Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen Koodaamattomat RNA: iden, jotka säätelevät geenin ilmentymistä. Ne poikkeavasti ilmaistaan ​​monenlaisia ​​syöpiä. Tässä tutkimuksessa määritimme genominlaajuisia miRNA profiilit virtsarakon urothelial karsinooma syvät sekvensoimalla.

Menetelmät /Principal Havainnot

Olemme havainneet 656 ilmentyvät eri tunnettujen ihmisen miRNA ja miRNA antisense-sekvenssit (miRNA * s) yhdeksässä virtsarakon urothelial karsinooma potilaiden syvä sekvensoinnilla. Monet miRNA ja miRNA * s merkittävästi yliaktiivista tai vaimentua virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin.

HSA-miR-96

oli kaikkein merkittävästi voimistunut miRNA ja

HSA-miR-490-5p

oli kaikkein merkittävästi vaimentua yksi. Voimistunut miRNA olivat yleisempiä kuin vaimentua niistä.

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

ja

HSA-miR-17~ 92

klustereita merkittävästi voimistunut.

HSA-miR-143~145

klusteri merkittävästi vaimentua.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

arvioitiin Real-Time qPCR kaikkiaan viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma potilaille. Ne poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin (p 0,001 kullekin miRNA).

Johtopäätökset /merkitys

Toistaiseksi tämä on ensimmäinen tutkimus selvittää genomi- leveä miRNA ilmentymismalleja ihmisen virtsarakon urothelial karsinooma syvä sekvensoinnilla. Huomasimme, että kokoelma miRNA oli poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin, mikä viittaa siihen, että ne saattavat pelata roolit onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla kehittämiseen ja /tai etenemistä tämä syöpä. Tuloksemme tarjota uusia oivalluksia syöpäbiologian.

Citation: Han Y, Chen J, Zhao X, Liang C, Wang Y, Sun L, et al. (2011) MicroRNA Expression allekirjoitukset Virtsarakon syövän paljasti Deep Sequencing. PLoS ONE 6 (3): e18286. doi: 10,1371 /journal.pone.0018286

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Saksa

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2011; Julkaistu: 28 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (863 Program, 2006AA02A302 ja 2009AA022707) sekä edistämisohjelma Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kiina (CXB200903090055A), Bank of Clinical Data merkittävien sairauksien ja biologinen yksilöitä Shenzhen (CXC201005260001A). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yksi yleisin pahanlaatuisten maailmassa. Noin 357000 virtsarakon syövän tapausta äskettäin diagnosoitu ja 145.000 syöpään liittyvät kuolemat arvioitiin vuonna 2002 [1]. Urothelial virtsarakko-, yleisin histopatologisia tyyppi virtsarakon syövän, on erilaisia ​​geneettisiä ja fenotyyppisiä ominaisuuksia. Monet tekijät, kuten kromosomaalisia poikkeavuuksia, geneettisten polymorfismien, geneettiset ja epigeneettisiä muutoksia, myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn ja etenemiseen urothelial virtsarakko- [2].

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä, ei-koodaavaa RNA-molekyylejä on noin 22 nukleotidiä, jotka säätelevät geenien ilmentymistä [3]. He liittyvät RNA aiheuttama hiljentäminen monimutkainen säädellä niiden kohdennettua lähetti-RNA (mRNA) by tukahduta mRNA käännös ja /tai ohjaa mRNA pilkkominen [4]. miRNA tärkeitä rooleja normaalin kehityksen, solujen kasvua, erilaistumista ja apoptoosia nisäkkäillä [5].

Yli puolet miRNA geenit sijaitsevat syöpään liittyvän genomialuetta tai hauras sivustoja [6]. Poikkeavasti ilmaistuna miRNA on osoitettu liittyvän moniin syöpätyyppeihin. Sekä tappiot ja voitot miRNA toiminta edistää syövän kehitystä. miRNA toimivat onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [7]. Tärkeintä on, eri syöpätyyppejä, vaiheittain tai erilaistuminen valtiot ovat ainutlaatuisia miRNA ekspressioprofiileja, mikä viittaa siihen, että miRNA voivat toimia uusien biomarkkereiden syövän diagnosointiin [8], [9].

Useat aiemmat tutkimukset käytetään miRNA mikrosiruja rajoitetuin ja monipuolinen koettimet profiloida miRNA ilmentymistä virtsarakon syöpään ja niiden tulokset eivät aina osoittavat yhdenmukaisia ​​tuloksia [10] – [13]. Jotta paremmin ymmärtää roolin miRNA virtsarakon syövän kehittymisessä ja etenemisessä, kattava analyysi ilmaisun ja runsaasti miRNA Tässä syöpä on tarpeen. Kun ansio suurikapasiteettisten syvä sekvensointitekniikan, genominlaajuisten syövän miRNA voidaan kvantitatiivisesti ja tarkasti määritellä. Tässä esitämme genominlaajuisia miRNA profiilit yhdeksän paria snap-jäädytetty virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin syvä sekvensoinnilla. Huomasimme, että kokoelma miRNA oli poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin, joista useat arvioitiin Real-Time qPCR kaikkiaan viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma potilailla.

Tulokset

Katsaus miRNA profiilien

Tunnettuja miRNA ilmaisu tiedostoja virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalit uroteeliin kustakin potilaan verrattiin selvittää ilmentyvät eri miRNA. Ilmentyminen miRNA pariksi näytteistä osoitettiin laskemalla log

2Ratio. Menettelyt on esitetty alla: (1) Normalisoi ilmentymistä miRNA kahdessa näytettä (kasvain vs. normaali) saada ilmaus transkriptin miljoonasosaa (TPM). Normalisoitu ilmaisu = Actual miRNA count /kokonaislukumäärä puhtaita lukee * 1000000. (2) Laske kertamuutosta ja p arvon normalisoitu ilmaisua. Sitten Laske log

2Ratio. Fold-muutos = log

2Ratio (kasvain /normaali). Määritimme 656 ilmentyvät eri tunnettujen ihmisen miRNA ja miRNA antisense-sekvenssit (miRNA * t) miRBase14.0 yhdeksällä virtsarakon urothelial karsinooma potilasta (taulukko S1).

tunnistettu lukuisia miRNA ja miRNA * s että oli signicantly yliaktiivista tai vaimentua näillä potilailla ja saattavat syrjiä virtsarakon urothelial karsinooma iältään vastaaviin normaaleihin uroteeliin.

HSA-miR-96

(log

2Ratio = 4,664328) oli kaikkein merkittävästi voimistunut miRNA ja

HSA-miR-490-5p

(log

2Ratio = -5,79794) oli kaikkein merkittävästi vaimentua yksi (taulukko 1). Valitut ilmentyvät eri miRNA todensi Real-Time qPCR. Real-Time qPCR havainnot korreloivat hyvin Sekvensointianalyysin. Vertailtaessa Real-Time qPCR havaintoja ja syvä sekvensointi tulokset on esitetty kuvassa 1. laskee ilmen- tymisen lisääntymisen ja vaimentua miRNA vaihteli potilailla. Voimistunut miRNA olivat yleisempiä kuin vaimentua niitä (kuva 2). Lisäksi tunnistimme merkittävä eroavuus ilmaisun tasoilla miRNA ja pariksi miRNA *. Ilmaisu tasot miRNA olivat yleensä suuremmat kuin pariksi miRNA * s (kuva 3).

vertailu syvä sekvenointitulosten ja Real-Time qPCR tuloksia,

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

määritetty voidaan ilmentää eri tavalla virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin yhdeksässä potilaiden syvä sekvensointi validoitiin käyttäen Real-Time qPCR. Korkeudet sarakkeet kaavion edustavat log-transformoituja mediaani kertaiseksi muutoksia (kasvain /normaalista) ilmaisumuotoja yli yhdeksän potilasta varten kunkin viiden miRNA validoitu; palkit edustavat keskivirheet. Vahvistustulokset Viiden miRNA osoitti, että syvä sekvenointitulosten korreloivat hyvin Real-Time qPCR tuloksia.

Monet miRNA todettiin olevan merkittävästi yliaktiivista tai vaimentua virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaali uroteeliin yhdeksässä potilaiden syvä sekvensoinnilla. Kreivien voimistunut ja vaimentua miRNA vaihteli yhdeksästä potilaille. Kahdeksassa yhdeksästä virtsarakon urothelial karsinoomapotilaista voimistunut miRNA olivat yleisempiä kuin vaimentua niistä. Vain yksi potilas (Patient nro B13), upregulated miRNA olivat harvinaisempia kuin vaimentua niitä.

Kokoelma miRNA ja pariksi miRNA antisense-sekvenssit (miRNA * t) päättäväisesti ilmaistaan ​​yhdeksässä virtsarakon urothelial karsinooma potilaiden syvä sekvensoinnilla. Olemme tunnistaneet merkittävä eroavuus ilmaisun välillä miRNA ja pariksi miRNA *. Ilmaisu on miRNA /miRNA * paria esitetään parvikuvio kanssa logaritmin koordinaatisto; jokainen piste edustaa ilmaus miRNA /miRNA * pari. Useimmissa miRNA /miRNA * paria, ilmentymistason miRNA oli korkeampi kuin pariksi miRNA *. Pienessä määrä miRNA /miRNA * paria miRNA oli vähemmän runsasta kuin pariksi miRNA *.

Lisäksi tunnetut miRNA ja miRNA * s, 92 novel miRNA järjestyksessä ehdokkaat havaittiin meidän tutkimus (taulukko S2). Useimmat heistä ilmaistiin hyvin alhaisilla tasoilla ja vain tietyissä näytteissä. Niiden ilme ja mahdollisista rooleista tarvitaan lisätutkimuksia.

Expression aihekokonaisuuksien miRNA

Olemme havainneet, että kokoelma vapautuneilla miRNA klustereita ilmaistiin.

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200b~429

,

HSA-miR-200c~141

ja

HSA-miR-17~ 92

klustereita merkittävästi voimistunut.

HSA-miR-143~145

klusteri merkittävästi vaimentua.

Real-Time qPCR validointi

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

arvioitiin Real- Time qPCR kaikkiaan viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma potilaille.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

ja

HSA-miR-200a

oli yli-ilmentynyt

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

oli ali-ilmentynyt virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin (p 0,001 kullekin miRNA) (taulukko S3).

keskustelu

kehitys suurikapasiteettisten syvä sekvensointitekniikan antaa mahdollisuuden lähes täydellisen kuvan miRNA profiileja. Deep sekvensointi tekniikalla on mahdollista tunnistaa uusia kudosspesifisiä miRNA [14]. Se määrittää absoluuttinen runsaus miRNA ja voi löytää uusia miRNA jotka ovat jääneet yhteisellä kloonaus ja sekvensointi menetelmiä [15]. Deep sekvensointitekniikan on ylivoimainen microarray jotka määrittävät rajoitu tunnettuja miRNA ja yleensä eivät sisällä täyttä listaa tunnetuista miRNA antisense-sekvenssit. Tähän asti syvä sekvensointitekniikan on kultakantaan varten kattava analyysi miRNA.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA voidaan käyttää biomarkkereita eri syöpien [8], [9]. Jotkut miRNA biomarkkereina pystyvät jäljittämään kudoksen alkuperän syöpien tuntematonta ensisijainen alkuperä [16]. Erityisiä miRNA allekirjoitukset ovat parempia mRNA allekirjoitukset ennakoinnissa ennustetta keuhkosyövän [17].

Tässä työssä käytimme syvä sekvensointitekniikan määrittää kattavan miRNA ilmaisun profiileja yhdeksän paria snap-jäädytetty virtsarakko urothelial syöpä ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin. Monet miRNA merkittävästi yliaktiivista tai vaimentua virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin näillä potilailla, mikä viittaa siihen, että nämä poikkeavasti ilmaisi miRNA voisi olla roolit näitä syöpiä. Kaikkein merkittävästi voimistunut miRNA

HSA-miR-96

on raportoitu olevan onkogeenisen [18], mutta rooli kaikkein merkittävästi vaimentua miRNA

HSA-miR-490-5p

ei ole selvä. Paljon miRNA * s merkittävästi vapautettiin virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin tässä tutkimuksessa. Jotkut miRNA * s voi liittyä RNA aiheuttama hiljentäminen monimutkainen ja on estävä toiminto [19].

Monet vapautettu miRNA klustereita ilmaistiin mukaan syvän Sekvensointianalyysin. Huomasimme, että

HSA-miR-183

klusteri yliekspressoitui virtsarakon syöpään. Tämä klusteri koostuu

HSA-miR-96

,

HSA-miR-182

ja

HSA-miR-183

ja sijaitsee kromosomissa 7. Nämä kolme miRNA ovat yläreguloituja eturauhassyövän [18]. Samanaikaista ilmentymistä kuvio miRNA tämän klusterin syövissä viittaa he rooleja yhdessä.

HSA-miR-200

perheen miRNA (

HSA-miR-200A /b /c

,

HSA-miR-141

ja

HSA-miR -429

) on yli-ilmentyy virtsarakon syöpä.

HSA-miR-200b~429

klusteri sijaitsee kromosomissa 1 ja

HSA-miR-200c~141

klusteri sijaitsee kromosomissa 12. -parin Näiden klustereiden viittaa siihen, että ne voisi ohjata yhteisiä tekijöitä ja rooleja yhdessä.

HSA-miR-200B

,

HSA-miR-200a

ja

HSA-miR-429

miRNA koodataan yhdellä polykistronista otteen ja säätelee negatiivisesti ZEB1 ja SIP1 [20]. TGFß 1 voidaan downregulate

HSA-miR-200

perheen johtavat säätelyä ZEB1 ja ZEB2 [21].

HSA-miR-200

perheen myös yli-ilmennetään munasarjojen ja kohdunkaulan syöpiä [22] – [24], mikä viittaa tämän miRNA perhe ovat onkogeenisiä sisään seveval syövissä.

HSA-miR-17-92

klusteri sijaitsee kromosomissa 13 ja toimii oncogenes. E2F1 ja E2F3 voi suoraan aktivoida transkriptiota näiden miRNA [25].

HSA-miR-143~145

klusteri sijaitsee kromosomissa 5 ja vaimentua monissa syövissä, mukaan lukien virtsarakon syöpien ja niiden solulinjoja [13], [26]. Meidän havainnot antanut enemmän todisteita, joiden mukaan

HSA-miR-143~145

klusteri on kasvain heikentävän virtsarakon syöpään.

Tässä tutkimuksessa, Real-Time qPCR suoritettiin arvioimiseksi ekspressiomalleja

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

,

HSA-miR-200a

,

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

kaikkiaan viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma potilaille.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

ja

HSA-miR-200a

oli yli-ilmentynyt

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

oli ali-ilmentynyt virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin. Nämä havainnot tukevat syvää Sekvensointianalyysin.

Vertasimme tuloksia julkaistuihin tietoja seacrch riippumattomia ulkoisia validoinnit.

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

ja

HSA-miR-224

ovat voimistunut ja

HSA-miR-1

,

HSA-miR-101

,

HSA-miR-143

,

HSA-miR-145

,

HSA-miR-127

ja

HSA-miR-29c

ovat vaimentua virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin [27]. Syvä sekvensointi tulokset olivat pitkälti yhdenmukaisia ​​näiden havaintojen. Ylössäätelyyn

HSA-miR-182

ja

HSA-miR-183

ja downregulation

HSA-miR-143

todettiin virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaalit uroteeliin meidän Real-Time qPCR arviointi. Profilointi miRNA 106 virtsarakon syöpien ja 11 normaalia näytteitä mikrosiruja on paljastanut, että joukko miRNA ovat yliaktiivista tai vaimentua rakon syövissä [13]. Näistä vapautettu miRNA,

HSA-miR-21

,

HSA-miR-20a

,

HSA-miR-184

,

HSA-miR-26a

,

HSA-miR-125b

,

HSA-miR-29a

,

HSA-miR-29c

ja niin edelleen jakaa vastaava ilmaisu kuvioita tuloksemme.

HSA-miR-133a

,

HSA-miR-133b

ja

HSA-miR-195

ovat vaimentua rakon syövissä [28]. Nämä miRNA osoittivat downregulation meidän Sekvensointianalyysin ja

HSA-miR-195

downregulation oli comfirmed Real-Time qPCR tässä tutkimuksessa.

Käytimme sovitettu viereisen histologisesti normaaliin uroteeliin kontrollina tutkimuksessamme . On raportoitu, että valitsemalla näytteet histologisesti normaalin uroteeliin virtsarakon syöpäpotilailla on geneettisiä muutoksia [29]. Jotkut kromosomimuutokset jaetaan molempien kasvaimen ja histologisesti normaalin näköinen kudosta vieressä kasvain voi aiheuttaa samanlaisia ​​muutoksia miRNA ilmaisua. Tämän kompensoimiseksi heikkoutta, vertasimme hakutuloksistamme useita julkaistuja raportteja uroteeliin alkaen normaalit kontrollina [10], [13], [28]. Suuri kokoelma havainnot olivat samankaltaiset omaansa ja meidän. Meidän havainnot olivat myös yhdenmukaisia ​​lehtiin sovitettu viereisen histologisesti normaaliin uroteeliin kontrollina koskee paljon miRNA [26], [27]. Päällekkäiset havainnot välillä julkaistut tiedot ja meidän tulokset on esitetty taulukossa 2.

Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen genominlaajuisten profiloinnin miRNA ihmisen virtsarakon syövän syvä sekvensoinnilla. Huomasimme, että kokoelma vapautuneilla miRNA oli poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​virtsarakon urothelial karsinooma verrattuna Hyväksytty histologisesti normaaliin uroteeliin, mikä viittaa siihen, että ne saattavat pelata roolit onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla kehittämiseen ja /tai etenemistä tämä syöpä. Tuloksemme tarjota uusia oivalluksia syöpäbiologian. Työtä tarvitaan määrittämään mahdolliset roolit miRNA diagnostisina biomarkkereita ja ehdokas terapeuttisia kohteita virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

Kirjallinen suostumus oli saatu kaikista potilaista ja tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Pekingin yliopiston Shenzhen sairaalassa. Viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma jotka saivat osittaisen tai radikaali cystectomy olivat mukana tutkimuksessa. Näistä potilaista yhdeksän käytettiin aluksi syvälle sekvenssianalyysin miRNA ja neljäkymmentä kaksi käytettiin ylimääräistä arviointia. Virtsarakon urothelial karsinooma diagnosoitiin histopatologisesti. Virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalit uroteeliin Kustakin koehenkilöstä oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä immmediately resektion jälkeen. Yksityiskohtaiset tiedot yhdeksän virtsarakon urothelial karsinoomapotilaista syvässä sekvensointi set on esitetty yhteenvetona taulukossa S4.

RNA

Kun osuus syöpäsolujen kudoksessa osassa oli suurempi kuin 80%, jäädytetty blokki suoritettiin RNA. Kokonais-RNA uutettiin viisikymmentä-yksi paria snap-jäädytetty virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. RNA eheys arvioitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

miRNA sekvensointi ja analyysi

Kahdeksantoista pieniä RNA kirjastot valmistettiin yhdeksän paria snap-jäädytetty virtsarakko urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin rakennettiin, monistettiin ja sekvensoitiin. Kokonais-RNA käytettiin miRNA sekvensointiin. Jälkeen 5’adapter ja 3’adapter ligoitiin pieniä RNA: ita, Käänteinen transkriptio suoritettiin. Sitten suoritettiin PCR ja PCR-tuotteet puhdistettiin. Lopuksi miRNA kirjastoa konstruoitiin ja sekvensoitiin Illumina Cluster asemalta ja Genome Analysoi (Illumina Inc, CA, USA) Beijing Genomics Institute Shenzhen mukaan valmistajan protokollaa.

Heikkolaatuinen lukee poistettiin ja sovitin sekvenssit oli tarkasti leikattu tuella dynaamisen ohjelmoinnin algoritmi ennen tarkempaa analyysiä. Poistamisen jälkeen kahtena lukee, loput lukee vähintään 18 nt kartoitettiin ihmisen viite genomi (hg19) saippualla V2.0 [30]. Tunnistaa sekvenssimerkkejä peräisin koodaus eksonit, toistot, rRNA, tRNA, snRNA, ja snoRNA, UCSC RefGene, RepeatMasker, NCBI Refseq tiedot ja ncRNA merkinnät koottu NCBI Genbank data (https://www.ncbi.nih.gov ) käytettiin. Tunnistaa uusia miRNA geenejä, kaikki hiusneula kaltainen RNA rakenteet käsittää pieniä RNA tagit tunnistettiin käyttämällä MIREAP (https://sourceforge.net/projects/mireap).

Real-Time qPCR vahvistus ja tilastolliset menetelmät

kolme yli-ilmentynyt (

HSA-miR-182

,

HSA-miR-183

ja

HSA-miR-200a

) ja kaksi ali-ilmentynyt miRNA (

HSA-miR-143

ja

HSA-miR-195

) arvioitiin kaikki potilaat mukana tässä tutkimuksessa. Nämä miRNA valittiin, koska ne merkittävästi vapautettiin alkuperäisessä syvällä sequecing analyysi. snRNA U6 käytettiin endogeenisen ohjaus. Real-Time qPCR suoritettiin käyttäen All-in-One ™ miRNA qRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). 10 ug kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: n mukaan valmistajan protokollaa. PCR suoritettiin kaikkiaan reaktiossa 20 ui, joista 10 ui 2xAll-in-One ™ qPCR Mix, 2 ui Universal Adaptor PCR Primer (2 uM), 2 ui All-in-One ™ qPCR Primer (2 uM), 2 ui ensimmäisen juosteen cDNA (laimennettu 1:05), 50xROX Viite Dye 0,4 ui ja 3,6 ui kahteen kertaan tislattua vettä. Reaktiot suoritettiin ja analysoitiin käyttäen ABI PRISM 7000 Fluorescent Kvantitatiivinen PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-reaktiot suoritettiin syövän ja normaalin cDNA kolmena kappaleena kullekin joukolle. Pyöräily parametrit PCR olivat seuraavat: (1) ensimmäinen denaturointivaihetta 15 minuuttia 95 ° C: ssa; (2) 40 sykliä, joissa 1 sykli koostuu 15 s 95 ° C: ssa, 20 s 55 ° C: ssa, ja 30 s 70 ° C: ssa. Luettelon määrä All-in-One ™ miRNA qPCR Alukkeet luetellaan taulukossa S5. Mediaani Kunkin kolmena kappaleena käytettiin laskettaessa suhteellinen miRNA pitoisuudet (ACt = Ct

medianmiRNA-Ct

mediansnRNAU6). Expression kertainen muutokset laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmiä [31]. Mirna ilme erot syövän ja ohjaus analysoitiin käyttäen Studentin

t

testillä SPSS (versio 16.0 SPSS Inc.). Arvoa p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

miRNA oli ilmennetty eri välillä virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s001

(XLS) B Taulukko S2.

sekvenssit uusia miRNA ehdokkaiden havaittiin virtsarakon urothelial karsinooma ja Hyväksytty histologisesti normaalin uroteeliin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s002

(XLS) B Taulukko S3.

Delt-Ct-arvoja Real-Time qPCR in viisikymmentäyksi virtsarakon urothelial karsinooma potilaille.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s003

(DOC) B Taulukko S4.

Potilastiedot syviin sekvensointi asetettu.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s004

(DOC) B Taulukko S5.

Primer luettelo.

doi: 10,1371 /journal.pone.0018286.s005

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme kaikkia avunantajia, jotka osallistuivat tähän ohjelmaan, kaikki työtoverisi, jotka osaltaan rakentaminen Urologiset Tissue Bank Pekingin yliopisto Shenzhen sairaalan ja kaikki ne, jotka omistettu syvä sekvensointi palvelun Beijing Genomics Institute Shenzhen.