 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Chicagon Medical Research Council, Illinois Department of Public avun ja US Department of Human Health Services ja Marylandin yliopiston Medical Centerin (ja RYZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka on ollut suuria edistysaskeleita syövän hoidossa viime vuosikymmeninä on yhä edelleen olemassa useita merkittäviä esteitä, jotka rajoittavat käyttöä joidenkin näiden uusien hoitojen. Esteet, jotka on esitetty, ovat, mutta eivät rajoitu niihin, 1) olla sivuvaikutuksia, koska ei-spesifinen sytotoksisuus hoitoja, 2) lääkeresistenssin kehittymisen, kehittäminen ja 3) kasvaimen resistenssin apoptoosia. Siksi kaikki syöpälääkkeen, joka voi joko välttää tai ohittaa puutteita joidenkin nykyisten syöpälääkkeen hoidot olisi suuri merkitys tulevaisuuden suunnitteluun syövän hoitoon. Ihannetapauksessa, tehokas syövän vastaisen aineen tulisi olla seuraavat ominaisuudet. Sen pitäisi pystyä 1) estää vain solujen epänormaali lisääntyminen, joka johtuu menetys normaalista solukierron säätelyssä, esim cellular tarkistuspiste mutaatiot; 2) aiheuttaa jatkuvia solukierron pysähtymisen joka voi johtaa solukuolemaan tai apoptoosin; 3) aiheuttaa spesifistä solun tappaminen syöpäsoluihin vähän tai ei lainkaan vaikutusta normaaleihin soluihin; 4) voi ohittaa apoptoottisen vastus, tyypillinen piirre monissa syöpäsolujen; 5) on solun tappaminen vaikutus riippumattomia yhteisiä onkogeenisten mutaatioiden, kuten p53; 6) antaa samat pysähtymisvaiheesta ja solujen tappaminen vaikutuksia huumeiden resistentit solut, eli kun muiden kemoterapia huumeiden epäonnistuu; ja 7) imeytyy helposti tai jota solut alkuperäisessä bioaktiivisten muodossa.

virusproteiinin R (Vpr) tekemät ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV-1) voi mahdollisesti täyttää monet edellä mainitut edellytykset. Koska, 1) Vpr lohkojen leviämisen syöpäsolujen mukaan solusyklin G2-pidätys [1], [2], ja tämä pidättivät vaikutus on riippumaton klassinen DNA tarkastuspisteiden [3], [4]; 2) Vpr indusoi apoptoosin läpi useita reittejä, jotka eivät ole riippuvaisia ​​vastaanottavan soluvasteita [5], [6]; ja 3) Vpr selektiivisesti tappaa nopeasti kasvava soluja p53-riippumattomalla tavalla [7], [8], mikä viittaa Vpr aiheuttama solukuolema voi tarjota enemmän valikoivasti valtaa tappaa syöpäsoluja kuin normaalit solut ja tämä sytotoksinen ominaisuus olisi oltava tehokkaita monissa ja syövät, joissa p53-geeni on mutatoitunut. 4) Vpr sinänsä ei ole tarttuvaa; 5) Vpr on liukoinen proteiini, joka on myös luonnollisesti transdusoidaan. Proteiini luonnollista tranducing kyky mahdollistaa sen ylös ottaa ja erittävät solut ilman tukea erityisiä antovehikkeli [9]; ja 6) Vpr on virionin liittyvä proteiini. Tämä mahdollistaa mahdollisimman toimituksen Vpr-proteiinin kohdistaa tiettyihin kasvaimia, kuten neuroblastooma tai gliooma käyttäen erityisesti suunniteltuja virusvektorit [Katsauksia varten katso [10]].

HIV-1 Vpr on pieni lisälaite viruksen proteiinia, jossa on keskimääräinen pituus on 96 aminohappoa ja sen laskettu molekyylipaino on 12,7 kD. Vpr on ainutlaatuinen proteiini, joka ei osoita tiedossa homologiaa mihinkään muuhun nykyiseen solun proteiineista. Tertiäärinen rakenne Vpr perusteella ehdotetaan NMR-analyysi koostuu α-heliksin-turn-α-heliksin domeenin aminopään puoli aminohappojen 17-46 ja pitkä α-heliksin aminohapoista 53-78 vuonna karboksipään puoli [11]. Nämä kolme α-heliksien taitetaan hydrofobisen ytimen rakenne, joka mahdollistaa vuorovaikutuksen Vpr- ja muita erilaisia ​​solun proteiinien [12]. Välinen vuorovaikutus Vpr- ja solun proteiinien korostavat monipuolista roolit sen puuttumista isäntä solutoiminnoille edellä kuvatulla [Katsauksia varten katso [8], [13], [14]].

Yksi vaikeimmista syöpien hoitoon on neuroblastooma. Tämä tappava sarkooma koostuu pahanlaatuisten neuroblasti soluja, jotka joko näkyy autonomisen hermoston tai lisämunuaisytimessä. Neuroblastooma pidetään eräänlainen neuroepithelial kasvain, joka vaikuttaa pääasiassa imeväisten ja alle 10-vuotiaita lapsia. Se on yksi yleisimmistä kiinteiden kasvainten varhaislapsuudessa. Kasvain tyypillisesti peräisin lisämunuaisytimessä, jossa Yleisin on vatsa (lähellä lisämunuaisten), mutta se löytyy myös ihossa, rinnassa, niska, lantion tai muilla alueilla. Samalla kun ymmärretään, että geneettisiä mutaatioita joko sikiön kehityksen aikana tai jotka ovat perineet lukemiin neuroblastooma, tarkka syy näiden geneettisten mutaatioiden ovat vielä tuntemattomia. Hoitovaihtoehtoja, jotka ovat käytettävissä sisältävät pääasiassa leikkaus, kemoterapia, sädehoito, ja luuydinsiirteet. Huolimatta eri hoitovaihtoehtoja sairastuvuus tämä syöpä on edelleen erittäin korkea ja on tällä hetkellä lähes 100%. Ensisijainen syy tällaiseen suuri sairastuvuus koska useimmat potilaat ovat laajalle levinnyt tauti diagnoosin ja nämä kasvaimet kehittävät nopeasti resistenssin kemoterapiaa ja sädehoitoa.

ensisijainen lähestymistapa syövän hoitoon usein kemoterapia. Kemoterapia toimii tappamalla nopeasti jakautuvat solut, joka on tärkein ominaisuus syöpäsoluja. Valitettavasti neuroblastooma kehittyy vastustuskyky nopeasti kemoterapeuttisten aineiden ja tekee hoidon vaikeaksi. On olemassa useita mahdollisia syitä kemoterapian resistenssin, ne ovat 1) soluja, jotka eivät tappaneet kemoterapiaa muuntua ja muuttua vastustuskykyisiksi, 2) proteiinit, jotka kuljettavat huumeita syöpäsoluihin lakkaa toimimasta, 3) solut voivat alkaa pumpata huumeita ulos solun nopeasti kuin ne voivat tulla solun, 4) geenejä, jotka laukaisevat ylituotantoa proteiineja, jotka tekevät huumeiden tehoton voi tulla monistaa, ja 5) syöpäsolujen voi alkaa korjata DNA taukoja aiheutti hoidosta. Ottaen huomioon nopea lääkeresistenssin neuroblastooma ja rajoitettu määrä lääkettä tällä hetkellä hoitoon neuroblastooma, on olemassa suuri tarve uuden hoidon, joka voisi jatkaa poistaa pahanlaatuisten solujen, kun nämä solut on kehitetty resistenttejä muille syöpälääkkeiden. Mahdollinen uusi ratkaisu tähän ongelmaan on mahdollista käyttöä HIV-1 Vpr ainutlaatuisen biologiset ominaisuudet on kuvattu edellä.

osoittamiseksi potentiaali hyödyllisyys Vpr kuin solunsalpaajaksi, olemme tehneet proof of-concept alustavat tutkimukset

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset tutkimuksemme osoittivat, että Vpr indusoi solusyklin G2 pysähtymiseen ja apoptoosiin useissa eri syöpätyyppien. Olemme lisäksi osoittaneet, että sama Vpr vaikutukset voidaan havaita myös syöpäsoluja, jotka ovat resistenttejä syöpälääkkeet, kuten DOX. Lisäksi olemme hyväksyneet neuroblastooma hiirimallissa, jonka avulla voimme näyttää ehkäisevän vaikutuksen Vpr kasvaimen kasvuun

in vivo

.

Tulokset

Vpr indusoi solusykliä G2 pidätys eri syöpäsoluissa

Vpr on havaittu aiheuttavan solusyklin G2 pidätys on laaja valikoima eukaryoottisolut vaihtelevat fissio hiiva ihmisen soluihin [15], [16]. Nämä havainnot ovat viitteellisiä, että erittäin konservoituneita solujen toimintaa eukaryoottisoluissa ovat todellakin vaikuttaa Vpr. Tässä tutkimuksessa, adenovirusinfektio järjestelmä valittiin potentiaalista vaikutusta HIV-1 solusyklin G2-induktio eri syöpätyypeissä (taulukko 1) kuten aiemmin on kuvattu [17] – [19]. Adenoviruksen järjestelmät mahdollistaa lähes 100% solujen tartunnan transduktion ja havaitseminen Vpr vaikutukset voivat havaita jo 5 tuntia [18]. Käyttämällä tätä järjestelmää, testasimme mahdollinen vaikutus Vpr eri tyyppisiä syöpäsolulinjoja. Näitä syöpä tyyppejä ovat kohdunkaulan (HeLa), rinta (MCF-7), munasarjojen (A2780), ja T- tai B-solujen lymfoomat (Jurkat ja SU-DHL-4). Kuten on esitetty kuviossa 1 ja taulukossa 1, Vpr indusoiman solusyklin G2-pidätys kaikissa syöpäsolutyyppien testattu sillä poikkeuksella, että vain osittain G2 muutos havaittiin MCF-7-soluissa (kuvio 1 – keskellä). Toiminnallinen merkitystä tämän osittaisen G2 induktio on arveltu keskusteluun. Lisäksi tämä G2 induktio näyttää olevan riippumaton p53-geenin asema, joka on yhdenmukainen useiden aikaisempien raporttien [7], [20].

Kaikki syöpäsolun linjat (katso taulukko 1 yksityiskohdat; vain 3 solulinjoja on esitetty tässä esimerkkejä) kasvatettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solut transdusoitiin Adv tai Adv-Vpr kanssa MOI 1,0. Solut kerättiin 48 tuntia infektion jälkeen (

p.i.

), Jälkeen solut valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Cellular DNA-pitoisuus analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson), kuten aikaisemmin on kuvattu [4], [19]. Solusyklin profiilit mallinnettiin ModFit ohjelmistoa (Verity Software House, Inc.).

Vpr indusoi solusyklin G2 pidätyksen ja solukuoleman riippumatta lääkeresistenssin aseman doksorubisiinille

Doksorubisiini (adriamysiini, hydroxydaunorubicin, DOX) on syövän vastainen lääke, joka on käytetty hoidettaessa monenlaisia ​​syöpiä, mukaan lukien rinta-, maha-, keuhko-, munasarja- ja virtsarakon syövät sekä leukemia, monenlaisia ​​karsinooma, ja pehmytkudoksen sarkoomat. Tarkka molekyylimekanismi DOX ei ole vakiintunut. Kuitenkin on tunnettua interkalatoi DNA ja keskeyttää DNA-replikaatioon mikä johtaa solun kuolemaan [21]. Vaikka DOX edelleen olennaisena osana ensilinjan syöpälääkkeiden hoidettaessa monenlaisia ​​kasvaimia, kehittäminen kasvain huumeiden resistenttejä DOX ja muiden syöpälääkkeiden hoito on merkittävä este saavuttamiseksi onnistuneen anti-syöpähoitoihin [22], [23]. Tutkitaan onko Vpr voi estää soluproliferaatiota G2 pidätyksestä ja tappaa ne syövän huumeiden vastustuskykyisten kasvainsolut, me ilmaisi

vpr

geeni

kautta

Adv-Vpr transduktion in kolme paria huumeiden infektoitunut (WT) ja DOX-resistenttejä (DOX-R) syöpäsoluja. Ne ovat ihmisen neuroblastooma (SK-N-SH), osteosarkooma (SaOS2), ja rintojen adenokarsinooma (MCF-7). Nämä DOX-resistenttejä solulinjoja jatkuvalla inkuboimalla vanhempien solulinjoja portaittain kasvaa DOX pitoisuudet välillä 10

-9-10

-6 M aikana 3-6 kuukautta. Yksityiskohtaiset menetelmä tuottaa nämä DOX-resistenttejä solulinjoja on kuvattu aikaisemmin [24]. Kuten on esitetty taulukossa 1, ilmentymistä Vpr aiheuttaa solujen kasvun pysähtymistä kaikissa soluissa testataan riippumatta lääkeaineille asema DOX. Lisäksi mittaus soluproliferaation ja elinkelpoisuuden MTT-määritystä, joka metaboloi tetratsoliumsuolan (MTT), ilmeni vähän solujen lisääntymisen tai elävien solujen jäljellä 5 päivää sen jälkeen, Adv-Vpr transduktion (kuvio 2); Vastaavasti määritys solukalvon eheyden trypaanisini, joka värjää vain kuolleet solut osoittivat, että Vpr antaa erittäin voimakas sytotoksisuus näiden solujen (kuva 2).

Kolme paria lääkkeen infektoitunut (WT) ja DOX-resistenttejä (DOX-R) syöpäsoluja testattiin Vpr-induced G2 pidätys (taulukko 1) ja solukuolemaan. Nämä syövän solulinjat kasvatettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solut transdusoitiin Adv tai Adv-Vpr kanssa MOI 2,5. Solujen elinkelpoisuus määritettiin joko trypaanisinieksluusiolla määritys, joka tunnistaa kuolleita soluja (ylempi kuva) tai MTT-määritystä mittaamaan solujen eloonjäämistä (alhaalla kuvassa). Soluja tutkittiin 5 päivää

p.i.

Intials: WT, villityyppisen; Dox-R, doksorubisiiniresistenttejä; 1, Mock; 2, Adv ja 3, Adv-Vpr.

Vpr indusoi annoksesta riippuvaisen solukuoleman ja apoptoosin DOX-naiivi ja kestävä neuroblastoomasoluilla

edelleen ymmärtää Vpr aiheuttama soluntappokyky huumeiden naiivi ja resistenttien kasvainsolujen ja valmistautumaan

in vivo

tutkimus mahdollisten Vpr n vaikutusta kasvaimen kasvua hiirimallissa, päätimme keskittää tutkimus vaivaa neuroblastooma. Neuroblastooma valittiin malliksi järjestelmää, koska neuroblastooma on yksi yleisimmistä kiinteiden kasvainten varhaislapsuudessa yleensä löytyy vauvojen ja pienten lasten. Toinen syy valintaan neuroblastooma malli on, että ihmisen neuroblastooma ksenograftissa hiirimallissa järjestelmä tunnetaan hyvin [25], [26].

analysoiminen Ennen

in vivo

hiiren tutkimuksissa määriteltiin aluksi potentiaali annoksesta riippuvaa vasteita Vpr aiheuttaman solukuoleman molemmissa villityypin (WT) ja lääkkeille vastustuskykyiset (DOX-R) SK-N-SH neuroblastoomasoluihin. Trypaanisinisen ja MTT määrityksiä käytettiin mittaamaan solujen lisääntymistä ja elinkelpoisuus 5 päivän kuluessa Adv ohjaus ja Adv-Vpr transductions. Yhteenveto näistä tuloksista esitetään kuviossa 3A-a. Vaikka kasvu useista infektiivisyyden (MOI) Adv ohjaus ei aiheuta merkittävää solukuolemaa, selvä annoksesta riippuvainen solujen tappaminen on esitetty sekä WT ja DOX-R soluissa osoitetaan trypaanisinistä määrityksessä. Pienillä end, MOI 1,0 aiheutti noin 40-80% solukuolema; kun taas kaikki solut (100%) tapettiin MOI 10.0. MTT-määritystä osoitti, että vastaava annoksesta riippuvaa vähenemistä solujen lisääntymisen ja solujen eloonjääntiä, ja Western blot-analyysit vahvistivat, että Vpr on tuotettu näiden Adv-Vpr-infektoituneissa soluissa (kuvio 3A-b). Edelleen ymmärtää dynamiikkaa Vpr vaikutuksesta solujen lisääntymistä, solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus mitattiin ajan (enintään 5 päivää) ja MOI 2.5. Kuten kuviossa 3B, mock tai Adv-tartunnan solut osoittivat normaalin solun lisääntymistä ja saavutti tasanteen 3 päivän vähän tai ei lainkaan solujen lisääntymistä havaittu Adv-Vpr infektoiduissa soluissa. Pelkistetty metabolinen aktiivisuus ajan ehdotti lisääntynyt solukuolema ajan mittaan. Arvioitava edelleen tila Vpr aiheuttaman solukuoleman neuroblastoomasolujen (vai ei Vpr tappaa nämä solut apoptoosin tai muu mekanismi) mahdollisia kaspaasi-3 katkaisun vaikutus mitattiin osoituksena apoptoosin. Erottaa Vpr-solukuolema sen vaikutus solusyklin, Vpr- mutantti (F34I), joka aiheuttaa G2 induktio mutta ei indusoi solukuolemaa oli myös mukana tässä tutkimuksessa verrokkina [18], [27], [28] . Sen jälkeen, kun adenovirus-infektio, tila kaspaasi-3 seurattiin alkaen 6-36 tuntia Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita yhteensä kaspaasi-3 (kuvio 3C, suurin kaista) tai pilkkoa spesifisesti kaspaasi-3 (kuvio 3C – keskellä kaistaa). Ei kaspaasi-3-pilkkoutumisen havaittiin Adv-F34I Vpr-infektoiduista soluista (merkitty ”m”) koko kokeen ajan; kaspaasi-3 lohkaisu näkyi 24-36 tuntia soluissa, jotka oli infektoitu villityypin (merkitty ”w”) Vpr.

. Vpr indusoi annosriippuvaisen solukuoleman huumeiden naiivi ja kestävä SK-N-SH-solut. a. Taso Vpr-solukuolema tutkittiin infektoimalla DOX-naiivi ja kestävä SK-N-SH-soluja käyttäen yhä MOI Adv tai Adv-Vpr viruksia. Solukuolema mitattiin määrittämällä solukalvon eheyden ja lisääntymistä käyttämällä Trypan blue ponnistelua (vasen) tai solujen elinkelpoisuuden MTT-määritystä (oikealla). Solut leviämisen ja elinkelpoisuus tutkittiin 5 päivää

p.i

. b. Vpr-proteiinin tuotanto vahvistettiin Western blot -analyysillä. Huomaa, että on hyvin vaikea havaita Vpr-proteiinia alhaisella MOI. Onnistunut infektio Adv-Vpr varmistettiin suurennettu ytimiä soluja kuten aiemmin raportoitu [43]. B. Vpr indusoi solukuolemaa ajan myötä huumeisiin naiivi ja kestävä SK-N-SH-solut. Sekä huumeiden naiivi ja kestävä SK-N-SH-soluja käsitellään samalla tavalla kuin A. Vain MOI2.5 käytettiin täällä. C. Vpr indusoi apoptoosia huumeiden naiivi ja kestävä SK-N-SH-solut. Kaspaasi-3 lohkaisu seurattiin jopa 36 tuntia. Initials: Csp3, kaspaasi-3; cl-Csp3, pilkottiin kaspaasi-3; m, Adv-VprF34I; w, Adv-Vpr.

Yhdessä tulokset

in vitro

tutkimukset tukevat ajatusta, että Vpr estää neuroblastoomasolu- lisääntymisen solusyklin G2 pidätyksen ja solukuolemaa

kautta

apoptoosin. Vielä tärkeämpää on, Vpr antaa nämä sytotoksisia vaikutuksia neuroblastoomasoluilla vastaavalla tasolla riippumatta heidän lääkeresistenssi tila.

In vivo

vaikutus Vpr on neuroblastooma kasvaimen kasvua hiirimallissa järjestelmä

vieressä tutkineet Vpr- vaikutusta kasvaimen kasvuun neuroblastooma solujen C57-SCID-hiirimallissa järjestelmä [29], [30]. Kahta eri lähestymistapaa käytettiin viemään Vpr kasvaimiin, eli ennen virustransduktio ennen solujen inokulaation hiiriin tai post-kasvaimeen injektion. Pre-transduktion villityypin ja DOX kestävä SK-N-SH ruiskutettiin Adv, Adv-VprF34I ja Adv-Vpr

s.c..

Sisään vasempaan kylkeen C57-SCID hiirillä. Tuumorin koko mitattiin joka 7 päivä. Lopullinen kasvaimen koon mittaus oli 26 päivää transduktion jälkeen ja hiiret uhrattiin lisäanalyysiä. Kuten kuvassa 4A on esitetty, keskimääräinen kasvaimen koko n. 2 cm näkyi hiirillä, jotka inokuloitiin WT tai DOX kestävä SK-N-SH-soluja 26 päivää transduktion jälkeen. Samanlaisia ​​kasvainten koot havaittiin myös Ad-F34Ivpr tartunnan hiirillä. Sen sijaan hyvin pieniä kyhmyjä on pistokohdan nähtiin Ad-Vpr transduktoitu- hiirillä, mikä viittaa ilmaus Vpr niissä soluissa estänyt niiden kasvua C57-SCID-hiirissä. Minimoida mahdollisten muunnelmien Yksittäisten hiirien yksittäiset hiiriin injektoitiin kaikkien kolmen transdusoimaan virukset

s.c..

On vatsan alueella, kuten on esitetty kuviossa 4B. Samanlainen kuin mitä olemme havaittu hiirillä, jotka inokuloitiin yksi hoitokerta, suunnilleen sama koko kasvaimia nähtiin sivustoja Adv tai Adv-F34Ivpr injektiot taas vähän tai ei kyhmyt nähtiin sivustoja ADV-Vpr injektiot.

tukahduttaminen neuroblastooma tuumorikasvun Vpr osoitetaan tässä joko ennalta transduktio Adv-Vpr (AB) tai post-kasvaimensisäistä injektion (C). Pre-transduktion, villityypin (WT) tai DOX-resistenttejä SK-N-SH-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 37 ° C: ssa 95% ilma /5% CO

2-ilmakehässä. Tuore soluja kasvatettiin ensin 12-kuoppalevyllä 36 tuntia ja adenoviruksen transduktio suoritettiin 5 tuntia ennen soluinokulaation kanssa MOI 2,5, joka määritettiin empiirisesti. Soluja käsiteltiin sitten Trpsin- EDTA, suspendoitiin uudelleen DMEM ja pestään PBS: llä 3 kertaa. Lopulliset solut suspendoitiin DMEM Ymppäykseen. Noin 2 x 10

6 soluja 100gl ruiskutettiin

s.c..

Sisään vasempaan kylkeen C57-SCID hiirillä. 3-4-hiiriin injektoitiin kussakin käsittelyssä. Näihin hoitoryhmissä kuuluvat Adv virus- kontrolli, Adv-Vpr ja Adv-F34IVpr. F34IVpr mutantti käytetään tässä kontrollina, koska yhden aminohapon muutos aminohappojen 34 Fenyylialaniini (F) isoleusiini (I) tekee Vpr voi aiheuttaa apoptoosia (kuvio 3C), mutta mahdollistaa solusyklin syöttää pitkän G2 vaihe [18], [27], [28]. Tuumorin koko mitattiin joka 7 päivä mittaamalla kaksi kohtisuorassa kasvaimen halkaisijaa mittaharpilla. Lopullinen kasvain mittaus oli 26 päivää transduktion jälkeen ja hiiret uhrattiin lisäanalyysiä. Sisäiseen leesiottoman injektion Vpr, WT ja DOX-R SK-N-SH-neuroblastoomasoluja valmistettiin oleellisesti samalla tavalla kuin edellä on kuvattu. 200 ui Adv, Adv-Vpr tai Adv-F34Ivpr ruiskutettiin sitten huomaamattomasti 3-sisimäiseen kasvaimia 2 viikon kuluttua soluinokulaation kanssa virusperäisen pitoisuus 1012 /ml. Tuumorin koko mitattiin joka 7 päivä. Lopullinen tuumorin koon mittaus oli 39 päivää injektion jälkeen ja hiiret lopetettiin sitten lisäanalyysiä varten. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin, ja näiden kokeiden tulokset, joissa keskimääräinen kasvaimen koon standardipoikkeama (SD) on esitetty taulukossa 2.

Yksi mahdollinen argumentit saatuja tuloksia pre-transduktio on että ilmaus Vpr

in situ

voisi nopeasti tappaa SK-N-SH-solut estäen kasvaimen muodostumisen ja näin testaus Vpr vaikutusta varsinaisen kasvaimen kasvua. Voit kiertää tämän ongelman, vaihtoehtoista post-kasvaimensisäistä injektion menetelmää käytettiin. WT ja DOX-R SK-N-SH-neuroblastoomasoluja valmistettiin ja siirrostettiin olennaisesti samalla tavalla kuin edellä on kuvattu. ADV, Adv-Vpr tai Adv-F34Ivpr ruiskutettiin sitten huomaamattomasti 3-sisimäiseen kasvaimia 2 viikon kuluttua soluinokulaation. Tuumorin koko mitattiin joka 7 päivä. Lopullinen tuumorin koon mittaus oli 39 päivää injektion jälkeen ja hiiret lopetettiin sitten lisäanalyysiä varten. Tilastollinen kokeet suoritettiin arvioimaan mahdolliset erot kasvaimen koon joka viikko tai sen aikana koko kokeen aikana. Lopulliset tulokset on esitetty taulukossa 2. Vaikka Vpr alennetaan 44,1 ± 11,8%: n kasvaimen kasvua villityypin SK-N-SH kasvainten viikolta 1 jälkeen kasvaimeen injektion, tilastolliset analyysit osoittivat

t

– arvo 2,35 (p = 0,10), eli ei tilastollista eroa; Samoin, ei kasvaimen kasvu eroa nähtiin Dox-R kasvaimia viikko 1. Kuitenkin tilastollinen merkittäviä eroja havaittiin sekä villityypin ja Dox-R kasvaimia viikolla 2 ja viikolla 3. Erityisesti WT neuroblastoomasoluilla Vpr vähentää 64,2 ± 6,7%: n tai 76,4 ± 5,9%: n kasvaimen kasvua viikolla 2 tai 3 sen jälkeen, kun kasvaimeen injektion, vastaavasti; Samoin verrattavissa prosenttia vähennys (67,1 ± 4,5%: n tai 75,6 ± 1,8%) havaittiin myös, että DOX-R-soluja samaan aikaan. Vertailu kasvaimen kasvun aikana koko koejakson painotetun keskimääräisen summia [31] ehdotti yleisiä eroja kasvaimen kasvun välillä Ad ohjaus hoidetuissa hiirissä ja Ad-Vpr injektoidaan hiiriin (p 0,05). Vuonna Päinvastoin, ei tilastotieto havaittu eroja Ad ohjaus ja Ad-F34IVpr ryhmiä. Näin ollen, on selvää, että ilmaus Vpr kasvaimissa on vähentänyt merkittävästi kasvaimen kasvua ja ilmentymistä Vpr todellakin estää kasvaimen kasvua ihmisen neuroblastoomasoluja riippumatta sen lääkkeen resistenteiksi.

Keskustelu

esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että HIV-1-viruksen proteiini Vpr estää soluproliferaatiota pidättämällä ne solut G2-vaiheen solusyklin eri syöpäsolutyyppien testataan (taulukko 1, kuvio 1). Lisäksi, Vpr indusoi solukuoleman kolmesta eri syöpäsolulinjojen riippumatta siitä, onko ne ovat resistenttejä tai herkkiä DOX (kuvio 2). Lisäksi analyysit Vpr vaikutuksen neuroblastoomasolut osoittivat, että Vpr indusoi solukuolemaa annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A-B)

kautta

apoptoosin kuten kaspaasi-3 pilkkoutumisen (kuvio 3C). Käyttämällä neuroblastooma hiirimallissa, olemme edelleen osoittaneet, että toimitus Vpr

kautta

adenovirus-toimitus neuroblastoomakasvainten, joko pre-infektio (kuva 4A-B) ja kasvaimeen injektiota (kuvio 4C), inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvu. Näin kuvattu tulokset osoittavat by proof-of-concept joka Vpr voisi olla hyvä ehdokas lisätutkimuksia sen osassa kasvaimen tukahduttaminen etenkin ne, jotka ovat vastustuskykyisiä syöpälääkkeiden.

Vaikka Vpr indusoi solusykliä G2 pidätys kaikissa syöpäsolutyyppien testattaessa havaittiin, että taso G2 pidätettiin solujen rintasyövän MCF-7 oli paljon pienempi (kuvio 1 – keskellä). Se on tällä hetkellä epäselvä, miksi tämä solulinja on osittain resistentti Vpr aiheuttama G2 pidätys. Kuitenkin ei näytä olevan mielenkiintoinen korrelaatio Vpr aiheuttama G2 pidätyksen ja entsymaattinen tilan proteiinifosfataasi 2A (PP2A). Kuten olemme aikaisemmin on raportoitu, yksi ainutlaatuisia ominaisuuksia Vpr aiheuttama G2 pidätys on se, että se vaatii toimintaa PP2A [2], [4], [16], [32]. Haku kirjallisuuden osoitti, että sääntely alayksikköä PP2A on joko merkittävästi vähentynyt tai menetetty MCF-7 solulinja [33], [34]. Vähentäminen G2 pidätys MCF-7-solut tukevat käsitystä, että Vpr estää soluproliferaatiota induktion G2 pidätyksen kautta PP2A välittyvä mekanismi [4], [32]. Lisäksi tämä havainto viittaa siihen, että Vpr ei ehkä voi estää soluproliferaatiota G2 pidätyksen kaikissa tuumorisoluissa, erityisesti kasvainsolujen, jotka sisältävät PP2A liittyviä mutaatioita. Lisätutkimuksia tämän käsitteen on varmasti perusteltua erityisesti yhteydessä käyttäen Vpr kuin solunsalpaajaksi.

Vpr indusoi solukuoleman ja apoptoosin läpi useita mekanismeja [Katsauksia varten katso [5], [6]] . Koska Vpr kykenee indusoimaan solukuolemaa ja apoptoosia sekä DOX-naiivi ja kestävä neuroblastoomasoluja, yksi tai muutamia niistä ehdotetuista Vpr väyliä saattanut aiheuttaa havaittu sytotoksisuus. Tulevaisuutemme on keskittyä testaus joka mekanismi Vpr-solukuolema voi voittaa apoptoottisen vastus, tyypillinen piirre monissa syöpäsolujen kuten neuroblastooma. Tietojen perusteella kuviossa 3C on esitetty, on selvää, että Vpr kykenee aiheuttamaan apoptoosin kuten on esitetty kaspaasi-3 pilkkominen. Tämä havainto on johdonmukainen luonnehdinta Vpr aiheuttaman apoptoosin samassa neuroblastoomasoluilla osoittaneet käyttämällä liitteessä V määritys [35]. Siellä, olemme edelleen osoittaneet, että Vpr: n indusoiman apoptoosin SK-N-SH-neuroblastoomasoluja kautta mitokondrioiden riippuvainen ja kaspaasi-9-välitteisen mekanismi. [35]

käytetty pre-infektio ja sisäisen kasvainten injektiot meidän hiirimallissa käyttöönoton Vpr osaksi neuroblastoomakasvainten. Nämä kaksi menetelmää käytettiin, koska ilmaus Vpr

in situ

voi nopeasti tappaa soluja ja siten estää testauksen todellisiin kasvaimen kasvua. Tuloksemme osoittivat, sekä menetelmiä merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua käyttöönoton jälkeen Vpr. Verrattain, DOX-resistentit solut osoittivat myös samantasoiset kasvaimen koon pieneneminen tukee oletuksesta, että Vpr ilmentyminen estää kasvaimen kasvua riippumatta lääkkeen resistenteiksi.

On syytä mainita, että kuvatut kokeet, emme potentiaalin testaamiseksi Vpr- vaikutuksen metastaattisen neuroblastoomasoluilla. Emme kuitenkaan suorittaa alustavat farmakologiset tutkimukset testata haitallisia vaikutuksia, C57-SCID kun he olivat altistuneet Vpr systemaattisella koko kehon injektio. Näissä kokeissa Kasvavat kasvua Adv-Vpr viruspartikkelien välillä 1 x 10

13-6 x 10

13 viruspartikkelien injektoitiin C57-SCID kautta häntälaskimoiden. Ei selvää haittavaikutuksia havaittiin näissä hiirissä aikana koko kokeen aikana. Patologiset tutkimukset eri elinten 3 viikkoa sen jälkeen, kun virus injektion ei ollut selvää sytotoksisia vaikutuksia asettamat Vpr- (tuloksia ei ole esitetty). Siksi otetaan systemaattisesti Vpr voisi myös olla vaihtoehto tulevaisuudessa testaus.

käsitettä käytetään HIV-1 Vpr mahdollisena syöpälääke ei ole uusi. Itse asiassa, muut varhaiset tutkimukset myös meidän ovat ehdottaneet tätä mahdollisuutta [36], ja lukuisia tutkimuksia ovat osoittaneet, että toimitus Vpr eri kasvaimia, kuten melanooman [37] – [39], hepatooma [40], [41] ja suun syöpä [42] tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

. Uutta on kuitenkin se, että olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että Vpr pystyy tukahduttamaan kasvaimen kasvua riippumatta siitä, onko se herkkä tai resistentti syöpälääkkeen läpi solusyklin G2 pysähtymisen ja apoptoosin. Tämä havainto saattaa olla merkittävä, koska tuhoaminen lääkkeille vastustuskykyiset syöpäsolut tekee mahdollisen ja voimakas uusien ja vaihtoehtoisten syövän vastaisen aineen. Tämän tyyppinen syöpälääke voi tulla erityisen käyttökelpoisia täydentävä viruksen terapeuttisen aineen selektiivinen esto kasvaimen kasvua erityisesti silloin, kun muut terapiat eivät.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

erilaisia ​​ihmisen syövän solulinjat, jotka edustavat eri syöpien lääkkeellä tai ilman resistenssin syöpälääke doksorubisiinin (DOX) käytetään tässä tutkimuksessa ja yhteenveto taulukossa 1. Ellei erityisesti ole mainittu, nämä solulinjat kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen (DMEM) (Cellgro) tai RPMI 1640 väliaine (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen). Inkubaatio tapahtui 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa.

adenovirusinfektio

Adenovirusvektori (Adv) ja Adenovirusvektori asetettu laitteeseen

vpr

geeni (Adv-Vpr) ystävällisesti toimitti Dr. LJ Zhao [17]. Noin 1 x 10

6 Testin solut infektoitiin Adv tai Adv-Vpr viruksia. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia

p.i.

, Solut kerättiin solusyklin analyysiä tai Western blot-analyysi. Infektiot suoritettiin infektiokertoimella (MOI) 1,0 solusyklin analyysit, kuten on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa. 1. MOI 2,5 käytettiin aluksi solukuoleman analyysit, kuten on esitetty kuviossa. 2.Under tämä adenovirus-muutin- ehto, yli 90% infektion tehokkuus saavutettiin näillä viruksen varastot (tuloksia ei ole esitetty).

Solusyklianalyysiä

Solut kerättiin 48 tuntia

pi

, sitten pestiin kaksi kertaa käyttäen 2 ml 5 mM EDTA: ta /PBS: ää ja sentrifugoitiin 1500 rpm: ssä.