Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti. Expression of kasvain vaimennin, promyelosyyttinen leukemia (PML) proteiini, vähennetään tai se poistetaan vuonna mahakarsinoomat, yhdessä tehostettuun imusuonten hyökkäystä, kehittäminen korkeamman pTNM lavastus, ja epäsuotuisa ennuste. Tässä tutkimme suhdetta laajuus kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja asema PML-proteiinin ilmentymistä kehittynyt mahasyöpä. Havaitsimme Useammat soluttautua T-solujen mahakarsinoo- kudoksissa, jossa PML ilmentyminen vähennetään tai se poistetaan, verrattuna kudoksiin positiivinen PML. Laajuus T-solumigraation kohti viljelmien supernatanteista saatu interferoni-gamma (IFN-γ-stimuloidun mahahapon sinoomasolulinjoja on lisäksi vaikuttanut ekspressioon PML

in vitro

. Interferoni-gamma-indusoituva proteiini 10 (IP- -10 /CXCL10) ekspressio lisääntyi mahakarsinoo- kudoksissa näytetään vähentää PML tasoja. Lisäksi sekä

PML

knockout ja pudotus solujen tehostunut IP-10-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen, kun läsnä on IFN-γ. PML pudotus lisääntynyt IFN-γ-välitteisen signaalin muuntimet ja Activator of Transcription-1 (STAT-1) sitoutuminen IP-10-promoottorin, jolloin kohonnut transkriptio IP-10-geeni. Kääntäen, PML IV proteiinin ilmentyminen tukahdutetaan IP-10-promoottorin aktivaation . näiden tulosten perusteella ehdotamme, että menetys PML-proteiinin ilmentymistä mahasyövän soluissa osaltaan lisäsi IP-10 transkriptio

kautta

tehostaminen STAT-1 aktiivisuutta, mikä puolestaan ​​edistää lymfosyyttiliikennettä sisällä kasvain alueilla .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) menettäminen promyelosyyttileukemian proteiini mahasyövän: Implications for IP-10 Expression ja kasvain-tunkeutuvia lymfosyyttejä. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 huhtikuu 2011; Hyväksytty 23. syyskuuta 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia (2010-0015506) Y-HC, National Research Foundation of Korea (NRF) rahastoiva jonka Korean hallitus (MEST) (2010-0029353) on JLK sekä RO1 NS50665 ja ENB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Viimeaikaiset edistysaskeleet genetiikan ovat helpottaneet havaitsemista tapahtumista aikana mahasyövän, mukaan lukien aktivoituminen onkogeenien, hiljentäminen kasvainten synnyssä, ja mutaatio liittyvien geenien DNA: n korjaukseen [1]. Näistä geneettisiä tapahtumia, tiedetään, että kasvain vaimennin promyelosyyttinen leukemia (PML) proteiinin ilmentymistä vähennetään tai se poistetaan mahasyövän, ja että tämä liittyy laajempaan imusuonten invaasio, korkeampi pTNM lavastus, ja epäsuotuisa ennuste viittaa siihen, että PML menetys on liittyy syövän synnyn ja mahakarsinoo- eteneminen [2]. Aikaisemmat tutkimukset sekaantunut

PML

toimintahäiriöitä etenemistä erilaisia ​​syöpiä, ja vähennetään tai se poistetaan ilmaus PML on raportoitu eturauhas-, rinta-, keskushermoston, paksusuoli-, keuhko-, ja syöpien [2], [3] .

PML

geeni tunnistettiin alun perin fuusiolla kanssa retiinihapporeseptorin mukana t (15; 17) kromosomaaliseen translokaatio liittyvä akuutti promyelosyyttinen leukemia (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML on tuumorisuppressoriproteiinia joka säätelee solusyklin etenemistä, geenitranskriptiota, transformaatio tukahduttaminen, ja apoptoosin.

PML

hiirten ovat huomattavasti herkempiä kasvaimen muodostumisen altistumisen jälkeen karsinogeeneja kuin ovat villin tyypin valvontaa, ja

PML

vajausta solut ovat vähemmän todennäköisesti apoptoosiin soveltamisen jälkeen tietyntyyppisiä solustressiä [9]. Sen lisäksi, jossa keskitytään tuumorisuppressorigeenin roolia PML, useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että proteiini toimii transkription sääntelijä,

kautta

yhdessä koaktivaattoria CREB-sitova proteiini; co-repressors myös HDAC, N-CoR ja mSin3A; ja transkriptiotekijöille Nur77, AP-1, myc, p53, ja STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressive mutaatio ja geneettisiä muutoksia useissa tuumorisuppressorigeeneille edistää kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [18]. Lisäksi geneettiset muutokset sisällä tuumorisoluissa, sekä tulehdussolujen ja välittäjien edistää muodostumista erityisesti kasvaimen mikroympäristöihin [19], [20]. Kasvaimeen liittyvä fibroblasteissa (TAFs) ja makrofagit (TAM) on myös mukana modulaatio kasvaimen mikroympäris-

kautta

sytokiinien, kemokiinien, interferonien, ja muita biologisesti aktiivisia tekijöitä [21], [22]. Cross-talk keskuudessa kasvainsoluja, TAFs, TAM, ja lymfosyytit, on merkittävä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, ja edistää perustamiseen kasvaimen mikroympäristöjen rikastettu ilmaus erilaisten biologisesti aktiivisten tekijöiden [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM on todettu korreloivan angiogeneesiä ja epäsuotuisa ennusteeseen useiden syöpätyyppien, kuten mahasyövän [22], [28]. Syöttösolujen tuottaa paljon angiogeenisten tekijöiden ja erilaisia ​​sytokiineja, ja sen tiheys on raportoitu erittäin korreloivan laajuus kasvaimen neoangiogeneesin ja huonoon ennusteeseen [29], [30]. CD4

+ ja CD8

+ lymfosyytit löytyy myös erilaisia ​​kiinteitä syöpä kudoksiin. Tähän asti molekyylitason mekanismeja, joiden tyyppi ja määrä kasvaimeen infiltroituvat solut säätelevät ovat suurelta osin tuntemattomia. On olemassa useita kiistanalaisia ​​raportteja osalta lukumäärä ja tehtävät kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Erityisesti CD8

+ T-lymfosyyttejä, kun taas niiden funktio on tunnetusti poistaa orastavan transformoitujen solujen ja edistää immuunitutkimusohjelmasta [31], on raportoitu, että CD8

+ kasvainta infiltroituneen T-solut ovat puutteellisia Efektorivaihe toiminto kosketuksessa kasvaimen soluihin [32], ja niiden tunkeutuminen liittyy epäedullinen ennustetta tietyntyyppiset syövät kuten nonsmall keuhkosyöpä ja nenänielun karsinooman [33], [34].

Kemokiinit erittävät stroomasolut tai kasvain solut vaikuttavat kasvainsolun muuttoliike, invaasio, proliferaatio, angiogeneesi ja immuunijärjestelmän solujen tunkeutuminen kasvain massa [35]. IFN-γ-indusoituva proteiini-10 (IP-10, CXCL10) on yksi CXC-kemokiinien, joka toistaa useita rooleja tulehdussairauksien ja syövän [36], [37]. Koska IP-10 edullisesti edistää Th1 immuunivasteita voimakkaasti houkuttelemalla NK ja T-solujen, on ehdotettu yhtenä mahdollisista mekanismeista T-solujen infiltraatio kasvaimissa.

Onko menetys tuumorisuppressorigeeneille kasvainsoluissa indusoi rekrytointi lymfosyyttien ja modulaatio toimintoja tällaisten solujen kasvain mikroympäristöihin on tällä hetkellä epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme PML toiminnon suhteen rekrytointi lymfosyyttien ja modulaatio ilmentymisen tuumorista peräisin tekijät. Expression of PML oli korreloi käänteisesti laajuus tunkeutumisen CD8

+ T-solujen mahakarsinoomat. PML häviö liittyy edelleen parannettu ekspressio IP-10, yksi lymfosyytti-houkutella CXC-kemokiinien, mahalaukun karsinooma soluja ja kudoksia. PML pudotus edisti IFN-γ-välitteisen STAT-1 sitoutumisen IP-10-promoottorin, mikä lisää transkription IP-10-geeni. Meidän tiedot tukevat käsitystä, että PML osallistuu lymfosyyttien värväytymistä kasvaimiin,

kautta

modulaatio ekspressiotasot kasvain- tekijöistä, kuten IP-10, tarjoaa uutta näyttöä siitä, että menetys tuumorisuppressorigeeneille kasvaimen solut osallistuu aktiivisesti perustamista kasvain mikroympäristöihin.

tulokset

menetys PML-proteiinin liittyy lisääntynyt infiltraatio CD8

+ T-solujen kehittynyt mahakarsinoo- kudos

immunohistokemiallinen värjäys PML ja CD8 avulla selvitettiin, onko siinä määrin lymfosyyttien tunkeutumisen liittyi PML ilmentymistilanne pitkälle mahasyövässä. CD8-immunopositiivisen solut laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikkiaan 35 näytettä (71,4%) osoitti osittainen-to-täydellinen menetys PML kasvainsolun ytimet vaiheen IV kehittyneen mahakarsinoomat. Näytteet 14 kehittynyt mahakarsinoo- potilaista oli hajanaisesti positiivisia PML, ja sisälsi keskimäärin 32,7 CD8

+ T-solujen määrä kenttää kohden (kuvio 1A). Havaitsimme 19 tapauksia kehittyneiden mahakarsinooman näytteille polttovälin positiivisuutta PML, keskiarvon ollessa 47,2 CD8

+ T-solujen määrä kenttää kohden. Lisäksi täydellinen menetys PML havaittiin 16 kehittynyt mahasyöpä potilaita; näytteet sisälsivät keskimäärin 52,8 CD8

+ T-solujen määrä kenttää kohden. Näytteitä näytetään polttoväli positiivisuus tai täydellinen menetys PML osoitti voimakkaampaa kasvua CD8

+ T-solujen määrä kuin teki yksilöiden näytteille diffuusi positiivisuutta PML. Kuvat ovat esitetään kuviossa 1B. Vaikka PML-proteiinin ilmentymistä vähennetään tai se poistetaan kasvainsoluissa, kaikki normaalin mahalaukun limakalvon rauhaset, strooman kudokset, ja imusolujen, näytteillä diffuusi kohtalainen-vahva ydinvoiman immunopositivity PML.

(A) immunohistokemiallinen värjäys PML-proteiini ja CD8 suoritettiin 49 tapauksessa vaiheen IV kehittyneen mahakarsinoomat. Immunopositivity PML-proteiinin luokiteltiin hajanainen positiivisuus (DP, ydin- immuunivaste ≥50% kasvainsolujen, n = 14), polttoväli positiivisuus (FP; in ≥10%, mutta 50%, n = 19), tai täydellinen menetys (CL; in 10%, n = 16). Lukumäärä CD8 immunopositiivista solujen yksi korkean tehon kentän (HPF, x40) 0,25 mm

2 viiden satunnaisesti valitun kasvain infiltratiivinen rajat laskettiin kunkin näytteen, jota seuraa laskeminen keskiarvo ja SD. (B) edustaja kuvat osoittavat PML-proteiinin ilmentymisen ja CD8

+ T-solujen tunkeutuminen kehittyneiden mahakarsinoo- kudoksiin. Bars, SD. *

P

0,05.

PML vaikutteita T-solujen tunkeutuminen /muuttoliike

in vitro

Koska menetys PML proteiinin ilmentymiseen ja kasvu soluttautuminen CD8

+ T-lymfosyyttien kehittynyt mahasyöpä kudoksia, me arveltu, että PML osaltaan T-solujen tunkeutuminen /muuttoliikkeen mahasyövässä. Tutkia, onko PML tason mahalaukun syöpäsoluissa vaikuttanut T-solujen vaeltamiseen, väliaine mistä SNU-638-solut transfektoitiin joko

PML

siRNA tai PML IV ekspressiovektoria, sitten käsiteltiin IFN-γ hyödynnettiin TranswellTM muuttoliike määrityksiä. SNU-638 mahasyövän solut ilmensivät korkeita PML-proteiinin, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [2], kun taas SNU-638-solut transfektoitu

PML

siRNA näytetä kevyemmästä endogeenisen PML ilmaisun (~46-56%) on vahvistanut, immunoblottauksella (kuvio 2A). IFN-γ aiheuttama vaatimaton kasvu PML-proteiinin ilmentymisen, yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa [38]. Migraatio Jurkat-T-solujen kohti väliaine

PML

siRNA-transfektoiduissa SNU-638-soluissa oli merkittävästi parannettu verrattuna kontrolli-siRNA-transfektoiduissa soluissa, sen jälkeen kun hoito IFN-γ (kuvio 2B). Kun transfektointi SNU-638 PML IV ekspressiovektorilla, migraatio Jurkat T-soluja kohtaan väliaine PML IV yli-ilmennetään solujen väheni verrattuna tyhjällä vektorilla (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PML säätelee tasot sekretorisen molekyylejä tuotetaan ja vapautetaan IFN-γ-stimuloitujen mahalaukun syövän soluja, ja vaikuttaa myös kulkeutumista T- lymfosyyttien.

(A) SNU-638 mahalaukun syöpäsolujen transfektoitiin lyhytaikaisesti

PML

siRNA tai kontrolloida siRNA. Kaksi päivää transfektion jälkeen, solut käsiteltiin tai ilman interferoni-gamma (IFN-γ (10 ng /ml) 8 tuntia ja lyysattiin ja analysoitiin immunoblottauksella. Tehokas siRNA-välitteisen suppression PML-proteiinin ilmentymistä tarkastettava kunkin määrityksen immunoblottauksella . (B) Jurkat-solut ja viljelmäsupematanteista SNU-638-soluja, jotka transfektoitiin väliaikaisesti joko ohjaus siRNA tai

PML

siRNA analysoitiin käyttäen transwell migraatiokokeessa. transfektion jälkeen SNU-638-soluja inkuboitiin IFN -γ (10 ng /ml) 8 tuntia tai jätettiin käsittelemättä, ja kerättiin supernatantit laitettiin alakammioissa. ylempi kammiot sai 5 x 10

5 Jurkat-solujen 100 ul: n ja transwell muuttoliike yksiköt inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 h. Migration Jurkat-solujen ylemmästä laskea kammioon analysoitiin tutkimalla solut kerättiin alakammioissa fluoresoivalla count-helmi välitteisen laskenta virtaussytometrillä. Suhteellinen migraatiota määritettiin useissa Siirretyn solujen normalisoituna solujen lukumäärä ja supernatantit SNU-638-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA ilman IFN-γ, ja arvo emosoluista mielivaltaisesti asetettu 1. (C) SNU-638 mahalaukun syövän soluja väliaikaisesti transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla (vale) tai PML IV ekspressiovektorin (PML IV). Päivä transfektion jälkeen solut käsiteltiin tai ei IFN-γ (10 ng /ml) 8 tuntia ja supernatantit saatiin ja alistettiin Transwell migraatiokokeessa, kuten on kuvattu B. PML-proteiinin ilmentymistä tarkastettava kunkin määrityksen immunoblottauksella. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmea koetta. Bars, SD. *

P

0,05.

Menetys PML parantaa IFN-γ aiheuttama IP-10 ilmentyminen

Chemokines, perheen kemotaksista sytokiinien, edistää maahanmuuttoa kiertävien leukosyyttien /lymfosyyttien tulehduskohtiin ja vahingon. Tutkitaan onko kemokiinitasoihin vaikutti

PML

perimäluokituksesta, kemokiini geenin ilmentymistä tutkittiin käyttäen ribonukleaasisuojausmäärityksestä (RPA).

PML

+ /+ ja

PML

– /- hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluja inkuboitiin poissa tai läsnä IFN-γ varten 0-24 , kokonais-mRNA kerättiin eri ajankohtina, ja niille RPA. In

PML

– /- MEF-solut, IP-10-mRNA: n tasot nousivat 1,5-kertainen 2 h, ja tuli merkittävästi koholla (8-kertainen), 4 h (kuvio 3A). RANTES mRNA kohoamiseen 3,2-kertainen 0,5 tuntia, ja pysyi koholla, mutta vähemmässä määrin (1,3-kertainen), 8 h jälkeinen IFN-γ hoitoa

PML

– /- MEF . Muut kemokiini geenejä, mukaan lukien MIP-1, MIP-2, ja MCP-1, eivät havaittavasti ilmaistu

PML

+ /+ tai

PML

– /- MEF-solut (tuloksia ei ole esitetty). STAT-1 ekspressio lisääntyi altistumisen jälkeen IFN-γ molemmissa solutyypeissä, mutta ei eroa ollut selvää, kun IFN-γ tasot verrattiin toisiinsa

PML

+ /+ ja

PML

– /- solut. Koska transkriptio IP-10-geeni merkittävästi koholla IFN-γ-stimuloidun

PML

– /- MEF, mittasimme asiaan proteiinin tasot viljelysupernatanteista

PML

+ /+ ja

PML

– /- MEF-solut, käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Yhdenmukainen RPA tuloksia, korkeampaa IP-10-proteiinin näkyivät kunnostetussa alustassa IFN-γ-käsitelty

PML

– /- MEF-solut (kuvio 3B). Lisäksi, IP-10 mRNA: n ekspression

PML

siRNA-transfektoiduissa NIH3T3-solut on parantunut verrattuna kontrolli-siRNA-transfektoiduissa soluissa, seuraavat IFN-γ hoitoa (kuvio 3C). Väheneminen ilmentyminen PML-proteiinin

PML

siRNA-transfektoiduissa NIH3T3-solut varmistettiin immunoblottauksella.

– /- MEF verrattuna

PML

+ /+

villityypin soluissa. (A) RNA:

PML

+ /+ ja PML

– /- MEF-solut käsiteltiin IFN-γ (10 ng /ml) 0-24 h saatettiin ribonukleaasisuojausmäärityksestä ( RPA). Kvantifiointi IP-10, RANTES ja STAT-1 mRNA (kaksinkertaistuu) laskettiin jakamalla densitometrisellä arvo kunkin kaistan vastaavilla GAPDH arvoa. (B)

PML

+ /+

ja

PML

– /- MEF-soluja inkuboitiin poissa tai läsnä ollessa IFN-γ (10 ng /ml) 12 h. IP-10-proteiinin viljelmän supernatantit analysoitiin ELISA: lla ja normalisoitu solun proteiinipitoisuus. Suhteellinen pitoisuus laskettiin normalisoitu summa jaettuna normalisoitu määrä käsittelemätöntä

PML

– /- MEF-soluissa. (C) NIH3T3-fibroblastit transfektoitiin ohimenevästi joko

PML

siRNA tai kontrolli-siRNA. Kaksi päivää transfektion jälkeen, solut käsiteltiin tai ei IFN-γ varten 0-24 h, ja analysoitiin immunoblottauksella havaitsemiseksi PML-proteiinin ilmentymisen ja RT-PCR: IP-10-mRNA: n. Kvantifiointi (Quant) IP-10 mRNA laskettiin jakamalla densitometrisellä arvo kunkin kaistan vastaavalla aktiini-mRNA arvoa. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmea koetta. Bars, SD. *

P

0,01.

Alennettu PML ilmentyminen korreloi käänteisesti IP-10-proteiinin tasot mahasyövässä kudosten ja SNU-638 solut

Seuraavaksi tutkimme suhdetta IP-10 ja PML-proteiinin ilmentymistä kehittynyt mahakarsinoo- kudosta. Cancer kudokset immunohistokemiallisesti värjättiin PML ja IP-10, ja intensiteetti IP-10 immunopositivity mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Keskimääräinen intensiteetti IP-10 oli 1,2 14 näytteissä osoittaa diffuusi positiivisuus (DP) PML, 2,2 19 esiintymät polttoväli positiivisuus (FP), ja 2,0 vuonna 16 näytettä, joissa oli täydellinen menetys (CL) PML ilmaisun ( Kuva 4A, vasen paneeli). Merkittävä nousu IP-10 ilmentyminen havaittiin näytteissä osoittaa polttoväli positiivisuus PML (

P

= 0,034), verrattuna osoittavat hajanainen positiivinen PML ilme. Lisääntyminen IP-10 ilmentyminen havaittiin, kun täydellinen menetys PML oli ilmeistä, kuin mitä havaittiin, kun PML oli hajanaisesti ilmaistuna; mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Edustavia esimerkkejä vaihtelut PML-proteiinin asema, joka korreloi eri IP-10 ekspressiotasot kasvainsoluissa kehittyneistä mahakarsinoomat esitetään (kuvio 4A, oikealla). Tutkia edelleen suhdetta IP-10 ja PML-proteiinin ilmentymistä mahan sinoomasolulinjoja, IP-10-proteiinin tasot mitattiin viljelmäsupematanteista SNU-638-solut transfektoitiin joko

PML

siRNA tai PML IV exression vektori. Soluja kasvatettiin ilman tai sen läsnä ollessa IFN-γ: ssa 8 tuntia, supernatantit kerättiin, ja IP-10-tasot määrällisesti siinä (ELISA-menetelmällä). IFN-γ-indusoidun IP-10: n eritystä tehostaa merkittävästi SNU-638-

PML

siRNA-transfektoiduissa soluissa, verrattiin SNU-638-solut transfektoitiin ohjaus siRNA (kuvio 4B). Transfektio SNU-638 PML IV ekspressiovektorilla tukahdutetaan IFN-γ aiheuttama IP-10 eritystä (kuvio 4C). Tulokset osoittavat selvästi, että eritystä IP-10 mahalaukun syövän solujen kasvaa, kun PML ilmentyminen vähenee.

(A) immunohistokemiallinen värjäys PML ja IP-10-proteiinin ilmentyminen suoritettiin 49 tapauksessa vaiheen IV etenee mahakarsinoomat. Immunopositivity PML-proteiinin luokiteltiin hajanainen positiivisuus (DP, ydin- immuunivaste ≥50% kasvainsolujen), polttoväli positiivisuus (FP; in ≥10%, mutta 50%), tai täydellinen menetys (CL; in 10% ). Kvantitatiivista analyysiä immunoreaktiivisuus IP-10, positiivisesti värjäytyneet alueet mitattiin käyttämällä ImageJ ohjelma, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Edustavia kuvat osoittavat PML ja IP-10-proteiinin ilmentyminen kehittynyt mahakarsinoo- kudokset (oikealla). (B) SNU-638-soluja transfektoitiin ohimenevästi

PML

siRNA tai kontrolli-siRNA. Kaksi päivää transfektion jälkeen soluja inkuboitiin poissa tai läsnä ollessa IFN-γ (10 ng /ml) 8 tuntia. IP-10-proteiinin viljelmän supernatanteista analysoitiin ELISA: lla ja normalisoitu solun proteiinipitoisuus. Suhteellinen pitoisuus laskettiin normalisoitu summa jaettuna normalisoitu määrä SNU-638-soluja, jotka transfektoitiin väliaikaisesti ohjattu siRNA: n läsnä ollessa IFN-γ, ja pitoisuus vanhempien solut mielivaltaisesti asetettu 100%. (C) SNU-638 mahalaukun syövän soluja transfektoitiin ohimenevästi joko tyhjällä vektorilla tai PML IV ekspressiovektoriin. Päivä transfektion jälkeen solut käsiteltiin tai ei IFN-γ (10 ng /ml) 8 tuntia ja supernatantit saatiin ja altistettiin ELISA: lla kuten on kuvattu B. PML-proteiinin ilmentymistä tarkastettava kunkin määrityksen immunoblottauksella. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmea koetta. Bars, SD. *

P

0,05, **

P

0,01.

IP-10 neutralointi vähentää migraation T-solujen

kuten SNU-638-

PML

siRNA sisältävät soluja, jotka ilmentävät alhaisempia PML-proteiinin osoitti parantamiseksi uusien T-solujen ja IP-10 eritys vasteena IFN-γ (kuviot 2 ja 4), tutkimme seuraavaksi onko lisäys IP-10 tasoa helpotti T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine SNU-638 mahalaukun syöpäsolujen stimuloida IFN-γ. SNU-638-

PML

siRNA soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman IFN-γ: ssa 8 tuntia, ja kerättiin supernatantit esikäsiteltiin anti-IP-10 neutraloivan vasta-aineen tai kontrolli-ei-spesifisiä IgG: tä 1 h, ennen aloittamista transwell määrityksessä. Neutraloivien vasta-aineiden tai IgG sisältäviä supernatantteja sijoitettiin alakammioissa, ja muuttoliike Jurkat-solujen ylhäältä alentaa kammioihin analysoitiin tarkastelemalla kerättyjä soluja alakammioissa. Sisällyttäminen IP-10-neutraloivat vasta-aineet inhiboivat Jurkat T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine SNU-638-

PML

siRNA-soluja (kuvio 5A). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​saatuja tietoja NIH3T3-solut; IP-10-neutraloiva vasta-aine inhiboi EL-4-T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine NIH3T3-

PML

siRNA-solut (kuvio 5B).

(A) SNU-638-

PML

siRNA soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman IFN-γ (10 ng /ml) 8 tuntia, ja supernatantti kerättiin ja esikäsiteltiin IP-10 neutraloivat vasta-aineet (5 ug /ml) tai IgG: tä (5 ug /ml) 1 tunti ennen aloittamista transwell migraatiokokeessa. Määrä vaeltavat Jurkat-solut on saatu alemman kammion analysoitiin fluoresoivalla count-helmi välitteisen laskenta virtaussytometrillä. (B) Transwell migraatio EL-4-soluja viljelmäsupematanteista NIH3T3-solut transfektoitiin ohimenevästi

PML

siRNA neutraloivia IP-10-vasta-ainetta tai IgG-ohjaus. Suhteellinen solumigraation määritettiin useissa siirrettyjä soluja jaettuna solujen lukumäärä ja supernatantteja ilman IFN-γ, ja arvo emosoluista mielivaltaisesti asetettu 1. Data esitetään edustavat ainakin kolmen kokeen. Bars, SD. *

P

0,05.

PML Knockdown lisää IP-10 promoottoriaktivoinnilla

Koska IP-10 ekspressio lisääntyi PML pudotus soluissa, me tutkia tarkemmin onko PML-proteiinin ilmentyminen vaikuttaa IP-10-promoottorin aktiivisuutta. Hiiren IP-10-promoottori sisältää oletetun GAS-elementin välissä mukset -246 ja -238 (TTN

5AA) (kuvio 6A). Olemme aiemmin raportoitu, että PML säätelee negatiivisesti transkriptionaalista aktiivisuutta STAT-1 [17]. Sen varmistamiseksi, PML vaikuttaa IFN-γ aiheuttama IP-10-geenin ilmentymisen

kautta

mekanismin liittyy STAT-1, me eristettiin ja tuotti reportterikonstruktio joka alkaa asemassa -330 hiiren IP-10-promoottorin sisältävä oletetun GAS-elementin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. IP-10-

luc

reportteri, joka sisältää GAS-elementin transfektoitiin väliaikaisesti NIH3T3-solut inkuboitiin kanssa tai ilman IFN-γ: ssa 24 tuntia, ja sen jälkeen niistä määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktiivisuus on merkittävästi parannettu NIH3T3-soluissa, jotka on transfektoitu

PML

siRNA, verrattuna soluihin, jotka saavat ohjaus siRNA (kuvio 6B). Kun transfektio NIH3T3-soluja, joilla on PML IV ekspressiovektori, IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktivaatio oli merkittävästi tukahdutettu. Downregulation PML ilmaisun käyttämällä

PML

siRNA ja yli-ilmentyminen PML PML IV ekspressiovektori todennettiin immunoblottauksella. Sen määrittämiseksi, onko estävä vaikutus PML IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktiivisuus on tapahtunut mahalaukun syövän solulinjat, suoritimme samanlaisia ​​kokeita SNU-638 mahalaukun syöpäsoluja. Kuviot nousu ja lasku lusiferaasiaktiivisuuden SNU-638 olivat samankaltaisia ​​kuin NIH3T3-solut (kuvio 6C). Taso PML-proteiinin ilmentymistä SNU-638-solut transfektoitiin joko

PML

siRNA tai PML IV ekspressiovektoriin varmistettiin immunoblottauksella (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Hiiren IP- 10-promoottorin sisältää oletetun GAS-elementin (alleviivattu). (B) NIH3T3-solut ko-transfektoitiin IP-10-luc-reportterin, joka sisältää GAS-elementin ja /tai

PML

siRNA, tai PML IV-proteiinin ekspressiovektorin. Solut olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin hiiren IFN-γ (10 ng /ml) 24 tuntia, ja sitten lusiferaasiaktiivisuus määritettiin. PCMV-β-galaktosidaasi-vektori sisältyi normalisoida transfektion tehokkuutta. Lusiferaasiaktiivisuus on normalisoitu aktiivisuuden puuttuessa IFN-γ ja aktiivisuus emosoluista mielivaltaisesti asetettu 100% (RLA; suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus). Lisääntynyt tai vähentynyt PML-proteiinin ilmentymistä solulysaateista transfektoitiin joko PML IV ilmentämisvektoriin tai

PML

siRNA todennettiin immunoblottauksella, vastaavasti. (C) SNU-638 mahalaukun syövän solut ko-transfektoitiin IP-10-luc-reportterin, joka sisältää GAS-elementin ja /tai

PML

siRNA, tai PML IV-proteiinin ekspressiovektorin ja analysoitiin, kuten on kuvattu B. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. Bars, SD. *

P

0,05, **

P

0,001.

PML pudotus kasvaa IFN-γ aiheuttama STAT-1 DNA: n sitoutumista IP -10 promoottori

vaikutus PML on IFN-γ aiheuttama STAT-1 DNA: n sitoutumista IP-10 promoottori tutkittiin tarkemmin. PML-proteiinin yli-ilmentyminen NIH3T3-soluissa, sen jälkeen kun ohimenevän transfektion kanssa PML IV ekspressiovektori, osittain tukossa IFN-γ-indusoidun STAT-1 DNA: ta sitova ja IP-10-promoottorin, mukaan lukien sekvenssi -246–238 (kuvio 7A, vertaa kaistat 3 ja 5). Kilpailu käyttäen 100-molaarisen ylimäärän leimaamatonta oligonukleotidi, joka koodaa IP-10-promoottorin kumottu kompleksin muodostumista (kaista 6). Tasot PML ja STAT-1-proteiinin ekspression kokosolulysaateista (WCL) ja missä määrin STAT-1 tyrosiinifosforylaation tumauutteita (NE) todennettiin immunoblottauksella. Hyödyntämällä NE päässä NIH3T3-

PML

siRNA-solut saadaan 0,5 tunnin kuluttua IFN-γ hoitoon, vahva sitoutuminen hiiren IP-10-promoottori havaittiin (kuvio 7B, yläpaneeli, kaista 5), ​​verrattuna sitoutuminen nähty NIH3T3-ohjaus siRNA soluja (kaista 3). Samat NE altistettiin STAT-1 konsensus oligonukleotidia, ja STAT-1 DNA: n sitoutuminen oli lisääntynyt NE alkaen NIH3T3-

PML

siRNA soluja (kuvio 7B, keskimmäinen paneeli, vertaa kaistat 3 ja 5). Käyttäen SNU-638 mahalaukun syövän soluja, olemme myös havainneet, että STAT-1 DNA: n sitoutumisen

PML

siRNA-transfektoiduissa SNU-638-solut on parantunut verrattuna ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa, sen jälkeen kun hoito IFN-γ (kuvio 7C, vertaa kaistat 3 ja 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PML osittain estää STAT-1 sitoutumisen IP-10-promoottorin, ja että tämä vaikutus korreloi lisääntyneen IFN-γ-indusoidun IP-10-transkription puuttuessa PML.

(A) tumauutteita (NE) päässä NIH3T3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti PML IV-proteiinin ekspressiovektorin ja käsiteltiin IFN-γ (10 ng /ml) 30 minuutin ajan, inkuboitiin, kun läsnä on radioaktiivisesti DNA-koettimen, joka sisältää GAS-kaltainen elementti IP-10-promoottorin, ja sille suoritettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA). Siirtynyt koetin-proteiini-komplekseja on merkitty nuolella. Lisääntynyt PML-proteiinin ilmentymistä kokosolulysaateista (WCL) transfektoitu PML IV ekspressiovektorilla todennettiin immunoblottauksella. Määrä histoni NE on esitetty valvontaa. (B) NE päässä NIH3T3-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko

PML

siRNA tai ohjata siRNA ja käsiteltiin IFN-γ (10 ng /ml) 30 minuutin ajan, inkuboitiin, kun läsnä on radioaktiivisesti DNA-koettimia, jotka sisältävät kaasu- elementti IP-10 promoottori tai STAT-1 konsensussekvenssi, ja sen jälkeen niille EMSA. Sitova spesifisyys testattiin lisäämällä kasvavia pitoisuuksia kylmä koetin (kilpailija). Tehokas siRNA-välitteinen tukahduttaminen PML-proteiinin ilmentymistä tarkastettava kunkin määrityksen immunoblottauksella. (C) SNU-638 mahalaukun syövän soluja transfektoitiin ohimenevästi joko

PML

siRNA tai ohjata siRNA ja käsiteltiin IFN-γ (10 ng /ml) 30 minuutin ajan. NE saatiin, inkuboitiin, kun läsnä on radioaktiivisesti DNA-koettimien, jotka sisältävät STAT-1 konsensus-sekvenssin, ja analysoitiin sitten EMSA kuten on kuvattu B. tasot PML ja STAT-1-proteiinin ekspression WCL ja laajuus STAT-1 tyrosiini fosforylaatio NE todennettiin immunoblottauksella. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolmen kokeen.

Keskustelu

histopatologinen tutkimukset ovat osoittaneet, että tulehduksellinen microenvironment kasvaimia on ominaista läsnäolo mononukleaaristen solujen infiltraatteja, sekä tukevat strooman ja kasvain alueilla. Kuitenkin tarkka mekanismeja, joilla mononukleaarisolujen tunkeutuu ja on jatkuvaa kuluessa syövän kudoksissa tällä hetkellä ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme todisteita siitä, että menetys ilmentymisen tuumorisuppressoriproteiinia, PML, edistää parantaminen lymfosyyttien tunkeutumista mahasyövässä kudokseen,

kautta

sääntely IP-10 ilmentyminen.

Tutkimme funktio PML suhteen lymfosyyttien rekrytointi käyttäen ihmisen mahasyövän kudosnäytteitä,

PML

+ /+ ja

PML

– /- MEF, ja PML pudotus sekä NIH3T3 ja SNU-638 soluja. Saadut tiedot sekä ihmisen kudoksesta testejä ja Transvvell- muuttoliike analyysit osoittivat, että menetys PML edistää lymfosyyttiliikennettä; Näin olemme pyrkineet syntyminen että mahdollisesti selittää nämä havainnot. Osoitamme, että kasvu IP-10 tasoa syöpäsoluissa ilmentävät alhainen PML osallistuu lymfosyyttien rekrytointi.