Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Yhä useammat tutkimukset ovat tutkineet MikroRNA (miRNA) mahdollisina markkereita diagnoosin, hoidon ja ennusteen. Toistaiseksi välisen tutkimuksissa on ollut vähäistä, mikä saattaa osittain selittää kasvaimensisäisiä heterogeenisyys miRNA ilmaisua. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli arvioida heterogeenisuus valikoiduilla miRNA vuonna peräsuolen syöpä, kahdella eri teknisiä lähestymistapoja.

Materiaalit ja menetelmät

ilmentymistä tutkittiin miRNA analysoitiin reaaliaikaisella kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) ja

in situ

-hybridisaatio (ISH) kasvaimen yksilöitä 27 potilasta, joilla T3-4 peräsuolen syöpä. Jokaisesta kasvain, kudos kolmesta eri luminal lokalisoinneissa tutkittiin. Välisiä ja potilaiden välillä arvioitiin laskemalla intraclass korrelaatiokertoimet (lisähintaa). Korrelaatioita RT-qPCR ja ISH arvioitiin käyttämällä Spearmanin korrelaatiota.

Tulokset

ICC

single (yksi näyte kustakin potilas) oli yli 50% miRNA-21 ja miRNA- 31. Sillä miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630, ICC

single oli pienempi kuin 50%. ICC

tarkoittaa (keskiarvo kolmen näytteen jokaisesta potilaan) oli yli 50% miRNA-21 (RT-qPCR ja ISH), miRNA-125b (RT-qPCR ja ISH), miRNA-145 (ISH), miRNA-630 (RT-qPCR), ja miRNA-31 (RT-qPCR). Sillä miRNA-145 (RT-qPCR) ja miRNA-630 (ISH), ICC

keskiarvo oli pienempi kuin 50%. Spearman korrelaatiokertoimet, vertaamalla tuloksia saatiin RT-qPCR ja ISH vastaavasti vaihteli +0,084-0,325 varten keskiarvo kustakin potilaan ja -0,085-+0,515 jaksossa lukien syvimmästä kasvain.

Johtopäätös

kasvaimeen heterogeenisuus saattaa vaikuttaa mittaukseen miRNA ilmaisun ja siten näytteiden lukumäärä, joita tarvitaan edustavia arvioita. Meidän havainnot kahdella eri menetelmällä mukaan yksi näyte riittää riittävä arviointi miRNA-21 ja miRNA-31, kun taas enemmän näytteitä parantaisi arviointia miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630. Mielenkiintoista on, löysimme huono korrelaatio ilmaisu arvioiden saatiin RT-qPCR ja ISH, vastaavasti.

Citation: Eriksen AHM, Andersen RF, Nielsen BS, Sørensen FB, Appelt AL, Jakobsen A, et al. (2016) kasvaimensisäisenä heterogeenisyys MicroRNA Expression in peräsuolisyöpä. PLoS ONE 11 (6): e0156919. doi: 10,1371 /journal.pone.0156919

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 20 toukokuu 2016; Julkaistu: 03 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Eriksen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: projektikuluihin tutkimuskohteista aineet kuuluivat Vejle Hospital Research Council. Rahoittaja ei antanut tukea muodossa palkkojen tekijöille. Virasto tutkimus- ja innovaatio rahoitti BSN (Bioneer A /S). Rahoittajien ei osansa tutkimusasetelma, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: BSN työskentelee Bioneer A /S, Tanska, joka ei -tulosyksikön omistama Technical University of Denmark. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä koodaamattomalla RNA-molekyylien toimivat negatiivisina geeni sääntelyviranomaisten transkription jälkeisellä tasolla. On hyvin tunnettua, että samaa miRNA voi vaikuttaa useita geenejä, vaan myös se, että samasta geenistä voi vaimentua eri miRNA. Siten miRNA edustavat monimutkainen sääntelyjärjestelmä keskeinen biologinen merkitys. Järjestelmä on väärin säädellystä aikana pahanlaatuisiksi, ja se on yleensä odotettavissa, että muutos miRNA toimintaa on keskeinen rooli syövän synnyssä [1-4]. Näin ollen huomattava ja kasvava määrä on tutkittu miRNA mahdollisina markkereita diagnoosin, hoidon ja ennusteen. Kliiniset vaikutukset ovat kuitenkin toistaiseksi olleet vähäisiä [5]. Yksi syy voi olla erilaisia ​​metodologisia lähestymistapoja, mikä vaikeuttaa vertailua tutkimuksia. Toinen ongelma on erilainen koostumus ja laatu potilasaineistojen tutkittu. Lisäksi kirjallisuudessa hallitsevat monet pienet tutkimukset ilman myöhemmin validoivat asiaa koskevat päätelmät [5-10].

Toinen tärkeä este on normalisointia reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) data, mitattaessa miRNA ilme tarvittaessa normalisointi on tärkeää varmistaa luotettavan ja toistettavia tuloksia. Vaikka yhä useammat miRNA ilmaisun tutkimukset, kirjallisuudessa on niukkaa, kun se tulee luotettava Normaliser ehdokkaille [11-14].

kasvaimensisäisenä heterogeenisuus on yleinen ominaisuus pahanlaatuisia kasvaimia [15-17] ja se muodostaa merkittävän este tutkimuksessa tuumoribiologiassa, miRNA ollessa ole poikkeus. Tähän mennessä asia on lähes huomiotta huolimatta ilmeisen tärkeitä; toiminta miRNA todennäköisesti vaihtelevat eri puolilla kasvaimen mahdollisten merkittävä vaikutus kliinisissä sovelluksissa. Vain harvat julkaisuissa on käsitelty ongelmaa kasvaimensisäisenä heterogeenisyys vaikuttaa mittaukseen miRNA ilmaisua. Eräs tutkimus käsittelee asiaa rintasyövän [18], toinen maksasolukarsinoomassa [19].

Nämä haasteet ovat erityisen merkityksellisiä potilailla, joilla on paikallisesti edennyt peräsuolen syövän, jossa hoitopäätökset perustuvat usein yhteen koepaloja ja myöhemmin tulkinta kasvain vaikuttavat ennen leikkausta sädehoitoa [20, 21].

tavoitteena läsnä oli analysoida ilmaus epäyhtenäisyyttä valikoiduilla miRNA vuonna peräsuolen syövän yksilöiden kahdella eri teknisiä ratkaisuja, ja selvittää niiden keskinäistä vastaavuutta. RT-qPCR valittiin, koska se on laajalti hyväksytty kultakantaan miRNA ilmaisun analyysejä.

In situ

-hybridisaatio (ISH) valittiin, koska sen kyky visualisoida solun lokalisaatio tutkittiin miRNA lisäksi ekspressiotason.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteet

Kaksikymmentäseitsemän potilasta valittiin satunnaisesti kohortin 239 potilasta, joille oli tehty resektio peräsuolisyövässä Vejle Hospital, Tanska vuodesta 1999 vuoteen 2008. Inclusion tehtiin vain, jos histopatologinen diagnoosi oli peräsuolen adenokarsinooma pT3 tai pT4, jos ennen leikkausta kemosädehoidon annettiin, ja jos formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) peräsuolen syöpä kudosta oli saatavilla kolmea eri lokalisoinneissa kasvaimen, mukaan lukien luminaalinen puoli.

mukaan Alueellinen Tieteellinen eettiset komiteat Southern Denmark, etiikka hyväksyntä ja kirjallinen suostumus ei tarvita, koska tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä ja kliinistä tietoa analysoitiin edelleen (laki Research Ethics Review of Health Research Projects, vrt § 14, jakso 1). Näytteet kerättiin normaalina peräsuolen resektion, ja hanke toteutettiin ilman tietoa kliinisten tietojen. Tutkimus on rekisteröity Tanskan tietosuojaviranomainen, ja Tanskan Registry of Human Tissue Käyttöaste oli kuultava ennen kudosnäytteitä käytettiin.

Käytettävissä histologisia osat värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H miRNA-31 perustuu positiivinen korrelaatio ekspressiotason ja vaihe CRC [4, 23]; miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630 perustuu niiden ehdotti ylössäätöä in peräsuolen syövän kudoksen jälkeen neo-adjuvantti kemosädehoidon [6-8].

jossa käsiteltiin normalisoinnin äskettäin suoritettu tutkimus miRNA ilmaisun profilointi tunnistaa ja vahvistaa viite geenien suhteellista kvantifiointia miRNA. MicroRNA-193a-5p, miRNA-27a, ja anna-7g tunnistettiin kaikkein stabiilisti ilmaistu miRNA meidän kohortissa peräsuolen syöpä ja olivat näin ollen käytettiin normalisointi tässä tutkimuksessa [24].

Expression analyysin RT-qPCR

RNA.

RNA eristettiin mikro leikattiin FFPE kudokseen käyttämällä miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäinen vaihe lisäämällä lyysipuskuria, joka sisälsi proteinaasi-K: seuraa lyhyt inkubointi 70 ° C: ssa. Tätä seurasi DNaasikäsittely ja RBC puskuri hoitoa. Etanolia lisättiin ja näyte Rneasy MinElute spin sarakkeessa, jossa kokonais-RNA, kuten miRNA, on sitoutunut membraaniin. Lopuksi kokonais-RNA eluoitui 14 ul RNaasi-vapaaseen veteen.

RT-qPCR.

Custom TaqMan® MicroRNA Single Analyysit (Life Technologies, CA, USA) HSA-kirjaimien 7g 002282, HSA-miR-193a-5p 002281, HSA-miR-27a 000408, HSA-miR-21 000397, HSA-miR-31 002279, HSA-miR-125b 000449, HSA-miR-145 002278, ja hsa- miR-630 001563 käytettiin mukaan valmistajan standardi ohjeita pieni näyte tulo (LSI).

Custom MicroRNA RT Primer Pool Custom MicroRNA Esivahvistustaso Primer Pool analysoimiseksi edellä mainittuja miRNA luotiin mukaan pöytäkirjan luominen Custom RT ja Esivahvistus altaat käyttäen TaqMan® MicroRNA Analyysit (julkaisu osanumero 4465407, Life Technologies).

RNA käänteistranskriptoituneet käyttäen Custom MicroRNA RT Primer Pool. Kukin RT reaktio sisälsi 3 ui kokonais-RNA ja 12 ui RT-reaktioseosta alkaen TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit.

Esivahvistus (12 sykliä) suoritettiin Custom MicroRNA Esivahvistustaso Primer Pool, kunkin reaktion sisältää 2,5 ui RT Tuote , TaqMan® Esivahvistustaso Master Mix (2 x) ja Esivahvistustaso Primer Pool on reaktion kokonaistilavuus on 25 ui. ETUVAHVISTIMEN Tuote laimennettiin 1:40 TE-puskuriin.

RT-qPCR analyysit tehtiin Applied Biosystems 7900 HT Real-Time System käyttäen 1 ui laimennettua Esivahvistustaso tuote, TaqMan® MicroRNA Kokeet ja TaqMan® Universal Master Mix II NoAmpErase® UNG on reaktion kokonaistilavuus 20 pl. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen SDS-ohjelmisto ver. 2.2.2 (Life Technologies).

Vettä käytettiin negatiivisena kontrollina. No mallia ohjaus sisältyi koko prosessin (RT, esivahvistus ja qPCR) ja analysoitiin yhdessä näytteistä.

suhteellinen kvantitointi.

Keskimääräiset arvot kolmena Cq arvoja käytettiin lisäanalyysiä. Cq määritellään PCR-syklin, jossa fluoresenssi täyttää kynnyksen vahvistusta juoni. Aritmeettinen keskiarvo Cq arvojen miRNA-193a-5p, miRNA-27a, ja anna-7g käytettiin normalisoinnin kuten edellä mainittiin.

ΔCq arvot muutettiin lineaarisia arvoja tilastolliset analyysit yhtälöllä lineaarinen arvo (ΔCq) =

2

-ΔCq

olettaen, että vahvistus hyötysuhde määritysten oli lähes 100%.

Expression analyysin in situ -hybridisaatiolla

Ennen analyysin määritys optimointi toteutettiin määrittämään optimaaliset koetinpitoisuudet ja hybridisaatiolämpötiloja. MicroRNA-31 ei havaittu 10 näytettä analysoitiin aikana määrityksen optimoinnin ja sen vuoksi ei tarkasteltu tarkemmin. ISH varten miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25] käyttämällä seuraavia pitoisuuksia: 20 nM (miRNA-21 ja miRNA-145), 30 nM (miRNA-630), 50 nM (miRNA-125b). ISH-analyysi suoritettiin käyttäen Tecan Freedom Evo automatisoitu hybridisaatio väline (Tecan, Sveitsi), jossa seuraavat vaiheet suoritettiin: pre-digestiolla proteinaasi-K: n (15 ug /ml) 37 ° C: ssa 8 minuutin ajan, ennen hybridisaatio 57 ° C: ssa 15 minuutin ajan, hybridisaatio kaksinkertaisella-karboksifluoreseiini (FAM) leimattu Lukittu Nucleic Acid (LNA) antureista (Exiqon A /S, Tanska) 1 tunti. Mirna-125b käsiteltiin 56 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun tiukat pesun suolaliuoksella natrium-sitraatti puskuri koettimet havaittiin alkalisella fosfataasilla konjugoidulla lampaan anti-FAM Fab-fragmenttien, jota seurasi inkubointi 4-nitrosinitetratsoliumia ja 5-bromi-4-kloori-3′-indolyylifosfaatti (Roche, Tanska) 60 minuuttia (90 minuuttia miRNA-125 b) tuloksena tummansininen värjäys ja lopuksi counterstaining ydin- nopea punainen (Vector Laboratories, CA, USA).

Kuva-analyysi ja kvantifiointi

Digital koko slide kuvat saatiin kanssa x20 tavoite käyttämällä Axio Scan Z1 kirkas skanneri (Carl Zeiss, Saksa). Kuva-analyysi digitaalisen dioja suoritettiin käyttäen VisiomorphDP ohjelmistoa (Visiopharm, Tanska).

alueet ROI ympäröimä on H for miRNA-125b ja miRNA-630 potilasta suljettiin pois; ja miRNA-145 neljä potilasta suljettiin pois.

pikseli luokittelija oli koulutettu erottamaan sinisen ISH signaalin punainen vastavärinä, The unstained ja heikosti värjätään kudos, ja kudos-vapaita alueita. Seuraavat parametrit saatiin kuvankäsittelyn aikana kultakin ROI: alue sinistä (ISH-signaalin), alueen heikon sinisen (katsotaan tausta ISH-signaalin), alueen violetti sininen (sininen sijaitsee yli ydin- punainen), ja kokonaispinta-ala yksittäiset ROI. Suhteellinen alue jakeet (alueet sininen väri kohteisiin jaettuna ROI alue) katsottiin edustavan suhteellisen ilmentymisen miRNA kiinnostava.

Tietojen analysointi

Kaikki tiedot olivat yhteenvetona käyttämällä standardi kuvailevia tilastoja. Välisiä ja potilaiden välillä arvioitiin laskemalla intraclass korrelaatiokertoimet (ICC), käyttäen yksisuuntainen random-vaikutus malli. Erityisesti ICC voi tässä ympäristössä pidettävä prosentuaalinen osuus varianssi näytteissä selittyy erot Tutkituista potilaista. Jos suurin osa vaihtelu näytteen mittaukset on peräisin potilaiden välillä vaihtelevat, ICC on korkea (ICC → 1). Jos suurin osa vaihtelu on sisäisistä potilaan tasoitettu ICC on alhainen (ICC → 0). Mietimme ICC sekä yksittäisten näytteiden (ICC

single) ja keskiarvo näytteitä potilaista (ICC

keskiarvo). ICC

single tarjoaa arvion luotettavuuden tietyn otoksen saattaakseen tietoa tietylle potilaalle (verrattuna kaikkiin muihin potilasta). Vastaavasti ICC

arvioitu keskimääräinen luotettavuus tietojen suoritettu ottamalla keskiarvo kolmen näytteen potilaalta.

Korrelaatio RT-qPCR ja ISH-jakeet jokaista miRNA arvioitiin yksittäisille näytteille ja keskiarvot yksittäisille potilaille käyttäen Spearmanin korrelaatiokerroin.

jotta havainnollistamiseksi välisiä ja potilaan vaihtelu sekä korrelaatio RT-qPCR ja ISH arvot, kaikki data normalisoitiin sallimaan piirtämistä yhteisestä mittakaavassa. Kunkin miRNA, keskiarvo ja keskihajonta kaikille RT-qPCR mittaukset kunkin potilaan laskettiin, ja mikä tahansa yksittäisen näytteen mittaaminen normalisoitiin vakio mittakaavassa uuttamalla keskiarvo ja jakamalla se keskihajonta. Tämä tehtiin myös kaikkien ISH mittauksiin, jokaisen miRNA. Tuloksena arvot sekä RT-qPCR ja ISH piirrettiin erikseen kullekin miRNA.

Tulokset

RT-qPCR

ekspressiokuviota kohde miRNA (miRNA-21 miRNA-31, miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630) analysoitiin kolmella eri näytettä kustakin tuumorinäytesylinterin RT-qPCR. MicroRNA-21, miRNA-31, miRNA-125b, ja miRNA-145 osoitti erilaista ja mitattavissa ekspressiotasot, ja kaikki miRNA ilmaistiin kaikki kolme näytettä kustakin kasvaimesta. MicroRNA-630 oli havaittaisi kaksi näytettä kahdelta eri potilailla. Valikoima Raaka Cq tasoilla oli 17,4-21,6 varten miRNA-21, 20,9-28,7 varten miRNA-31, 20,4-26,3 varten miRNA-125b, 15,9-24,4 varten miRNA-145, ja 28,5-36,7 varten miRNA-630. Muutama harha on kolmena RT-qPCR mittaukset poistettiin aineisto ennen lisäanalyysejä. Normalisoinnin jälkeen, The ΔCq arvot muutettiin lineaarinen arvot tarkempaa analysointia.

In situ -hybridisaatio

suhteellinen ilmaisu arvioiden tavoite miRNA (miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630) saatiin kuva analyysi ISH-värjättyä dioja (taulukko 1) kantavassa miRNA-21 ISH johti vahvan signaalin strooman ympäröivään kudokseen epiteelikasvainsolut kuten myös aiemmin on kuvattu [25, 26]. Vahva signaali enteerinen neuronien strooman kudosten ja heikomman signaalin muissa stroomasoluissa havaittiin varten miRNA-125b. ISH varten miRNA-145 johti vahvan ja heikon signaalin lähinnä sileän lihaksen soluissa ja myofibroblastic jotka ympäröivät kasvainta soluihin [26, 27]. Mirna-630 ISH osoittivat värjäytymistä kasvainsolujen ja alijoukko viereisen stroomasoluissa. Sekä vahvat ja heikot ISH signaalit otettiin huomioon kuva-analyysi. Esimerkkejä ISH signaalit miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630 vastaaviin luokitellut kuvat on esitetty kuvassa 1.

ISH signaali vastaa sinisen värin vasen rivi. St: strooman; Ca: epiteelikasvainsolut. (A) Expression of miRNA-21 esiintyy pääasiassa stroomaan vieressä epiteelikasvainsolut. (B) Pixel luokittelija vastaava kuva A. (C) Expression of miRNA-125b voimakkaiden ISH-signaalin läsnä enteerisellä neuroni (nuolet) ja pienempi ISH signaalia edustavat eri stroomasoluihin. (D) Pixel luokittelija, joka vastaa kuvan C. (E) Expression of miRNA-145 esiintyy pääasiassa sileissä lihassoluissa (SMC) ja myofibroblastic soluja. (F) Pixel luokittelija, joka vastaa kuvan E. (G) Expression of miRNA-630 hajallaan epiteelikasvainsolut ja vieressä stroomasolut (nuolet osoittavat esimerkkejä ISH-positiivisten solujen strooman). (H) Pixel luokittelija, joka vastaa kuvan G.

Intraclass korrelaatiokerroin (ICC) B

ICC Kunkin miRNA laskettiin sekä RT-qPCR ja ISH esitetyllä taulukossa 2. miRNA-21, miRNA-145, ja miRNA-630, TBP-jae (eli kaikki siniset värit) käytettiin, mutta miRNA-125b emme sisällyttää alueet sinistä värjäystä edustavat enteerisen neuronien .

korrelaatio qPCR ja ISH

Spearman Korrelaatiokerroin laskettiin verrata tuloksia saatiin RT-qPCR ja ISH, vastaavasti (taulukko 3). ISH, kun vertaamalla RT-qPCR, TBP-osa (kaikki sininen) käytettiin kaikkien neljän miRNA, koska RT-qPCR mittaa koko ilmaus miRNA kohteisiin, riippumatta lokalisointi. Yleisesti oli heikko korrelaatio arvioiden saamat kaksi tekniikoita korrelaatiokertoimet vaihtelevat ,084-+0,325 varten keskiarvon jokaiselle potilaalle, ja jotka vaihtelevat -0,085-0,515 jaksossa lukien syvin osa kunkin kasvaimen.

sisäinen ja potilaiden välillä vaihtelevat ja korrelaatio RT-qPCR ja ISH varten miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630 kuvataan kuviossa 2. miRNA-31 (RT-qPCR vain) katso S3 kuvassa.

Kaikki tiedot normalisoitiin piirretään yhteiseen mittakaavassa: katso varsinainen teksti yksityiskohtia. Jokainen pystysuora viiva kuvaa erilaisia ​​kolmen toimenpiteen saatu yksittäisen potilaan eri värejä edustaa RT-qPCR ja ISH mittauksia, vastaavasti. Kunkin miRNA, potilasta lajiteltu niiden keskiarvo RT-qPCR mittaus piirtämistä.

Keskustelu

Yhä useammat tutkimukset keskittyvät miRNA mahdollisina biomarkkereita syövän diagnosointiin ja hoitoon , mutta toisistaan ​​poikkeavia ja ristiriitaisia ​​tuloksia kirjallisuudessa ovat merkittävä este kliinisissä sovelluksissa [5, 21]. Tilanne vaatii kriittisesti metodologian joista heterogeenisuus kärkimaita.

Tissue heterogeenisuus on yleinen ominaisuus pahanlaatuisia kasvaimia. On tunnettua, että mikro-ympäristö vaihtelee koko kasvaimeen vaikutusta kasvuun, leviämisen, ja metastaattisen potentiaalin. Käyttäytyminen kasvain mutaatioiden on epäjohdonmukainen, liian [16, 17]. Näin ollen asia pitää ratkaisevan tärkeitä biomarkkereiden tutkimuksen näkökulmat kliinisissä sovelluksissa. Tämä koskee myös miRNA. Tässä tutkimuksessa osoitetaan heterogeenisyys ongelma vertaillaan kahta eri tapaa miRNA ilmentymisanalyysiä.

käsittelevää kirjallisuutta miRNA ja kasvaimensisäisenä heterogeenisuus on harvaa. Raychaudhuri

et al

. (2012) tutkivat kasvaimensisäisenä epäyhtenäisyyttä paneelin miRNA rintasyövässä [18] RT-qPCR. He löysivät variaatiokerroin (CV) 40% sisällä primaarikasvaimen näytteitä ja päätellä, kasvaimeen heterogeenisyys voi johtaa merkittäviin vinoutunut otos ja arviointi miRNA profiilien saattaa vaatia näytteenottoa useilla eri kasvain paikoissa. Peveling-Oberhag

et al

. (2014) [19] suorittivat miRNA profilointi maksasolukarsinoomassa vertailla eri osastoihin maksakasvaimien ja totesi, että miRNA säätelyhäiriötä vaihtelee kasvain osastoissa. Kahdessa tutkimuksessa, ei varauksetta verrata tulostamme, koska mikään niistä ei raportoida ICC. Toisaalta, ne molemmat raportoivat merkittävistä kasvaimensisäisenä heterogeenisyys mukaisesti tässä tutkimuksessa.

Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus arvioimaan kasvaimensisäisenä heterogeenisuus miRNA vuonna peräsuolen syöpä. Lisäksi emme ole tietoisia muista tutkimuksista soveltamalla kahta tekniikkaa RT-qPCR ja ISH viereisillä osia kudoksen valottaa keskinäistä vastaavuutta. RT-qPCR valittiin, koska se on laajalti hyväksytty kultakantaan miRNA ilmaisun analyysejä. ISH valittiin, koska sen kyky visualisoida solun lokalisaatio tutkittiin miRNA lisäksi ekspressiotason. Käytimme kasvain potilas jolta näyte peräsuolen syöpä analysoida kasvaimensisäisenä epäyhtenäisyyttä paneelin miRNA mahdollisten kliinistä merkitystä [4, 6-9, 22, 23].

Olemme löytäneet yleistä laajuutta heterogeenisyys, kuten ilmaisemat ICC, olla erilainen viiden miRNA. CV ei ole yhtä käyttökelpoinen parametri tässä ympäristössä, koska se ei ole suoraan mittaa sisäisen potilaan vaihtelua suhteessa yleiseen vaihtelu mittauksia. ICC kuitenkin mahdollistaa vertailun sisäisestä ja välisestä potilaiden vaihtelu aineistoja kahdesta eri menetelmillä, jolloin saadaan arvio tarkkuuden yksittäisten mittausten viittaa tietylle potilaalle.

potilaiden välinen vaihtelu oli suurempi kuin sisäisen vaihtelee potilaskohtaisesti suhteessa miRNA-21 ja miRNA-31. Tämä on osoitus siitä, että kaksi miRNA on potentiaalia biomarkkereina, kun analysoidaan yksi näyte (esim. Yksi diagnostinen biopsia). Täällä olemme huomanneet, että tarkoitetaan ICC arvot RT-qPCR ja ISH olivat lähes identtiset miRNA-21, 0,848 ja 0,838, tässä järjestyksessä. Nämä arvot ovat hyvässä yhdenmukaiset Nielsen

et al

. (2011), joka kertoi ICC arvo miRNA-21 ISH 84% vuonna CRC kudoksessa [25].

Toisaalta, sillä miRNA-125b, miRNA-145, ja miRNA-630 ICC

single oli alle 50%, mikä edellyttää varovaisuus tuloksia tulkittaessa yhdestä näytteestä. Sillä miRNA-125b ja miRNA-630 ISH analyysi osoitti alempi ICC arvot (yhden ja keskiarvo) kuin RT-qPCR analyysi, joka osoittaa korkeampaa sisäistä potilaiden vaihtelu varten ISH analyysiä. Sillä miRNA-145 se oli päinvastainen skenaariossa ISH analyysi osoittaa korkeampia ICC arvot (yhden ja keskiarvo) kuin RT-qPCR analyysi, joka osoittaa korkeampaa sisäistä potilaiden vaihtelu RT-qPCR analyysi. Näin ollen, nojaudutaan vain lisähintaa, kumpikaan tekniikat ovat parempia kuin muut.

Mielenkiintoista on, löysimme huono korrelaatio tulosten RT-qPCR ja ISH kaikkien miRNA; joten vaikka ICC (single ja keskiarvo) on yhtä suuri RT-PCR ja ISH varten miRNA-21, tulokset eivät ole vertailukelpoisia. Tärkein selitys on todennäköisesti luonnostaan ​​eroja menetelmiin RT-qPCR ja ISH. Esim. eroaa RT-qPCR tekniikka, ISH tekniikka havaitsee sekä esiaste ja kypsä miRNA. Ei kuitenkaan voida sulkea pois, että osa selitystä köyhien korrelaatio voisi olla pieni siirtymät ROI kopioitaessa se ensisijaiselta suunnittelevat ISH digitaalisen koko dian ja dian RT-qPCR. Tämä merkitsisi eroa analysoidaan alueella, etenkin strooman jossa kaikki miRNA ovat edustettuina.

Yleensä RT-qPCR on korkea toistettavuus ja on suhteellisen edullinen tapa soveltaa valtaosassa laboratorioissa. FFPE kudos on hyvin miRNA ilmentymisen analyysi suoritettiin pieni määrä kudosta, jolla on vain kypsää miRNA havaitaan. Kuitenkin RT-qPCR sisältää useita valmistelevia vaiheita (RNA käänteistranskriptio, esivahvistus), jossa tekninen muutos voidaan ottaa käyttöön, ja lisäksi oikea normalisointi on tärkeää varmistaa toistettavia tuloksia.

ISH tekniikka esittelee useita etuja , mukaan lukien kyky visualisoida solun lokalisaatio tutkittiin miRNA lisäksi ekspressiotason. Määrällinen ISH menetelmä vaatii standardoituja leikepaksuuden, koska määrälliset arviot eivät ole normalisoitu vastaan ​​referenssistandardia. Muut valmistelut, jotka voivat ottaa käyttöön joitakin teknisiä vaihtelua kuuluvat proteolyyttinen esikäsittely sekä kudoksen taittuu ja irtoaminen. Lisäksi ISH on työläämpi menetelmä ei sovellu kaikille laboratorioille, ja tietojen tulkinta vaatii erikoistunutta henkilöstöä

Tässä tutkimuksessa oli mahdollista visualisoida sijainti solun tutkittujen miRNA, ja vastaava ISH-signaalin sallitaan varten keskittyä asiaan solujen ISH data-analyysi. Sillä miRNA-125b voisimme jättää pois vahva ISH-signaalin muodostavat enteerisen neuronien laskettaessa ICC. RT-qPCR, sama vaihtoehto ei ole käytettävissä, ja miRNA-125b suolistossa hajoavasta neuronien on osa mitatun ekspressiotason. Koska enteerisen neuronit ovat läsnä riippumatta syövän, jättää ne pois analyysi on tarkin asia tehdä. Siinä tapauksessa, RT-qPCR lukien miRNA-125b suolistossa hajoavasta neuronien antaisi puolueellinen arvion, ja ISH antaisi todennäköisesti enemmän oikean tuloksen. Tämä on tasapainotettava menetys tapausten ISH analyysien takia taitettu tai kadonnut kudoksen. Siten useita tapauksia menetetään kaikille analysoitiin miRNA, johtunee virheellinen kiinnitys kasvaimia.

Kaikille miRNA ICC

keskiarvo oli korkeampi kuin ICC

single. Alhainen ICC arvo voidaan selittää korkean mittaus melu, kun taas korkea ICC arvo osoittaa vähemmän Mittauskohina. Se, että ICC

keskiarvo oli korkeampi kuin ICC

yksittäinen viittaa siihen, että yhdistämällä kaikki kolme näytettä vähentää mittauksen melua, mutta vain yksi käytettävissä biopsia on usein skenaario kliinisessä työssä.

Vedoten lisähintaa tässä laskettu, ei ollut mahdollista päätellä, kumpi kahdesta tekniikkaa, RT-qPCR tai ISH, tarjoaa kaikkein edustava lauseke arvioita ja siten muodostavat kasvain heterogeenisyys. Kuitenkin kliiniseen käyttöön menetelmän, käytännön tekijät, kuten määrä koepaloja tarvitaan tutkimusta, saatavuus ja kustannukset menetelmän, ja tulosten tulkinta ovat todellakin tärkeitä tekijöitä

Yhteenvetona kasvaimeen heterogeenisuus tulisi harkita analyysissä miRNA biomarkkereina, ja miRNA analyysi olisi siten tehtävä kaikille käytettävissä näytteistä. Yksi näyte saattaa riittää joillekin asetukset tarkoitettu miRNA-21 ja miRNA-31 nykyisessä tutkimuksessa. Köyhät korrelaatio RT-qPCR ja ISH viittaa siihen, että tulokset on saatu kahdella tekniikalla olisi verrattava varovaisesti. Kliinisessä ympäristössä, RT-qPCR näyttää parempi kuin helppo tapa saada toistettavia tuloksia, mutta sitä ei voida sulkea pois, että ISH menetelmä voi antaa enemmän kliinisesti merkitsevää ilmaisua arvioita.

tukeminen Information

S1 Fig . Peräsuolen syöpä näyte varten miRNA ilmaisun analyysejä.

(A) Vuodesta pinnallinen /luminaaliselle osa kasvain, kolmessa eri (punaiset nuolet) valittiin tutkittavaksi. (B) Kohdat RT-qPCR ja ISH leikattiin samaan aikaan kuin vierekkäisten osioiden. Alueen Interest (ROI) oli ympäröity on tulostaa digitaalisen koko dia kuva HE-osiossa. ROI on siirretty digitaalisen koko dioja ISH-kuvien ja osat leikataan RT-qPCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0156919.s001

(TIF)

S2 kuviossa. Region of Interest (ROI).

(EN) tuloste H & E värjättyä osassa, ROI leimasi patologi.