Krooninen sairaus

tiivistelmä

rooli neo-angiogeneesin eturauhassyövässä (PCA) kasvua ja etäpesäkkeiden on vakiintunut, vaan kehittää tehokkaita ja myrkyttömiä farmakologinen angiogeneesin estäjiä edelleen unaccomplished tavoite. Tältä osin kohdistaminen poikkeava angiogeneesi kautta myrkyttömiä phytochemicals voisi olla houkutteleva angiopreventive vastaista strategiaa PCA. Ajatuksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli verrata antiangiogeenisen potentiaalin neljä puhdasta diastereoisomeeristen flavonolignans eli silybin A, silybin B, isosilybin A ja isosilybin B, jota aikaisemmin on vahvistettu biologisesti aktiivisia aineosia Milk Thistle uutetta. Tulokset osoittivat, että suun kautta ruokinta näistä flavonolignans (50 ja 100 mg /kg) tehokkaasti estää kasvun kehittyneiden ihmisen PCA DU145 ksenografteja. Immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että nämä flavonolignans estää kasvaimen angiogeneesiä biomarkkereita (CD31 ja nestiinifenotyypin) ja molekyylejä säädellään angiogeneesiä (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, fosfo-Akt ja HIF-1α) vaikuttamatta haitallisesti aluksen-count normaaleissa kudoksissa (maksa, keuhkot, ja munuainen) kasvaimen kantavien hiirten. Nämä flavonolignans esti myös pienten suonten versoja hiiren selkä- aorttoja

ex vivo

, ja VEGF: n indusoimaa soluproliferaatiota, kapillaarimaisen putken muodostumiseen ja invasiivisuus ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC)

in vitro

. Lisätutkimukset HUVEC osoittivat, että nämä diastereoisomeerit tavoite solusyklin, apoptoosin ja VEGF: n indusoimaa signalointiryöpyn. Kolmiulotteinen kasvu määrityksessä sekä yhteistyö kulttuurin invaasio ja

in vitro

angiogeneesiä tutkimukset (HUVEC ja DU145 solut) ehdottivat ero tehokkuutta diastereoisomeerit kohti PCA ja endoteelisolujen. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset selvitetty vertaileva antiangiogeenisen tehoa puhdasta flavonolignans Milk Thistle ja ehdottaa niiden käyttökelpoisuus PCA angioprevention.

Citation: Deep G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, Gu M, Agarwal C , et ai. (2012) Angiopreventive tehokkuus Pure Flavonolignans Milk Thistle Pura vastaan ​​Eturauhassyöpä: Targeting VEGF-VEGFR Signaling. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10,1371 /journal.pone.0034630

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2011; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2012; Julkaistu: 13 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Deep et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI R01 apurahoja CA102514 ja CA104286. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on useimmin diagnosoitu ei-kutaaninen maligniteetti miesten Yhdysvalloissa, ja se on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien [1]. Kliiniset ja kokeelliset todisteet ovat ehdottaneet, että ihmisen kasvaimista voivat säilyä vuosia mikroskooppisia vaurioiden lepotilaan ja niiden kasvua on kriittisen riippuvainen saavuttaa ”angiogeeninen fenotyyppi” [2], [3], [4], [5] . ”Angiogeenisen kytkimet”, joihin liittyy korkea VEGF ja VEGF-reseptori (VEGFR) tasot on tunnistettu ja katsoa olevan vastuussa PCA siirtymisestä huono laatu PIN (eturauhasen intraepiteelisen neoplasia) vaiheessa korkealuokkaisesta PIN ja edelleen aggressiivisempia, huonosti eriytetty, ja androgeenin itsenäinen pahanlaatuisten vaiheiden [6]. Lisäksi angiogeneesi tasolla PCA on korreloivat suoraan Gleason pisteet, kasvaimen vaiheessa etenemistä, etäpesäkkeitä ja selviytyminen [6], [7], [8]. Siksi kohdistaminen angiogeneesi on tehty monia kliinisiä tutkimuksia parantaa elämänlaatua syöpäpotilaiden [9], [10], [11]. Lisäksi synnyn estäminen angiogeneesin veltto kasvaimet (viitataan nimellä ”angioprevention ’) on ehdotettu uutena ja perusteluja lähestymistapa valvontaan PCA kasvun, pahanlaatuiset eteneminen ja etäpesäkkeiden toissijaiseen sivustoja.

DU145 ksenograftit aloitettiin ja hiirille annettiin joko vehikkeliä (CMC) tai 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta kunkin diastereoisomeerin. (A) Kasvaimen tilavuus mitattiin ja esitettiin graafisesti ajan funktiona (päiviä). Kukin arvo käyrät on keskiarvo ± SEM 10-12 hiirillä. (B-D) Ksenograftikudoksista analysoitiin PCNA, TUNEL ja halkaistut kaspaasi-3 (CC3) IHC. Tiedot näkyvät baarissa kaaviot on keskiarvo ± SEM 4-5 näytteitä. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

DU145 Ksenograftikudoksista analysoitiin CD31, nestiinifenotyypin, VEGF ja VEGFR2 IHC. Kvantitatiiviset analyysit suoritettiin käyttäen Zeiss Axioscope 2 mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa) ja valokuvia on alun perin tallennettu (at 400x), jossa on Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera Axiovision Rel 4.5 ohjelmisto. Tiedot näkyvät baarissa kaaviot on keskiarvo ± SEM 4-5 näytteitä. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

DU145 Ksenograftikudoksista analysoitiin VEGFR1, HIF-1α, fosforyloidun Akt

Ser473 ja yhteensä Akt tasoilla IHC. Kvantitatiiviset analyysit suoritettiin käyttäen Zeiss Axioscope 2 mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa) ja valokuvia on alun perin tallennettu (at 400x), jossa on Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera Axiovision Rel 4.5 ohjelmisto. Tiedot näkyvät baarissa kaaviot on keskiarvo ± SEM 4-5 näytteitä. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

Noin neljä vuosikymmentä sitten, Juudan Folkman ensin ennustaa mahdollinen rooli antiangiogeenisestä estäjät kiinteitä syöpiä, ja tähän mennessä useita angiogeneesin inhibiittoreita on testattu monia pahanlaatuisia kasvaimia [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Monet näistä inhibiittoreita on jo FDA: n hyväksymä niiden käyttöön joko yksinään tai yhdessä kemoterapeuttisten syöpälääkkeiden [13], [15], [16]. Esimerkiksi humanisoidun VEGF-vasta-aine on hyväksytty vastaan ​​peräsuolen, aivo-, keuhko-, ja munuaisten syövät [16]. Samoin tyrosiinikinaasiestäjiksi sorafenibia ja sunitinibi, joiden kohteena VEGFR aktiivisuutta, on hyväksytty käytettäväksi vastaan ​​edennyt munuaissyöpä [16]. Vaikka angiogeneesin syövän, periaatteessa on ääni ennaltaehkäisevä /terapeuttinen strategia, nykyinen lähestymistapa kohdistaminen yksittäisen molekyylin, kuten VEGF tai VEGFR on virheellinen, koska syöpäsolut kehittää resistenssin kautta kiertämisen näiden molekyylien ja jatkaa leviämistä verisuoniverkostoja [17 ]. Rinnalla niiden rajoitettu tehoa suhteen paraneminen potilaan selviytymistä, nämä hoitovaihtoehdot ovat erittäin kalliita ja ovat osoittaneet liiallisia myrkyllisyys [18], [19]. Siksi me järkeistetään tarvetta tunnistaa myrkyttömiä luonnollisia aineita laajakirjoisten antiangiogeenistä teho; ja tässä suhteessa, että tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet antiangiogeenisiä tehoa neljä puhdasta diastereoisomeerien Milk Thistle (

maarianohdake

) ote, nimittäin silybin A, silybin B, isosilybin A ja isosilybin B. Nämä diastereoisomeerit ovat flavonolignans identtisellä flavonoidi osan ja eroavat toisistaan ​​vain kokoonpanoissa noin lignaanista osan, ja niiden kemialliset ja biologiset ominaisuudet on esitetty yksityiskohtaisesti aikaisemmin [20], [21], [22], [23], [24]. Tässä ensimmäistä kertaa olemme analysoineet angiopreventive tehoa näiden flavonolignans PCA ksenograftimallia ja erilaiset

ex vivo

,

in vivo

ja

in vitro

angiogeneesiin määrityksiä.

(A-B) keuhkoihin, maksaan ja munuaisiin kustakin hiirestä otettiin talteen ja analysoitiin CD31-immunoreaktiivisuus sekä histopatologisia analyysejä. Kvantitatiiviset analyysit suoritettiin käyttäen Zeiss Axioscope 2 mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa) ja valokuvia on alun perin tallennettu (at 400x), jossa on Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera Axiovision Rel 4.5 ohjelmisto. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B.

(A) Flavonolignans estävät angiogeneesiä

ex vivo

. Hiiren aorttoja maljattiin Matrigelillä ja käsiteltiin flavonolignans. Nuolet kuvassa merkki syntymässä alusta alkaen aorttoja. (B) Flavonolignans estää VEGF-indusoitua putki muodostumisen HUVEC. HUVEC maljattiin Matrigelillä ja vaikutuksesta diastereoisomeerit hoidon VEGF: n indusoimaa putken muodostumiseen analysoitiin. Edustavia putkimainen verkko mikrovalokuvia näkyvät 100x (yläpaneeli). Putkenpituus kvantitoitiin kuten yksityiskohtaisesti ”Methods” (alapaneeli). Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

(A) HUVEC indusoitiin VEGF ja käsiteltiin kukin flavonolignan 0,5% seerumia media, ja solujen kokonaismäärä analysoitiin 24 tunnin kuluttua. (B) HUVEC maljattiin ylemmässä kammiossa DMSO tai yksittäisiä diastereoisomeerin, kun taas VEGF lisättiin alempaan kammioon ja HUVEC invaasio tutkittiin. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

(A-B) HUVEC hoidettiin DMSO tai yksittäisiä flavonolignan ja analysoitiin solujen kokonaismäärä ja solusyklin jakelu. (C) HUVEC käsiteltiin flavonolignans, ja 24 tuntia myöhemmin, kokosoluliuotteista valmistettiin ja analysoitiin solujen lukiertosäätelijöistä. Densitometrian arvot esitetään alla nauhat ovat ”kertainen muutos” verrattuna kontrolliin lataamisen jälkeen ohjaus (α-tubuliinin) normalisointi. (D) HUVEC käsiteltiin flavonolignans (30 uM annos) 36 tuntia ja analysoitiin morfologian (edustaja mikrovalokuvia näkyvät 100x), tasot cPARP, pilkkoa kaspaasi 3 ja 9, ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

HUVEC olivat ilman seerumia 22 tunnin ajan, käsitellään diastereoisomeerit 2 h ja stimuloitiin VEGF: llä (10 ng /ml) 10 minuutin ajan. Kokosoluliuotteista valmistettiin ja analysoitiin edellä mainittujen signalointimolekyylien. Densitometrian arvot esitetään alla nauhat ovat ”kertainen muutos” verrattuna kontrolliin lataamisen jälkeen ohjaus (β-aktiini) normalisointi.

(A) vaikutus flavonolignans (90 uM annoksesta) on kolmiulotteinen kasvuun DU145 solujen tutkittiin yksityiskohtaisesti ”Materiaalit ja menetelmät”. Edustavia pallosia mikrovalokuvia näkyvät 100x ja 400x. (B) In TranswellTM invaasiomääritys joko DU145 soluja (päällystetty alemmassa kammiossa) tai HUVEC (päällystetty ylemmässä kammiossa) käsiteltiin yksittäisten diastereoisomeerit (30 uM annoksesta), ja HUVEC invasiivisuus mitattiin. (C) DU145-soluja käsiteltiin yksittäisten diastereoisomeerit (30 uM annoksesta) ja kasvatusliuos otettiin talteen. HUVEC maljattiin Matrigelillä yhdessä 0,5% FBS tai väliaine eri hoitoryhmissä; ja putken muodostumiseen analysoitiin. Edustavia mikrovalokuvia putkimainen verkko esitetään 100x. Lyhenteet: Sil V: silybin A; Sil B: silybin B; Iso V: Isosilybin A, Iso B: Isosilybin B; CM: väliaine; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01.

silybin A, silybin B, isosilybin A ja isosilybin B tavoite angiogeneesiä eturauhastuumoreissa kautta kohdesignaalireitteihin molekyylien PCA soluissa sekä endoteelisoluissa, tärkeä komponentti PCA microenvironment.

Methods

Cell Line ja reagenssit

Ihmisen PCA DU145 solut olivat ATCC (Manassas, VA) ja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. HUVEC olivat Lonza (Walkersville, MD) ja kasvatettiin EBM2 median kanssa EGM-2 SingleQots täydentää. Matrigel ja invaasio kammio olivat BD Biosciences (New Bedford, MA). TUNEL iinianalyysikitissä oli Promega (Madison, WI). Karboksimetyyliselluloosa (CMC), Harris hematoksyliinillä ja β-aktiini-vasta-aine olivat yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO). DAB pakki oli Vector Laboratories (Burlingame, CA). Streptavidiini ja PCNA-vasta olivat Dako (Carpinteria, CA). Vasta-aineet CD31, VEGF ja nestiinifenotyypin olivat Abcam (Cambridge, MA). Vasta-aineet VEGFR1, VEGFR2 ja HIF-1α [käytetään immunohistokemia (IHC) analyysi] sekä vasta-Cdk2, Cdk4, Cdc2, sykliini D1, sykliini D3, sykliini B1, p21, p27, Skp 2, Cdc25A ja Cdc25C ja normaalia vuohen seerumia oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). p27-vasta-aine oli peräisin Neomarkers (Fremont, CA) ja p21-vasta oli Upstate (Charlottesville, VA). Vasta-aineet tunnustaa fosforyloidun ja /tai koko proteiinin tasot VEGFR1, VEGFR2 Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, halkaistut kaspaasi 3, pilkotaan kaspaasi 9, ja vuohen anti-kani HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet olivat peräisin Cell signaling (Beverly, MA). ECL tunnistusjärjestelmä ja anti-hiiri-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen oli GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). VEGF oli T D (Minneapolis, MN). Silybin A, silybin B, isosilybin A ja isosilybin B eristettiin (puhtaus 97%) peräisin ote jauheeksi hedelmistä

maarianohdake

(L.) Gaertn. [Saatu Euromed, S.A. (Barcelona, ​​Espanja)]. Hybridi kromatografiset /precipitative tekniikoita ja menettelyjä gramman mittakaavassa puhdistus nämä flavonolignans ilmoitetaan jo aiemmin [26].

In vivo

-tuumoriksenografti Study

Kateenkorvattomiin (

nu /nu

) nude-hiiret olivat NCI (Frederick, MD). Hoitoprotokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of Colorado Denver. Noin 3 x 10

6 DU145 solut suspendoitiin 50 ui seerumittomalla väliaineella, sekoitettiin 50 ui matrigeeliä, ja injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Seuraavana päivänä ksenografti istutusta, hiiret jaettiin satunnaisesti jaettu yhdeksään ryhmään, ja kaikki hoidot tehtiin letkulla suun kautta, kuten: Ryhmä I-hiirille (ajoneuvon kontrolliryhmä) 200 ul: n 0,5% CMC: tä (w /v) steriiliin veteen; Ryhmät II ja III hiirissä 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta silybiinillä A; Ryhmiin IV ja V hiiret 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta silybiinillä B; Ryhmien VI ja VII hiirissä 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta isosilybin A; ja ryhmät VIII ja IX hiirissä 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta isosilybin B, vastaavasti. Kaikki nämä hoidot (5 päivää /viikko) annettiin 200 ul: aan 0,5% CMC: tä. Koska kaikki neljä yhdisteillä on sama molekyylipaino (482,1), kunkin annoksen tason oli ekvimolaarinen poikki näitä aineita. Kun -tuumoriksenografti kasvu alkoi, kasvainten koot mitattiin kahdesti viikossa käyttäen digitaalinen työntömitta ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5236 L

1 (L

2)

2, jossa L

1 on pitkä halkaisija, ja L

2 on lyhyt halkaisija.

IHC Analyysit

Tuumorinäytteet käsitelty ja immunologiseen värjätään seuraavat julkaistuja menetelmiä [27], [28], [29]. Prosenttiosuus PCNA, TUNEL, halkaistut kaspaasi 3 ja HIF-1α positiivisten solujen laskettiin laskemalla useita myönteisiä värjäytyneiden solujen (ruskeat värjätty) ja kokonaismäärä solujen viisi mielivaltaisesti valituilla aloilla kustakin kasvainta 400x suurennuksella. Mikrosuonten värjättiin CD31 ja nestiinifenotyypin kvantitoitiin 5 random mikroskooppisen (400x suurennos) kenttää per kasvain. VEGF, VEGFR1, VEGFR2 Pakt

Ser473, ja Akt immunoreaktiivisuus analysoitiin 5 random alueilla kunkin kasvainkudoksessa ja pisteytettiin 0+ (ei värjäystä), 1+ (heikko värjäytyminen), 2+ (kohtalainen värjäytyminen), 3+ (voimakas värjäytyminen), 4+ (erittäin voimakas värjäytyminen).

Ex vivo

Capillary muodostumisen määritys

aorttoja eristetty hiiret puhdistetaan, leikataan pieniksi paloiksi ja saatettu Matrigel peitossa kaivoja ja peitetään toisella 100 ui matrigeeliä. Kun nämä aortat viljeltiin 24 tuntia, väliaine (täydellinen HUVEC media) korvattiin kanssa tai ilman flavonolignans (30 ja 60 uM). Käsittelyt uusittiin 48 tunnin jälkeen. 6 päivän jälkeen koko inkuboinnin alusta versoja päässä aorttoja valokuvattiin käyttäen Cannon PowerShot A640 kamera Zeiss käännettyä mikroskooppia.

Putken muodostumisen määritys

HUVEC (4 x 10

4) viljeltiin 1 ml EBM2 (täydennettynä 0,5% FBS: ää ja 4 ng /ml VEGF) eri diastereoisomeerien (5-30 uM) Matrigelillä päällystetyillä levyillä. Kun 9 tunnin inkuboinnin, putkimainen rakenne muodostuminen kvantifioitiin laskemalla putken pituus (100x), jossa Zeiss mikroskoopilla käyttäen Cannon PowerShot A640 kamera ja AxioVision Rel.4.7 ohjelmistoja. Tähän liittyvässä kokeessa, DU145-soluja käsiteltiin 30 uM annos kunkin flavonolignan 72 tuntia, ja tuoretta väliainetta (0,5% FBS), lisättiin, ja kerättiin 12 tunnin kuluttua (merkitty ”väliaine”). Esikäsitelty väliaine sekoitettiin 0,5% FBS EBM2 media (75:25 suhde) lisättiin sitten HUVEC ja putken muodostumiseen tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.

solunelinkykyisyysmääritys

HUVEC hoidettiin tai ilman VEGF (10 ng /ml) ja eri pitoisuuksia flavonolignans (5-30 uM). Sen jälkeen kun haluttu hoito, solujen kokonaismäärä määritettiin käyttäen hemosytometriä.

Transwell Invasion Pitoisuus

Tässä kokeessa, pohja kammioihin Transwell täytettiin EBM2 väliaineessa, joka sisälsi 0,5% FBS: ää, jota oli täydennetty 4 ng /ml VEGF ja ylhäältä kammioissa HUVEC (4 x 10

4) ympättiin 500 ui EBM2 (0,5% FBS) plus 30 uM annos kutakin flavonolignan. 10 tunnin kuluttua, invasiiviset solut kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [30], [31]. Samanlaisia ​​määritys suoritettiin myös DU145 soluja levytettiin pohjalle kammioon (RPMI Media 0,5% seerumia) ja HUVEC (EBM2 media 0,5% seerumia) ylempään kammioon. Kahdessa erillisessä kokeessa, flavonolignans lisättiin joko ylä- kammiot tai alakammioissa ja invasiivisuus HUVEC tutkittiin kussakin tapauksessa.

Cell Cycle Distribution ja apoptoosi

Cell cycle jakelu (saponiini /PI-värjäys) ja apoptoosin (anneksiini-PI-värjäys) analysoitiin FACS [32], [33].

Immunoblottausmääritys

HUVEC hoidettiin 30 uM annos kutakin flavonolignan tai ilman VEGF stimulaatio, lysaatit valmistettiin ja analysoitiin tavanomaisella immunoblottauksella menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [33], [34]. α-tubuliinin ja β-aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä suuri proteiinin lataamista.

Kolmiulotteinen sferoidi muodostumisen määritys

24-kuoppalevyillä, 100 ui matrigeeliä lisättiin. Sen jälkeen 100 ui RPMI-1640 ja matrigeeliä seosta (50:50), joka sisälsi ~ 1 x 10

3 DU145-soluja lisättiin. 15 minuutin kuluttua 1 ml RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää, joka sisälsi DMSO: ta ajoneuvon tai 90 uM kutakin flavonolignan lisättiin hyvin; hoitoja vaihdettiin joka 48. h 2 viikkoa. Lopussa kokeen, pallomainen muodostuminen laskettiin Zeiss mikroskoopilla 100x.

TILASTOANALYYSI

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Sigma Stat ohjelmistoversio 2.03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). Tilastollinen merkitys eroja valvonnan ja käsiteltyjen-ryhmät määritettiin Studentin t-testiä ja p 0,05 arvon katsottiin merkitseväksi. Yksisuuntainen ANOVA, jota seuraa Tukeyn testiä käytettiin monilukuisten vertailujen. Autoradiogrammien /nauhat skannattiin, ja keskimääräinen tiheys bändejä (jossa mainitaan) määritettiin käyttäen Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).

Tulokset

vaikutus Flavonolignans on PCA DU145 Vieraslajisiirteen Growth

mitattuna antituumoriteholla, suun kautta flavonolignans tehokkaasti esti kasvua DU145 nude-hiirissä, ja tämä oli havaittavissa kolmannesta viikosta eteenpäin (Fig. 1A). Lopussa kokeen (10 viikkoa), silybin Hoito esti tuumorin tilavuus 44 ja 50% 50 ja 100 mg /kg kehon painoa annosta, vastaavasti (p 0,05) (Fig. 1A); kun taas silybin B esti tuumorin tilavuus 38 ja 47% samaan annoksilla, vastaavasti (p 0,05) (Fig. 1A). In isosilybin Käsitelty hiirissä kasvaimen estyi 44 ja 50% (p 0,05) (Fig. 1A), kun taas hiiret, joita käsiteltiin isosilybin B kasvaimen inhiboitui 46 ja 67% 50 ja 100 mg /kg kehon paino annoksia, vastaavasti (p 0,05) (Fig. 1A). Kaiken isosilybin B oli tehokkainta estämään DU145 ksenograftissa kasvua, jota seuraa silybin A tai isosilybin A ja silybin B. Vaikka nämä erot biologinen vaikutus kunkin diastereoisomeerin ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä; nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen

in vitro

tutkimuksissa [21], [22].

Tuolloin ruumiinavauksen, kaikki eläimet tutkittiin makroskooppisia, ja emme noudata mitään merkkejä poikkeavuus kaikissa elintärkeissä elimissä tutkitaan. Lisäksi näiden yhdisteiden annon kautta letkulla suun kautta ei aiheuttanut merkittävää muutosta ruokavaliossa kulutustottumusten tai painonnousun hiirten (tuloksia ei esitetty). Lisäksi meillä ei havainnut haittavaikutuksia suhteen käyttäytymistä eläinten, mikä viittaa yleisesti turvallinen luonteeltaan näiden yhdisteiden.

vaikutus Flavonolignans leviämisen estämistä ja apoptoosi DU145 ksenoqraftit

IHC analyysi DU145 kasvain näytteet osoittivat, että flavonolignans hoito estää merkittävästi immuunivärjäykseen PCNA (biomarkkeri solujen lisääntymistä) (Fig. 1 B), mutta lisää TUNEL ja halkaistut-kaspaasi 3 positiivisten solujen (biomarkkereita apoptoosin) (Fig. 1 C ja 1 D ). Vaikka tilastollisesti merkitsevä vaikutus flavonolignans proliferaatioon ja apoptoosiin liittyvien biologisten merkkiaineiden oli vaatimaton, eikä voinut täysin selittää havaitun hitaampi ksenograftissa kasvun ja lähes 50% kasvun eston kanssa flavonolignan hoitoon (Fig. 1A). Siksi seuraavaksi analysoimme kasvain kudosten flavonolignans vaikutus angiogeneesiin, joka on ehdottoman välttämätöntä, että kasvaimia kasvaa yli 1-2 mm koko [3].

vaikutus Flavonolignans on Angiogeneesi DU145 ksenoqraftit

Sen tutkimiseksi, nämä yksittäiset flavonolignans esti ksenograftissa kasvua tukahduttamalla kasvaimen angiogeneesi, me värjätään kasvain osio CD31 (biomarkkeri erääntyi mikrosuonten) ja nestiinifenotyypin (biomarkkeri kehittymätön ja vastaperustetun mikrosuonten). Kaikki neljä yhdistettä esti mikroverisuonitiheys, sekä kypsät ja vasta muodostavien, mutta isosilybin B oli suhteellisen tehokkaammin sen estävä vaikutus nestiinifenotyypin-positiivisten pienten verisuonten (Fig. 2). VEGF on voimakas pro-angiogeeninen tekijä [17], [35], ja IHC analyysit tuumorisektioiden osoitti selvästi, että hoito nämä diastereoisomeerit pienentää sekä VEGF ja VEGFR2 ilmentyminen kasvaimen kudoksissa (Fig. 2). Erityisesti, paitsi silybin A, VEGFR1 ilmentyminen väheni myös merkittävästi näillä aineilla (Fig. 3). Kaiken isosilybin B oli suhteellisen voimakkaampi sen tehokkuus VEGF, VEGFR2 ja VEGFR1 ilme. HIF-1α on master transkription tekijä, joka on vakiintunut hypoksisissa olosuhteissa kasvavien kasvainten ja valvontaa kasvain aineenvaihdunta sekä ilmentymisen pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF [36], [37], [38]. Vaikka HIF-1α vakauttaminen tapahtuu pienessä happipitoisuudessa olosuhteissa, sen ilme on myös ohjaa seriini /treoniini-kinaasi Akt [39]. Akt myös tärkeä rooli useiden solun prosessien kuten solujen eloonjäämistä, apoptoosin, muuttoliike ja aineenvaihdunta [40], [41]. IHC analyysit kasvaimia osoitti, että kaikki neljä flavonolignans voimakkaasti vähentää HIF-1α ja Pakt

Ser473 tasoilla, marginaalinen vaikutus koko Akt ilmaisun vain isosilybin A ja isosilybin B (Fig. 3).

vaikutus flavonolignans angiogeneesiin in Muut kuin kohde-elimet

Varmista, että anti-angiogeeninen vaikutuksia näillä flavonolignans ovat ominaisia ​​tuumorikudoksia, olemme analysoineet kuin kohde-elimiin (maksa, keuhkot, ja munuaisten) CD31 lauseke määrittää pienten verisuonten tiheyden. Ei ollut eroa mikroverisuonitiheys maksan, keuhkojen ja munuaisten välillä valvonta- ja hiiriä syötettiin puhdasta flavonolignans (Fig. 4A, CD31 määrän tuloksia ei ole esitetty). H E analyysit osoittivat myös, että nämä diastereoisomeerit ole haitallista vaikutusta histologia normaalin elinten (Fig. 4B).

vaikutus Flavonolignans on Angiogeneesi

Ex vivo

ja

In vitro

Analyysit

tutki vielä antiangiogeeninen aktiivisuus flavonolignans in

ex vivo

kapillaarisen muodostumisen määritys hiirellä selkä aorttoja. Kuuden päivän viljelyn Matrigelillä mukaisesti angiogeeninen olosuhteissa, havaitsimme merkittävää alusten määrä versoja hiiren aortat (merkitty nuolilla), joka estyi annoksesta riippuvalla tavalla flavonolignans hoitoon (Fig. 5A).

Yksi tärkeä vaiheiden aikana neo-angiogeneesin on muodostumista ja yhdistämällä putket tuottamien endoteelisolujen muodostamalla kompleksi verkosto aluksia ja hiussuonten [42], [43]. Ymmärtää vaikutus flavonolignans tähän biologiseen tapauksessa suoritimme putken muodostumiseen määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, pohjapaneeli, kaikki neljä yhdistettä estivät merkitsevästi VEGF: n indusoiman putken pituus HUVEC. Kuten kuvissa (Kuva. 5B, yläpaneeli), VEGF indusoi muodostumista putkimaisen verkkojen HUVEC, joka sekoitti flavonolignan hoitoja.

vaikutus Flavonolignans VEGF-indusoitua proliferaatiota ja kemotaktinen Motility

VEGF on tärkeä rooli aikana neo-angiogeneesin kautta mitogeeninen ja motogenic vaikutusta endoteelisoluissa [17], [35]. Tutkimuksissamme, VEGF indusoi HUVEC kasvua voimakkaasti inhiboivat flavonolignans hoitoon (Fig. 6A). Tällaiset käsittelyt esti myös kemotaktinen motiliteettia HUVEC kohti VEGF TranswellTM invaasiomääritys (Fig. 6B). Tärkeää on, isosilybin B oli vähiten tehokas verrattuna muihin diastereoisomeerien suhteen estovaikutusta kemotaktinen motiliteettia HUVEC.

vaikutus Flavonolignans elinkelpoisuuteen, solusykliä ja apoptoosi HUVEC

edelleen selvittämiseksi biologinen vaikutus näiden flavonolignans endoteelisoluissa, olemme analysoineet elinkelpoisuus, solusyklin ja apoptoosin HUVEC. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, neljä flavonolignans (5-30 uM) esti HUVEC elinkelpoisuus annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Solusyklin analyysit paljastivat, että kaikki diastereoisomeerit aiheuttamaa G1 pidätyksen jälkeen 24 h hoidon, mutta vain silybin A, silybin B ja isosilybin aiheuttivat myös G2 /M pidätys (Fig. 7B). 48 tunnin kuluttua hoidon jälkeen havaittavaa vaikutusta silybiinillä A, silybin B ja isosilybin A HUVEC oli induktioon G2 /M pidätys, joka puuttui kanssa isosilybin B hoitoon (Fig. 7B). Isosilybin Hoito (30 uM) indusoituu merkittävästi S-vaiheen pysähtymisen jälkeen 48 h hoidon, joka voisi olla yhteydessä voimakkaaseen apoptoottista kuolemaa indusoitiin isosilybin A (Fig. 7B).

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus näiden flavonolignans eri solusyklin säätelymolekyyleja, nimittäin sykliinejä, CDK ja Cdk inhibiittorit sekä niiden sääntelyviranomaisten Skp2 ja fosfa- Cdc25. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, neljä flavonolignans vähensi tasot Cdk2- ja Cdk4 kanssa marginaalinen vaikutus Cdc2. Nämä yhdisteet myös vähensi tasoja sykliini D1, sykliini D3, sykliini A ja sykliini B1. Silybin A ja isosilybin kohtalaisen lisäsi p27 ilmaus, mutta se väheni isosilybin B (Kuva. 7C). Päinvastoin, p21-ekspressio väheni silybiiniin A, silybin B ja isosilybin A, mutta eikä isosilybin B (Fig. 7C). Kuitenkin kaikki neljä diastereoisomeerit voimakkaasti vähentynyt ilmentyminen Skp2 ja Cdc25C ilman tai kohtalainen estävä vaikutus Cdc25A tasolla (Kuva. 7C). Nämä tulokset viittaavat, että nämä neljä diastereoisomeerit on muutama samanlainen (mutta eroavat siinä määrin) ja muutama vastakkaisia ​​vaikutuksia ilmaus solusykliä säätelevien molekyylien.

Sitten tutkittiin, mikä vaikutus puhtaan flavonolignans (30 uM) apoptoosiin kuluttua 36 h hoidon HUVEC. Kuten on esitetty kuviossa. 7D, isosilybin B oli vähiten tehokas suhteen aiheuttamaan apoptoosin liittyvän morfologisia ominaisuuksia (irtoaminen ja pyöristys), signalointimolekyylejä mukana apoptoosin (cPARP, halkaistut kaspaasi 3 ja 9) ja prosenttiosuus apoptoottisten solupopulaation HUVEC. Käänteisesti silybin A, silybin B ja isosilybin Vahvasti aiheuttamaa apoptoottista kuolemaa HUVEC (Fig. 7D).

vaikutus Flavonolignans VEGF-indusoitu signaali HUVEC

Seuraavaksi tutkimme flavonolignans vaikutus VEGF-indusoitu signaali cascade, joka ohjaa proliferaatiota, liikkuvuuteen ja putken muodostumiseen endoteelisoluissa [35]. VEGF hoito voimakkaasti lisääntynyt VEGFR2 fosforylaation Ser1175 sivusto, luotettava merkki sen aktiivisuuden, joka estyi esikäsittely kanssa flavonolignans (Fig. 8). Vastaavasti VEGF lisäsi fosforylaatiota VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR, ja p70S6K. Kuten on esitetty kuviossa. 8, paitsi ERK1 /2 ja mTOR, fosforylaatio muissa kohdissa estyi näiden yhdisteiden vaikkakin eri laajuudessa. Verrattuna muihin diastereoisomeerit isosilybin B oli vähiten tehokas suhteen vaikutus VEGF: n indusoiman signaloinnin molekyylien HUVEC.

Differential herkkyys Flavonolignans Kohti PCA ja endoteelisoluissa

Aiemmat havainnot [ ,,,0],20], [21], [22], [24] ja nykyisen tutkimuksen mukaan yksi neljästä puhdas flavonolignans, isosilybin B on tehokkain tehokkuuden kannalta vastaan ​​PCA soluissa, mutta yllättäen se on vähiten tehoa kannalta sen vaikutus HUVEC (esto kemotaktinen liikkuvuudessa tai apoptoosin induktion) (kuviot. 6 ja 7). Siksi teimme sarjan kokeita valaista suhteellinen tehokkuus näiden neljän diastereoisomeerin vastaan ​​PCA soluja nähden suhteessa endoteelisolujen. Ensin analysoimme niiden vaikutus kolmiulotteisen kasvun DU145 solujen matrigeeliä. Hoito näillä yhdisteillä esti voimakkaasti lukumäärä ja koko pallomainen muodostettu DU145-solujen isosilybin B ovat tehokkaimpia (kuvio. 9A). Seuraavaksi suoritimme yhdessä viljelemisen -tutkimukset Transwell kammiot. Me päällystetty HUVEC ylemmässä kammiossa, kun taas DU145 soluja viljeltiin alemmassa kammiossa. Kaksi erillistä koetta, HUVEC tai DU145-soluja käsiteltiin puhtaalla flavonolignans, ja sen jälkeen, HUVEC hyökkäyksen kautta matrigeeliä tutkittiin kussakin tapauksessa. Kuten on esitetty kuviossa. 9B, isosilybin B oli tehokkain alenevassa HUVEC siirtyminen, kun sitä DU145-soluja käsiteltiin, mutta on vähintään tehokas, kun HUVEC käsitelty.

seurata tätä, käsittelimme DU145-soluissa näillä diastereoisomeerien (30 uM) ja kerätty vakioitu väliaine. Pro-angiogeeninen potentiaali elatusaine analysoitiin putken muodostumisen määritystä käyttäen HUVEC. Kuten on esitetty kuviossa. 9C, ilmastoitu mediaa DU145-solujen määrä nousi putken pituus sekä putkimainen muodostama HUVEC. Käsitelty väliaine päässä flavonolignan käsiteltyjen DU145 soluissa merkittävästi vähentynyt putken pituus sekä putkimainen verkko (Fig. 9C). Tässä määrityksessä myös isosilybin B oli tehokkain diastereoisomeeri (Fig. 9C).