Krooninen sairaus

tiivistelmä

Synaptonemal monimutkainen proteiini 3 (SCP3), jäsen COR1 perhe, on säädelty eri syöpäsoluissa; kuitenkin, sen onkogeeninen ja kliinistä merkitystä ei ole vielä tunnettu. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onkogeenisiä roolia SCP3 ja sen suhteesta fosforyloidun AKT (Pakt) kohdunkaulan neoplasioihin. Toiminnallista roolia SCP3 ilmaisun tutkittiin yli-ilmentyminen tai knockdovvn SCP3 hiiren solulinjassa NIH3T3 ja ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa CUMC6, SiHa-, CaSki-, ja HeLa molemmat

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi tutkimme SCP3 ilmentyminen kasvaimen yksilöitä 181 kohdunkaulan syövän ja 400 CIN-muutos (CIN) potilasta immunohistokemiallisesti ja analysoidaan korrelaatio SCP3 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä tai selviytymistä. Yliekspressio SCP3 edistetään AKT-välitteinen kasvaimien syntyyn sekä

in vitro

ja

in vivo

. Toiminnalliset tutkimukset käyttäen NIH3T3-soluja, osoitti, että C-terminaalinen alue ihmisen SCP3 on tärkeää AKT aktivointia ja onkogeeninen. Korkea ilmentyminen SCP3 merkitsevästi liittyvä kasvain vaiheessa (

P

= 0,002) ja kasvaimen (

P

0,001), kun taas SCP3 ilmentyminen positiivisessa yhteydessä Pakt proteiinin taso kohdunkaulan neoplasioihin . Survival kertaa potilaille, joilla on kohdunkaulan syöpä yli-ilmentävät sekä SCP3 ja Pakt (mediaani, 134,0 kuukautta,

n

= 68) olivat huomattavasti lyhyempi kuin potilailla, joilla on alhainen ilmentyminen joko SCP3 tai Pakt (161,5 kuukautta, n = 108) määritettynä monimuuttujamenetelmin (

P

= 0,020). Tuloksemme viittaavat siihen, että SCP3 on tärkeä rooli etenemistä kohdunkaulan syövän kautta AKT signalointireitin, joka tukee sitä mahdollisuutta, että SCP3 voi olla lupaava uusi syövän kohde kohdunkaulan syövän hoidossa.

Citation: Cho H, Noh KH, Chung JY, Takikita M, Chung EJ, Kim BW, et ai. (2014) Synaptonemal Complex Protein 3 Onko Prognostiset Marker kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 9 (6): e98712. doi: 10,1371 /journal.pone.0098712

Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 28 syyskuu 2013; Hyväksytty: 06 toukokuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Cho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Research Foundation of Korea (2012R1A2A2A01007527, 2012R1A6A3A01010537, 2011-0005230, 2011-0010286 ja 2011-0007146), Korea Healthcare Technology R Lääketieteellisen teknologian kehityksen ohjelma opetus-, tiede- ja teknologia, Korea (https://www.kgcb.or.kr). Kaikki kasvain kudokset histologisesti tarkistetaan ja vain yksilöitä riittävän runsaasti kasvainsolujen sisällytettiin kudoksessa microarray rakentamiseen. Staging suoritettiin kansainvälisen liiton Gynecology and Obstetrics (FIGO) lavastus järjestelmä. Ensisijainen hoito invasiivisen kohdunkaulan syövän koostui tyypin 3 radikaali kohdunpoisto lantion imusolmuke leikkelyn. Samanaikaiset Platinum-pohjainen chemoradiation annettiin tapauksissa kohonnut toistuminen, kuten positiivinen resektio marginaalit, positiivinen imusolmukkeet, tai parametrial invaasio. Potilastietoja tarkasteltiin saadakseen tietoja kuten ikä, kirurgisen, elinaika, ja selviytyminen tila. Hoitovaste arvioitiin mukaan Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST; versio 1.0), joko tietokonetomografialla tai magneettikuvaus [11]. Tiedot kasvaimen kokoa, solutyyppi, kasvaimen, ja imusolmuke etäpesäke saatiin tarkistamalla patologiaraporteista. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Institutional Review Boards (Sisäiset asiakasriskiluokitukset) Gangnam Severance Hospital ja Office of ihmiskoe National Institutes of Health (NIH).

Muodosta of SCP3 ja sen Deleetiomutantin ilmentämisvektoreita

hSCP3 koko ja deleetiomutantit luotiin PCR-pohjainen strategia ihmisen kiveksen cDNA-kirjastoa (Clontech, Moutain View, CA) ja seuraavia alukkeita: hSCP3 1 eteenpäin 5′-GCTCGAGATGGTGTCCTCCGGAAAAAAG-3 ’; hSCP3 81 eteenpäin 5’-CCCTCGAGACCATGATTAACAAGGCTCTTCTT-3 ’; hSCP3 131 eteenpäin 5’-GGCTCGAGATGGATATGCAGAAAGCTGAG-3 ’; hSCP3 80 käänteinen 5’-CGAATTCTCAGTCAACTCCAACTCCTTCCA-3 ’; hSCP3 130 käänteinen 5’CGAATTCTCAGAAACTGCTGAGAATAT-3 ’; hSCP3 236 käänteinen 5’-CGAATTCAGTCTTATTGTACCTAACTTCTCTG-3 ’. hSCP3 1-236 (täysi), 1-80, 1-130, 81-236, ja 131-236 fragmentit alikloonattiin pMSCV-puro-vektoriin (Clontech) on

Xho

I ja

EcoRI

I restriktiokohtia. Rekombinantti pMSCVs koodaa SCP3 tai sen deleetiomutantteja varmistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.

Muodosta of shSCP3 vektorit

luoda Scp3 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) exoression konstrukti ihmisen Scp3-shRNA hehkutettu eteenpäin 5 ”GATCCGGAGAAGAATCATGATAATTCAAGAGAT TATCATGATTCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ’(

Bam

HI-yhteensopiva), ja reverse 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGAATCATGATAATCTCTTGAATTATCATGATTCTTCTCCG-3′ (

Hind

III-yhteensopiva) oligonukleotidit ligatoitiin

Bam

HI /

Hind

III-pilkottu pSilencer 3,1-H1 puro. ShRNA ohjaus käytetty näissä tutkimuksissa oli salattu DNA-sekvenssi, joka ei kohdistu mitään tunnistettu ihmisen koodaussekvenssi (Ambion, Austin, TX).

Western blot-analyysi

Kutakin koetta yhteensä 5 x 10

5-solut huuhdeltiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja lisättiin 0,2 ml: aan Protein Extraction Solution RIPA (Elpis Biotech, Daejeon, Korea) [50 mM Tris Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5 mM EDTA], inkuboitiin 30 minuutin ajan jäillä, ja sen jälkeen kaavittiin ja sentrifugoitiin. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Coomassie plus proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, USA). 50 ug proteiinia liuotettiin Laemmli-puskuriin (62,5 mM Tris /HCI, pH 6,8, 10% glyserolia, 2% SDS, 5% merkaptoetanolia ja 0,00625% bromifenolisinistä), keitettiin 5 minuuttia ja erotettiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Erotettu Geeli siirrettiin nitroselluloosakalvoille 90 V: ssa 1 tunnin ajan jäillä. Ensisijainen vasta-aineita fosfo AKT (Ser473), AKT, ja fosfo ERK (T202 /Y204) ostettiin Cell Signaling (Beverly, MA) ja käytettiin laimennoksena 1:1000. Samoin ensisijainen vasta-aineita dual fosfo p38 MAPK (Stressgen, Victoria, Kanada) ja SCP3 (BD ​​Biosciences, San Jose, CA) käytettiin laimennoksena 1:1000, kun taas vasta-aineita β-aktiini ja Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) käytettiin laimennoksena 1:10,000 Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) -T, joka sisälsi 5% BSA: ta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen 3 pesua TBST, 5 minuuttia per pesu. Vuohen anti-hiiri-IgG-HRP, anti-kani-lgG-HRP-vasta-aineita (1:5000) (Stressgen) inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Immunoreaktiivisia bändit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (ECL, Elpis Biotech). Densitometria suoritettiin käyttäen kuva-analysaattoria Fujifilm LAS-4000 (Fuji, Tokio, Japani) ja Multi Gauge V3.1 kuvankäsittelyohjelma (Fujifilm Medical Systems USA, Inc., Edison, NJ). Kvantitoimiseksi intensiteetti profiilia Proteiinijuovan kuvia, käytimme Image J densitometria ohjelmisto (versio 1.6, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Bändi kuvat oli skannattu harmaasävyin resoluutiolla vähintään 600dpi ja ilmaistiin prosenttiosuutena koko yhteensä kaikkien mitattujen piikkien. Laskea suhteellinen arvo, intensiteetti kunkin näytteen jaettiin että valvontaa. Pienemmät luvut western blotit viittaavat suhteelliset arvot intensiteetti normalisoidaan kullekin valvonnan.

Solujen lisääntyminen ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset

Soluproliferaatiomäärityksiä, solujen (n = 3) kasvatettiin kuusi kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 10

4 solua per kuoppa ja 3 päivää. Prosenttiosuudet elävien solujen määritettiin käyttäen hematosytometrillä jälkeen 0,4% trypan blue-värjäyksellä. Mittaukset tehtiin kolmena rinnakkaisena kullekin solulinjojen ja kokeet toistettiin kolme kertaa. Jotta pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, 1 x 10

4 NIH3T3-solut, CaSki-solut ja HeLa-solut maljattiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle suspensiona 2 ml DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,4% agaria päälle pohjakerroksen 0,7% agaria, joka sisälsi 2 ml samaa alustaa. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 viikkoa, kunnes pesäkkeitä muodostui. Kaksi viikkoa myöhemmin, ja gt; 2 mm pesäkkeet laskettiin silmän mikrometrin mikroskoopin. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kahdesti.

siRNA hoito

Synthetic Sirna (siRNA) spesifisiä vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ja hiiren AKT ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Seuraavat sekvenssit käytettiin: GFP (ei-spesifinen kohde-ohjattu) 5′-GCAUCAAGGUGAACUUCAA-3 ’(sense), 5′-UUGAAGUUCACCUUGAUGC-3′ (antisense); AKT, 5’-GACAACCGCCAUCCAGACU-3 ’(sense), 5′-AGUCUGGAUGGCGGUUGUC-3’ (antisense). Sillä

in vitro

toimitus, NIH3T3-solujen 6-kuoppaisilla aluksen transfektoitiin 300 pmol syntetisoidun siRNA: iden käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. SiRNA-käsitellyt solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen Western blot-analyysi, solujen lisääntymisen määrityksessä, ja pesäkkeitä muodostavien määrityksessä.

Kasvaimen muodostuminen

Transfektoituja NIH3T3-soluja (1 x 10

5 solua /hiiri), CaSki- soluja (1 x 10

6 solua /hiiri) tai HeLa-soluja (1 x 10

6 solua /hiiri) ihonalaisesti Balb /c nude-hiirissä. Tuumorin koko mitattiin kaksi kertaa viikossa 24 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Kukin yksittäinen kasvaimen koko mitattiin paksuus, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus (mm

3) = [leveys x pituus

2] /2 [12].

Immunofluoresoivat merkintöjä kasvainkudossektioista

kasvaimen kudosnäytteitä kiinnitettiin ja upotettiin Tissue-Tek lokakuu yhdistettä (Sakura Finetechnical, Tokio, Japani) muoteissa. Sillä immuunifluoresenssivasta analyysit, 10-pm kryoleikkeet asetettiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin dioja, kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, ja estettiin PBS 10% normaalia vuohen seerumia (NGS) (NGS /PBS). Kudosleikkeet inkuboitiin Pakt vasta-aineella (1:100; Soluviestintä) yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen Alexa555-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (1:1000 in NGS /PBS; Molecular Probes, Eugene, OR), ja sitten asennettu loisteputki asennus väliaineessa (Dako, Glostrup, Tanska) on mikroskoopin dioja. Kaikki kuvat hankittiin käyttäen Zeiss LSM 5 Pascal -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa). Kvantitoimiseksi intensiteetti profiilia Pakt fluoresenssin kuvan kasvainkudossektioista, käytimme ImageJ densitometrisesti ohjelmisto. Kasvain kudokset objektilaseille skannattiin harmaasävyin resoluutiolla vähintään 600dpi. Kasvain alueet skannattujen kuvien valittiin yli 10 kertaa kustakin ryhmästä vapaalla kädellä työkalun ja mitataan keskiarvo harmaata sävyä. Laskea suhteellinen arvo, intensiteetti kunkin näytteen jaettiin että tyhjiä dioja (ilman primääristä vasta-ainetta).

Tissue mikrosirujen rakentamiseen

Full-päällyskerrososasta kaikkien luovuttajien lohkojen värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 75%)] (Kuva S1). Yleistä proteiinin ilmentyminen pisteet laskettiin kertomalla intensiteetti ja positiivisuus tulokset (yleisarvosanaksi alue, 0-12). IHC pettymystä kahtia osaksi korkea lauseke (SCP3 IHC pisteet 7 ja Pakt pisteet 7, vastaavasti), ja heikkoa ilmentymistä (IHC pistemäärä ≤7 sekä SCP3 ja Pakt). Vastaanotin toimii (ROC) analyysiä käytettiin määritettäessä raja-arvot SCP3 ja Pakt. Herkkyys ja spesifisyys erotteleva kuoleman tai elossa piirrettiin jokaisen IHC pisteet ja cut-off-arvon todettiin olevan pisteen ROC-käyrä, jossa summa herkkyys ja tarkkuus maksimoida [13]. Kaksi itsenäistä patologia kokemusta kudoksessa mikrosiruanalyysi tutki diat ilman mitään tietoa vastaavan kliinisten tietojen.

Tilastollinen

Kaikki tiedot edustavat vähintään 2 itsenäisen kokeen. Ei-parametrinen 1-tie tai 2-tie ANOVA suoritettiin SPSS versio 18.0 ohjelmisto (SPSS Inc., Chicago, IL). Vertailut yksittäisten datapisteiden arvioitiin Studentin t-testi. Tilastollisia analyysejä SCP3 ja Pakt ilmaisu suoritettiin käyttäen Mann-Whitneyn testiä ja Kruskal-Wallisin testiä. Spearman nonparametric korrelaatio testiä käytettiin analysoimaan suhdetta SCP3 ja Pakt. Survival käyrät arvioitiin Kaplan-Meier-analyysi. Log-rank-testi käytettiin vertaamaan eroja selviytymisen jakelun ryhmien välillä. Monimuuttuja-analyysi Coxin suhteellisten riskien mallia tehtiin tunnistamaan riippumattomia ennustajia taudista vapaan eloonjäämisen säätö kliiniset covariates kuten ikä, FIGO vaiheessa histologinen tyyppi, kasvaimen, kasvaimen koon ja imusolmuke tila. Lopullinen malli valittiin perustuen tuloksen univariable analyysin sekä vastikkeena kliinisen tai biologisen merkityksen muuttujia. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ektooppinen ilmentyminen hSCP3 lisää leviämisen ja tuumorigeenisyystesti NIH3T3-solujen

Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että ihmisen SCP3 (hSCP3) ilmentyy eri syöpäsoluissa ja että sen ilmentyminen ihmisen yksilöiden liittyy oncogenesis [8], [10]. Kuitenkin kasvaimia synnyttävän potentiaalin SCP3 ole määritelty riittävän joko molekyyli- tai solutasolla. Sen tutkimiseksi, onko hSCP3 voi olla solu Tuumorigeenisuustutkimuksissa, ensin käytetään ei-tuumorigeeniset hiiren fibroblastien NIH3T3 solulinjan ja perusti jotka ilmentävät hSCP3 käyttämällä retroviruksen transduktiojärjestelmää (NIH3T3 /hSCP3). NIH3T3 /ei-insertin (tyhjä vektori) soluja vahvistettiin myös kontrollina. Ilmentymistä SCP3 proteiinin NIH3T3 /hSCP3 solujen varmistettiin Western blot (kuvio 1A). Soluproliferaatiota Transdusoitujen NIH3T3-solut mitattiin laskemalla elävien solujen lukumäärä sen jälkeen, kun trypaanisinisellä värjäystä. Vuonna Soluproliferaatiomäärityksiä (kuvio 1 B), NIH3T3 /hSCP3 solut ilmensivät huomattavasti leviämisen nopeus verrattuna NIH3T3 /ei insert solut (

P

0,005). Tulokset pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, jolla on sama solulinjat olivat yhdenmukaisia ​​niiden kanssa solulisäkasvumääritykselle (kuvio 1C). NIH3T3 /hSCP3 solut osoittivat merkitsevästi korkeampi potentiaalit pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa verrattuna NIH3T3 /ei insert solut (

P

0,005). Me seuraavaksi injektoidaan subkutaanisesti hSCP3- tai ei insertti-ilmentäviä NIH3T3-solua vasempaan kylkeen, joilta puuttuu kateenkorva Balb /c-nude-hiirissä (kuvio 1 D). Vastaa meidän

in vitro

tietojen kasvain muodostava kyky NIH3T3-solut rajusti kasvanut ektooppisesti ilmentäviä hSCP3 (no insert

vs

. HSCP3,

P

(Vasemmalla) Kuvat ovat keskimääräisen pesäkkeen koko kussakin ryhmässä; (Oikealla) Pylväsgrafiikka edustavat pesäkkeiden lukumäärä, joiden halkaisija on yli 2 mm pehmeässä agarissa (asteikko bar: 1 mm). (D) tuumorigeenisyystesti NIH3T3 /hSCP3 soluja. Balb /c-nude-hiiriin (n = 5) inokuloitiin subkutaanisti 1 x 10

5 solua /hiiri NIH3T3 /ei-insertin tai NIH3T3 /hSCP3 soluja. Error edustavat keskimäärää ± SD.

hSCP3 edistävää tumorigeneesin kautta AKT-reitin NIH3T3-soluissa

aiemmin raportoitu, että Pakt taso lisääntyy hSCP3 ilmentäviä kohdunkaulan solulinjoja [10] . Muutosta arvioidaan eri molekyylejä, jotka voivat olla rooli globaalissa valvonnassa solujen lisääntymistä, suoritimme Western blot-analyysi mittaamaan tasoa Ser 473 fosforyloidun AKT, Thr 202 /Tyr 204 fosforyloidun ERK, ja Thr 180 /Tyr 182 fosforyloitua p38 MAP-kinaasi NIH3T3-soluissa jotka ilmentävät hSCP3 tai ei insertin (tyhjä vektori). Havaitsimme, että ilmentyminen Pakt kasvoi merkittävästi soluissa transdusoitiin hSCP3 kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 2A). Seuraavaksi tutkia suhdetta hSCP3-välitteisen Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja AKT signalointi, vertasimme sekä solujen lisääntymisen ja pehmeä agar pesäkkeitä muodostavaa kykyä NIH3T3 /hSCP3 solujen läsnä ohjaus (DMSO), 10 uM API2 (inhibiittori AKT ), 50 uM PD98059 (estäjä MEK /ERK) tai 10 uM SB203580 (inhibiittori p38-MAPK) (kuvio 2B ja 2C). Hoito PD 98059 ja SB203580 ei vaikuttanut leviämisen ja pesäkkeiden muodostumista kapasiteetti NIH3T3 /hSCP3 soluja verrattiin DMSO. Päinvastoin, API2 käsiteltiin NIH3T3 /hSCP3 solut osoittivat merkittävästi vähentynyt proliferaatio hinnan verrattuna DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin (

P

0,001). Johdonmukaisesti API2-käsitelty NIH3T3 /hSCP3 soluja muodostuu myös pienempi pesäkkeitä, joiden lukumäärä oli lähes 5 kertaa vähemmän kuin muodostuneiden pesäkkeiden DMSO-käsiteltyjen NIH3T3 /hSCP3 soluja. Näin ollen on selvää, että sekä leviämisen ja pesäkkeiden muodostuminen näissä soluissa ovat riippuvaisia ​​AKT signalointia. Poissulkemiseksi mahdollisia off-tavoite vaikutukset API2 teimme

in vitro

solujen lisääntymisen ja pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista kokeiden avulla siRNA-kohdistamista AKT (siAKT) estää AKT-reitin. siRNA kohdistus merkitystä GFP (GFP siRNA) käytettiin negatiivisena kontrollina. Yhdenmukainen API2 tietojen siAKT saaneista NIH3T3 /hSCP3 solujen osoitti Hidastuneen solujen lisääntymistä (kuvio 2D ja 2E) ja pesäkkeiden lukumäärä verrattuna ohjaus siGFP saaneilla NIH3T3 /hSCP3 soluja (kuvio 2F). Samanlaisia ​​AKT riippuvuus havaittiin myös NIH3T3-soluissa jotka ilmentävät mXLR, joka näkyy tehokkain Tuumorigeenisuustutkimuksissa jäsenten kesken hiiren COR1 perhe (kuva S3). Siten meidän tiedot osoittavat, että SCP3 ja muut COR1 jäsenet voisivat antaa tuumorigeenisia potentiaalit upon NIH3T3 solun kautta AKT-reitin.

(A) Western blot analyysi tasojen Pakt, Perk, ja pp38 NIH3T3-soluissa ektooppisesti ilmentävät hSCP3 tai no insertti. Pienemmät luvut western blotit viittaavat suhteelliset arvot intensiteetti normalisoidaan ei lisää valvontaa. (B)

In vitro

kasvukäyrät NIH3T3 /hSCP3 soluja käsiteltiin DMSO tai API2 (Akt-estäjä), PD98059 (Erk estäjä), tai SB203580 (p38-estäjä). (C) Pehmeä agar pesäkkeitä muodostavien kapasiteetti NIH3T3 /hSPC3 solujen läsnä ollessa API2, PD98059 tai SB203580; (C, oikea) Kuvat ovat keskimääräisen pesäkkeen koko kussakin ryhmässä; (C, vasen) pylväskaavio, joka esittää pesäkkeiden lukumäärä, joiden halkaisija on yli 2 mm pehmeässä agarissa (asteikko bar: 1 mm). (D) Western blot analyysi tasojen Pakt NIH3T3 /hSCP3 solut transfektoitu siRNA kohdistaminen GFP tai AKT (siGFP tai siAKT) vahvistaa vähentämistä AKT-proteiinin tason. Pienemmät luvut western blotit viittaavat suhteelliset arvot intensiteetti normalisoidaan ei lisää valvontaa. (E)

In vitro

kasvukäyrät NIH3T3 /hSCP3 transfektoitujen solujen siGFP tai siAKT. (F) Pehmeä agar pesäkkeitä muodostavien kapasiteetti NIH3T3 /hSPC3 käsiteltyjen solujen siGFP tai siAKT; (Vasen) Kuvat ovat keskimääräisen pesäkkeen koko kussakin ryhmässä; (Oikea) Pylväsgrafiikka edustavat pesäkkeiden lukumäärä, joiden halkaisija on yli 2 mm pehmeässä agarissa (asteikko bar: 1 mm). Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.

C-terminaalinen alue hSCP3 on riittävä lisäämään Pakt tasoilla ja parantamaan kasvaimen kehittymisen

Kuten kaavamaisesti kuviossa 3A, hSCP3 sisältää tumaanohjaussignaali (NLS, tähteet 88-91), Gln-rikas (tähteet 106-139) ja kelataan kela (tähteet 131-236) motiiveja. Tunnistaa avaimen motiiveja mukana hSCP3-välitteisen syövän synnyn, rakensimme neljä deleetiomutanttien hSCP3 sisältävät erilaisia ​​kuvioita (kuvio 3A). N-päiden täyden hSCP3 ja deleetiomutantteja, jotka on merkitty Flag-epitooppi visualisointi Western blotilla. Sitten ominaista ilmaisua ja toiminta hSCP3 ja sen mutanttien retrovirus transdusoimattomien NIH3T3-solut. Erityisesti, mutantit, joilta puuttuu kelattu kela motiivi (hSCP3

1-80 ja hSCP3

1-130) ei lisätä fosforylaation AKT (Kuvio 3B). Toisaalta, hSCP3

81-236 ja hSCP3

131-236 mutantit sisältävät kelattu kela motiivi onnistuneesti kohonneeseen Pakt (kuvio 3B). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, NIH3T solut, jotka ilmentävät hSCP3

81-236 tai hSCP3

131-236 näytteillä korotettuun solujen lisääntymisen ja pesäkkeitä verrattiin ilmentävät hSCP3

1-80 ja hSCP3

1-130 sekä ei insertti (kuvio 3C ja 3D). Vielä tärkeämpää on, kuten on esitetty kuviossa 3E-3G, samanlaisia ​​ilmiöitä havaittiin myös

in vivo

kanssa -tuumoriksenografti kokeiluja. Kasvain muodostava kyky NIH3T3-solut oli voimakkaasti kohonneet jälkeen ektooppinen ilmentyminen hSCP3

81-236 ja hSCP3

131-236 [no insert

vs

. hSCP3

81-236 (

P

0,01) tai hSCP3

131-236 (

P

0,003)]. Samoin immunofluoresenssivärjäystä Pakt korotettiin merkittävästi histologisia osissa kasvainten ektooppisesti ilmentävien hSCP3

81-236 tai hSCP3

131-236 [no insert

vs

. hSCP3

81-236 (

P

0,05) tai hSCP3

131-236 (

P

0,003)] (Kuva 3G). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että kelattu-kela motiivi, joka sisältää C-pään alueen on ensisijainen rahoittaja AKT-riippuvaisen onkogeenisia potentiaalin hSCP3.

(A) Kaaviokuva verkkotunnuksia hSCP3. Laatikot ovat Maanmittauslaitoksen, Gln-rikas, ja rulla-kela motiivit, vastaavasti. (B) Western blot -analyysi tasoja hSCP3 ja sen deleetiomutanttien, N-päät, jotka on koodattu lippu epitoopin visualisointiin. Pienemmät luvut western blotit viittaavat suhteelliset arvot intensiteetti normalisoidaan ei lisää valvontaa. (C) Pehmeä agar pesäkkeitä muodostavien kapasiteetti NIH3T3 ilmentävät villityyppistä tai deleetiomutantteja hSCP3. (D)

In vitro

kasvukäyrät NIH3T3-solut ilmentävät villityyppistä tai deleetiomutantteja hSCP3. Solut laskettiin jälkeen trypaanisinisellä värjäyksen jättää kuolleita soluja. (E)

In vivo

kasvainten muodostumiseen ja NIH3T3-solut. Balb /c-nude-hiiriin (n = 5) inokuloitiin subkutaanisti 1 x 10

5 solua /hiiri, että NIH3T3-solut, jotka ekspressoivat täyspitkää tai mutantti hSPC3. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD. (F) Kuvat ovat ihon kasvaimet (asteikko bar: 60 mm). (G) Pylväsdiagrammi, joka edustaa intensiteettiä Pakt fluoresenssin kuvan kasvainkudossektioista, ImageJ tiheysmittaria ohjelmistoa käytettiin kvantifioimaan intensiteetti kuvan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.