Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme äskettäin osoittaneet, että immunofiliiniin FKBP5 (tunnetaan myös nimellä FKBP51) on rakennustelineet proteiini, joka voi parantaa PHLPP -AKT vuorovaikutus ja helpottaa PHLPP välittämä defosforylointia Akt Ser473, negatiivisesti säätelevä Akt aktivointi

in vitro

. Näin ollen, FKBP5 voi toimia kasvaimia estävä, ja tasot FKBP5 vaikuttaisi-soluvasteen kemoterapiaa. Nykyisessä tutkimuksessa olemme ottaneet askeleen eteenpäin käyttäen haimasyöpä ksenografti hiirimallissa osoittaa, että alaspäin säätely FKBP5 vuonna shFKBP5 ksenograftin hiirissä edistää kasvaimen kasvua ja kestävyys gemsitabiinin, ilmiö yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen haiman solulinjoissa. Lisäksi olemme myös havainneet, että inhibiittorit kohdistettu Akt-reitin, kuten PI3K estäjä, Akt: n estäjä ja mTOR-estäjä oli erilainen vaikutus herkistymiseen gemsitabiinin ja muiden kemoterapia-aineiden solulinjoissa, tietyllä Akt estäjä, trisiribiinin, joilla on suurin herkistymistä vaikutus. Sitten testattiin hypoteesia, että lisäys trisiribiinin voi herkistää gemsitabiinihoidon erityisesti shFKBP5 haimasyövän ksenograftin hiirillä. Olemme havainneet, että yhdistelmä gemsitabiinihoidon ja trisiribiinin on parempi vaikutusta kasvaimen esto kuin kumpikaan lääke yksin (p 0,005), ja että esto vaikutus on merkittävämpi shFKBP5 ksenograftin hiirissä kuin villityypin hiirien (p 0,05). Nämä vaikutukset korreloivat taso Akt 473 fosforylaation sekä leviämisen nopeus, kuten on osoitettu Ki67 värjäys vierassiirrekokeissa tuumorikudoksissa. Nämä tulokset tarjoavat todisteita tukeakseen tulevaisuudessa kliinisten tutkimusten tarkoituksena on räätälöidä hoito perustuvat havaintoihin.

Citation: Hou J, Wang L (2012) FKBP5 kuin Valinta biomarkkeri gemsitabiini ja Akt estäjät in Hoito haimasyövän . PLoS ONE 7 (5): e36252. doi: 10,1371 /journal.pone.0036252

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 28 lokakuu 2011; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2012; Julkaistu: 09 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 Hou, Wang. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Yhdysvaltain National Institutes of Health myöntää K22 CA130828, R01 CA138461, P50 CA102701, ja U19 GM61388 (farmakogenomiikka Research Network). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sytidiinianalogit kuten gemsitabiini käytetään laajalti hoitamaan erilaisia ​​syöpiä. Gemsitabiini on edelleen tavanomaista hoitoa haimasyövän adjuvanttia ja lievittävän asetukset [1], [2], [3]. Kuitenkin gemsitabiinin vaste on hyvin alhainen haimasyövän, jossa vain 18% 1 vuoden pysyvyys [4]. Tämä huono eloonjäämisaste on ensisijaisesti siksi, ettei varhaisen havaitsemisen ja usein etäpesäkkeiden primaarikasvainten imusolmukkeisiin ja ympäröivien elinten, kuten maksa ja vatsa [5], [6], [7]. Askeleena kohti yksilöllistä Gemsitabiinihoidon saavuttamiseksi parempiin tuloksiin, me aikaisemmin suoritettu genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa käytetään 197 yksittäisiä lymfoblastisolulinjoissa [8], [9] ja tunnistettu proteiini, FKBP5, että havaittiin merkittävä vaikutus gemsitabiinin vastaus kasvainsoluissa negatiivisesti säätelemällä Akt fosforylaatio seriinillä 473 [10], [11]. Fosforylaatiota Akt aktivoi Akt-reitin, joka on keskeisessä asemassa kasvainten synnyssä ja chemoresistance [12], [13], [14], [15]. Näin ollen alhainen FKBP5 ilmentyminen tekee kasvainsolut resistentti monille kemoterapeuttiset aineet, mukaan lukien gemsitabiinin [8]. Lisäksi, FKBP5 ekspressio on vähäistä tai menetetään paljon haimasyövän solulinjoissa ja haimasyövän potilaan näytteitä, korreloi lisääntynyt Akt Ser473 fosforylaation [10].

Nämä tulokset viittaavat siihen, että FKBP5 voi olla tuumorisuppressori ja että tasot of FKBP5 voisi määrittää potilaan vaste kemoterapiaan. Jos tämä on oikein, potilaat, joilla on alhainen FKBP5 ja Akt hyperactivation saattavat hyötyä lisäämällä estäjien kohdistaminen Akt-reitin. Nykyisessä tutkimuksessa testasimme että hypoteesi käyttämällä FKBP5 Knockdown haimasyöpä ksenografti hiirimallissa (shFKBP5) ja näiden kokeiden tulokset voivat muodostaa perustan tuleville kliinisiin käännöstiede. Olemme havainneet, että shFKBP5 ksenografti hiiret osoittivat merkittävää kasvaimen taakkaa verrattuna wtFKBP5, ja että nämä kasvaimet olivat resistenttejä gemsitabiinihoidon. Vaikka sekä paino- ja shFKBP5 ksenograftin hiiret pystyivät hyötymään yhdistelmähoito gemsitabiinin ja Akt estäjä, trisiribiinin (TCN), shFKBP5 hiiret osoittivat suurempi vaikutus jälkeen yhdistelmähoito.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

ihmisen haimasyövän solulinjoissa SU86, ASPC1, ja BXPC3 olivat lahja Dr. Daniel D. Billadeau, Mayo Clinic. Ihmisen rintasyövän solulinjoissa Hs578T (HTB-126 ™) ja MCF7 (HTB-22 ™) saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Haiman syöpä solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, ja pidettiin inkubaattorissa, jossa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ihmisen rintasyövän soluja viljeltiin DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia kuvatuissa olosuhteissa edellä.

Plasmidit ja Short häiritsevän RNA

FKBP5 shRNA ja siRNA käytetään kaataa tutkimukset hankittiin QIAGEN Inc. (Valencia, CA). Transfektio suoritettiin kahdesti, 24 tunnin välein, ja 200 nM siRNA käyttäen Lipofectamine ™ RNAiMAX reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Sekvenssit shRNA vastaan ​​FKBP5 olivat:

Ensimmäinen FKBP5 shRNA.

Sense strand: GGG UAA ACA GAU UGA GCA UdTdT.

Antisense strand: elokuu CUC AAU CUG UUU ACC CdGdT.

toinen FKBP5 shRNA.

Sense strand: AAU AUC CCU CUC CUU UCC GdTdT.

Antisense strand: CGG AAA GGA GAG GGA UAU UdGdT.

Molemmat FKBP5 shRNA duplexes kloonattiin pSuper vektoreihin, ja yhdistettiin transfektiota. Pakkaus- solulinja 293T infektoitiin retrovirus pSuper-shRNA [16]. Väliaine vaihdettiin 24 tunnin kuluttua ja kerätään 48 tai 72 tunnin kuluttua transfektiosta. Sitten väliaine suodatettiin steriilin suodattimet (0,45 um suodatin) ja käytettiin infektoimaan SU86-soluja. Infektoidut solut valitaan 2 ug /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich). Kuusitoista puromysiinin kestävä pesäkkeet, jotka varmistettiin RT-PCR: llä yhdistettiin sitten ja stabiilit transfektantit pidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää ja 2 ng /ml puromysiiniä.

Sekvenssit siRNA vastaan ​​FKBP5 olivat:

Sense strand: GGG UAA ACA GAU UGA GCA UdTdT.

Antisense strand: elokuu CUC AAU CUG UUU ACC CdGdT.

sekvenssit negatiivinen kontrolli siRNA olivat:

Sense strand: UUC UCC GAA RTY GUC ACG UdTdT.

Antisense strand: ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT

Lääkkeet ja soluproliferaatiomäärityksissä

Gemsitabiini toimitti Eli Lilly (Indianapolis, IN). Trisiribiinin (TCN), rapamysiinin ja LY 294002 ostettiin EMD Biosciences (San Diego, CA). Etoposidi ja paklitakselin ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Sytotoksisuusmäärityksissä kasvaimen solulinjojen suoritettiin CellTiter 96® vesipitoinen Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, Madison, WI), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Sytotoksisuus arvioitiin piirtämällä solujen selviytymistä vastaan ​​lääkeaineen pitoisuus (loki mittakaavassa). IC50 fenotyyppi (tehokas annos, joka tappaa 50% soluista) laskettiin käyttäen neljän parametrin logistista mallia, ja sitä käytettiin tilastollista vertailua eri hoitoja.

kasvua inhiboivia vaikutuksia gemsitabiinin, etoposidin ja paklitakselia sekä vaikutukset yhdistelmän hoidon TCN, rapamysiinin ja LY 294002 in BXPC3, ASPC1, SU86, MCF7 ja Hs578T solut määritettiin myös käyttämällä MTS-määritystä. Tulokset ilmoitetaan edustavat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä rinnakkaisnäytettä.

Transient Transfektio ja RNA-interferenssi

Ihmisen BXPC3 ja ASPC1 haimasyövän solulinjoissa sekä MCF7 ja Hs578T rintasyöpä solulinjoja käytetään suorittamaan siRNA tutkimuksissa. Hiperfect transfektioreagenssia (QIAGEN) käytettiin siRNA käänteinen transfektiota. Erityisesti, solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja sekoitettiin siRNA-kompleksi, joka koostuu 10 nM erityisiä tai negatiivinen kontrolli siRNA (QIAGEN) ja 0,1 ui lipofektamiinia ™ RNAiMAX reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Quantitative Reaaliaikainen Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista kanssa Qiagen RNeasy kit (QIAGEN Inc. Valencia, CA), jota seurasi QRT-PCR suoritettiin 1-vaiheen, Brilliant SYBR Green QRT-PCR master mix (Stratagene, La Jolla, CA). Erityisesti alukkeet ostettiin Qiagen käytettiin suorittamaan QRT-PCR: llä käyttäen Stratagene Mx3005P ™ Real-Time PCR havaitsemisjärjestelmä (Stratagene). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena β-aktiini sisäisenä kontrollina. Käänteistranskriptio Universal Human viite RNA (Stratagene) käytettiin standardikäyrän muodostamiseksi. -kontrollireaktiot Puuttui RNA-templaatin.

Western blot analyysit

SDS-PAGE ja Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. FKBP5 vasta-aineita on esitetty GST-fuusioproteiinit, jotka sisältävät amino-terminaaliset tähteet 1-100 FKBP5. Vasta-aineet Akt (# 9272), fosfo-Akt (Ser473) (# 9271), fosfo-Akt (Thr308), FOXO1 (# 9454), fosfori-FOXO1 (Thr 24) (# 9464), GSK3p (# 9315) ja fosfo-GSK3p (# 9316) ostettiin Cell Signaling Inc (Boston, MA). Tuumorinäytteet käsiteltiin Western blotting kuten aiemmin on kuvattu käyttäen Triton X-100-sisältävien hajotuspuskuria [10]. Blotit kehitettiin Super Signal kemiluminesenssin reagenssia (Pierce, Rockford, IL).

Kateenkorvattomiin Nude Mouse Kasvaimen muodostumisen määritys

Kaikki hiiret käytettiin tässä tutkimuksessa pidettiin Mayo Clinic Kotieläinjalostusosuuskunta Facility. Kaikki koemenettelyn tarkistettiin ja hyväksyttiin Mayo Clinic Institutional Animal Care ja Käytä komitea (protokolla ei. A14008), ja kaikki tutkimukset suoritettiin menetelmien mukaisesti hyväksytty protokolla.

SU86 solut ilmentävät stabiilisti FKBP5 shRNA ja mock solua injektoitiin ihon alle vasempaan imusolmukkeet alueen 4-viikkoisen naaras-kateenkorvattomiin väistyvä nude /nude-hiirten (kateenkorvattomissa NCR-nu /nu: National Cancer Institute-Frederick) käyttäen 19 gaugen neulojen [18], [19] . Kukin hiiri sai yhden injektion 5 x 10

6 solua 200 ul: ssa seerumitonta DMEM: ää. Eläimiä seurattiin aktiivisuuden ja fyysisen kunnon päivittäin, ja määritykset kehon painon ja mittaus syöpäkasvaimen suoritettiin joka 3 päivä. Kasvaimen kasvua seurattiin ja 6 viikkoa, ja tuumorin tilavuus laskettiin 1 /2a x b

2, jossa ”a” tarkoittaa pitkän halkaisijan ja ”b” on lyhyt halkaisija [18], [19]. Sitten tuumorien poistettiin kirurgisesti ja käsitellään.

Therapy Arviointi

Hiiret, ihonalainen wtFKBP5 SU86 ja shFKBP5 SU86 kasvaimia osallistui tutkimukseen, kun kasvaimet saavuttivat -100 mm

3 (päivä 0) ja satunnaistettiin hoitoryhmään, 5 hiirtä kussakin ryhmässä. Gemsitabiini annettiin i.p. joka 3 päivä pitoisuuksina 25, 50 tai 100 mg /kg. Sillä gemsitabiinin /TCN tutkimuksessa neljään hoitoryhmään sisällytettiin: (a) ajoneuvon (b) TCN, annoksella 0,5 mg /kg /d 1,5% natriumbikarbonaatilla (Thermo Fisher) w /v vedessä, pH 8,0 annettuna 100 ml vatsaontelonsisäisiä kerran päivässä maanantaista perjantaihin 4 viikon, (c) gemsitabiinia, annoksella 50 mg /kg suolaliuosta, annettiin ip joka 3 päivä ja 4 viikkoa, tai (d) yhdistelmä, kaksi käsittelyä. Ei ollut todisteita brutto myrkyllisyydestä lääkettä saaneilla eläimillä mitattuna laihtuminen. Kasvaimen kasvu laskettiin koko mitattiin kussakin aikapisteessä normalisoitiin alkuperäisen kasvaimen päivänä 0, kun kasvaimet shFBKP5 ja wtFKBP5 ksenograftin hiirillä oli 100 mm

3. Tulokset hoitovaikutus edustivat kasvaininhibitioaktiivisuuden suhde, joka määritellään kasvaimen kasvunopeus shFKPB5 hiirten korjattuna että wt FKBP5 hiirillä. Maksimaalinen kasvaimen kasvun estoa käytettiin tilastollinen vertailu eri hoitoryhmään.

immunohistokemiallinen värjäys

kudosleikkeiden poistettiin parafiini ksyleenillä, kastetaan pitoisuuksien alentamista etyylialkoholia, ja sitten niihin lisätään tislattuun vesi. Antigeeni haku for Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) suoritettiin asettamalla liukuu esilämmitetään EDTA kuin palauttamisen liuoksena höyrystimen 98 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Värjäystoimenpide toteutettiin Dako Autostaineriin Plus. Erityisesti, kudosleikkeet käsiteltiin Peroxidase Blocking Reagent (Dako, Carpinteria, CA) 5 minuutin ajan ja sitten pestiin 1x Wash Buffer (Dako, Carpinteria, CA), jota seuraa käsittely Protein Block Serum-Free (Dako, Carpinteria , CA) 5 minuutin ajan. Kudos Sitten leikkeitä inkuboitiin Ki67 primaarisen vasta-aineen kanssa 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mitä seurasi inkubaatio sekundaari- vasta-aineella (Dako, Carpinteria, CA) 15 minuutin ajan. Herkkä diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia (DAB +) kromogeenisubstraattia järjestelmä (Dako, Carpinteria, CA) käytettiin kolorimetristä visualisointiin.

Tilastollinen analyysi

Kokeelliset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Erot kontrolli- ja testiryhmään määritettiin käyttämällä pariksi

t

testiä tai ANOVA, ja p 0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

knockdovvn FKBP5 johtaa lisääntyneeseen haiman tuumorikasvun ja Gemsitabiini Resistance

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että FKBP5 ilmentyminen säätyy alas haimasyövän ja ovat ehdottaneet, että FKBP5 voi olla mukana kasvainten synnyssä haimasyövän. SU86 haimasyövän solulinja transfektoitiin stabiilisti yhdistettiin FKBP5 shRNA. Sitten määritetään vaikutus FKBP5 muodostumista ksenograftikasvaimissa. Oli dramaattinen kasvu kasvaimen koon FKBP5 pudotus hiirillä verrattuna kontrollihiiriin, mikä osoittaa, että FKBP5 on mahdollinen tuumorisuppressori (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1A on esitetty, tuumorin tilavuus oli merkittävästi suurempi shFKBP5 hiirissä kuin kontrollihiirillä. Päivänä 18, keskimääräinen tilavuus oli 200 ± 101 mm

3 kontrollieläimiltä (n = 5 hiirtä /ryhmä), ja 937 ± 103 mm

3 shFKBP5 hiirillä (n = 5; p 0,001). Tämä suuntaus oli yhdenmukainen päivään 30 kun hiiret tapettiin (shFKBP5 hiiret: 2999 ± 298 mm

3, ja wtFKBP5 hiiret: 1190 ± 243 mm

3; n = 5; p 0,001). Koska meidän aiemmat tutkimukset osoittivat, että ekspressiotaso FKBP5 korreloi herkkyyttä haimasyövän soluja kemoterapeuttisten [10], me seuraavaksi ratkaistava, onko knockdovvn FKBP5 voivat vaikuttaa kemosensitiivisyys on SU86 ksenograftien gemsitabiiniannokseen

in vivo

. Ensin testataan annosvaikutuksen gemsitabiinin sekä paino- ja shFKBP5 SU86 ksenografteissa kun kasvaimet olivat saavuttaneet saman kokoinen, 100 mm

3. Annoksesta riippuva tuumorin kasvun havaittiin gemsitabiinin kanssa kaikkien SU86-ksenografteissa (kuvio 1 B ja C). FKBP5 villityypin SU86-ksenografteja havaittiin tilastollisesti merkittävä vaste 100 mg /kg gemsitabiinia verrattuna shFKBP5 SU86 ksenografteissa käsiteltiin samalla gemsitabiinin annos (kuvio 1D, p 0,05), mikä viittaa siihen, että alhainen ilmentyminen FKBP5 voivat aiheuttaa resistenssin gemsitabiinin . Olemme myös havainneet, että on pienemmillä pitoisuuksilla gemsitabiinin, The wtFKBP5 oli myös suuntaus paremman vasteen kuin shFKBP5 ksenografti hiirissä, vaikkakaan ei tilastollisesti merkitsevästi (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki hoidot olivat hyvin siedettyjä, eikä merkittävää kehon painon (kuvio 1 E ja F).

Hiiret, ihonalainen wtFKBP5 SU86 ja shFKBP5 SU86 kasvaimia osallistui tutkimukseen, kun kasvaimet saavuttivat -100 mm

3 (päivä 0 ). Kaikki hiiret satunnaistettiin valvoa tai hoitoryhmään ja sai vehikkeliä tai gemsitabiinin annoksina 25, 50, ja 100 mg /kg vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa. (A) muodostus ihonalainen (s.c.) kasvaimia paino- ja shFKBP5 SU86 pistetään paljaisiin hiiriin. Tulokset esitetään kasvaimen tilavuuden mitataan kunakin ajankohtana. ** P 0,001 (5 hiirtä /ryhmä) verrattuna välillä wtFKBP5 ja shFKBP5 ksenografteissa käsiteltiin suolaliuoksella. (B ja C) Gemsitabiini vasteen paino- tai shFKBP5 ksenograftin hiirillä. Tulokset esitetään kasvaimen tilavuuden mitataan kunakin ajankohtana korjattu päivänä 0, kun hiiret osallistui tutkimukseen. (D) shFKBP5 ksenograftit ovat vastustuskykyisiä gemsitabiinin

in vivo

. Tulokset esitetään kasvaimen inhibitio suhde, joka määritellään mittaukset kasvaimen tilavuuden kunakin ajankohtana normalisoitu päivä 0 shFKPB5 hiiriä, korjattuna että paino- FKBP5 hiirillä. ** P 0,001; * P 0,05 (5 hiirtä /ryhmä), kuten vertailu kasvaimen kasvun inhibition suhde wtFKBP5 ja shFKBP5 käsiteltiin 100 mg /kg gemsitabiinia. (E ja F) mittaukset painokiloa paino- ja shFKBP5 ksenograftit. Kehon paino rekisteröitiin kullekin hiirelle 3 päivän välein koko kokeen ajan. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kaksisuuntainen ANOVA.

Olemme aiemmin osoittaneet, että aktivoitua Akt signalointi liittyy alhainen FKBP5 haiman syöpäsoluissa [10]. Siksi tutkimme aktiivisuus Akt-reitin kasvaimen näytteitä kustakin solulinjasta. Vuonna shFKBP5 ksenografteja, fosforyloitu Akt-Ser473, FOXO1and GSK3p lisääntyivät merkitsevästi kontrolliin verrattuna (kuvio 2, p 0,01). Lisäksi gemsitabiinin ei ollut vaikutusta tasoilla fosforylaation näitä proteiineja. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen avulla haiman solulinjoja [10]. Yhdessä tämä sarja kokeita viittaa siihen, että FKBP5 toimii tuumorisuppressorina negatiivisesti säätelemällä Akt-reitin

in vivo

. Lisäksi taso FKBP5 vaikuttaa herkkyys gemsitabiinihoidon liittyy sen vaikutus Akt-fosforylaation haiman ksenograftimallissa.

Kasvaimen näytteitä wtFKBP5 SU86 tai shFKBP5 SU86 ksenografteja valmistettiin ja analysoitiin fosforylaatioon Akt ja loppupään signalointimolekyylien Western blot-analyysi.

Akt Inhibitor herkistää kasvainsolut Low FKBP5 on Solunsalpaajalääkeaineet

in vitro

fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitillä on solu selviytymisreittiin joka on tärkeä normaali solujen kasvua ja lisääntymistä [20], [21], [22], [23]. Tämä reitti on myös tärkeä tavoite syövän hoitoon, mukaan lukien nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) inhibiittorit, PI3K ja estäjiä Akt jotka ovat jo osoittaneet kliinistä tehoa eri kasvaimissa [24]. Koska FKBP5 säätelee negatiivisesti Akt-aktiivisuutta, odotamme, että lisäys estäjien kohdistaminen Akt-reitin voi kääntää vastustuskykyä gemsitabiinia. Tämän hypoteesin testaamiseksi teimme sarjan

in vitro

kokeissa käyttäen kolmea haiman tuumorisolulinjoja (ASPC1, BXPC3 ja SU86) ja kaksi rintasyövän solulinjoissa (MCF7 ja Hs578T). Valitsimme kolme erilaista Akt-reitin estäjiä, mukaan lukien ylävirran estäjä PI3K, LY294002, tietyn Akt estäjä, trisiribiinin (TCN), joka estää fosforylaatiota kaikkien kolmen isomuotoja Akt, ja mTOR-estäjä, rapamysiini. Sitten arvioitiin sytotoksisuuden vaikutuksesta gemsitabiinin yhdistettynä LY294002, TCN, ja rapamysiini, vastaavasti. Taulukossa 1 on yhteenveto IC50-arvot kutakin hoitoa näihin viiteen solulinjoista. Meidän tiedot vahvistivat, jälleen kerran, että pudotus on FKBP5 desensitized solujen gemsitabiiniannokseen hoitoon kaikissa testatuissa solulinjoissa (taulukko 1 ja kuvio S1). LY294002, TCN ja rapamysiini oli hyvin vaatimaton vaikutuksia käytettynä yksinään joko FKBP5 Knockdown soluja tai ohjaus soluja, erityisesti pitoisuuksina (10 uM TCN, 1,4 uM LY294002, ja 1 nM rapamysin) että käytimme yhdistelmähoidot (kuva S2) . TCN herkistyneet sekä ohjaus ja FKBP5 knockdown solujen gemsitabiinia (taulukko 1, ja, p 0,005). Kuitenkin TCN herkistymistä vaikutus oli suurempi FKBP5 pudotus soluissa kuin wtFKBP5 soluissa (p 0,001) (taulukko 1 ja kuvio S1). Herkistymistä vaikutukset LY294002 ja rapamysiinin olivat vähemmän kuin TCN (taulukko 1 LY294002, p = 0.0023~0.3412, rapamysiini, p = 0.0171~0.931).

aiemmin havaittu, että taso FKBP5 vaikuttaa myös vastaus muiden kemoterapia-aineiden, mukaan lukien etoposidi ja taksaanien [10]. Siksi testasimme TCN voi myös herkistää nämä aineet neljän solulinjoissa tutkittu. Kaikilla neljällä solulinjoissa, FKBP5 pudotus teki solut kestävät paremmin etoposidi hoito yksinään, mikä on sopusoinnussa aiempien tulosten. Huomasimme, että TCN voisi merkittävästi herkistää etoposidin BXPC3, ASPC1, Hs578T ja MCF7-soluissa verrattuna IC 50-arvot etoposidin hoito yksinään vs. eri yhdistelmähoidot (taulukko S1). Herkistymistä vaikutus oli huomattavampi solujen FKBP5 knockdown. LY294002 voisi myös herkistää etoposidin BXPC3 ja MCF7-soluissa sekä ohjaus ja siFKBP5 transfektio, kun taas rapamysiini oli selvästi vähäisempi vaikutus ohjaus tai FKBP5 kaataa soluja (taulukko S1). Lisääminen TCN voisi myös herkistää paklitakseli kaikissa neljässä solulinjoissa (taulukko S2). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa aste herkistymistä vaikutuksen välillä ohjaus ja FKBP5 knockdown solulinjoissa. LY294002 ja rapamysiini oli rajallinen vaikutus paklitakselia herkistymistä.

The effects of LY294002, TCN ja rapamysiinin yhdessä gemsitabiinin on Akt signalointireitin arvioitiin myös SU86 soluissa. FKBP5 pudotettiin käyttämällä siRNA, joka kohdistuu FKBP5 (kuvio 3A). Akt 473 fosforylaation nostettiin FKBP5 kaataa soluja verrattuna ohjaus (kuvio 3B, sarake 1 sekä vasen ja oikea paneeli, p 0,005), samoin kuin alavirran molekyylejä, kuten fosforyloitiin GSK3p ja FOXO1 (kuvio 3C ja D, sarake 1 sekä vasen ja oikea paneeli), yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten [10]. TCN yksinään riittävä estämään Akt-reitin, kuten on esitetty vähentynyt fosforylaation tasoja Akt verrattuna ohjaus (kuvio 3B, sarake 3 sekä vasen ja oikea paneeli, p 0,005), GSK3p ja FOXO1 (kuvio 3C ja D, sarake 3 sekä vasen ja oikea paneeli). LY294002 oli myös vaikutusta PI3K-Akt signalointireitin (kuvio 3C ja D, sarake 5 sekä vasen ja oikea paneeli). Kuitenkin rapamysiinin yksin oli vähemmän estävä vaikutus PI3K-Akt-reitin verrattuna TCN ja LY294002 (kuvio 3B, C ja D, sarake 7 sekä vasemmalla että oikealla paneelit). TCN yhdessä gemsitabiinin (kuvio 3B, C ja D, sarake 4 sekä vasen ja oikea paneeli,) laskivat edelleen fosforylaation tasoja Akt 473, GSK3p ja FOXO1 verrattuna joko gemsitabiinin (kuvio 3B, C ja D, sarake 2 sekä vasen ja oikea paneeli) tai TCN (kuvio 3B, C ja D, sarake 3 sekä vasen ja oikea paneeli) yksinään (p 0,005), ja tämä vaikutus oli paljon huomattavampi TCN plus gemsitabiinin kuin LY294002 tai rapamysiini plus gemsitabiinin (kuvio 3B, C ja D, sarake 6 ja 8 sekä vasen ja oikea paneeli). Koska knockdovvn FKBP5 huomattavasti Akt 473 fosforylaation tasoja, vähennys nähdään TCN plus gemsitabiinin oli paljon merkittävämpi FKBP5 pudotus soluissa (kuvio 3B, C ja D, sarake 4 sekä vasen ja oikea paneeli), mikä vahvistaa hypoteesia, että solut alhainen FKBP5 saattaa riippua enemmän Akt aktivointia ja siksi hyötyä enemmän lisäämällä Akt estäjä.

(A) FKBP5 kaataa tehokkuus määritettiin RT-PCR ja Western blot. (B) SU86-soluja käsiteltiin DMSO: ssa (vehikkeli), 10 nM gemsitabiinin yksin, tai 10 uM TCN, 1,4 uM LY294002, ja 1 nM rapamysiinin yksin tai yhdistelmänä. Annoksesta riippuvia vaikutuksia eri hoitoja solujen elinkelpoisuus testattiin MTS määrityksellä 48 tunnin. Vain yhdistettynä hoidon TCN ja gemsitabiinin esti Akt

in vitro

. *** P 0,005. (C ja D) yhdistelmä TCN ja gemsitabiinin osoitti suurimman inhibition pGSK3β ja pFOXO1 verrattuna muihin hoitoihin. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin

t

testiä ja p 0,005 katsottiin merkitseväksi mikä näkyy tähdellä (***).

Tehostettu Tumor Growth Inhibition kanssa TCN Plus gemsitabiini

in vivo

Seuraavaksi käytimme ksenograftin hiiriä joko wt tai shFKBP5 SU86 solujen testata onko FKBP5 pudotus hiiret saattavat hyötyä enemmän lisäämällä Akt estäjä, TCN. Villityypin ja FKBP5 pudotus SU86 ksenograftikasvaimissa kasvatettiin nude-hiirissä. Kun ksenograftikasvaimissa muodostunut, TCN ja gemsitabiinin injektoitiin i.p. Nopeampaa kasvaimen kasvu oli jälleen havaittu shFKBP5 ksenograftin hiirissä (kuvio 4A ja B). Arvioimaan tuumorin vastaista tehokkuutta, tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin TCN (0,5 mg /kg /päivä) i.p. 4 viikkoa tai gemsitabiinia (50 mg /kg) i.p. kolme kertaa viikossa 4 viikon ajan, kun läsnä tai poissa TCN 0,5 mg /kg, i.p. kerran päivässä 5 päivää. Monoterapia TCN yksinään ei ollut tehokas paino- tai FKBP5 Knockdown ksenograftit, ja ei ollut merkittävää eroa maksimaalisen suppression kasvaimen kasvua paino ja shFKBP5 ksenografteissa kun käsiteltiin 50 mg /kg gemsitabiinin yksinään (kuvio 4C). Kuitenkin yhteiskäsittely kanssa TCN tehostaa merkittävästi gemsitabiinin antituumorivaikutus verrattuna joko gemsitabiinin tai TCN yksin sekä paino- ja shFKBP5 ksenograftin hiiriä (p 0,005 sekä paino- ja shFKBP5) (kuvio 4D ja E). Suurempi esto vaikutus TCN plus gemsitabiinin havaittiin shFBKP5 ksenograftin hiirissä verrattuna wtFKBP5 (p 0,005) (kuvio 4F). Kaikki hoidot olivat hyvin siedettyjä, eikä eläimet kuolivat aikana hoidon. Siksi yhdistelmä gemsitabiinin ja TCN oli hyvä turvallisuusprofiili hiirissä ilman kuolleisuutta tai painonmenetystä (kuva 4G ja H). Siten yhdistelmä TCN ja gemsitabiinin aiheutti merkittävästi suurempi

in vivo

antituumorivaikutukset kuin kummallakaan aineella yksinään, varsinkin kun taso FKBP5 väheni.

yhdistelmä TCN gemsitabiinihoito tehokkaasti esti kasvaimen kasvua

in vivo

. Hiiret, joilla ihonalaisesti perustettu kasvainten wtFKBP5 SU86 tai shFKBP5 SU86-soluja osallistui tutkimukseen, kun kasvaimet saavuttivat -100 mm

3 (päivä 0), ja käsiteltiin TCN 0,5 mg /kg vuorokaudessa ja /tai gemsitabiinia 50 mg /kg 3 päivän välein 30 päivää. (A) wtFKBP5 hiiriä ja (B) shFKBP5 hiirten kasvainten kasvua. *** P 0,005. (C) Vertailu maksimaalisesta tuumorisuppressiogeeneksi välillä p- ja shFKBP5 ksenograftit. Mitään merkittävää eroa maksimaalinen kasvaimen kasvun estoa havaittiin paino- ja shFKBP5 ksenografteissa, kun käsiteltiin 50 mg /kg gemsitabiinin yksin. (D ja E) yhteiskäsittely kanssa TCN merkittävästi parannettu gemsitabiini antituumorivaikutus sekä paino- ja shFKBP5 ksenograftin hiirillä. ** P 0,001; * P 0,05 (5 hiirtä /ryhmä), kuten vertailu kasvaimen kasvun inhibition suhde TCN plus gemsitabiinin ja gemsitabiinin yksin wtFKBP5 ja shFKBP5 ryhmiä, vastaavasti. (F) menetys FKBP5 ilmaisun johtaa lisääntyneeseen herkistymisen voimassa TCN gemsitabiinin vastausta. *** P 0,005 vertailuna kasvaimen kasvun inhibition suhde wtFKBP5 ja shFKBP5 hiirillä. Keskiarvo ± SEM viidelle kasvaimia datapisteen. (G ja H) mittaukset painonpudotusta paino ja shFKBP5 ksenograftit. Myrkyllisiä vaikutuksia hallinnon Gemsitabiinin ja gemsitabiinin sekä TCN määritettiin rekisteröimällä kehon painosta kullekin hiirelle 3 päivän välein koko kokeen ajan. ANOVA-analyysi suoritettiin, ja p 0,005 katsottiin merkitseväksi, kuten on esitetty tähdellä (***).

seuraavassa lähemmin tarkastelemaan suhteellinen Akt 473 fosforylaation sisällä ksenograftikasvaimissa eri käsittelyjen jälkeen. Huomasimme, että gemsitabiini kestävä shFKBP5 ksenografteissa oli kohonneita fosforyloidun Akt 473 verrattuna wtFKBP5 (kuvio 5A, sarake 1 sekä vasen ja oikea paneeli, p 0,005) odotetusti. TCN yksin kohtalaisen esti fosfo-Akt (53,1 ± 6,2% kontrolli) (kuvio 5A). Gemsitabiini yksin vain hieman esti fosfo-Akt kasvaimen (kuvio 5A). Lisäämällä TCN, tasojen fosforyloidun Akt 473 vähensi merkittävästi verrattuna kontrolleihin (kuvio 5A, p 0,005). Edelleen ratkaise mekanismi eston syövän etenemisen, proliferaatio määritettiin immunovärjäyksellä on ksenograftikasvaimissa. Immunovärjäystä leviämisen merkki Ki67 paljasti enemmän lisääntyvien kasvainsolujen shFKBP5 ksenografteissa verrattuna kontrolleihin (Kuva 5B ja C). Proliferatiivinen aktiivisuus oli alhaisempi yksilöiden gemsitabiiniryhmässä plus TCN kuin gemsitabiinihoito yksin sekä paino- ja shFKBP5 ksenograftit (kuvio 5D, p 0,01). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että yhdistelmä TCN ja gemsitabiinin parantaa estämällä Akt-reitillä.

(A) Pakt 473 tasot analysoitiin sekä wtFKBP5 ja shFKBP5 kasvainkudoksissa. *** P 0,005. (B ja C) kasvaimen näytteet wtFKBP5 SU86 ja shFKBP5 SU86 -ksenografteja valmistettiin ja värjättiin Ki67. (D) kvantifiointi Ki67-värjäys ilmaistiin positiivisten solujen prosenttiosuuden (5 random kentät kullekin näytteelle, *** P 0,05). Tilastollinen arviointi suoritettiin

t

testiä.

Keskustelu

raportoi äskettäin, että FKBP5 on rakennustelineet proteiini, joka voi parantaa PHLPP-Akt vuorovaikutus [10]. Toiminnallinen Tämän yhteisvaikutuksen seurauksena johtaa negatiiviseen säätelyyn Akt-aktiivisuutta. Säätelyä alaspäin FKBP5 johtaa laski PHLPP-Akt vuorovaikutus ja lisääntynyt Akt-fosforylaation on Ser473 sivustolla [10], mikä viittaa siihen, että FKBP5 voi toimia kasvaimia estävä, on tärkeä seikka myötävaikuttaa chemoresistance. Perustuen aikaisemmat havainnot FKBP5 ja sen roolia chemoresistance [9], [10], testasimme tämä hypoteesi

in vivo

käyttäen ksenograftin hiirimallissa.

Huomasimme, että kasvaimia shFKBP5 hiiret olivat resistenttejä gemsitabiinihoidon ja oli myös nopeampi kasvaimen kasvua (kuvio 1A-D). Tämä vaikutus oli mukana sääntelyn Akt aktivointi, määritettynä fosforyloidun Akt ja loppupään molekyylejä (kuvio 2). Koska Akt aktivoituu FKBP5 on tippuu alas, me arveltu, että lisäämällä estäjien kohdistaminen tämän reitin voisi kääntää huumeiden resistenssifenotyyppi. PI3K-Akt-reitin on useita lääkekykyprofiili tavoitteet [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], joten testasimme useita estäjien kohdistaminen PI3K, Akt ja mTOR . Havaitsimme erilainen kohtelu vaikutus eri solulinjoissa (taulukot 1, S1 ja S2), mikä saattaa johtua solu tai kudosspesifisyyttä.