Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat ympäri maailmaa. Metformiini, biguanidi, jota käytetään laajalti hoidettaessa diabetes mellitus, on äskettäin osoitettu olevan estävää vaikutusta CRC riskiä ja kuolleisuutta, mutta eivät kaikki laboratorion tutkimukset viittaavat siihen, että metformiini on antineoplastinen aktiivisuus. Täällä, tutkimme vaikutus metformiinin ja AMPK aktivaattori AICAR CRC solujen lisääntymistä. Tämän seurauksena, metformiinin ei estänyt soluproliferaatiota tai apoptoosin CRC solulinjojen in vitro ja in vivo. Erilaiset metformiinin, AICAR syntynyt antituumorivaikutus ja säteilyherkälle syövänvastainen vaikutus 5-FU CRC soluihin in vitro ja in vivo. Vuonna tarkempaa analysointia, osoitamme, että AMPK aktivaatio voi olla keskeinen molekyylimekanismiksi lisäaineen vaikutuksen AICAR. Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että metformiini ei ole antineoplastinen aktiivisuus CRC solujen monoterapiana mutta AMPK aktivaattori AICAR voi indusoida apoptoosia ja parantaa sytotoksista vaikutusta 5-FU kautta AMPK aktivoitumisen.

Citation: Sui X, Xu Y, Yang J, Fang Y, Lou H, Han W, et ai. (2014) käyttö metformiinin Alone ei liity Survival Outcomes paksusuolisyövän Cell mutta AMPK Activator AICAR herkistää Syövän vaikutus 5-fluoriurasiili kautta AMPK aktivointi. PLoS ONE 9 (5): e97781. doi: 10,1371 /journal.pone.0097781

Editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Korva sairaala, Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 helmikuu 2014; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2014; Julkaistu: toukokuu 21, 2014

Copyright: © 2014 Sui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukevat avustuksia National Natural Science Foundation of China (avustus nro 81301891 ja 81272593) ja Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China (myöntää nro LQ13H160008). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen johtava syy syöpään liittyvien sairastuvuutta ja kuolleisuutta ympäri maailmaa, vaikka paljon on edistytty hoidossa CRC viime vuosina [1], [2 ]. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että diabetes mellitus (DM) lisää ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta syöpien, erityisesti maha-suolikanavan pahanlaatuisten kasvainten [3], [4]. On yhä enemmän näyttöä yhdistää diabetes lisääntynyt paksusuolisyövän riskin [5], [6]. Kuitenkin jotkut muut tutkimukset eivät ole tukeneet tätä näkemystä. Multi-keskus, kaksoissokkoutettu, lumekontrolloitu, satunnaistettu kontrolloitu tutkimus osoitti, että ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa paksusuolen syövän erityinen eloonjääminen, jotka on diabetes [7]. Niin, suhde DM ja CRC riski on edelleen kiistanalainen.

Metformin (1,1-dimetyylibiguanidi hydrokloridi), biguanidi johdannainen, jota käytetään laajalti hoidettaessa diabetes mellitus, on osoitettu saavan aikaan mahdollisesti tärkeitä syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [ ,,,0],8], [9], mutta muut eivät ole tukeneet tätä mieltä [10], [11]. Liittyviä mekanismeja antineoplastisia vaikutuksia metformiinin ovat todennäköisesti hyvin erilaisia, mukaan lukien aktivoituminen adenosiinimonofosfaatin (AMPK) [12], fosfatidyyli-3 kinaasi (PI3K) mutaatio [13], p53 puute [14] ja niin edelleen. Näistä varalle, AMPK- nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) akseli on keskeinen rooli antineoplastisten vaikutusten metformiinia. Metformiinin ja 5-amino-imidatsol-4-karboksamidi-1-b-4-ribofuranosidi (AICAR) voidaan aktivoida AMPK kautta. AMPK on seriini /treoniini-kinaasi ja matkapuhelinverkon polttoainetunnistimeen koulutusjakson herkkä kasvu AMP /ATP-suhde, joka on yhdistetty useisiin ihmisen tuumorisuppressoreilla [15]. Vaikutukset metformiinin selittyvät pääasiassa aktivoituminen AMPK, joka estää proteiinisynteesiä ja glukoneogeneesin aikana solustressiä [16].

Toistaiseksi 5-fluorourasiili (5-FU) on edelleen laajalti käytetty kemoterapeuttisen lääkeaineen kolorektaalisen karsinooman. Äskettäin metformiini on raportoitu olevan synergistinen vaikutus yhdessä joidenkin kemoterapia-aineiden [17], [18]. On kuitenkin vielä epäselvää, metformiini tai AICAR voidaan käyttää yhdessä 5-FU parantaa syövän vastaista vaikutusta, koska ei ole tutkimuksen korrelaatio metformiinin /AICAR ja 5-FU käsittely in vitro ja in vivo.

tutkineet vaikutusta metformiinin ja AMPK aktivaattori AICAR CRC soluproliferaatioon. Tässä osoitamme, että käyttö metformiini yksinään ei liity selviytymisen tuloksia paksusuolen syöpäsolu mutta AICAR voi indusoida apoptoosia ja parantaa sytotoksista vaikutusta 5-FU kautta AMPK aktivaation, jotka tulisi ottaa huomioon meneillään olevissa kliinisissä tutkimuksissa, joissa metformiini käytetään kolorektaalisen syövän.

tulokset

metformiini ei estänyt peräsuolen syövän Cell Growth

jotta tutkia metformiini vaikuttaa paksu- ja peräsuolisyövän solujen lisääntymistä tutkimme vaikutus huumetta kolmen syöpäsolulinjoissa: HCT116, RKO ja HT29. Soluja kasvatettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), käsiteltiin metformiinin (1 ja 5 mM) ja AICAR (5 mM) kontrollina. AICAR tiedetään indusoivan apoptoosia. MTT tehtiin elinkyvyn lisäyksen jälkeen aineet 24 tuntia. Tämän seurauksena, AICAR vähentää solujen elinvoimaisuuden 50-70% kolmessa solulinjoissa, mutta vähän lasku solujen elinkelpoisuuden havaittiin kolmessa solulinjoissa hoidettiin metformiinilla (kuvio 1A), mikä osoittaa, metformiini voi olla mitään vaikutusta paksusuolen ja peräsuolen syövän solujen kasvu. Sen määrittämiseksi, onko metformiini estää ankkurista riippumattomaan kasvuun, teimme pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys puuttuessa tai läsnä 5 mM metformiinin uusitaan päivittäin. 2 viikon kuluttua, solut laskettiin mikroskoopin alla. Suostumuksella MTT-elinkyky määrityksen tulokset, metformiini ei laskenut määrää ja kokoa pesäkkeiden (kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että metformiini ei ollut kasvua estävää aktiivisuutta kolorektaalisyövässä solussa.

(A) HCT116, RKO ja HT29 ympättiin 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua, metformiini (1 ja 5 mM) ja AICAR (5 mM) lisättiin viljelyalustaan. 24 h lisäyksen jälkeen aineet, vaikutus metformiinin ja peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä suoritettiin solun elinkelpoisuuden määritys (MTT). (B) Valokuvia pehmytagar siirtomaita HCT116, RKO ja HT29 2 viikon kuluttua hoidon 5 mM metformiinin ja 5 mM AICAR. (3) Cancer solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla metformiinin (1, 5 ja 10 mM) ja eri ajankohtina, sen jälkeen, ilmaus aktiivinen kaspaasi-3 ja LC3-II /I-suhde arvioitiin western-blottauksella.

metformiini ei apoptoosin, autophagy ja solusyklin pysähtymisen

Sen tutkimiseksi, metformiini apoptoosin ja autophagy, kolme syöpäsolun riviä käsiteltiin eri pitoisuuksilla metformiinin (1, 5 ja 10 mM ) eri aikaa, niin ilmaus aktiivisen kaspaasin 3 ja LC3-II /I-suhde arvioitiin western-blottauksella. Kuten kuviossa 1C on esitetty, apoptoosia ja autophagy ei aktivoida annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, kun soluja käsiteltiin metformiinin kanssa. Edelleen vahvistusta, kaikki nämä käsitellyt solut analysoitiin elektronimikroskoopilla ja virtaussytometrialla. Nämä kolme soluilla laaja apoptoottisia soluja (kuvio 2A) ja lisääntynyt sub-G1 väestöstä (kuvio 2B), kun AICAR hoidon. Sen sijaan hyvin harvat apoptoosin havaittu metformiinia käsitellyissä soluissa. Sitten kysytään metformiini vaikuttaa solusyklin. Kuten nähdään kuviossa 2B, havaitsimme saman prosenttiosuuden soluja G0 /G1, G2and S vaihe metformiinia käsitellyissä soluissa verrattuna niiden valvontaa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että metformiini ei apoptoosin, autophagy ja solusyklin pysähtymisen.

(A) 24 h lisäämisen jälkeen 5 mM metformiinin ja 5 mM AICAR vaikutus metformiinin peräsuolen syöpäsolujen eloonjäämistä havaittiin. Edustavia solujen morfologisia muutoksia havaitaan valomikroskoopilla; ominainen morfologiset piirteet apoptoosin havaittiin, mukaan lukien irtoaminen ja solujen kutistuminen. (B) fraktioita solujen sub-G1, G0 /G1, S tai G2 /M vaiheiden solusyklin tutkitaan jälkeen metformiinin ja AICAR.

AICAR voimistua Anti-syöpä Effect of 5-FU in vitro ja in vivo

on tunnustettu, että 5-FU käytetään yleensä yhdessä muiden kemoterapeuttisten lääkeaineiden parantaa sen terapeuttista tehoa, CRC potilaille. Jotta voidaan tutkia, onko AICAR voi herkistää syövänvastainen vaikutus 5-FU, arvioimme vaikutus AICAR 5-FU: n indusoiman apoptoosin. Olemme havainneet, että Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin AICAR yhdistelmänä 5-FU oli merkittävästi pienempi kuin kontrolleilla (kuvio 3A). Virtaussytometria osoitti, että osuus apoptoottisten solujen oli merkitsevästi suurempi soluissa käsiteltiin AICAR yhdistelmänä 5-FU: n kontrolleihin verrattuna (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AICAR parantaa 5-FU: n indusoiman apoptoosin peräsuolen syövän soluissa.

(A) HCT116, RKO ja HT29 ympättiin 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua, metformiini (5 mM), AICAR (5 mM), 5-FU: ta (20 uM) ja AICAR plus 5-FU lisättiin viljelyalustaan. 24 h lisäyksen jälkeen aineet, vaikutus metformiinin ja AICAR on peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä suoritettiin solun elinkelpoisuuden määritys (MTT). (B) edustavat tulokset anneksiini V-FITC /PI-värjäys ja kvantitatiivinen analyysi; Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta; * P 0,05.

tutkittava, metformiinin ja AICAR voivat vaikuttaa kasvaimen kasvua in vivo, me sitten pistetään nude-hiiriin ihonalaisesti HT29. Hiiret kanssa tuumoriksenografteja maahan 100 mm

3 jaettiin satunnaisesti 5 koeryhmään: kontrolliryhmään, metformiini 200 mg /ml /d (juomavedessä, mikä vastaa 15 mg /kg) ryhmä, AICAR 400 mg /kg /2 päivää, 5-FU 40 mg /kg /2 päivää ryhmä ja AICAR plus 5-FU ryhmässä 5 viikon ajan. Hoitoa annettiin kautta kasvaimeen injektiona. Kaikki hiiret siedetty tätä hoitoa hyvin ilman merkittävää toksisuutta ja oli vakaa painon. Ensinnäkin, metformiinin tasot määritettiin (3 h ja 15 h kuluttua metformiini injektion) käyttämällä korkean erotuskyvyn nestekromatografia ja metformiinin tasot hiirissä seerumit olivat keskimäärin 1,15 (± 0,31) ng /ml piikin, joka vastasi noin ihmisen huippu tasoja 500 mg po (Suun kautta) päivittäin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset osoittivat, että tasot metformiinin plasmassa naisten nude-hiiriä yleensä saavutettu ihmisissä. Sitten kasvaimen kokoa alkaen ksenografteista mitattiin. Tämän seurauksena kasvaimen kokoa alkaen ksenografteista of AICAR ryhmä ei metformiinin ryhmää pienempi verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi koot AICAR plus 5-FU ryhmässä olivat merkittävästi pienempiä kuin AICAR yksin tai 5-FU ryhmässä, viittaa siihen, että AICAR voisi voimistaa 5-FU-indusoidun syövän vastainen vaikutus HT29 (kuvio 4A).

( A) kasvu käyrä ksenograftikasvaimissa hoidettu ilmoitettu huumeita. (B) vaikutus AICAR on AMPK aktivointia. Ekspression aktiivinen kaspaasi-3, p-AMPK ja p-mTOR analysoitiin Western-blottauksella.

AICAR saattaa lisätä Syövän 5-FU kautta AMPK Activation

Se on ollut myönsi, että vaikutukset AICAR selittyvät pääasiassa aktivoituminen AMPK, joka säätelee solujen energia-aineenvaihduntaa. Sen tutkimiseksi, AMPK aktivointi saattaa liittyä lisäaineen vaikutus AICAR, fosforylaatiota AMPK ja mTOR arvioitiin western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Huomasimme, että p-AMPK aiheuttama 5-FU parannettiin AICAR yhdessä vähentynyt p-mTOR ja suurensi aktiivisen kaspaasin 3 (kuva 4B), mikä osoittaa, että aktivointi AMPK mukaan AICAR voimistaa 5-FU: n indusoiman apoptoosin.

keskustelu

Vaikka yhä todisteet tukevat ajatusta, että hyper- ja hyperglykemia edistää syövän syntymistä diabetes mellitus [19], [20], se on edelleen kiistanalainen onko paksusuolen syövän riskiä liittyy myös diabetekseen mellituksen ja metformiini hoito voisi vähentää riskiä CRC [10].

metformiini, biguanidi johdannainen, on laajalti käytetty ja hyvin siedetty lääke hoidettaessa tyypin 2 diabetes. Tehokkuus metformiinin diabeteslääke lääke selittyy sen kykyä vähentää maksan glukoneogeneesin ja stimuloida glukoosin ottoa lihaksessa, mikä vähentää verenkierrossa glukoosipitoisuuksien [21]. Metformiini määrää ihmisille ovat mikromolaarinen tasoilla mutta suolen voi tai ei näe soti-molaarinen tasolle. Tuoreet tiedot viittaavat siihen, että metformiini voisi suojata syöpään mukaan lukien CRC ja on anti-kasvain vaikutuksia hiiren ksenografteissa [22], [23]. Kiinnostavaa on ristiriitainen raportti koskien mahdollista roolia metformiinin ja syöpä. Bodmer ja työtovereiden totesi, että käyttö metformiinin ei liittynyt alentunut paksusuolisyövän riskin ja metformiinin myös ei muuttanut keuhkosyövän riskiä [10], [24]. On myös raportoitu, että ei ollut tilastollisesti merkitsevästi yhteydessä metformiinin altistumisen ja levitetään peräsuolen syövän diagnoosin [25]. Metfromin välttämättä toimi säännöllisesti kasvainsoluihin vaan työtä kantasoluja. On osoitettu, että metformiini voi valikoivasti tavoite syövän kantasoluja [26], ja toimivat yhdessä kemoterapian kanssa estää kasvaimen kasvua ja pidentää remission useita syöpäsolutyyppien [26], [27]. Metformiini voi myös estää tulehdusreaktion liittyy solujen transformaatio ja syövän kantasolujen kasvua [28]. Lisäksi metformiinin voi nopeuttaa kasvua BRAF V600E perustuva melanooma säätelemällä VEGF-A [29] ja edistää angiogeeninen fenotyyppi ERalpha negatiivinen MDA-MB-435 rintasyövän malli [30]. Kaiken metformiini voi vain olla vaikutuksia estämään kasvaimen aloittamisen mutta kun syöpä on todettu se ei saa olla vaikutusta. Tietomme osoittivat myös, että metformiini altistuminen ei estänyt peräsuolen syövän solujen kasvua, indusoi apoptoosin tai autophagy ja solusyklin pysähtymisen. Suostumuksella in vitro, in vivo osoitti, että metformiini ei tukahduttaa kasvaimen kasvua mutta AMPK aktivaattori AICAR syntynyt antituumorivaikutus. Siksi metformiini välttämättä ole antineoplastinen aktiivisuus CRC solujen monoterapiana.

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on AICAR välittyvät aktivoitumisen AMPK ja vähentämisestä mTOR signaloinnin [31]. AMPK aktivointi voi estää mTOR polku estävät solujen kasvua ja lisääntymistä. AICAR on raportoitu tehostavat tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden hoidon paikallisten ja metastasoituneen nenänielun karsinooma (NPC) [32]. AMPK aktivaattorit kuten AICAR tarjota terapeuttinen strategia hematologisten maligniteettien [33], [34]. Ensinnäkin, AICAR voi indusoida apoptoosia krooninen lymfaattinen leukemia solujen [35] ja tappaa krooninen myelooinen leukemia (KML) soluihin PKC riippuva induktio autophagic solukuoleman [36]. Toiseksi, AICAR on leukemiaa vaikutuksia BCR-ABL-ilmentäviä soluja [37] ja lapsuuden akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) solut [38]. Kolmanneksi AICAR voi aiheuttaa G (1) /S pidätyksen ja Nanog downregulation kautta p53 ja parantaa erytroidien erilaistuminen [39]. Lopuksi AICAR voi myös indusoida apoptoosia riippumatta AMPK ja p53 läpi ajan sääntely BH3 vain proteiineja BIM ja NOXA kroonisen lymfaattisen leukemian soluja [40]. Lisäksi NPC ja leukemia, AICAR on mukana hermo kantasolujen kasvua vaimentava ja solukierron pidättäneet alaspäin säätäminen fosfo-retinoblastoomaproteiiniin ja sykliini D [41]. AICAR voi estää kasvua retinoblastoomaa vähentämällä angiogeneesiä ja aiheuttamaan apoptoosin [42] tai aktivoitumista AMPK [43]. AICAR on myös osoitettu inhiboivan leviämisen EGFRvIII ilmentävien glioblastoma kautta AMPK reitin [44]. Lisäksi AICAR voidaan käyttää kliinisissä tutkimuksissa sydäntä suojaavan alle ATP-köyhdytettyä olosuhteissa ja sen on osoitettu olevan harjoituksen jäljittelevää eläimillä [45]. Suostumuksella Näiden tulosten kerroimme että AICAR voivat aiheuttaa apoptoosin syntyä antineoplastinen aktiivisuus. Lisäksi AICAR parannettu sytotoksista vaikutusta 5-FU kautta AMPK aktivoitumisen.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että käyttö metformiini yksinään ei liity selviytymisen tuloksia paksusuolen syöpäsolu mutta AMPK aktivaattori AICAR voi aiheuttaa apoptoosin ja syntyä antineoplastinen aktiivisuus. Lisäksi aktivointi AMPK voisi olla keskeinen syy, joka AICAR voi parantaa sytotoksista vaikutusta 5-FU: n peräsuolen syövän soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

paksu- sinoomasolulinjoja HCT116, RKO ja HT29 ostettiin ATCC (LGC Standards SLU, Barcelona, ​​Espanja). Solulinjoja pidettiin McCoyn 5A tai Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), ja 2 mmol /l L-glutamiinia, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Materiaalit

5-FU hankittiin Jinyao amino Acid Co., Ltd (Tianjin, Kiina). AICAR ja metformiinin ostettiin Sigma-Aldrich. Anti-fosfo-eIF2α ja fosfori-AMPK ostettiin Cell Signaling.

mittaus elinkykyyn ja apoptoosi

Solun elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille tasapohjaisille mikrotiitterilevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Aineet lisättiin annettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla (Synergy HT, Bio-Tek, USA) 570 nm: ssä.

Phartmingen anneksiini V-FITC Apoptosis Ddtection Kit I (BD, USA) käytettiin apoptoosin havaitsemiseen ja arviointi menettely suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. 2 x 10

6 solua ympättiin 6 cm: n maljalla. Sen jälkeen kun kiinnitys yön yli, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kasvualusta korvattiin väliaineessa 5 mM metformiinin tai 20 ug /ml 5-FU. Kaikki solut mukaan lukien kelluvien solujen viljelyväliaineeseen kerättiin. Solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään 1 × sitomispuskuria pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml. 100 ui solususpensiota sekoitettiin ku- takin 5 ui FITC anneksiini V: n ja 5 ui PI. Seosta inkuboitiin 15 min huoneenlämpötilassa pimeässä ja analysoitiin sitten FACSCalibur -virtaussytometrillä (BD Biosystems, Heidelberg, Saksa).

Soft-agar Colony muodostumisen määritys

500-soluja suspendoidaan väliaineeseen, joka sisälsi 0,3% alhaisen sulaa agaroosia, ympättiin kuuden kuoppalevyn peitettiin 0,5% matalan agaroosin sulattamiseksi, ja annettiin kasvaa 2 viikkoa 37 ° C: ssa 5% CO

2. Pesäkkeet, jotka sisältävät yli 50 solut laskettiin mikroskoopin alla. Kolme kaivot analysoitiin kussakin kokeessa.

Cell-syklin analyysi

Solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 200 ui: sitraattipuskurissa (250 mM sakkaroosi, 40 mM trinatriumsitraattia, 5% dimetyylisulfoksidia (DMSO), säädettiin pH-arvoon 7,6 40 mM etikkahappoa). Propidiumjodidia (40 ng /ml) lisättiin soluihin ja inkuboitiin 45 min ajan pimeässä 4 ° C: ssa ennen analyysiä.

Western blot -analyysi

Solut kerättiin viljellystä astiat ja lyysattiin lyysipuskurissa [20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% NP-40, 1% aprotiniini, 1 mM phenylemethylsulfonyl (PMSF), 1 mM natriumvanadaattia]. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce). Solulysaateista (40 ug proteiinia /linja) erotettiin 5-20% Tris-Tricine Ready Gel SDS-PAGE: lla (Bio-Rad) ja nitroselluloosakalvolle blottauksella. Blotatun membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 1 tunti ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla. Immunoreaktiivinen nauhat visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssin avulla piparjuuri perox-idase-konjugoidulla IgG sekundäärisiä vasta-aineita. Band tiheys mitattiin densitometrian, kvantifioidaan geeliä piirtämällä makroina NIH image 1.62 ja normalisoidaan ohjeellisella näytteen sama kalvo.

In vivo ihonalainen Kasvainmalli

Kaikki in vivo koeprotokollaa hyväksynyt eläinten hoito komitea Sir Run Run Shaw sairaala, Zhejiangin yliopistossa. Elinkelpoisia HCT116-solut (1 x 10

7cells 0,1 ml fosfaattipuskurisuolaliuoksessa) injektoitiin ihonalaisesti oikeaan selkäpuolen kupeeseen 6-viikkoisen naaras-BALB /c-nude-hiiriin (kuusi hiirtä ryhmässä). Kasvaimen tilavuus määritettiin välein 2 päivää ja 4 viikkoa. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavalla kaavalla: (lyhyt läpimitta)

2 x (pitkä halkaisija) /2.

Tilastollinen analysointi

Tulokset ilmaistaan ​​arvoina keskiarvo ± keskihajonta ( SD). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SPSS 11.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Suoritimme pariksi t-testiä (kaksisuuntainen) tilastollinen analyysi, tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05.