Krooninen sairaus

tiivistelmä

Resistenssin kehittymistä gemsitabiinin on suuri huolenaihe virtsarakon syövän hoidossa, ja mekanismi on edelleen epäselvä. Eg5 on äskettäin tunnistettu houkutteleva kohde syövän kemoterapiassa, joten uusia kohdennettuja kemoterapiaa Eg5 estäjän odotetaan parantavan syöpää torjuva vaikutus gemsitabiinin kestävä virtsarakon syöpä. Tässä tutkimuksessa, RT112-Gr solut 350 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat, kun taas KU7-Gr soluja 15 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat. Ihmisen OneArray Microarray-analyysi suoritettiin saada laaja kirjo tietoa geeneistä differentiaalisesti ilmaistut RT112 ja RT112-Gr soluissa. Anti-proliferatiivista aktiivisuutta S (MeO) TLC, joka on Eg5 estäjä, analysoitiin RT112-Gr solulinjoja käyttäen solunelinkykyisyysmääritys. Lisäksi inhiboiva vaikutus arvioitiin in vivo käyttäen ihonalaisen ksenograftin kasvaimen malli. Mukaan seurausta ihmisen OneArray® GeneChip-, RRM1 ja RRM2 oli säädelty, vaikka ei ollut merkittävää muutosta Eg5. Trypaanisinisellä värjäys vahvisti, että S (MeO) TLC ja Gemsitabiini yhdistämällä S (MeO) TLC ryhmä solujen elinkelpoisuus heikkeni merkittävästi RT112-Gr soluissa verrattuna muihin ryhmiin. S (MeO) TLC ja S (MeO) TLC + gemsitabiini ryhmien näkyvästi tukahdutti kasvaimen kasvua verrattuna muihin ryhmiin ”in vivo. Ei ollut merkittäviä eroja S (MeO) TLC ja gemsitabiinin S (MeO) TLC ryhmä vaikutus eston virtsarakon syövän in vivo ja in vitro. Tuloksemme kollektiivisesti osoittaneet, että S (MeO) TLC edustaa uutta strategiaa hoitoon Gemsitabiinin resistenttien virtsarakon syöpään.

Citation: Sun L, Lu J, Niu Z, Ding K, Bi D, Liu S, et al. (2015) voimakas Kemoterapia strategian Eg5 Inhibitor vastaan ​​Gemsitabiini Kestää virtsarakon syövän. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10,1371 /journal.pone.0144484

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat |

vastaanotettu 16. lokakuuta 2014; Hyväksytty: 19 marraskuu 2015; Julkaistu: 10 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Olemme ladanneet tiedot ArrayExpress. Data Review URL: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81202017) (https://www.nsfc.gov.cn), Natural Science Foundation of Shandong (nro ZR2011HQ027 ja nro ZR2014HQ041) (https://www.sdnsf.gov.cn), ja tiede- ja teknologianeuvoston Research Foundation Shandongin maakunnassa (nro 2012YD18049) (https://www.sdnsf.gov.cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BCA) edustaa neljänneksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa [1,2]. Noin 25% virtsarakon syöpä potilaat ovat diagnosoitu lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä (MIBC), vaikka 75% vasta diagnosoitu kasvaimia ovat ei-lihas- invasiivisia (Ta, Tis ja T1); useimmat uusiutua ja 15-20% edistymisestä hyökätä tunica musculariksesta. Ja valtaosa syövän erityisiä kuolemista johtuu MIBC, mikä johtaa paikalliseen invaasiota ja etäpesäkkeiden [3, 4]. Kuolleisuus taudin kehottaa urologit tutkia uusia menetelmiä hoitoon virtsarakon syöpään [5]. Kemoterapia gemsitabiinihoidon ja sisplatiini on suosituin vaihtoehto virtsarakon syöpään. Gemsitabiini on analoginen deoksisytidiinin, joilla on korkea aktiivisuus monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien haiman, kohdunkaulan, munasarja-, rinta-, virtsarakko- ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän [6,7]. Kuitenkin resistenssin kehittyminen gemsitabiinin on nyt suuri huolenaihe urologit. Huolimatta kohtuullisen hoitovaste jälkeen alkuperäisen kemoterapiaa metastasoituneen virtsarakon syöpä, 60-70% reagoi potilaista relapsi ensimmäisen vuoden kuluessa, joiden eloonjäämismediaani 12-14 kuukautta. Tämä rajoitettu teho saattaa johtua de novo lääkeresistenssin ja kehittäminen solu lääkeresistenttiä fenotyyppi hoidon aikana [8].

Kuitenkin taustalla olevien mekanismien asiakkuutta kemoterapia vastarinnan Gemsitabiini ei vielä tunneta. Viime aikoina tutkimuksen avulla haimasyövän, Nakahira S et ai raportoitiin tärkeä tekijä gemsitabiinin vastus oli yli-ilmentyminen ribonukleotidireduktaasin (RR) [9]. RR koostuu dimeroituneesta suuria ja pieniä alayksiköitä, M1 ja M2 vastaavasti. M1 alayksikkö hallussaan sitoutumiskohdan entsyymin asetuksen (säätelyalayksikköä), ja M2-alayksikkö on mukana RR aktiivisuus (katalyyttinen alayksikkö) [10]. RRM1 pitäisi olla rooli gemsitabiinin resistanssin erilaisia ​​syövän metaboliaentsyymien lääkkeen [9, 11]. RRM1 ei ole ainoastaan ​​solun kohde gemsitabiini, mutta myös tuumorisuppressori. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet sen osallistumista tukahduttaminen syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota, ja etäpesäkkeiden [12, 13]. Joissakin syöpien, korkea RRM2 mRNA korreloi kemoterapeuttisten vastus, solu invasiivisuus ja tyytymätön ennuste viittaa siihen, että RRM2 vaikuttaa maligni kehittyminen ja on potentiaalinen terapeuttinen kohde. On kuitenkin vähän tietoja RRM1 ja RRM2 proteiinin ilmentymistä virtsarakon syöpä, ja meidän tietääksemme ole raportoitu olemassa kuvataan roolia RRM prosessissa lääkeresistenssin virtsarakon syöpään. Lisäksi jotkut viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että nopean toiminnan tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen ihmisen karsinoomien, mutta kliininen merkitys RRM ilmaisun BCA jää epäselväksi.

Toisaalta, se on suuri merkitys tutkia uusia virtsarakon syövän kemoterapia-strategiaa. Kohdennettu lääkkeet hoidettaessa virtsateiden kasvaimet viime vuosina osoitti lupaavia tuloksia. Meidän varhainen tutkimukset ovat osoittaneet, että Eg5 inhibiittorit kuten kohdennettuja lääkkeitä in vivo ja in vitro eturauhassyövän hoitoon ja virtsarakon syöpä pitäisi olla tyydyttävä hoitavia vaikutuksia [14, 15]. Eg5, on keskeinen molekyyli mukana muodostumista kaksisuuntainen karat, on yksi houkutteleva kohde-entsyymien mitoosia lääkekehityksen [16]. Eg5 osuus monien liikkeiden karan ja kromosomien jakamalla solujen ja paikantuu kara mitoosi jakamalla soluissa [17]. Mielenkiintoinen piirre Eg5 on, että se paikantuu mikrotubulusten mitoosia, mutta ei InterPhase mikrotubuluksiin, mikä viittaa siihen, että Eg5 estäjä voi olla hyödyllistä kohdistaa lisääntyviä kasvainkudoksen [18]. Useita kemiallisia tyyppejä pienimolekyylisiä Eg5 estäjien on raportoitu [16]. S- (4-metok-) -L-kysteiiniä (S (MeO) TLC), johdannainen S-trityyli L-kysteiini (STLC), voidaan erityisesti estää Eg5, ja aiheuttaa monopolaariset sukkularihmaston muodostumisen [14, 15]. Epäonnistuminen Eg5 toiminta johtaa solusyklin pysähtymisen mitoosin monoastral mikrotubulusten paneelit. Tärkeän roolin Eg5 mitoosi etenemistä tekee siitä houkuttelevan ehdokkaan kehittämiseksi täsmähoitoihin syövässä [19]. Ei ole kuitenkaan mitään tutkimusta Eg5 estäjä hoitoa Gemsitabiini resistenttien virtsarakon syöpään.

Tässä tutkimuksessa, joka on gemsitabiinin kestävä ihmisen virtsarakon syövän solulinja perustettiin, ja rooli RRM1 ja RRM2 kehittämisessä gemsitabiinin vastus alun perin tutkittu. Olemme myös arvioinut tehoa syövän vastaisen vaikutuksen Eg5 täsmähoitoihin in vitro ja in vivo, jonka tavoitteena on tarjota parempi kliininen hoitostrategia potilailla gemsitabiiniryhmässä resistenttejä virtsarakon syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Provincial sairaalan Affiliated Shandong University (Luvan numero: 2013-026). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Virtsarakon syöpä kudokset kerättiin Shandong Hospital Affiliated Shandong University. Ennen tutkimusta, protokollan hyväksyttiin eettisen komitean Provincial sairaalan Affiliated Shandong University (Luvan numero: 2012-033). Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Solut, reagenssit ja kliinisissä näytteissä

Virtsarakon syöpä-solulinjasta RT112 ja KU7 käytettiin tässä tutkimuksessa, ja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [14,20]. RT112 ja KU7 solulinjoja ostettiin solusta pankin Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina). RT112 ja KU7 soluja käytetään pääasiassa Seuraava tutkimus, jotka ovat peräisin ei-invasiivisia virtsarakon syöpä. Soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä.

Eg5-inhibiittorit, S (MeO) TLC hankittiin Bachem (Bubendorf, Sveitsi) ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Vasta-aine, anti-RRM1 ja anti-RRM2 (Rabbit) hankittiin Abcam (USA); IRDye 800CW konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä oli Li-Cor Biosciences (USA). Prime Script RT-PCR kit hankittiin TaKaRa (Kiina). TRIzolia ostettiin Invitrogen (USA).

140 tapausta virtsarakon syövän kudokset kerättiin Shandong Hospital Sidoksissa Shandongin yliopistossa joulukuun 2005 ja maaliskuun 2007 Sädehoito, kemoterapia ja immunoterapia ei ole tehty ennen leikkausta ja kaikki näytteet varmistettiin kaksi patologioiden leikkauksen jälkeen.

perustaminen gemsitabiinin vastustuskykyisten solulinjojen

gemsitabiini-resistentit solut ovat kehittäneet krooninen, toistuva altistuminen gemsitabiinin vaikka kaltevuus kulttuuriin. Vakiintuneen resistentti solulinja pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 45 nmol /l gemsitabiinia. Kaikissa tutkimuksissa resistenttejä soluja viljeltiin drug-väliaineessa 1 viikko poistamiseksi gemsitabiinia. Gemsitabiini-resistenttejä soluja kutsutaan kuten RT112-Gr solujen ja KU7-Gr. IC50 Gemsitabiini vastustuskykyisten RT112 solujen Gemsitabiini on 4.2umol /l. IC50 Gemsitabiini vastustuskykyisten KU7 solujen Gemsitabiini on 0.285umol /l. Joten me valitsemme RT112-Gr solujen aihe seuraavissa kokeissa.

Human OneArray Microarray

Yhteensä-RNA uutettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Shanghai, CN) ja lähetetään Phalanx Biotech Group (Shanghai, CN) ilmentämiseen mikrosiruanalyysillä. Kolmena kappaleena hybridisaatiot kullekin näytteelle suoritettiin käyttäen Human Whole-genomin OneArray 6.1.

RRM1 ja RRM2 ilmentymisen analyysi IHC

immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin määrittämään RRM1 ja RRM2 ilmentymistä virtsarakon syövän aiemmin on kuvattu [21]. Anti-RRM1 ja anti-RRM2 vasta-aineita sekä käytettiin laimennuksessa 1: 100. Negatiiviset kontrollit koostuivat dioja jossa ensisijainen vasta-aine oli jätetty pois. Tapauksia arvioitiin olevan positiivista värjäytymistä, jos 10%: n sytoplasmaan kasvainsolujen värjättiin. Kasvaimen ja vaihe arvioitiin käyttämällä standardia hematoksyliinillä ja eosiinilla (H RRM1 (391bp) alukkeet olivat: Forward: 5′-GTTGTATTCGGGCTACTGG-3′, Reverse: 5′-ACTTTGCGGACACGACCT-3′; RRM2 (882bp) alukkeet olivat: Forward: 5′-GCCGCTTTGTCATCTTCC-3′, Reverse: 5′-TCCTCTGATACTCGCCTACT-3′. Sitten PCR-tuotteet elektroforesoitiin 1,0% agaroosigeelillä ja visualisoidaan läpivalaisulaitteella. Pikseli intensiteetti jokaiselle kaistalle määritettiin käyttämällä AlphaImager

TM2200.

eläinkoetta

Kuudesta kahdeksaan viikon ikäisiä BALB /c-nude-hiiriä hankittiin Vital River Company (Beijing, Kiina). Tutkimus saatiin hyväksynnän valiokunnan eläinten tutkimus- Shandongin maakunnan sairaalan Shandongin yliopistossa ja meidän hoito oli mukaisesti laitoksen ohjeiden.

Ihon alle ksenograftimalleja, noin 4 x 10

6 RT112-Gr solut (suspendoitiin 100 ui PBS: ssä) inokuloitiin subkutaanisesti molempiin kylkiin hiirtä kohti, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavasti: tilavuus = leveys

2 x pituus /2. Kun kasvaimet olivat tunnettavissa ja mitattavissa (noin 50mm

3), 20 hiirtä jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään ja käsiteltiin kerran päivässä (viitenä päivänä viikossa) ruiskuttamalla niiden vatsaonteloon DMSO (ajoneuvon hallinnan), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg gemsitabiinia tai 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemsitabiinin 5 päivää. Hiiret runko painaa ja kasvainten koot mitattiin joka toinen päivä. Toinen Hiiret tapettiin 21. päivänä sen jälkeen, kun alkuperäisen hoidon, ja kasvaimet myös leikattiin ja parafinoidut H 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Global geenien ilmentymisen analyysi RT112 ja RT112-Gr solulinjoissa

RT112-Gr solut 350 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat, mikä IC50 oli 4,2 umol /l entisessä. KU7-Gr soluja 15 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat, mikä IC50 oli 0.285umol /l entisessä. Microarray-analyysi suoritettiin saada laaja kirjo tietoa geeneistä differentiaalisesti ilmaistut RT112 ja RT112-Gr soluissa. RNA: t saatu RT112 ja RT112-Gr solut monistettiin, hajanainen, merkitty, ja hybridisoitiin GeneChip- mikrosiruja. Niistä 55752 geenit edustettuina Human OneArray® GeneChip-, 442 verrokkeja säädelty ja 235 alassäädetty. Niistä P-arvo (Differentially ilmaistuna) on RRM1 on 0,046, ja RRM2 on 0,021, kun taas EG5 (KIF11) on 0,323. Meidän mikrosirujen tulokset on onnistuneesti ladattu julkiseen arkistoon nimeltään ”ArrayExpress”, Data Review URL: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/.

Clustering suoritettiin visualisoida korrelaatiot joukossa rinnakkaisnäytteiden ja vaihtelevia näyte olosuhteissa. Osajoukko ero geenien valittiin klusterointi analyysiä. Intensiteetti suodatinta käytetään valitsemaan geenejä, jossa ero suurimman ja pienimmän intensiteetti ylitä 1000 kaikkien mikrosiruja. Tätä mikrosirun projekti, määrä geenejä ryhmittyneet oli 227 (kuvio 1).

Clustering suoritettiin havainnollistamaan korrelaatioita kopiot ja vaihtelevia näyte olosuhteissa. Up-ja alas-geenien ovat edustettuina punaista ja vihreää väriä, vastaavasti. Osajoukko ero geenien valittiin klusterointi analyysiä. Intensiteetti suodatinta käytetään valitsemaan geenejä, jossa ero suurimman ja pienimmän intensiteetti ylitä 1000 kaikkien mikrosiruja. Tätä mikrosirun projekti, määrä geenejä ryhmittyneet oli 227.

RRM1 ja RRM2 ilmentymisanalyysiä virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa

immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin määrittämään RRM1 ja RRM2 ilmaisun kirurgisesti resektoitiin yksilöitä virtsarakon syöpään. RRM1 ja RRM2 värjäys paikannettiin sytoplasmassa. Oli 98 mies- ja 42 naaras, 65 matala-asteinen tapauksissa ja 75 korkea-asteen tapauksia histologisia luokalla. Värjäytyminen reaktiivisuus anti-RRM1 ja anti-RRM2 oli osoitti taulukossa 1 ja kuviossa 2, vastaavasti. RT-PCR-analyysi piirrettiin tunnistamiseksi RRM1 mRNA ja RRM2 mRNA ilmaisun RT112 ja RT112-Gr solulinjoissa. RT-PCR osoitti lisäksi, että RT112-Gr soluja oli merkittävä nousu tasot RRM1 ja RRM2 mRNA verrattuna vanhempien solut (

p

0,001), tässä järjestyksessä (kuvio 3).

V: immunohistokemiallinen värjäys RRM1 ja RRM2 kliinisissä kudoksissa. RRM1 ja RRM2 immunovärjäyksellä pidettiin positiivisena, jos 10%: n sytoplasman syöpäsolujen osoitti heikkoa tai suurempi voimakkuus. (I) korkea ilmentyminen RRM1 kliinisessä virtsarakon syöpään. (II) Alhainen ilmentyminen RRM1 kliinisissä virtsarakon syöpä (III) korkea ilmentyminen RRM2 kliinisessä virtsarakon syöpään. (Ⅳ) Alhainen ilmentyminen RRM2 kliinisissä virtsarakon syöpä (kaikki luvut tallennettiin 400-kertainen suurennus). B: (I) Pylväsdiagrammi havainnollistaa yhteenlaskettu immunovärjäyty- sijoituksen RRM1 ilmaisun mukaan kasvaimen. (II) Pylväsdiagrammi havainnollistaa yhteenlaskettu immunovärjäyty- sijoituksen RRM2 ilmaisun mukaan kasvain vaiheessa (väri musta ja harmaa ovat heikosti ja vahvasti positiivinen, vastaavasti).

RT-PCR RRM1 ja RRM2 mRNA ilmaisun virtsarakon syöpä solulinjoissa. GAPDH toimi latauskontrollina. Pylväsdiagrammi esittää RRM1 ja RRM2 mRNA ilmaisun RT112, RT112-Gr ja siRNA-RT112-Gr virtsarakon syövän solulinjoissa. (

p

0,001).

siRNA-välitteisen knockdovvn RRM1 /2 in RT112-Gr virtsarakon syöpäsolujen

vaikutusten arvioimiseksi ja RRM1 /2 RT112-Gr virtsarakon syövän solulinjat, RRM1 /2-geenin olivat pudotus, vastaavasti (kuvio 3). RT112-Gr solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 45 nm Gemsitabiini (GEM), RNAi-välitteinen knockdovvn RRM1 ja RRM2 in RT112-Gr virtsarakon syövän solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 45 nm Gemsitabiini (GEM). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin elinkelpoisuutta analysoitiin trypaanisini värjäystä. RNAi-välitteinen knockdovvn RRM1 ja RRM2 + GEM, tuumorin vaikutus on paras joukossa neljä ryhmää. Kvantifiointi jokainen arvo on peräisin kolmena kappaleena itsenäisestä kokeesta (kuvio 4).

RT112-Gr-solut jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin 45 nm Gemsitabiini (GEM), RNAi-välitteinen knockdovvn RRM1 (A) ja RRM2 (B ) in RT112-Gr virtsarakon syövän solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 45 nm Gemsitabiini (GEM). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin elinkelpoisuutta analysoitiin trypaanisini värjäystä. RNAi-välitteinen knockdovvn RRM1 (A) ja RRM2 (B) + GEM, tuumorin vaikutus on paras joukossa neljä ryhmää. Kvantifiointi jokainen arvo on kolminkertaisista itsenäisestä kokeesta. (

p

0,01).

Antiproliferative vaikutukset S (MeO) TLC ja Gemsitabiini on gemsitabiini hylkivät virtsarakon syövän solulinjoissa

arvioimiseksi anti -proliferative vaikutuksia gemsitabiinin ja S (MeO) TLC virtsarakon syövän solulinjoissa RT112-Gr, ne jätetään hoitamatta tai hoidettiin 45nm gemsitabiinin, 0,5 uM S (MeO) TLC tai molempia yhdessä (gemsitabiini + S (MeO) TLC) 24 tuntia, 48 tuntia ja 72 tuntia, vastaavasti. Gemsitabiinia ja S (MeO) TLC tukahdutti solukasvun ajasta riippuva tavalla ja näytössä näkyvin tukahduttaminen hahmo 72 tuntia. IC50 on RT112 ja RT112-Gr vastaan ​​gemsitabiinin 72 tuntia olivat 0.012μM ja 4.2μM, kun taas IC50 on RT112 ja RT112-Gr vastaan ​​S (MeO) TLC olivat 210μM ja 290μM, vastaavasti (kuvio 5).

V: IC50 of gemsitabiinin KU7, KU7-Gr, RT112 ja RT112-Gr 72 tunnissa. B: Tällä IC50 S (MeO) TLC KU7, KU7-Gr, RT112 ja RT112-Gr 72 tunnissa. C: KU7-Gr ja RT112-Gr solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 45 nm Gemsitabiini (GEM), 0,5 uM S (MeO) TLC tai molempia yhdessä (GEM + S (MeO) TLC). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin elinkelpoisuutta analysoitiin trypaanisini värjäystä. S (MeO) TLC ja GEM + S (MeO) TLC, tuumorin vaikutus on paras joukossa neljä ryhmää. Kvantifiointi jokainen arvo on kolminkertaisista itsenäisestä kokeesta. (

p

0,01).

Apoptoosin S (MeO) TLC ja Gemsitabiinin Gemsitabiini hylkivät virtsarakon syövän solulinjoissa

Hoechst 33342 ydin- värjäys osoitti, että tyypillinen monopolar kara mitoosi solujen ominaisuus ruusuke kaltainen fenotyyppi havaittiin mitoosi vaiheessa 24 tuntia altistuksen jälkeen 45nm gemsitabiinin, 0,5 uM S (MeO) TLC, 45 nm gemsitabiini + 0,5 uM S (MeO) TLC tai ajoneuvon ja erottuva apoptoottisten solujen ydin- tiivistyminen ja hajanaisuus on havaittu myös 48 h altistuksen jälkeen (kuvio 6).

V: RT112-Gr solut jätettiin käsittelemättä; B: RT112-Gr soluja käsiteltiin 45nm gemsitabiini; C: RT112-Gr soluja käsiteltiin 0,5 uM S (MeO) TLC; D: RT112-Gr soluja käsiteltiin sekä yhdessä (45nm gemsitabiini + 0,5 uM S (MeO) TLC) varten osoitetut ajat ja sitten ydinvoiman morfologia tutkittiin Hoechstin värjäys ja visualisoidaan fluoresenssimikroskopialla.

trypaanisini värjäys vahvisti, että gemsitabiini + S (MeO) TLC ryhmä ja S (MeO) TLC ryhmä solujen elinkelpoisuus heikkeni merkittävästi RT112-Gr ja KU7-Gr soluja verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 5).

Effects of S (MeO) TLC ja Gemsitabiini virtsarakon syövän ksenograftimalli

alustavan analyysin syövän vastaisen aktiivisuuden S (MeO) TLC in ihonalaisen ksenograftimalleissa, kasvaimen tilavuus arvioitiin hoidon jälkeen DMSO: ta (vehikkelikontrolli), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemsitabiinia tai 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemsitabiinia. 3 viikon kuluttua havainto on havaittu, että S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemsitabiini (50 mg /kg) ja S (MeO) TLC (20 mg /kg) ryhmät näkyvästi tukahdutti kasvaimen kasvun verrattuna gemsitabiinin (50 mg /kg ) ja DMSO (ajoneuvon hallinnan). Painonmenetystä ei havaittu missään hoitoryhmien. Nekroosia havaittiin kasvaimen pintaan S (MeO) TLC (20 mg /kg) ja S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemsitabiini (50 mg /kg) käsitellyssä ryhmässä, vaikka mitään selvää nekroosia havaittiin kontrolliryhmässä . Kasvaimen tilavuus muutokset hiirissä välillä ja kontrolliryhmiin, ero keskimääräinen lopullinen kasvaimen tilavuus yksi neljästä ryhmien välillä oli tilastollisesti merkitsevä (kuvio 7).

. Onnistunutta perustamisen ihonalainen ksenograftikasvaimissa, DMSO (ajoneuvon ohjaus), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemsitabiini tai molempia (S (MeO) TLC + GEM) annettiin vatsaonteloon päivittäin 5 päivän ajan (nuolet) . Tuumoritilavuudet mitattiin joka toinen päivä. B. tarkoittaa painon hiirten arvioitiin joka toinen päivä. Ei ole mitään merkittävää eroa keskuudessa kolmeen ryhmään (

P

0,05).

Keskustelu

Chemoresistance on suurin syy epäonnistumiseen hoito virtsarakon syövän gemsitabiini. Siksi on erittäin tärkeää selventää mekanismi chemoresistance ja tunnistaa ennustavan markkereita luontaisia ​​ja hankitun chemoresistance ja gemsitabiinin [24]. Ribonukleotidireduktaasin (RR) on heterotetrameeri, ja toiminta vaatii kaksi 90kDa suurta alayksiköstä ja kahdesta 45 kDa pientä alayksiköstä. Entsyymi on ratkaiseva toimittamisesta deoksinukleosidi- de novo synteesiä DNA ja siten solujen lisääntymistä. Se koostuu dimerisoituneita suuria ja pieniä alayksiköitä, M1 ja M2. RRM1 on suuri peptidiketjun (α), kun taas RRM2 on pieni proteiini alayksikön RR (β). Vaikka entsymaattinen aktiivisuus RR moduloidaan tasot RRM2, RRM1 voisi olla keskeinen rooli joukossa 2 alayksiköiden aikana gemsitabiinihoidon [9, 13]. Rooli RRM1 RR muodostuminen on myös tehnyt siitä houkuttelevan molekyylitasolla kehittämistä varten kemoterapeuttisten aineiden, kuten gemsitabiini [13].

geeniekspressioprofilointi microarray-analyysi antaa tehokas keino saada yleiskuvan geenien ilmentyminen ja fysiologisten prosessien vastauksia erityisesti ärsykkeisiin. Nykyisessä tutkimuksessa, loimme gemsitabiini kestävä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa RT112-Gr ja KU7-Gr, RT112-Gr solut 350 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat, kun taas KU7-Gr solut 15-kertainen vähemmän herkkiä gemsitabiinin kuin vanhempien solulinjat. Joten me valitsemme RT112-Gr solujen aihe seuraavissa kokeissa. mikrosiruanalyysi käytettiin tutkia geenien ilmentymisen muutoksia välillä RT112 ja RT112-Gr soluissa. Tuloksemme osoittavat, että 442 geenit, mukaan lukien RRM1 ja RRM2, oli voimistunut, kun taas 235 geenit vaimentua in RT112-Gr soluissa. Eg5 muutos ei ollut ilmeinen. Nykyinen tutkimus osoittaa, että RRM1 ja RRM2 osallistuvat gemsitabiini resistenssin ihmisen virtsarakon syöpä. Solussa, gemsitabiini fosforyloituu monofosfaatti, difosfaatti tai trifosfaatti ennen sen sisällyttämistä DNA, joka on välttämätön sen kasvua inhiboivaa aktiivisuutta. Difosforyloitunut muoto gemsitabiinin toimii RR estäjä, joka on syynä gemsitabiinin sytotoksinen aktiivisuus. RR kasvattaa deoksinukleosiditrifosfaattia (dNTP) altaan soluissa, mikä voi johtaa alentuneeseen sisällyttämistä dNTP analogien kuten trifosfory- gemsitabiini osaksi DNA ja saattaa vähentää antituumorivaikutusta gemsitabiinin [9]. Useita prekliiniset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että RRM1 voisi olla suunnattu molekyyli säädellä gemsitabiinia vastarintaa. Lisäksi sen ekspressiotasot voisi olla hyödyllinen indikaattori gemsitabiinin vastarintaa. Shin Nakahira ym raportoitu, että lisääntynyt RRM1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä antituumorivaikutuksia ja huono selviytymisen jälkeen gemsitabiinihoidon haiman syöpäpotilaiden [9]. Hao Xie et al raportoitu, että kun kirurginen resektio haiman adenokarsinooma, jotta saavutetaan paras selviytymisen taso RRM1 ilmaisua voidaan käyttää ositusta potilaita saamaan joko adjuvanttia gemsitabiini tai ei-gemsitabiinia adjuvanttihoito. Tämä on johdonmukaista tulosten kanssa alkuvaiheen NSCLC tutkimuksia [13], ja tämä epäsuorasti tukee roolia RRM1 tuumorisuppressorina [12]. Lisäksi RRM2 tiedetään olevan osallisena chemoresistance. Tukahduttaminen RRM2 voisi herkistävät paksusuolen ja haiman syöpäsolujen kemoterapeuttisten aineiden [25]. Suhde RRM2 ilmaisun ja kemoterapeuttisen vaikutuksen kliinisissä näytteissä on myös tutkittu. Itoi et al tutki RRM2 mRNA tasot biopsianäytteistä 35 potilaalta, joilla leikkaushoitoon haimasyövän ennakoiva tutkimus, ja totesi, että vaste gemsitabiinin kemoterapia oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla on alhainen RRM2 ilme [26]. Kuitenkin mikään aiemmat tutkimukset ovat tutkineet ilmentymistä RRM virtsarakon syöpä.

tutkimuksessa todettiin, että RRM1 ja RRM2 ilmaistiin kliinisissä virtsarakon syövän kudosten ja virtsarakon syövän solulinjat. On osoitettu, että ilmaus RRM1 ja RRM2 oli merkitsevästi korkeampi heikompilaatuisen kasvaimia kuin korkealaatuisesta kasvaimia. Meidän tiedot osoittivat, että RRM1 ja RRM2 yli-ilmentyminen saattaa liittyä etenemistä virtsarakon syöpä. Virtsarakon syöpä solulinjoissa, RT-PCR-tulokset osoittivat, että RT112-Gr solut olivat huomattavasti tasojen RRM1 ja RRM2 mRNA verrattuna emo-solut (

p

0,001), vastaavasti. Vaikutusten arvioimiseksi on RRM1 /2 RT112-Gr virtsarakon syövän solulinjoissa, RRM1 /2-geenin pudotus. Tutkimuksemme osoitti, että kun knockdovvn RRM1 /2, RT112-Gr virtsarakon syöpä solulinjoja herkkä gemsitabiinin uudelleen, mikä osoittaa yli-ilmentyminen RRM liittyi gemsitabiinin vastus, ja saattaa olla uusi ehdokas biomarkkeri gemsitabiini vastus. Tietoja useista kliinisen tutkimuksen tulokset osoittivat, että RRM1 /2: n ilmentymisen kasvainsoluissa korreloi käänteisesti herkkyyden kasvainsolujen Gemsitabiinihoidon [9, 11, 12]. Esimerkiksi Woon-Gye Chung et al todettu, että lisääntynyt RRM1 ekspressio oli todennäköisesti vastuussa vastustuskyky gemsitabiinin TC-1-GR (gemsitabiini vastus TC-1-soluja), jota tukee lisäksi havainto, että transfektio RRM1 siRNA osaksi TC-1-GR, jotka oli tehty solut herkemmiksi gemsitabiiniannokseen HCl: [27]. Zhang M et al raportoitu että Sirna välittämää RRM2 knockdovvn merkittävästi käänteinen SKOV3 /DDP solun resistentiksi Sisplatiinin [28].

Tietojen mukaan potilaat gemsitabiiniryhmässä vastus joutuisi huonompaan tulokseen. Siksi hoito gemsitabiinin vastus virtsarakon syöpä on erittäin tärkeää. Lisääntyvä tutkimukset osoittivat paremman tuloksen käyttämällä kohdistamisen hoito virtsarakon syövän hoitamiseksi. Aikainen tutkimuksessa todettiin Eg5 estäjiä kuten kohdennettuja lääkkeitä in vivo ja in vitro hoitoon virtsarakon syöpä voi olla hyvä parantava vaikutus, lisäksi me aluksi osoitti syövän vastaisen vaikutuksen Eg5 estäjän gemsitabiinin vastus virtsarakon syövän Tässä asiakirjassa.

Eg5 on homotetrameerinä moottori muodostama antiparallel järjestämällä kaksi dimeerejä. Eg5 tetrameerin on kyky silloittua antiparallel mikrotubuluksia peräisin kahdesta sentrosomien G2 /M [29]. Ensisijainen tehtävä Eg5 on muodostaa kaksisuuntaisen karan alkuvaiheessa, prometaphase;