Krooninen sairaus

tiivistelmä

NPRL2, yksi tuumorisuppressorigeeneille asuvat 120 -kb homotsygoottinen deleetio alueella ihmisen kromosomin band 3p21.3, on korkea aminohapposekvenssihomologia typen kanssa permease säädin 2 (NPR2) hiivan geeni, ja mutaatioiden

NPRL2

hiivasoluissa liittyvät resistenssin sisplatiinia välittämiä solun tappaminen. Aikaisemmin osoitimme, että palauttaminen NPRL2 in NPRL2-negatiivisia ja sisplatiini-resistenttien solujen resensitize keuhkosyöpään solujen sisplatiinihoitoon

in vitro ja in vivo

. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että herkistyminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin sisplatiinia by NPRL2 onnistuu sääntelyn keskeisten komponenttien DNA-vaurioita tarkistuspiste reitin. NPRL2 voi fosforyloida ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) kinaasi aktivoidaan sisplatiinin ja edistää alavirtaan γ-H2AX muodostuminen

in vitro

ja

in vivo

, joka tapahtuu apoptoosin samanaikaisesti kuin ensimmäinen ulkonäkö korkea- molekyylipainon DNA-fragmentteja. Lisäksi tämä yhdistelmähoito johtaa korkeampiin Chk1 ja Chk2 kinaasitoiminta kuin tekee sisplatiinihoidolle vaan ne voidaan aktivoida Chk2 in keuhkopussin metastaasit -tuumoriksenografti hiirillä. Aktivoitu Chk1 ja Chk2 lisäävät ilmentymistä solusyklin Checkpoint proteiineja, mukaan lukien Cdc25A ja Cdc25C, mikä johtaa korkeampiin G2 /M-pysähtymisen kasvainsoluja käsiteltiin NPRL2 ja sisplatiinin kuin kasvainsoluissa sisplatiinia vain. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että ektooppinen ilmentyminen NPRL2 aktivoi DNA-vaurioita tarkistuspiste väylän sisplatiinin kestävä ja NPRL2-negatiivisia soluja; näin ollen, yhdistelmä NPRL2 ja sisplatiinin voi resensitize sisplatiinia nonresponders on sisplatiinihoitoon aktivoinnin avulla DNA-vaurio tarkistuspisteen polku, joka johtaa solujen pidätyksen G2 /M-vaiheen ja apoptoosin induktion. Suora seuraus tässä tutkimuksessa on, että yhdistelmä hoito NPRL2 ja sisplatiinin voi voittaa sisplatiinia kestävyys ja parantaa terapeuttista tehoa.

Citation: Jayachandran G, Ueda K, Wang B, Roth JA, Ji L (2010)

NPRL2

herkistää ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) Solut ja sisplatiinihoitoon säätelemällä Tärkeimmät komponentit DNA Repair Pathway. PLoS ONE 5 (8): e11994. doi: 10,1371 /journal.pone.0011994

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2009; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2010; Julkaistu: 05 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Jayachandran et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustusta National Cancer Institute, National Institutes of Health, SPORE P50CA70907, R01CA116322, ja MMHCC U01CA10535201; avustuksia puolustusministeriön keuhkosyöpään Program PROSPECT (DAMD17-02-1-0706); The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Support Core Grant (CA-16672); ja avustusta tupakka Settlement rahastoista soveliaita Texas valtion lainsäätäjä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

NPRL2 /Gene 21

(GenBank # AF040707), joka on 1351 bp pitkä ja koodaa proteiinia, joka on 380 aminohappotähdettä, on yksi tuumorisuppressorigeeneille tunnistettiin 120 -kb homotsygoottinen deleetio alueen ihmisen kromosomissa band 3p21.3 [1], [2]. Usein ja varhain heterotsygoottisuuden menetys ja päällekkäiset homotsygoottisia deleetioita havaittiin 3p21.3 alueella keuhko- ja rintasyöpiä viittaavat kriittinen rooli yhden tai useamman 3p21.3 geenien molekyyli- synnyssä näiden syöpien [1], [3] .

typpi permease säädin 2 (NPR2) hiivageeni (GenBank # P39923) tunnistettiin uutena osa liittyi solun tappaminen laukaisi sisplatiinia. Koska häiriöt NPR2 osoitettiin resistenssin sisplatiinia, uskottiin, että NPRL2 voivat käyttää samaa mekanismia välittää sytotoksisuutta syöpälääkkeiden [4]. Viime aikoina havaitsimme, että reexpression on NPRL2 in NPRL2-negatiivisia ja sisplatiini-resistenttien solujen merkittävästi resensitized vastetta näiden solujen sisplatiinihoitoon, mistä on osoituksena alentunut solujen elinkelpoisuus ja lisääntynyt apoptoosi

in vitro

ja

vuonna vivo

[5]. Kuitenkin molekyyli tapahtumia vastaava resensitization sisplatiiniin by

NPRL2

ei ole tunnistettu. Tässä tutkimuksessa yritämme ymmärtää molekyylitason yhteydestä NPRL2 ja sisplatiinin voittamisessa lääkeresistenssin.

vaikutukset Sisplatiinin välittyvät korkea DNA-vaurioita, mikä johtaa ohjelmoituun solukuolemaan tai solusyklin pysähtymiseen [6 ]. Kaksoisnauhaspesifisellä DNA katkoksia aiheuttama sisplatiinin välittyvät keskeinen DNA-vaurioita-signalointireitin ohjaa ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) kinaasia sekä useita muita DNA vaurioita reagoivaa kinaasien [7], [8]. Fosforylaatio ATM seriini-1981 on osoitettu fosfory- histoni H2AX [9], ja fosforylaatio histonien H2AX seriinin-139 (γ-H2AX) on välttämätöntä rekrytointi välittäjäaineiden, kuten MDC1 (välittäjänä DNA-vaurion tarkistuspisteen proteiini 1), 53BP1 (p53 sitova proteiini 1), BRCA1 (rintasyöpä 1), ja MRE11 (meioottisen rekombinaation 11) -RAD50 (säteilylle herkkiä 50) -NBS1 (Nijmegenin Murtumaoireyhtymä 1) kompleksi [10] – [13]. Fosfo-ATM helpottaa fosforylaatiota näiden välittäjäaineiden, ja muodostumista ydinvoiman pesäkkeitä aktivoitua molekyylien edistää siirto DNA-vaurio signaalin loppupään tavoitteita, kuten Chk1 (tarkista kohta kinaasi 1), Chk2 (Check Point kinaasi 2), ja SMC1 (rakenteellinen kunnossapito kromosomien 1) [14] – [16]. Chk1 ja Chk2 vaikuttavat eri DNA-vaurioita vasteita, kuten solukierron tarkastuspiste, genomin huolto, DNA: n korjaukseen, ja apoptoosin [17].

Siksi arveltu, että herkistymistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin sisplatiinia by NPRL2 saattaa johtua suoraan asetuksen keskeisten komponenttien DNA-vaurioita tarkistuspiste reitin. Tämän hypoteesin testaamiseksi, olemme analysoineet vaikutuksia ektooppinen ilmentyminen NPRL2 läsnä ollessa tai poissa ollessa DNA: ta vaurioittavien sisplatiinia kasvainsolujen kasvua ja apoptoosia paneelia NSCLC solulinjojen kanssa vaihteli tilan endogeenisen NPRL2 geenin ja proteiinin ilmentymistä ja sisplatiinia herkkyys. Osoitamme, että reexpression of NPRL2 in NPRL2-negatiivisia ja sisplatiini-resistenttien solujen merkittävästi aktivoi ne keskeiset komponentit, kuten ATM, Chk, ja H2AX ja herkistää keuhkosyöpään solujen sisplatiinihoitoon

in vitro

ja

vuonna vivo

, mikä johtaa solusyklin pidätyksen G2 /M vaiheessa ja apoptoosin induktion. Havainnot Tämän tutkimuksen lainaavat kokeellista tukea meidän hypoteesia, että NPRL2 voivat toimia paitsi ennustetyövälineenä biomarkkeri herkkyyttä sisplatiinin, vaan myös terapeuttisena aineena resensitizing nonresponding syöpäsoluja sisplatiinia.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja soluviljelmä

ihmisen NSCLC solulinjat H1299 [5] ja H322 [5], jossa eri 3p21.3 asema kuvattu aiemmin [18], [19], olivat käyttää

in vitro

ja

in vivo

kokeita. H1299 ja H322 ovat sisplatiini-resistenttejä (50% estävä pitoisuus [IC

50] ja IC

20-arvot sisplatiinin H1299 olivat 7,6 ja 3,0 uM, ja H322 olivat 13,1 ja 5,0 uM, tässä järjestyksessä, kuten arvioitiin XTT-määritys) ja eivät ilmaise NPRL2 proteiinia (arvioituna Western-blottauksella) [5]. Sisplatiini-herkkä NSCLC solulinjassa H1437 ja sisplatiini kestävä solulinjaa H1437R on kuvattu aikaisemmin [5].

Antibodies, reagenssit, ja annostus

Anti-ATM (5C2), anti- Chk1 (G-4), anti-Chk2 (H-300), anti-Cdc25A (F-6), anti-sykliini B1 (GNS1), ja anti-kaspaasi-2 (H-19) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-Chk1 (Ser345), anti-fosfo-Chk2 (Thr68), anti-fosfo-Chk1 (Ser345), anti-NBS1, anti-fosfo-NBS1 (Ser343), anti-SMC1, anti-fosfo-Cdc25C ( Ser216), anti-fosfo-Cdc2 (Tyr15), anti-kaspaasi-3, ja anti-kaspaasi-9 ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-ATM proteiinikinaasi pS1981 oli Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA), anti-fosfo-histoni H2AX (Ser139) oli Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), anti-fosfo-SMC1 oli peräisin Novus Biologicals (Littleton, CO) ja anti-kaspaasi-8 ja anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) olivat BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).

kaikki Western blotting, anti-β-aktiini (Sigma , St. Louis, MO) käytettiin latauskontrollina. Sisplatiini ostettiin Bristol-Myers Squibb Company (Princeton, NJ). DOTAP käytettiin transfektoimaan plasmidivektorit ja H1299 ja H322-soluissa. Sisplatiinihoitoon oli aina annettiin solujen IC

20 annosta (5). DOTAP: kolesteroli (DOTAP: Chol) (20 mmol) 5% glukoosi veteen, jota käytetään

in vivo

kokeissa syntetisoitiin meidän laboratoriossamme käyttämällä standardimenetelmiä aiemmin kuvattu [5].

plasmidin ilmentävät NPRL2

NPRL2-cDNA leikattiin plasmidista pAd-RAP-NPRL2 [2], joka sisälsi ihmisen NPRL2 cDNA: ta ja ligoitiin multikloonauskohdan on pdCpG-KGB2 ekspressiovektoriin. Kloonausstrategiaan on kuvattu aiemmin [5]. Tyhjän vektorin (pdCpG-KGB2) ja plasmidivektori joka ilmentää LacZ-geeniä, käytettiin negatiivisina kontrolleina. Olimme aikaisemmin ilmoittaneet, että transfektio tällä NPRL2 vektori voidaan todellakin ilmaista eksogeenista NPRL2 proteiinia

in vitro

ja

in vivo

[5] käyttäen anti-NPRL2 vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA ).

immunofluoresenssi ja virtaussytometristen analyysejä γ-H2AX

Immunofluoresenssikoe värjäys suoritettiin soluissa viljellään kammiossa dioja. Nimetyissä ajankohtina, H1299-soluja käsiteltiin NPRL2 kanssa tai ilman sisplatiinia kiinnitettiin 10% formaliinilla, ja inkuboitiin anti-fosfo-histoni H2AX (Ser139) (1:100) vasta-aineita 5%: fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen soluja inkuboitiin aasin anti-hiiri-IgG-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (Santa Cruz Biotechnology) laimennettiin 1:100 PBS: ssa 45 min, ja näytteet asentaa Vectashield asennus väliainetta, jossa 4 ’, 6-diamidino- 2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) ja vastavärjäämiseksi ytimet. Heti, objektilasit tutkittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Lisäksi, inkuboinnin jälkeen FITC-vasta-ainetta, solut otettiin talteen, ja FITC-positiiviset solut laskettiin virtaussytometria-analyysin.

Chk1 ja Chk2 kinaasiaktiivisuuden määrityksellä

Chk1 ja Chk2 kinaasiaktiivisuutta H1299-soluja käsiteltiin NPRL2 kanssa tai ilman IC

20-arvo sisplatiinin arvioidaan käyttämällä K-LISA Checkpoint Activity Kit (EMD Biosciences, San Diego, CA), joka on entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) -pohjainen aktiivisuuden määritys. Lyhyesti, H1299-solut maljattiin 60 mm: n annoksia 4 x 10

5 solua per malja ja seuraavana päivänä käsiteltiin 4 ug tyhjän vektorin tai NPRL2 kanssa tai ilman 3,0 uM sisplatiinia. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen lysaatit valmistettiin käyttämällä radioimmunosaostuskokeella (RIPA) /PBS-puskurissa (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaatti [SDS]). Solulysaateista (0,5 ml yhteensä proteiinikonsentraatio 2 mg /ml) esi-poistetaan lisäämällä 15 ui Protein A /Protein G-Plus agaroosihelmiin (Santa Cruz Biotechnology), ja inkuboitiin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen esipuhdistettiin lysaatit siirrettiin uuteen putkeen 20 ui Chk1 tai Chk2 vasta-aineen ja pyöritettiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Seuraavaksi 50 ui proteiini A /proteiini-G-Plus -agaroosihelmien lisättiin ja pyöritettiin 90 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Agaroosi helmet pestiin RIPA /PBS-puskurilla, ja K-LISA Checkpoint Activity Kit käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aktiivisuus määritettiin lukemalla absorbanssi kahdella aallonpituudella 450 ja 570 nm: ssä, jossa käytetään tavanomaista ELISA-levyn lukijalla.

Generation stabiilien kloonien keuhkosyövän solulinjat lyhyen häiritseviä RNA-välitteisen Chk2 geenien

Voit luoda solulinjoja vakaa knockdovvn Chk2 ilmaisun, me aluksi seulotaan neljä lyhyttä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) kloonattu kaksinkertainen (U6-H1) promoottori ekspressiovektoreita ostettu System Biosciences (Mountain View, CA). Lyhyesti, vektori hajotettiin Bbsl ja liitettiin hehkutettu Chk2 siRNA suunniteltu perustuu web-pohjaisilla työkaluilla. Kaikki sense oligot oli AAAG 5′-päähän, ja kaikki antisense-oligot oli AAAA-sekvenssin 5′-päähän. Olemme myös mutantti kontrollina. Sekvenssit olivat seuraavat: CHK2Si1: 5’aaagGAACCTGAGGACCAAG3 ’; CHK2ASi1: 5’aaaaCTTGGTCC TCAGGTTC3 ’; CHK2Si2: 5’aaagCGCCGTCCTTTGAATA 3 ’; CHK2ASi2: 5’aaaaTATTC AAAGGACGGCG3 ’; CHK2Si3: 5’aaagAACGGTATTATACAC CHK2ASi3: 5’aaaaGTG TATAATACCGTT 3 ’; CHK2Si4: 5’aaagAGTTTCAAGATCTTCTGTC 3 ’; CHK2ASi4: 5’a aaaGACAGAAGATCTTGAAACT 3 ’; CHK2Simta: 5’aaagGCTAGCTAGTCGATC 3 ’; CHK2Simtb: 5’aaaaGATCGACTAGCTAGC3 ”. Stabiileja klooneja valitaan käyttöä puromysiinin (1 ug /ml); ja kun ne on perustettu, ne seulottiin ekspressiotasot Chk2 proteiinin suhteessa kontrolliin. Klooni, jossa oli paras äänenvaimennusvaikutus (CHK2Si1 ja CHK2ASi1) valittiin toiminnallisia tutkimuksia.

ohimenevä vaiennettu NPRL2 geenien ilmentyminen keuhkosyövässä solulinjoissa.

ohimenevä knockdovvn NPRL2 ilmaisun, käytimme synteettinen kaksijuosteinen siRNA kohdistaa NPRL2 koodaavan mRNA-sekvenssin ja vastaavan sekoitetun siRNA: ita käytettiin ei-spesifisenä valvontaa. SMART-allas neljä On-kohde NPRL2-spesifisiä siRNA: ita käytettiin tässä tutkimuksessa: kohdesekvenssien olivat 5’GCAUCGAACACAAGAAGUA 3 ’, 5’GCAAGACAGGCAUGAGCUA 3’, 5’GUACUACGGCGUUGUGACA 3 ’, ja 5’GAC CCAAGAUCACCUAUCA 3’. Nämä siRNA: t hankittiin Dharmacon (Lafayette, CO). H1299-solut kotransfektoitiin NPRL2 ekspressoivat plasmidia ja NPRL2-siRNA: t, ja tyhjät plasmidivektori ja muokkaamalla siRNA: ita käytettiin kontrolleina vastaavasti. -Solut transfektoitiin ensin NPRL2 plasmidivektorin käyttäen Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) ja 2,5 ug DNA: ta ja 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle. Kuusi tuntia sen jälkeen, kun plasmidin transfektion, solujen elatusaine korvattiin tuoreella ilman antibiootteja ja solut transfektoitiin siRNA: illa, käyttämällä DharmaFECT transfektioreagenssia 50 uM siRNA kompleksoitu 5 ui DharmaFECTper hyvin edellä 6-kuoppalevylle. Solut kerättiin 24, 48, ja 72 tuntia transfektion jälkeen valmistamiseksi raakavalkuaisen lysaattien Western blot -analyysiin.

Immunosaostaminen-Western blot -analyysit

H1299-soluja käsiteltiin 4 ug tyhjällä vektorilla tai NPRL2 kanssa tai ilman 3,0 uM sisplatiinia. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen lysaatit valmistettiin käyttämällä RIPA /PBS-puskurissa (1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS). Blokkaamisen jälkeen 1 ug: lla normaalia IgG: n ja 20 ui proteiini A /proteiini-G-Plus agaroosihelmiin (Santa Cruz Biotechnology), proteiini immunosaostettiin 500 ug uutteista käyttämällä 2 ug anti-Cdc2 tai anti-sykliini B1-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) ja 30 ui proteiini A /proteiini-G-Plus -agaroosihelmien 5 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Agaroosi kerättiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin sitten neljä kertaa jääkylmällä PBS-puskuria. Seuraavaksi immunosaostumat suspendoitiin uudelleen 1 x SDS-näytepuskuria ja kuumennettiin 50 mM DTT: n kanssa 95 ° C: ssa 5 min; Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20].

analyysi solusyklin kinetiikkaan

Muutoksia solusyklin kinetiikkaan tuumorisoluissa käsiteltiin NPRL2 kanssa tai ilman sisplatiinia analysoitiin virtaussytometrialla (jossa käyttö fluoresenssi-solulajittelijaa [FACS]) käyttäen APO-BrdU-KIT (BD Biosciences Pharmingen). Lyhyesti, solut maljattiin 60 mm: n annoksia 4 x 10

5 solua maljaa kohti; Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 4 ug tyhjän vektorin tai NPRL2 ilmentävän vektorin kanssa tai ilman sisplatiinia. Nimetyissä ajankohtina, solut kerättiin ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydi. Liittämisen jälkeen 5-bromi-2′-deoksiuridiini-5′-trifosfaattia (BrdUTPs), solut tehtiin näkyviksi käyttämällä FITC-leimattua anti-BrdU-vasta-ainetta. Määrä solun kokonais-DNA saatiin värjäämällä solut PI /RNaasia. Soluja käsiteltiin FACS analyysi pääte deoxynucleotidyltransferase välittämä deoksiuridiinista 5-trifosfaatiksi (dUTP) nick-end merkinnät (TUNEL värjäys) määrittää solusyklin kinetiikkaan, kuten aiemmin on kuvattu [20].

Eläinkokeissa

Kaikkia eläimiä pidettiin ja kokeet suoritettiin National Institutes of Health ja institutionaalisten ohjeiden perustettu Animal Core Facility The University of Texas MD Anderson Cancer Center. Eläimiä käytettiin tässä tutkimuksessa oli naisia ​​

Nu /nu

hiiriä (4-6 viikon iässä), jotka hankittiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Ennen tuumorisoluinokulaatiosta, hiiret altistettiin 3,5 Gy koko kehon säteilyn cesium-137 säteilylähde kokonaan tehdä immuunijärjestelmän nude-hiirten välillä hylkäämisestä kasvaimen ksenografti. Tehokkuuden arvioimiseksi systeemisen annon NPRL2 ja sisplatiinin käytettäessä potilaalle tehdä mallin keuhkopussin levittämisen, hiiret saivat rintaonteloon injektiona (27 neulan) suspensiota H322 soluja tiheydellä 2 x 10

6 solua 100 ui. Hiiret jaettiin satunnaisesti seuraaviin 4 ryhmään: A, käsiteltiin LacZ; B, käsiteltiin LacZ ja sisplatiinin; C, käsiteltiin NPRL2; ja D, käsiteltiin NPRL2 ja sisplatiinin. Jokainen hoitoryhmä koostui 2 hiirtä.

Päivänä 26, voimme antaa eri nanohiukkasten (DOTAP: Chol-DNA-kompleksi) laskimonsisäisesti häntälaskimoihin Kaikkien hiirten annoksella 25 ug plasmidi-DNA: ta (LacZ tai NPRL2 plasmidi) ja 10 nmol DOTAP: Chol kukin 100 ui 5% glukoosi veteen hiirtä kohti. Ryhmissä B ja D, me injektoitiin sisplatiinia (2,5 mg /kg) intraperitoneaalisesti yhdessä nanohiukkasia. Arvioida γ-H2AX ja fosfo-Chk2 (Thr68) ilmentyminen kasvaimissa, hiiret sscrificed 48 tuntia myöhemmin, ja keuhkopussin kasvaimet (suurempia kuin 5 mm) kunkin ryhmän sattumanvaraisesti talteen ja flash-jäädytettiin. γ-H2AX ilmentyminen arvioitiin anti-fosfo-histoni H2AX (Ser139) (1:100) vasta-aine, ja aasin anti-hiiri-IgG-FITC: llä. Sitten näytteet asennettu Vectashield DAPI vastavärjäämiseksi ytimet. Heti, objektilasit tutkittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia. Myös fosfo-Chk2 ilmentyminen analysoitiin anti-fosfo-Chk2 (Thr68) vasta-aine (1:100) käyttäen Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories) ja sitten mikroskooppisesti.

Tilastolliset analyysit

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa kahtena tai kolmena kappaleena näytteitä. ANOVA ja Fisherin testiä käytettiin vertaamaan arvot testin ja kontrollinäytteestä.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. StatView 5.0 ohjelmisto (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) käytettiin kaikkia tilastollisia analyysejä.

Tulokset

induktio kaspaasi toiminnan vaikutus hoitoon NPRL2 ja sisplatiinin

NPRL2 herkistää sisplatiini-resistenttien solujen (H1437R) ja sisplatiinin indusoiman apoptoosin (kuvio 1A). Lisääntynyt apoptoosi havaittiin kaikissa kolmessa NPRL2-negatiivinen, sisplatiini-resistenttejä solulinjoja käsiteltiin pakko ilmentymisen NPRL2 ja sisplatiinia. Kuten kuviossa 1A on esitetty, apoptoosia indusoitiin 33,4%, 42,0%, ja 21,8% ja H1437R, H1299 ja H322-soluissa, vastaavasti, sen jälkeen, kun yhdistetyt hoidot. Käytimme myös Western blotting määrittämiseen aktivaatio caspases vuonna H1299 käsitellyissä soluissa tyhjän vektorin, tyhjä vektori plus sisplatiini, NPRL2 tai NPRL2 ja sisplatiinin (kuvio 1 B). Kaspaasi-3-, -8, ja -9 aktivoitiin vain H1299: lla käsiteltyjen solujen NPRL2 ja sisplatiinin, kuten on esitetty pilkkoutumistuotteet. Kaspaasi-2 havaittiin soluissa, sisplatiinia tai NPRL2 yksinään sekä yhdistelmä.

(A) Apoptoosin indusointi H1299 käsiteltyjen solujen NPRL2 läsnä ollessa tai poissa ollessa sisplatiinin (CDDP) virtaus- cytometry analyysi TUNEL värjäys. PBS käsitelty ja tyhjän vektorin (EV) käsiteltyjä soluja käytettiin mock ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti. Virhe palkit osoittavat SDS keskiarvosta kolmessa erillisessä kokeiden (*,

P

0,05; **,

P

0,0005). (B), kaspaasi cascades in H1299 soluissa Western blot-analyysi. Useat caspases in H1299 soluissa tutkittiin Western blottauksella 72 tuntia käsittelyn jälkeen tyhjän vektorin (EV) (tai ilman sisplatiini) tai NPRL2 (tai ilman sisplatiini). Käsitellyissä soluissa NPRL2 ja sisplatiinin, kaspaasit-3, -2, -8, ja -9 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkottiin. Myös kaspaasi 2 aktivoitiin käsittelemällä vain NPRL2.

aktivointi ATM ja NBS1 tekijänä NPRL2

Käytimme Western blotting-analyysi arvioida aktivoinnin ATM H1299 soluissa vastauksena ektooppinen aktivaatio NPRL2 läsnä ollessa tai poissa ollessa sisplatiinin (kuvio 2A). Vuonna H1299-solut transfektoitiin NPRL2, olemme havainneet alhainen fosfori-ATM (Ser1981), joka oli aktivoitu ATM-kinaasin; hoidon jälkeen NPRL2 ja sisplatiinin, fosfori-ATM tason lisääntyy selvästi ajasta riippuva tavalla. Vuonna H1299 solut käsiteltiin tyhjän vektorin ohjaus ja sisplatiini, emme havainneet mitään muutosta fosfori-ATM ilmentymisen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Tutkimme myös ilmentymisen fosfo-NBS1 (Ser343) (kuvio 2A), joka on fosforyloitu aktivoitu ATM ja rekrytoidaan DNA-vaurion kohdissa edistää lähetyksen sarja DNA-vaurion alavirran kohteisiin. Vaikka fosfo-NBS1 ei havaittu H1299 käsitellyissä soluissa tyhjän vektorin ja sisplatiini, se havaittiin H1299 soluissa käsitelty NPRL2, ja huomattavasti lisääntynyt ajasta riippuva tavalla hoidon jälkeen NPRL2 ja sisplatiinin.

( A), vaikutukset ektooppinen ilmentyminen NPRL2 ilmentymiseen ja fosforylaatiota ATM ja NBS1 proteins.H1229 soluja käsitellään tyhjällä vektorilla (EV) vektori ja IC

20 sisplatiinin (3,0 uM), NPRL2 tai NPRL2 ja IC

20 sisplatiinin otettiin talteen 24, 48 ja 72 h käsittelyn jälkeen ja analysoitiin ilmentymisen ataksia teleangiektasia mutatoituneen (ATM) kinaasi, fosfo-ATM (Ser1981), NBS1, ja fosfo-NBS1 (Ser343). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Kohonneita fosfo-ATM ja fosfo-NBS1 havaittiin soluissa, joita käsiteltiin NPRL2 tai NPRL2 ja sisplatiinin ajasta riippuva tavalla, mutta ei soluissa käsitelty kontrolli tyhjän vektorin ja sisplatiinia. (B), Effects of NPRL2-spesifisten siRNA (Si) ekspressiosta NPRL2 ja ATM proteiinien läsnä ja poissa ollessa sisplatiini (CDDP). Salattu siRNA (Sc) käytettiin epäspesifisen ohjaus.

spesifisyys NPRL2 aktivaatiota ATM-signalointireitin vahvistettiin lisäksi kokeellisesti geenispesifisiä siRNA: t ja pudotus NPRL2 ilmentymisen läsnä ollessa ja puuttuessa sisplatiinin näissä H1299-soluissa (kuvio 2B). Kohdunulkoinen aktivointi NPRL2 in NPRL2 puutosta H1299-solut aktivoituvat ATM, kuten on osoitettu ilmen- tymisen lisääntymisen fosfo-ATM ilmentymisen 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua transfektion sekä läsnäollessa ja ilman sisplatiinia. Knockdovvn NPRL2 ilmentymisen NPRL2-spesifisten siRNA: iden vähentää tai vähentynyt NPRL2-välitteistä säätelyä fosfo-ATM ilmentymisen, verrattuna käsiteltiin salattu siRNA ohjaa samanaikaisesti pistettä.

NPRL2 parantaa ilmentymistä γH2AX

in vitro

ja

in vivo

Käytimme Western blotting jonkin aikaa kurssin arviointi γ-H2AX proteiinin ilmentymisen (kuvio 3A). Vuonna H1299 solut käsitellään tyhjällä vektorilla ja sisplatiini tai NPRL2, γ-H2AX proteiini nousivat ja olivat samat 24 ja 48 tunnin kuluttua hoidon. Kuitenkin 72 h γ-H2AX proteiinin tasot soluissa käsitellään tyhjällä vektorilla ja sisplatiini väheni merkittävästi, kun taas pitoisuudet käsitellyissä soluissa NPRL2 pysyi lähes samana kuin nyt 24-tunnin ja 48-tunnin ajankohtina. Käsitellyissä soluissa yhdistelmä NPRL2 ja sisplatiinin, γ-H2AX proteiinin tasot nousivat ajassa riippuvalla tavalla.

H1229-soluja käsiteltiin tyhjällä vektorilla ja IC

20 Sisplatiinin (3,0 uM) , NPRL2 tai NPRL2 ja IC

20 sisplatiinin otettiin talteen 24, 48 ja 72 h käsittelyn jälkeen. (A) Western blot osoittaa merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen ja γ-H2AX käsitellyissä soluissa NPRL2 ja sisplatiinin verrattuna käsiteltyjä soluja tyhjällä vektorilla ja sisplatiinia. (B) γ-H2AX ilmentyminen tutkittiin 48 h käsittelyn jälkeen immunofluoresenssivärjäyksen ja virtaussytometria-analyysiä. γ-H2AX ekspressiota havaittiin soluissa, joita käsiteltiin tyhjällä vektorilla ja sisplatiini tai NPRL2, mutta ei soluissa, joita käsiteltiin tyhjän vektorin vain, ja tämä ekspressio paranee dramaattisesti käsitellyissä soluissa NPRL2 ja sisplatiinia. Suurennus: x 800. Tarkoittaa fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) intensiteetti tutkittiin myös 24, 48, ja 72 h käsittelyn jälkeen. Näissä kolmessa ajankohtina, γ-H2AX ilmentymistä soluissa käsitelty NPRL2 ja sisplatiinin oli huomattavasti suurempi kuin soluissa kaikissa muut hoidot (

P

0,02 tai

P

0,0005 ). Bars, SDS keskiarvon kahdessa yksittäisissä kokeissa. (C) γ-H2AX ilmentyminen analysoitiin immunofluoresenssivärjäyksen käytettäessä potilaalle tehdä malli H322 keuhkopussin levittämistä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Keuhkopussin syöpäsolujen hoidetuilla hiirillä LacZ ja sisplatiinin tai NPRL2 oli heikosti värjättiin; sen sijaan, γ-H2AX on hyperexpressed käsitellyissä soluissa NPRL2 + sisplatiini. Suurennus: x 400.

Seuraavaksi, immunofluoresenssivärjäyksen ja virtaussytometria analyysi γ-H2AX ilmentymistä 48 h kuluttua käsittely suoritettiin (kuvio 3B). Expression of γ-H2AX proteiinin ilmentyminen tumien käsiteltyjen solujen sekä NPRL2 ja sisplatiini parannettu verrattuna kaikissa muissa ryhmissä. Lisäksi keskimääräinen FITC intensiteetti NPRL2 ja sisplatiinihoitoon oli merkittävästi koholla verrattiin kaikkien muiden hoitojen (

P

0,02) aikana kurssin.

γ-H2AX -proteiiniekspressio sitten mitataan ihmisen NSCLC H322 potilaalle tehdä keuhkopussin -tuumoriksenografti hiirillä. H322 solulinja on NPRL2-negatiivinen ja sisplatiini kestävä. 26. päivänä sen jälkeen, kun rinta injektion H322-solujen, me antaa NPRL2 tai LacZ nanohiukkasten häntälaskimoon kanssa tai ilman vatsaonteloon sisplatiinia injektio. Keuhkopussin kasvainten käsitellyillä hiirillä LacZ yhdessä sisplatiinin tai NPRL2 heikosti värjättiin γ-H2AX (kuvio 3C). Kasvaimet käsiteltiin NPRL2 ja sisplatiinin osoittivat korkeita γ-H2AX (kuvio 3C).

aktivointi Chk1 ja Chk2 mukaan NPRL2 ja sisplatiinin

in vitro

ja

in vivo

tutki fosforylaatio Chk1 on Ser-345 ja Chk2 on Thr-68 Western blottauksella (kuvio 4A). Vuonna H1299-soluja käsiteltiin tyhjällä vektorilla ja sisplatiini tai NPRL2, fosforyloitu Chk1 lisääntynyt aika-riippuvaisella tavalla. Käsitellyissä soluissa NPRL2 ja sisplatiinin, Chk1 ilmentymistä huomattavasti. Vaikka fosforyloituu Chk2 ei havaittu H1299 käsitellyissä soluissa tyhjän vektorin ja sisplatiini, se selvästi lisääntynyt ajasta riippuva tavalla käsitellyissä soluissa NPRL2 tai NPRL2 sisplatiinin kanssa. Arvioimme fosfo-Chk2 proteiinin ilmentymistä ortotooppisten tuumoriksenografteja immunohistokemiallisella värjäyksellä kasvainsolujen kunkin ryhmän (kuvio 4B). Kasvainsolut hiiristä hoidettiin LacZ tai LacZ ja sisplatiinin oli hyvin matalan tason värjäystä. Kasvaimia käsiteltiin NPRL2, fosfo-Chk2 ilmentymistä havaittiin matalalla tasolla (kuvio 4B). Hoito yhdistelmällä NPRL2 ja sisplatiinin aiheuttama korkea fosfo-Chk2 ilme.

(A) H1229 käsiteltyjä soluja tyhjän vektorin ja IC

20 sisplatiinin (3,0 uM), NPRL2 tai NPRL2 + IC

20 sisplatiinin otettiin talteen 24, 48 ja 72 h käsittelyn jälkeen ja analysoitiin ilmentymisen Chk1, P-Chk1 (Ser345), Chk2, ja P-Chk2 (Thr68). Käsitellyissä soluissa tyhjällä vektorilla ja IC

20 Sisplatiinin tai NPRL2, P-Chk1 lisääntynyt aika-riippuvaisella tavalla. Sen sijaan niissä käsitellään NPRL2 ja IC

20 Sisplatiinin, P-Chk1 dramaattisesti parannettu. Vaikka P-Chk2 ei havaittu H1299 soluissa käsitellään tyhjällä vektorilla ja IC

20 Sisplatiinin, se oli selvästi lisääntynyt ajasta riippuva tavalla saaneilla NPRL2 tai NPRL2 + IC

20 Sisplatiinin. (B) P-Chk2 ilmentyminen immunohistokemiallisesti analysoitu potilaalle tehdä malli H322 keuhkopussin levittämistä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. P-Chk2 ilmentyminen hieman havaittiin keuhkopussin kasvainsoluja hiirille on NPRL2 nanohiukkasten, mutta ei niissä käsitelty LacZ tai LacZ + sisplatiini. Sen sijaan hoitoa NPRL2 nanohiukkasten ja sisplatiinin aiheuttama korkea fosfo-Chk2 ilmentymistä kasvainsoluissa. Suurennus: × 400. (C) kinaasiaktiivisuuden Chk1 ja Chk2 in H1299 käsitellyissä soluissa tyhjän vektorin + IC

20 Sisplatiinin, NPRL2 tai NPRL2 + IC

20 Sisplatiinin analysoitiin käyttämällä K-LISA Checkpoint Activity Kit , entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) -pohjaisen aktiivisuusmäärityksellä. Chk1 kinaasiaktiivisuutta oli suurempi käsitellyissä soluissa NPRL2 + sisplatiini kuin käsitellyissä soluissa tyhjällä vektorilla tai tyhjän vektorin + sisplatiini (

P

0,003). Chk2 kinaasiaktiivisuutta voimakkaammin parannettu käsitellyissä soluissa NPRL2 tai NPRL2 + sisplatiini kuin käsitellyissä soluissa tyhjällä vektorilla tai tyhjän vektorin + sisplatiini (

P

0,0001). Bars, SDS keskiarvon neljässä yksittäisten kokeiden.

mitattiin myös kinaasiaktiivisuutta Chk2 ja Chk1 in H1299 käsitellyissä soluissa NPRL2 tai ilman sisplatiinin käytön yhteydessä K-LISA Checkpoint Activity Kit ELISA-pohjainen kinaasiaktiivisuuden määrityksellä. Chk2 kinaasiaktiivisuuden soluissa, joita käsiteltiin NPRL2 tai NPRL2 ja sisplatiini voimakkaasti tehostetun verrattiin aktiivisuus soluissa, joita käsiteltiin tyhjällä vektorilla tai ilman sisplatiinia (

P

0,0001) (kuvio 4C). Chk1 kinaasiaktiivisuuden soluissa käsitelty NPRL2 ja sisplatiinia oli vahvempi kuin käsitellyissä soluissa tyhjällä vektorilla tai ilman sisplatiinia (

P

0,003) (kuvio 4C).

määritellä tarkemmin luonne Chk2 vuorovaikutusta NPRL2, olemme analysoineet vaikutuksia NPRL2 ja Chk2 ilme apoptoosin avulla Chk2-erityisiä siRNA (kuvio 5A) kaataa Chk2 ilmentymistä sisplatiini kestävä H1437-solut (H1437R) (kuvio 5B). β-aktiini käytettiin latauskontrollina.