Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Retinoidireseptorit 4-okso-N- (4 hydroksifenyyli) retinamidi (4-okso-4-HPR) on polaarinen metaboliitti fenretinidi (4-HPR) hyvin tehokkaasti syöpäsolujen tappamiseksi eri histotypes, kykenevät estämään 4-HPR-resistenttien solujen kasvun ja toimivat synergistisesti yhdessä alkuperäiseen lääkeaineeseen. Toisin kuin 4-HPR ja muiden retinoidien, 4-okso-4-HPR estää tubuliinin polymeroitumisen, joka johtaa moninapaista karan muodostumista ja mitoottisten pidätys. Täällä, tutkimme 4-okso-4-HPR, kuten 4-HPR, laukaista solukuoleman myös kautta reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) sukupolvi ja onko sen antimikrotubulusaine toiminta liittyi ROS riippuvaisen mekanismin munasarjan (A2780), rinta ( T47D), kohdunkaulan (HeLa) ja neuroblastooma (SK-N-BE) syöpäsolun linjat.

Menetelmät /Principal havainnot

esittänyt todisteita siitä, että 4-okso-4-HPR lisäksi toimiva kuten antimikrotubulusaine, indusoi apoptoosia signalointiryöpyn alkaen ROS: n syntyminen ja johon solulimakalvostoon (ER) stressivasteen, Jun N-terminaalinen kinaasi-(JNK) aktivointi, ja ylössäätely proapoptoottiset istukan luun morfogeneettinen proteiini (PLAB). Kautta ajan tietenkin analyysi ja inhibition ROS liittyvien signalointireitin (ylävirtaan C-vitamiinin ja alavirrassa PLAB hiljentämisen), olemme osoittaneet, että antimitoottinen aktiivisuus 4-okso-4-HPR oli riippumaton oksidatiivisen stressin aiheuttama retinoidi . Itse asiassa, ROS sukupolvi tapahtui aikaisemmin kuin mitoosi pidätys (30 minuutissa ja 2 tuntia, vastaavasti) ja kumota ne ROS liittyvien signalointireitin ei estä 4-okso-4-HPR aiheuttama mitoottisiin pidätys.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot osoittavat, että 4-okso-4-HPR syövän vastaista aktiivisuutta johtuu ainakin kaksi riippumattomien mekanismien ja annettava selvitys siitä, voiko 4-okso-4-HPR olla voimakkaampi kuin kanta-aine ja tehokkaiksi myös 4-HPR-resistenttejä solulinjoja. Lisäksi, kaksinkertainen vaikutusmekanismi saattaa sallia 4-okso-4-HPR tehokkaasti kohdistaa kasvain ja lopulta torjumaan lääkeresistenssin kehittymisen.

Citation: Tiberio.Seudun P, Cavadini E, Abolafio G, Formelli F , Appierto V (2010) 4-okso-N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi: Kaksi erillistä tapaa tappaa syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10,1371 /journal.pone.0013362

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 20 syyskuu 2010; Julkaistu: 14 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Tiberio.Seudun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it), Milano, Italia, avustuksina ja apurahan (s Tiberio.Seudun). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

retinoidien ovat luokan kemiallisia yhdisteitä rakenteellisesti A-vitamiiniin liittyvä jotka moduloivat olennainen solun prosesseja, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja apoptoosin [1]. Synteettinen retinoidi fenretinidi tai N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi (4-HPR) on myrkytön analogia all-trans-retinoiinihappo [2], joka on jo osoittanut lupaavia tuloksia esiuudiskasvuisissa [3] – [5] ja neoplastisten tilojen [6], [7]. Viljellyissä soluissa, 4-HPR on osoitettu aiheuttavan kasvun estäminen ja apoptoosin erilaisissa syöpäsolulinjoissa ja eri toimintamekanismeja on ehdotettu, mukaan lukien reaktiivisten hapen lajien (ROS) ja siitä oksidatiivisen stressin [8], [9 ]. Olemme viime aikoina raportoitu, että munasarjan syöpäsolujen, 4-HPR: n indusoiman apoptoosin välittyy proapoptoottiset istukan luun morfogeneettinen proteiini (PLAB), ja että sen säätelyä 4-HPR tapahtuu aktivoitumisen kautta signalointiryöpyn alkaen lisäys ROS , mikä induktio solulimakalvoston (ER) stressivasteen ja N-terminaalista Jun-kinaasin (JNK) aktivointi [9], [10]. Analyysistä plasmanäytteiden 4-HPR-hoitoa saaneilla potilailla, olemme tunnistaneet uuden 4-HPR napa-metaboliitti, 4-okso-N- (4-hydroksifenyyli) retinamidi (4-okso-4-HPR) [11], joka on jolla on lupaava biologiset ominaisuudet [12]. 4-okso-4-HPR saa aikaan antiproliferatiivisia ja apoptoottisten vaikutuksia erilaisissa syöpäsolulinjoissa (eli munasarja-, rinta-, ja neuroblastooma kasvainsolulinjoja), ja se on kahdesta neljään kertaa tehokkaampia kuin 4-HPR inhiboimaan solun kasvua [12]. Mielenkiintoista on, että 4-okso-4-HPR on myös tehokas 4-HPR-resistentit solut, ja yhdessä 4-HPR, on synergistinen vaikutus [12]. Samoin 4-HPR, kasvaimen kasvua estäviä vaikutuksia 4-okso-4-HPR ovat riippumattomia ydin- Retinoidireseptorit (RAR). Lisäksi, 4-HPR ja 4-okso-4-HPR jakaa useita signalointia välituotteita, kuten ROS: n syntyminen, solunsisäisen seramiditasoja, ja kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 [12]. Huolimatta siitä, nämä yhtäläisyydet, 4-okso-4-HPR näyttää uusia vaikutusmekanismeja verrattuna alkuperäiseen lääkeaineeseen, viittaa myös sen kyky olla tehokas 4-HPR resistenttien solujen [12]. Itse asiassa, toisin kuin 4-HPR, 4-okso-4-HPR aiheuttaa huomattavaa kerääntymistä solujen mitoosi vaiheessa, erityisesti ennen anafaasia yhdistettynä aktivointi karan tarkistuspiste [13]. 4-okso-4-HPR aiheuttama pidätys mitoosia liittyy poikkeavaan karan muodostuminen (eli moninapaista järjestäminen kärsimättä sentrosomimäärän eheys), koska kyky 4-okso-4-HPR kohdistaa mikrotubuleiksi ja estää tubuliinin polymerisaatiota suoralla molekyylien vuorovaikutus tubuliinin [13] kantavassa Tässä tutkimuksessa suunniteltiin edelleen leikellä 4-okso-4-HPR vaikutusmekanismit taustalla sen antiproliferatiivista vaikutusta, tutkivat, syövän vastaista aktiivisuutta retinoidi voi syntyä myös sen kyky lisätä ROS: n syntyminen ja onko mitoosinvastainen retinoidi liittyy oksidatiivista stressiä. Olemme tässä osoittaneet, että, kuten 4-HPR, 4-okso-4-HPR aiheuttaa kasvua ROS: n syntyminen, jonka jälkeen induktio ER stressin vasteen, JNK: n aktivaatiota ja PLAB säätelyä ja että tämä signalointiryöpyn on osittain mukana antiproliferatiivinen vaikutus retinoidi. Lisäksi 4-okso-4-HPR mitoosia vaikutus on toiminnallisesti riippumaton edellä mainituista apoptoottisen kaskadin, mikä osoittaa, että 4-okso-4-HPR antituumorivaikutus johtuu ainakin kaksi itsenäistä vaikutusmekanismeja.

tulokset

ROS osallistuu 4-okso-4-HPR-indusoitua apoptoosia in A2780 soluissa

Olemme äskettäin raportoitu, että 4-HPR laukaisee apoptoosin aktivoimalla signalointiryöpyn, joka alkaa ROS sukupolvi ja johon liittyy ER stressistä, JNK aktivointi ja PLAB säätelyä [9]. Sen tutkimiseksi, mikäli signalointikaskadin vastaava 4-HPR: n indusoiman apoptoosin mukana myös indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR, ensin analysoidaan osallistumista ROS: n syntyminen on indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR A2780, ihmisen munasarjasyövän solulinja, valittiin, koska se on jo tiedetään olevan herkkä retinoidi (IC

50 = 0,6 uM 72 tunnin testi) ja tuottaa ROS vastauksena 4-okso-4- HPR hoito [12]. Osallistuminen ROS määritettiin arvioimalla vaikutus antioksidantti C-vitamiinia 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin. Viisi uM 4-okso-4-HPR käsittely 4 tuntia aiheuttanut lisäystä ROS tuotannon, joka estää lisäämällä 100 uM C-vitamiinia (kuvio 1A). Kumota ROS: n syntyminen C-vitamiinin aiheuttama vähennys (1,7-kertainen) 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin, arvioidaan DNA: n fragmentoituminen ELISA-määrityksellä (kuvio 1 B). Samanlainen apoptoosin vähentäminen on havaittu kautta määritettäessä Saharan G

1 väestöä propidiumjodidivärjäys seuraa virtaussytometrialla analyysi (katso kuvio 5 ja suhteellinen tulos kohta). Nämä tiedot osoittivat, että ROS: n syntyminen indusoi 4-okso-4-HPR oli mukana 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin.

(A) analyysi ROS A2780 soluissa, joita käsiteltiin 4 tunnin ajan 5 uM 4-okso-4-HPR, kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia analyysi suoritettiin virtaussytometrialla lisäämisen jälkeen redox-herkkien väriaine CM-H

2DCFDA. Kuvaaja osoittaa edustaja virtaussytometrialla fluoresenssiprofiilit erilaisissa olosuhteissa hoidon (yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta). Siirtyminen oikealle kontrollista ilmaisee lisääntynyt ROS tasoilla. (B) A2780-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR, kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia ja apoptoosin, arvioidaan DNA-fragmentaatiota, mitattiin ELISA-määrityksellä. Tiedot ovat keskiarvoja kolmen riippumattoman kokeen; pystypalkit ovat keskihajonnat. Tähti osoittaa merkittävää eroa (P 0,05).

4-okso-4-HPR indusoi ER stressin vasteen A2780 soluissa

analysoinut, 4-okso-4-HPR, kuten 4-HPR [9], aktivoitu, alavirtaan ROS: n syntyminen, ER stressin vastaus, arvioimalla ER-stressi erityisiä signaaleja: transkription jälkeisellä silmukoinnin transkriptiotekijän X-box sitova proteiini-1 (XBP-1), ilmaus chaperon proteiinien glukoosin säätelemä proteiini 78 KD (GRP-78) /immunoglobuliini-sitovan proteiinin (BIP) ja lämpöshokkiproteiini 70 (HSP70), ja fosforylaatio tila alfa-alayksikön eukaryoottisten aloittamisesta tekijän 2 ( eIF2α) [14]. A2780-soluja, 5 uM 4-okso-4-HPR hoidon 24 tunnin indusoi silmukoitumisesta 25 bp introni XBP-1 prekursori mRNA, aiheutti säätelyä GRP78 /BIP ja HSP70 ja fosforylaation eIF2α (kuvio 2A). Aktivoituminen näiden ER stressiin liittyvät tapahtumat on kumottu (XBP-1, GRP78 /BIP ja HSP70) tai vähenee voimakkaasti (eIF2α) lisäämällä C-vitamiinia (kuvio 2A). Tulokset osoittivat, että 4-okso-4-HPR aiheuttama induktio ER stressin vasteen, alavirran tapauksessa ROS: n syntyminen.

(A) A2780-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia, tehtiin RT-PCR-määrityksen analysoimiseksi silmukoinnin 25 bp introni XBP-1-transkriptin ja western blot-analyysi ekspression GRP-78 /BIP, peIF2α, eIF2α. Käänteistranskriptioon-PCR, β-aktiini monistettiin sisäisenä kontrollina. Western blot -analyysiä varten, kuten kontrollina Lataamisen blot inkuboitiin aktiinin vasta-aineella. (B) Soluja käsiteltiin kuten (A) alistettiin western blot-analyysi ekspression pJNK ja JNK.

4-okso-4-HPR indusoi JNK-aktivaation A2780 soluissa

analysoidaan, onko 4-okso-4-HPR, kuten 4-HPR [9], indusoidun JNK aktivointi. Western blot-analyysi, A2780-soluissa, osoittaa, että 5 uM 4-okso-4-HPR hoitoa 24 tuntia aiheutti JNK fosforylaation ja että C-vitamiinin lisääminen vähensi voimakkaasti kinaasin aktivaatioon (kuvio 2B). Tulokset osoittivat, että 4-okso-4-HPR indusoi JNK: n aktivaatiota ja että tämän tapahtuman kautta ROS-riippuvaisen mekanismin.

PLAB säätelyä funktionaalisesti osallisena indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR

Olemme aiemmin raportoitu, että PLAB ylössäädellään 4-HPR on ROS riippuvaisella tavalla [9], ja että sillä on funktionaalinen rooli indusoiman apoptoosin retinoidi A2780 soluissa [10]. Meillä on siis arvioida, onko myös 4-okso-4-HPR moduloidun PLAB ilmaisua. Western blot-analyysi osoitti, että 5 uM 4-okso-4-HPR hoidon 24 tunnin indusoidun PLAB säätelyä, ja että tämä vaikutus on voimakkaasti vähennetty lisäämällä C-vitamiinia (kuvio 3A). Sen tutkimiseksi, PLAB säätelyä ollut toiminnallinen rooli indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR, me käytti PLAB hiljentäminen A2780 soluissa, aikaisemmin tuottamat vakaat transfektiolla [10]. Kuten odotettua, PLAB upmodulation indusoi 4-okso-4-HPR oli voimakkaasti alentunut soluissa, jotka oli transfektoitu PLAB siRNA plasmidi verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salatun plasmidia käytettiin kontrollina (kuvio 3B). Kuten kuviossa 3C on esitetty, indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR: llä transfektoiduissa soluissa PLAB siRNA oli noin 2-kertaisesti verrattuna transfektoitujen solujen muokatun plasmidin. Vähentäminen indusoiman apoptoosin 4-okso-4-HPR in PLAB vaiennetaan soluissa on myös vahvistettu arvioimalla osa-G

1 väestöstä jälkeen propidiumjodidivärjäys (tuloksia ei ole esitetty). Tulokset osoittivat, että 4-okso-4-HPR indusoi PLAB säätelyä, koska tapahtuma alavirtaan ROS: n syntyminen ja että PLAB osaltaan 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin. Kaikki edellä mainitut tiedot osoittivat, että 4-okso-4-HPR aiheutti aktivointi ROS liittyvien signalointikaskadin jo osoitettu aktivoida 4-HPR (ROS → ER stressiä → JNK → PLAB) [9].

(A) Western blot analyysi PLAB ilmentymisen A2780 soluissa, joita käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR, kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia kontrollina lastattavaksi, blot inkuboitiin aktiini-vasta-aine . (B) Western blot analyysi PLAB ilmentymisen A2780-soluissa stabiilisti transfektoitu plasmidilla, joka sisälsi PLAB siRNA tai salattu nonsilencing siRNA lisäyksen jälkeen 5 uM 4-okso-4-HPR 24 tuntia. Kontrollina Lataamisen blot inkuboitiin aktiinin vasta-aineella. (C) Detection of 4-okso-4-HPR-indusoitua apoptoosia in A2780 pysyvästi transfektoitu plasmidilla, joka sisältää PLAB siRNA (mustat pylväät) tai salattu nonsilencing siRNA (har- maat pylväät). Transfektoidut solut käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR ja apoptoosin, arvioidaan DNA-fragmentaatiota, mitattiin ELISA-määrityksellä. Tiedot ovat keskiarvoja neljästä itsenäisestä kokeesta; pystypalkit ovat keskihajonnat. Tähti osoittaa merkittävää eroa (P 0,01).

4-okso-4-HPR indusoi Bcl-2 ja Mcl-1 downregulation on ROS-riippumattomalla tavalla

Koska se on on todettu, että 4-HPR voi indusoida apoptoosin säätelyn kautta jäsenten Bcl-2-perheen, kuten loppupään tapauksessa ROS [15] – [17], analysoitiin vaikutusta 4-okso-4-HPR on antiapoptoottisten proteiinien B-solujen lymfooma geenin-2 (Bcl-2) ja myeloidisolun leukemia-1 (Mcl-1) ja proapoptoottiset proteiini Bcl-2-liittyvät X-proteiinia (Bax). A2780-soluja, 5 uM 4-okso-4-HPR hoitoa 24 tuntia pienensi Bcl-2 ja Mcl-1-proteiinin ilmentymisen tasolla, kun taas ei ollut vaikutusta Bax ilmentymistä (kuvio S1). Vaimennussäätely sekä Bcl-2 ja Mcl-1 ei ole estetty lisäämällä C-vitamiinia (kuvio S1), mikä viittaa siihen, että 4-okso-4-HPR aiheutti väheneminen ROS-riippumattomalla tavalla.

Mitoottisilla pidätyksen ja muodostumista moninapaista karat ovat riippumattomia ROS liittyvistä signalointiryöpyn A2780 soluissa

Toisin kuin 4-HPR, joka vain hieman vaikuttaa G

1 vaihe solusyklin, 4- okso-4-HPR aiheuttaa huomattavaa kerääntymistä solujen G

2-M faaseissa [12]. Olemme äskettäin raportoitu, että 4-okso-4-HPR-indusoidun solukierron häiriön johtui kyky retinoidi estää tubuliinin polymerisaatiota, pidätti solujen mitoosin [13]. Lisäksi mitoosia vaikutus retinoidi osoitettiin yhdessä muodostumista poikkeavasti muotoisen karan (ts multipolars), koska sen vaikutukset tubuliinin polymerisaatiota [13]. Tutkia, onko 4-okso-4-HPR aiheuttama mitoosi pidätyksen ja muodostumista moninapaista karan liittyivät ROS aiheuttama signalointiryöpyn ensin suoritetaan aika-kurssi analyysi sekä ROS sukupolvi ja solukierron häiritseekin indusoi 4- okso-4-HPR. ROS sukupolvi havaittiin jo 30 minuutin kuluttua retinoidi hoito (kuvio 4A) ja pysyi koko 24 tunnin ajan kurssin. Sitä vastoin lievää G

2-M solujen kertymistä havaittiin vain 2 tuntia ja kasvu prosenttiosuuden G

2-M pidätetty soluissa oli aikariippuvainen jopa 16-24 tuntia (kuvio 4B) . Aika-course analyysissä ilmeni, että oksidatiivisen stressin aiheuttamaa 4-okso-4-HPR tapahtui aikaisemmin kuin solusyklin pysähtymiseen ja että nämä kaksi tapahtumaa esitetty eri kinetiikkaa. Tutkia, onko 4-okso-4-HPR aiheuttama ROS sukupolvi ollut rooli mitoosi pidätys, olemme analysoineet vaikutuksia C-vitamiinin solusyklin häiritsemisestä ja muodostumista poikkeavien karat aiheuttama retinoidi. A2780-soluja altistettiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR, lisäämällä 100 uM C-vitamiinia ei estä kertyminen G

2-M solupopulaatio (kuvio 5 ja S2) tai muodostumisen moninapainen karan (kuva 5). Johdonmukaisia ​​tuloksia solusyklin jakelun ja muodostumista moninapaista karat saatiin estämällä ROS liittyvä signalointiryöpyn alavirran tasolla PLAB hiljentäminen: transfektio PLAB siRNA ei estänyt 4-okso-4-HPR aiheuttama mitoottisia pidätys ja muodostumista moninapainen karan (tuloksia ei ole esitetty). Tulokset osoittivat, että A2780 soluissa Mitoosi pidätyksen aiheuttama 4-okso-4-HPR ei ollut tapahtuma myötävirtaan ROS sukupolvi, eikä vaihe ROS liittyvien signalointiryöpyn.

(A) analyysi ROS tuotannon A2780 soluissa, joita käsiteltiin 5 uM 4-okso-4-HPR 30 minuuttia, 1 tunti, 2 tuntia, 4 tuntia, 6 tuntia, 16 tuntia ja 24 tuntia. Analyysi suoritettiin virtaussytometrialla lisäämisen jälkeen redox-herkkien väriaine CM-H

2DCFDA. Käyrät osoittavat edustaja virtaussytometrialla fluoresenssiprofiilit erilaisissa olosuhteissa hoidon (yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta). Siirtyminen oikealle kontrollista ilmaisee lisääntynyt ROS tasoilla. (B) virtaussytometrinen analyysi propidiumjodidilla värjättyjen A2780 soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä tai 5 uM 4-okso-4-HPR 30 minuuttia, 1 tunti, 2 tuntia, 4 tuntia, 6 tuntia, 16 tuntia ja 24 tuntia. Kuvan numerot tarkoittavat prosentuaalista solujen vaiheen solusyklin mukaan analyysin kanssa ModFit LT-ohjelmisto. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta on esitetty.

virtaussytometrinen analyysi propidiumjodidilla värjättyjen A2780 soluissa, joita käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia Numbers kuviossa tarkoittavat prosentuaalista solujen vaiheen solusyklin mukaan analyysin kanssa ModFit LT-ohjelmisto. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta on esitetty. Oikealla on esitetty edustava mitoosissa kuvan kunkin hoitoon, joka saadaan immunovärjäämällä α-tubuliinin vasta-ainetta (

vihreä

) ja tumavärjäystä Hoechst 33342 (

sininen

). Asteikko bar = 5 mikrometriä.

4-okso-4-HPR toiminnasta vastaa kaksinkertaista vaikutusmekanismi myös syöpäsolulinjoissa eri histotypes

Voit selvittää, onko osallistuminen kaksi riippumatonta mekanismeja 4-okso-4-HPR aktiivisuus rajoittuu A2780-soluja tai edusti erottuva toimintatapa retinoidi, jatkoimme analyysi 4-okso-4-HPR vaikutukset kolmea muuta ihmisen syövän solulinjat reagoivat retinoidi: T47D (maitorauhasen adenokarsinooma), HeLa (epiteelin kohdunkaulan adenokarsinooma) ja SK-N-BE (neuroblastooma) -soluja (kuvio 6A). Ensin arvioitiin solunsisäisen sukupolven ROS indusoi 4-okso-4-HPR osoittaa, että kolme syöpäsolulinjoissa, 5 uM 4-okso-4-HPR 4 tuntia lisääntynyt ROS kontrolleihin verrattuna, ja että lisäämällä 100 uM C-vitamiini esti ROS: n syntyminen indusoi retinoidi (kuvio 6B). Kolmen testattu solulinjoissa, 4-okso-4-HPR indusoi PLAB säätelyä ja tämä vaikutus vähensi C-vitamiinin lisääminen (kuvio 6C). Sitten suoritetaan solusyklin analyysi, joka osoittaa, että 4-okso-4-HPR indusoi merkitty G

2-M solusyklin pysähtymisen kaikilla testatuilla syöpäsolulinjoissa (kuvio 7 ja S2). Samoin kuin havaittiin A2780 soluissa, näissä solulinjoissa estyminen ROS sukupolvi C-vitamiinia merkittävä lasku sub-G

1 väestö, mutta ei laskenut solujen prosenttiosuus pidätettiin G

2- M vaihe (kuvio 7 ja S2). Lisäksi 4-okso-4-HPR hoito aiheutti muodostumista moninapaista karan T47D, HeLa ja SK-N-BE-solut (kuvio 7), ja ne kaikki on lisätty C-vitamiinia ei pääse muodostumaan poikkeavasta karat aiheuttamaa että retinoidi (kuvio 7). Tulokset viittasivat siihen, että myös T47D, HeLa ja SK-N-BE-soluja, ROS-riippuvaisen signalointiryöpyn oli mukana 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin. Lisäksi 4-okso-4-HPR aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja muodostumista moninapaista karat olivat riippumattomia ROS-liittyvä signalointiryöpyn, paitsi munasarjojen lisäksi myös rinta-, kohdunkaulan ja neuroblastooma syöpäsolulinjoilla paljastaen erottuva piirre 4-okso-4-HPR on kaksinkertainen vaikutusmekanismi.

(A) Citotoxic vaikutus 4-okso-4-HPR on T47D (□), HeLa (▵) ja SK-N- BE (○) solujen kasvua arvioitiin käyttäen sulforodamiini B määrityksessä. Antiproliferatiivinen 4-okso-4-HPR kussakin solulinjassa testattiin kolmessa riippumattomassa kokeessa, jossa on neljä rinnakkaista kuoppaa kutakin analyysiä; pystypalkit ovat keskihajonnat. (B) analyysi ROS tuotannon T47D, HeLa ja SK-N-BE-soluja käsiteltiin 4 tunnin ajan 5 uM 4-okso-4-HPR, kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia analyysi suoritettiin virtaussytometrialla lisäyksen jälkeen redox-herkkää väriainetta CM-H

2DCFDA. Käyrät osoittavat edustaja virtaussytometrialla fluoresenssiprofiilit erilaisissa olosuhteissa hoidon (yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta). Siirtyminen oikealle kontrollista ilmaisee lisääntynyt ROS tasoilla. (C) Western blot analyysit PLAB ilmaisun T47D, HeLa ja SK-N-BE soluja käsiteltiin 5 uM 4-okso-4-HPR 24 tuntia, tai ilman 100gM vitamiinia Kontrollina lastattavaksi, blot inkuboitiin aktiinin vasta-aineella.

virtaussytometrinen analyysi propidiumjodidilla värjättyjen T47D (A), HeLa (B) ja SK-N-BE (C) solut käsiteltiin 24 tunnin ajan 5 pM 4-okso-4-HPR kanssa tai ilman 100 uM C-vitamiinia numerot kuviossa tarkoittavat prosentuaalista solujen vaiheen solusyklin mukaan analyysin kanssa ModFit LT-ohjelmisto. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta on esitetty. Pohjalla kunkin histogrammin, immunofluoresenssianalyysillä jossa α-tubuliinin vasta-ainetta (

vihreä

) solujen kohdella samalla tavalla. Nuclear morfologia visualisoitiin värjäämällä Hoechst 33342 (

sininen

). Asteikko bar = 10 pm.

Keskustelu

4-okso-4-HPR on polaarinen metaboliitti synteettinen retinoidi 4-HPR joka havaittiin Plasmanäytteissä naisia ​​hoidettiin 4-HPR osallistuvat vaiheen III rintasyöpä ehkäisy tutkimus [11]. Aikaisemmat

in vitro

tehdyissä 4-okso-4-HPR ovat osoittaneet, että retinoidi on jolla on erittäin lupaava syövän vastaisia ​​ominaisuuksia, kuten korkeampi kasvaimen kasvua estäviä vaikutuksia kuin 4-HPR (on sen IC

50-arvot kahdesta neljään kertaa pienempi kuin kantalääkkeestä useimmissa testattujen solulinjojen), puute ristiresistenssiä ja yhteisvaikutukset vuorovaikutus kantalääkkeestä [12], mikä viittaa siihen, että kävisi esitetään uudeksi aineena syövän hoidossa. Toisin kuin 4-HPR ja muut retinoidit, 4-okso-4-HPR tavoitteet mikrotubuleiksi ja estää tubuliinin polymerisaatiota aiheuttaa mitoosi pidätyksen ja muodostumista moninapaista karan kärsimättä sentrosomimäärän eheys [13]. Toisaalta, samalla tavalla kuin alkuperäinen lääkeaine 4-okso-4-HPR indusoi kasvua ROS [12].

Koska 4-HPR-indusoitu ROS: n syntyminen on osoitettu aktivoivan apoptoottisen kaskadin joihin ER stressivaste, JNK aktivointi ja ylössäätely proapoptoottiset proteiinin PLAB [9], päätimme tutkia 4-okso-4-HPR laukaista apoptoosin myös kautta ROS sukupolvi ja onko sen mitoosinvastainen liittyi tähän ROS-riippuvaisen reitin. 4-okso-4-HPR-indusoidun ROS osaltaan apoptoottinen aktiivisuus retinoidi, koska hoito antioksidantin kanssa C-vitamiini vähensi 4-okso-4-HPR: n indusoiman apoptoosin. Edellisessä tutkimuksessa 4-okso-4-HPR luonnehdinta [12], emme pystyneet osoittamaan selvä syy-yhteyttä sukupolven ROS ja solujen kasvua estävää aktiivisuutta retinoidi. Mahdollinen selitys voisi olla, että antioksidanttina edellisessä analyysissä (eli

N

asetyyli-L-kysteiini) ei kokonaan estää oksidatiivisen stressin aiheuttama 4-okso-4-HPR, mutta vain aiheutti osittainen vähentäminen ROS [12].

alavirtaan ROS: n syntyminen, 4-okso-4-HPR aktivoitu muut signalointi välituotteita 4-HPR apoptoottiset cascade, kuten ER stressin vastaus (havaittu XBP-1 liittämiseen, GRP78 /Bip ja HSP70 säätelyä, ja eIF2α fosforylaation) ja JNK fosforylaation, sekä estetty C-vitamiinia lisäämällä. Ekspression proapoptoottiset proteiinin PLAB on kasvanut dramaattisesti 4-okso-4-HPR ja sen säätelyä väheni C-vitamiinia lisäksi viittaa siihen, että proteiinin ilmentyminen modulaatio oli alavirtaan tapauksessa, että oksidatiivisen stressin aiheuttama retinoidi. Lisäksi olemme osoittaneet, että PLAB ollut toiminnallista roolia 4-okso-4-HPR apoptoottista aktiivisuutta, koska sen hiljentäminen vähensi indusoiman apoptoosin retinoidi. Siksi meidän tulokset osoittivat, että 4-okso-4-HPR lisäksi toimii antimikrotubulusaine, indusoi apoptoosin kautta signalointikaskadin että olemme jo osoittaneet aktivoitumaan 4-HPR (ROS → ER stressiä → JNK → PLAB) [ ,,,0],9].

PLAB apoptoottista indusoivaa aktiivisuutta on havaittu ja raportoitu muiden kirjoittajien useissa solujen yhteyksissä ja hoidon jälkeen eri syöpälääkkeiden [9], [18] – [21]. Kuitenkin spesifinen alavirran tapahtumia, jotka PLAB välittää tällaisen vaikutuksen vielä määrittämättä. Meidän tulokset, joka on osallistuminen proteiinien Bcl-2 ja Mcl-1, Bcl-2-perheen jäsen, PLAB apoptoottinen aktiivisuus voidaan mahdollisesti sulkea pois. Itse asiassa, vaikka 4-okso-4-HPR hoito aiheutti downregulation ilmentymisen tason kaksi antiapoptoottisten proteiinit, kuten väheneminen eivät estäneet inhibition ROS-välitteisen apoptoottisen kaskadin, johon PLAB.

on mielenkiintoista huomata, että 4-okso-4-HPR on hapettunut muoto 4-HPR ja että muutos asemassa 4 syklohekseenirengas on todennäköisesti vastuussa 4-okso-4-HPR antimikrotubulusaine aktiivisuutta, mutta ei vaikuttaisi retinoidi aiheuttavan ROS sukupolvi ja aktivoida ROS liittyviä signalointiryöpyn. Tällainen kemiallinen modifiointi voi olla myös vastuussa eri sfingolipidi aineenvaihdunnan havaittu kahden retinoideja. Sekä 4-HPR ja 4-okso-4-HPR on osoitettu indusoivan dramaattinen kasvu on dihydroceramide tuotanto; kuitenkin, osuus erillisten molekyylilajiin koko lisäys ilmoitettiin olevan selvästi erilainen, suhteen sfingosiini /sphinganine ja rasvahappoja. Lisäksi 4-okso-4-HPR, toisin kantalääkkeestä, on osoitettu hieman lisätä myös Keramidin tuotanto [22].

Olemme aiemmin raportoitu, että 4-okso-4-HPR toimii epätavallisen verrattuna 4-HPR ja muut retinoidit, koska sen kyky estää tubuliinin polymerisaatiota, mikä johtaa muodostumiseen moninapaista karat ja mitoosi pidätys [13]. Tässä tutkimuksessa on havaittu, että mitoosi pidätys ja kytketyn muodostumista moninapaista karat aiheuttamien 4-okso-4-HPR oli riippumaton ROS liittyvistä signalointiryöpyn. Itse asiassa, olemme osoittaneet, että 4-okso-4-HPR-indusoitu ROS: n syntyminen on tapahtunut aikaisemmin kuin mitoosi pidätys, mikä osoittaa, että antimitoottinen aktiivisuus retinoidi ei ollut tapahtuma ylävirtaan oksidatiivista stressiä. Toisaalta, inhibition ROS liittyvän reitin C-vitamiinin tai PLAB hiljentäminen ei estänyt kykyä 4-okso-4-HPR käyttämään sen antimikrotubulusaine aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että mitoosi pidätys ei ollut ROS- riippuvainen mekanismi. Esiintyminen kaksinkertaisen vaikutusmekanismi voisi uskottavasti olla erottuva piirre toimintatavan 4-okso-4-HPR, koska nämä kaksi etuyhteydetöntä reittejä löytyivät syöpäsolulinjoissa eri histotypes (munasarja-, rinta-, kohdunkaulan syöpä ja neuroblastooma).

vaikka tarkkaa mekanismia, jolla 4-okso-4-HPR antimikrotubulusaine aktiivisuus laukaisee solu- kuolema on vielä määritettävä, perusteella edellä mainitut tiedot, voimme spekuloida, että sekä ROS- liittyvä signalointi cascade ja antimikrotubulusaine toimia itsenäisesti edistää 4-okso-4-HPR antiproliferatiivinen vaikutus ja ehdotamme, että retinoidi toimii esitetään kaavamaisesti kuvassa 8. kuitenkin analyysi 4-okso-4-HPR vaikutusmekanismit tulee lisätutkimuksia selvittämään, miten kahden reitin molecularly johtaa solukuolemaan. On houkuttelevaa spekuloida, että ROS-riippumaton downregulation Bcl-2 ja Mcl-1, havaittiin jälkeen 4-okso-4-HPR hoito, voisi olla rooli apoptoosin aiheuttama antimikrotubulusaine aktiivisuutta retinoidi, vaikkakin tällä hetkellä mitään todisteita tukee tätä hypoteesia. Havaintojemme mukaan, on raportoitu, että hoito muilla mikrotubulia häiritsevät aineet voivat vähentyä, Bcl-2 ja Mcl-1 solunsisäinen määrät vaikuttavat apoptoosin [23] – [25].

4 -okso-4-HPR indusoi solukuoleman kautta kahden itsenäisen toimintatapoja: 1) ROS liittyvä signalointiryöpyn liittyy ER stressin vastaus, JNK aktivointi ja ylössäätely proapoptoottiset proteiinin PLAB; ja 2) antimikrotubulusaine toimia, jotka koostuvat esto tubuliinin polymeroitumisen, mitoosi pidätyksen ja muodostumista moninapaista karat.

On huomattava, että muut mikrotubulia kohdistettujen aineiden on osoitettu edistävän ROS sukupolvi syöpäsoluissa, mutta suhde tubuliinia dynamiikkaa ja oksidatiivisen stressin edelleen epäselviä [26] – [33]. Äskettäin syövän vastaista aktiivisuutta paklitakselin on yhdistetty sukupolven solun sisäinen ja ulkoinen ROS ja on ehdotettu, että häiriön mikrotubulusten polymeroitumisen tilan aiheuttama tämä aine, sekä taksoteerin tai vinkristiini, voisi lisätä ROS stabiloimalla aktiivinen NADPH oksidaasin [31], [32]. ROS: n syntyminen osaltaan myös antiproliferatiivinen vaikutus patupilone, jäsen mikrotubulia stabilointiaineet epotilonien, ja syy suhde oksidatiivisen stressin ja muutokset mikrotubulusdynamiikan on ehdotettu [30]. Sitä vastoin ROS: n syntyminen indusoi stilbeeni 5c, mikroputkeen estäjää kolkisiini päällä, on osoitettu olevan liity lääkkeiden aiheuttaman solusyklin häiriön [29], samoin kuin mitä on havaittu 4-okso-4- HPR.

kyky 4-okso-4-HPR toimia läpi ainakin kaksi asiaan mekanismeja voitaisiin todennäköisesti mahdollistaa vastapainoksi lääkeresistenssin kehittymisen. Itse asiassa, olemme osoittaneet, että kun yksi reitti on estetty (eli ROS liittyvä signalointireitin), retinoidi kykenee toimimaan läpi muun mekanismin (eli mitoosi pidätys) tappaa syöpäsoluja.