Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime vuosikymmenellä, uusia todisteita on sekaantunut ihmisen hermostoon vaikuttavat virus JC virusta patologia paksusuolen syöpä. Kuitenkin mekanismit JC-viruksen välittämän oncogenesis vielä ole täysin määritetty. Yksi ehdokas välittää nämä vaikutukset on viruksen varhaisen transkription tuotteen T-antigeeni, jolla on kyky inaktivoida solusykliä sääteleviä proteiineja kuten p53. Vuonna medulloblastoomien, T-antigeenin on osoitettu sitoutuvan Wnt-signalointireitin proteiinin β-kateniinin; Kuitenkin vaikutukset tämän vuorovaikutuksen loppupään solusykliä sääteleviä proteiineja eivät ole tiedossa. Vuonna Näiden havaintojen valossa, tutkimme yhdistys T-antigeenin ja ydinvoiman β-kateniinin paksusuolisyövän tapauksissa ja vaikutuksia tämän kompleksin aktivoitumisen transkription ja solun lukiertosäätelijöistä c-Myc ja sykliini D1

in vitro

. Geenimonistus osoitti läsnäolo viruksen sekvenssien 82,4%: ssa tapauksista ja havaitsimme ilmentymistä T-antigeenin in 64,6% tapauksista immunohistokemiallisesti. Edelleen olemme huomanneet, että T-antigeeni ja β-kateniinin co-lokalisoitu ytimet kasvainsolujen ja olemme vahvistaneet fyysinen sitoutuminen näiden kahden proteiinin välillä

in vitro

. Ydin- läsnäolo T-Antigen ja β-kateniinin johti merkittävää parannusta TCF-riippuvaisen promoottorin aktiivisuutta ja aktivointi β-kateniinin loppupään tavoitteet, c-Myc: llä ja sykliini D1. Nämä havainnot tarjoavat lisää näyttöä rooli JCV T-antigeeni on dysregulaatio Wnt-signalointireitin aktivaatio ja patogeneesissä paksusuolen syöpä.

Citation: Ripple MJ, Parker Struckhoff A, Trillo-Tinoco J, Li L, Margolin DA, McGoey R, et ai. (2014) Activation c-Myc ja sykliini D1 JCV T-antigeeni ja β-kateniinin Colon Cancer. PLoS ONE 9 (9): e106257. doi: 10,1371 /journal.pone.0106257

Editor: Shao-Jun Tang, University of Texas Medical Branch, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2014; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2014; Julkaistu: 17 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Ripple et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli mahdollista ansiosta myöntää P20 RR021970 National Institutes of Health, LDV. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen vakava terveysongelma ympäri maailmaa, vaikka kehitys diagnosointiin ja hoitoon. Se on kolmanneksi eniten yleinen syövän ilmaantuvuus ja on toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus Yhdysvalloissa, missä on arviolta 140000 uutta tapausta ja 50000 CRC liittyvät kuolemat vuodessa [1]. Riski sairastua satunnaista paksusuolen syövän väestössä on 5%, mutta tämä ilmaantuvuus kasvaa iän takia kertymisestä geneettiset ja epigeneettiset muutokset [2]. Jotkut näistä muutoksista voivat aiheuttaa ympäristötekijät, mukaan lukien virukset, jotka on liitetty useisiin muiden syöpien. Useat riippumattomat tutkimukset ovat osoittaneet, että noin 20% kaikista syövistä aiheutuu tartunnanaiheuttajien [3], [4]. Yksi tällainen aine on ihmisen neurotrooppisesta JC-virus (JCV), jäsen

Polyomaviridiae

perhe, joka sisältää myös SV-40, BK-virus (BKV) ja äskettäin löydetty Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV), löydetty voidaan kloonaamalla integroitu suuri prosenttiosuus Merkelin solun karsinoomat. JCV on perustettu aiheuttava aine Progressiivinen multifokaalinen leukoenkefalopatia (PML), demyelinoiva tauti HIV-potilailla [5], ja viimeksi potilailla, joille immunomodulaarisia hoitoa [6]. Viime vuosikymmenen aikana, useat laboratoriot ovat osoittaneet, että JCV liittyy erilaisiin ihmisen syöpiin, kuten aivokasvaimia [7], [8], keuhkosyöpä [9], ja pahanlaatuisia kasvaimia ja ylemmän ja alemman ruoansulatuskanavan [10] – [12 ].

JCV on kaikkialla läsnä oleva virus, joka tarttuu suuri osa väestössä. Mukaan seroepidemiologiset tutkimuksissa ensisijainen infektio JCV esiintyy varhaislapsuudessa ja yli 70-90% aikuisista ovat positiivisia anti-JCV vasta [13], [14]. Vaikka ensisijainen infektio on oireeton, ehdotettu tartuntatapa on hengitysteiden kautta, jonka jälkeen JCV perustetaan piilevä infektio munuaisissa. Noin 30%: lla terveistä seropositiivisten yksilöitä, JCV vuodatetaan virtsaan normaaliolosuhteissa [15], [16]. Tämän seurauksena, ehjä JCV hiukkaset on eristetty näytteistä raaka kaupunkien jäteveden ympäri maailmaa [17], [18], jotka yhdessä havainnon virus-DNA epiteelisoluissa ylemmän ja alemman ruoansulatuskanavan [19], ehdottaa lisäksi lähtökohdaksi viruksen kautta maha-suolikanavan kautta altistuminen saastuneen veden tai elintarvikkeiden. Tärkeää on, Bofill-Mas,

et ai

osoitti, että viruspartikkelit eristettiin jäteveden säilyi ennallaan käsittelyn jälkeen pH: ssa 1 30 minuuttia, mikä osoittaa, että nauttiminen saastuneen veden tai elintarvikkeiden voi olla riittävä JCV infektio maha-suolikanavan [20]. Monet tutkimukset vuodesta, ovat osoittaneet läsnäolo JCV genomisekvenssien ja ilmentymistä T-antigeenin kudoksissa ruoansulatuskanavan kasvaimet, kuten ruokatorven syöpä [11], mahasyöpä [12], [21], [22], satunnaista adenomatous polyypit [ ,,,0],23], ja peräsuolen adenokarsinoomat [10], [24] – [30].

JCV genomi on noin 5,2 kb kooltaan, ja ne voidaan jakaa kolmeen alueeseen: aikaisin viruksen genomin alueella (EVGR), myöhään viruksen genomin alueella (LVGR), ja ei-koodaavan valvonta-alue (NCCR), joka sisältää replikaation aloituskohdan, ja se sijaitsee alussa ja lopussa genomialuetta. EVGR koodaa voimakas kasvaimia synnyttävän proteiinin, suuri T-antigeeni, kun taas LVGR koodaa viruksen kapsidiproteiinit VP1, VP2 ja VP3, sekä Agnoprotein, pieni lisälaite tuotteen [31]. Nykyisen mallin JCV-välitteisen syövän synnyn kuuluu integrointi osien JCV genomin, erityisesti T-antigeenin geenin, jota on ehdotettu lisätä riskiä sairastua syöpään, koska myöhemmin ilmentymisen T-antigeenin. Tämän tueksi mallin Theodoropoulos

et al

osoitti JCV viruskuorma oli 10- ja 50- kertaa suurempi paksusuolen ja -adenokarsinoomien verrattuna vastaaviin normaaleihin kudokseen [32]. Lisäksi Coelho

et al

viime aikoina osoittaneet, että CRC kudos on huomattavasti suurempi suhteellinen tiheys JCV genomisekvenssien kuin viereisen normaali limakalvo ja etäinen normaali limakalvo [33].

muuttamassa kyvyt JCV T -Antigen

in vitro

tunnetaan hyvin [34].

In vivo

T-antigeeni aiheuttaa erilaisia ​​Keskushermoston kasvainten kun ruiskutetaan aivoihin jyrsijöiden ja kädellisten, jotka vaihtelevat medulloblastoomien ja gliatuumorit [35] – [37]. Siirtogeenisiä hiiriä, jotka ilmentävät JCV T-antigeenin päässä NCCR kehittää kasvaimia neuroektodermaalinen alkuperää, sisältäen medulloblastoomien, gliatuumorit, ja pahanlaatuinen ääreishermoston tuppi kasvaimia [38] – [40]. Tämä muutosprosessi tapahtuu vuorovaikutuksen kautta T-antigeenin keskeisten solusykliä sääteleviä proteiineja, mukaan lukien p53, Rb, ja Keski-signalointi molekyylin Wnt signalointireitillä, β-kateniinin [41] – [43].

β-kateniinin usein väärin säädellystä paksusuolen syöpä [44], [45]. Tasot β-kateniinin niitä valvotaan sen tuhoaminen kompleksi, joka koostuu proteiineista APC, ak- siini, GSK3, ja CK1, jotka merkitsevät sitä ubikitinaation. Mutaatiot komponentit tuhoa kompleksi voi johtaa poikkeavaan lokalisoituminen tumaan β-kateniinin, joka on vakiintunut mekanismi syövän kolorektaalisyövässä [44], [46], joka johtaa aktivaatioon Wnt-reitin kohdegeenien puuttuessa Wnt signalointi ja johtaa valitsematta soluproliferaatiokokeessa [2]. Vaikka Wnt -systeemi aktivoituu geneettinen mutaatiot yli 90% paksusuolen syövän tapauksista [47], ydin- β-kateniinin ilmentymistä vain havaitaan noin 50%: ssa tapauksista [48], mikä viittaa siihen, että on olemassa muita tekijöitä, jotka edistävät ydinaseiden lokalisaatio β-kateniinin paksusuolen syöpä. On osoitettu, että JCV T-antigeeni on kyky sitoa β-kateniinin kautta vuorovaikutuksessa C-päähän β-kateniinin [41], ja että T-antigeeni voi vakauttaa β-kateniinin glioblastoomasoluissa [49]. Lisäksi T-antigeeni on klassinen tumalokalisaatiosignaalin (NLS) ja ilmentyy voimakkaasti pääasiassa ytimet neoplastisten solujen [10], [42], [50]. Siksi pyrimme vaikutuksen määrittämiseksi JCV T-antigeeni on ydinvoiman lokalisoinnin β-kateniinin ja rooli tämän kompleksin aktivoitumisen β-kateniinin kohdegeenien mekanismina kehitettäessä ja etenemisen paksusuolen syövän.

nykyisessä tutkimuksessa mitataan yleisyys T-Antigen genomisten sekvenssien ja proteiinien ilmentyminen ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin käyttämällä kokoelma hyvin tunnettu biopsianäytteissä. Mikä tärkeintä, me osoittavat yhdistys T-antigeenin ja ydinvoiman β-kateniinin ihmisen paksusuolen syövän näytteitä ja kehittää tätä yhdistyksen selvittämiseen molekyylitason vaikutuksia tämän vuorovaikutuksen dysregulaatio Wnt signalointikaskadissa ja aktivointi β-kateniinin tavoitteet käyttäen koolonsyöpäsolulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

yhteensä 113 de-tunnistetaan parafiiniin upotettu näytteitä peräsuolen syöpä ja pre-neoplastisia polyypit kerättiin patologian arkistoista seuraavat laitokset: LSUHSC-New Orleans (34 näytettä) ja Ochsner Clinic (79 näytettä). Kasvaimet olivat histologisesti porrastettu ja immunohistokemiallisesti ominaista WHO: n mukaan luokittelu kasvaimet ruoansulatuskanavassa.

DNA Extraction ja analyysi

Erillisen mikrotomin käytettiin osiossa parafiiniblokit jotta saastumisen estämiseksi. Lisäksi lohko ja teränpidin olivat ajoittain autoklavoitiin ja uusi, kertakäyttöinen terä käytettiin kunkin näytteen. DNA uutettiin noin 10 osien 10 um paksuus kustakin kudosnäytteiden käyttämällä QIAamp Tissue Kit, mukaan valmistajan ohjeiden (Qiagen). PCR-monistus T-antigeenin geenin suoritettiin käyttäen PEP1 ja Pep2 alukkeita (nukleotidit 4255-4272 ja 4408-4427, vastaavasti), jotka vahvistavat sekvenssien N-pään alueen JCV T-antigeenin (PEP1 sekvenssi: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC; Pep2 sekvenssi : AGGTGCCAACCTATGGAACA). Monistamiseen Control alue (CR), käytimme NCRR1 ja NCRR2 alukkeita, joka vastaa nukleotidejä 4993-5004 ja 258-279, vastaavasti (NCRR1 sekvenssi: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG; NCRR2 sekvenssi: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). Monistus suoritettiin 250 ng templaatti-DNA: ta kanssa Failsafe PCR -järjestelmää (Epicentre) kokonaistilavuudessa 25 ui. PCR ajettiin seuraavissa olosuhteissa: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 30 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 s, pariutuminen 62 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s. Koska irtisanominen askel laajentaminen aikaan viime kierron nostettiin 7 min. Näytteet monistettiin ilman templaatti-DNA toimi negatiivisena kontrollina, kun taas DNA: ta T-antigeenin positiivisia BSB8 soluja käytettiin positiivisena kontrollina jokaisessa menettelyssä. Southern blot suoritettiin ratkaista 10 ui kutakin PCR-reaktiota 2% agaroosigeelillä. Sitten geeli käsiteltiin 15 min kukin 0,2 M HCl: depurinaatio, 1,5 M NaCl /0,5 M NaOH denaturoinnin, ja 1,5 M NaCl /0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralointiin, jota seuraa siirto monistetut fragmentit geelistä nailonkalvoille (Hybond-N, Amersham). Sitten membraanit ennalta hybridisoitiin 1 tunnin EasyHyb liuosta (Roche), jota seurasi hybridisaatio samassa liuoksessa, joka sisältää 2 ug DIG-leimatun oligonukleotidin, joka on spesifinen JCV T-antigeenin (nukleotidit 4304-4405) yön yli. Synteesiin käytetyt primerit DIG-leimattu koetin ovat PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) ja PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). CR koetin käytimme alukkeita nukleotideistä 62-81. Koettimet syntetisoitiin käyttäen DIG DNA Labeling ja Detection Kit (Roche). Kalvoja hybridisoitiin yön yli, pestiin ja kehitettiin käyttäen DIG Wash ja Block Buffer Set noudattamalla valmistajan ohjeita (Roche).

DNA-sekvensointi valvonta-alue, suoritettiin käyttäen ABI Prism 3730x /DNA-analysaattori. Monistamiseen DNA housekeeping-geeni GAPDH, seuraavia alukkeita käytettiin:

5 ’TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3’ ja 3 ’GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC 5’.

Histologinen ja immunohistokemiallinen analyysi

parafinoidut kudoksen aiemmin kiinnitettiin 10% puskuroidussa formaliinia leikattiin 4 um paksuus ja kiinnitettiin ladattu dioja. Leikkeitä sijoitettiin uuniin 65 ° C: ssa sulaa parafiini ja sitten parafiini kolmeen kertaan ksyleeniä 30 min kukin. Sitten leikkeitä rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen läpi alkoholien jopa vettä, ja ei-entsymaattinen antigeenin haku suoritettiin 0,01 M natriumsitraatti (pH 6,0) 97 ° C: ssa vakuumiuunissa 35 min. Jäähdytysajan jälkeen 25 min, leikkeet huuhdeltiin PBS: llä, ja endogeeninen peroksidaasi pysäytettiin inkuboimalla liukuu metanoli /3% H

2O

2 30 min ajan huoneenlämpötilassa. Osiot blokattiin 2% hevosen seerumia ja inkuboitiin yön primaarisilla vasta-aineilla huoneenlämpötilassa kosteutetussa kammiossa. Vasta-aineita käytettiin tunnistamaan viruksen proteiineja sisälsi hiiren monoklonaalinen vasta-aine SV40: n suuren T-antigeenin, joka reagoi ristiin JCV T-antigeenin (klooni pAb416, 1:100 laimentamista; Calbiochem) ja hiiren monoklonaalinen anti-β-kateniinin-vasta-ainetta (klooni E -5, 1:100 laimennus; Santa Cruz Biotechnology). Huuhtelun jälkeen osiot PBS, levyt inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa biotinyloidun anti-hiiri-vasta-aineita ja sitten huuhdottiin PBS: ssä. Kudos jälkeen inkuboitiin avidiini-biotiini-peroksidaasi-komplekseja 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Vector Laboratories), ja lopuksi, leikkeet kehitettiin 3,3′-diaminobentsidiiniä substraattina (Sigma), vastavärjättiin hematoksyliinillä, ja peitettiin Permount-peitinlaseilla (Fisher). Arvioida osa immunomerkatut solujen yksilöitä kunkin potilaan tapauksessa merkinnän indeksi määritellään positiivisten solujen prosenttiosuuden kokonaismäärästä kasvainsolujen laskettiin määritettiin.

Double-merkinnät Immunofluoresenssikoe

Immunofluoresenssitutkimuksia ja kaksinkertainen merkitseminen parafiiniin upotettujen leikkeiden, deparaffinization, antigeeni haku, endogeeninen peroksidaasi sammutusta ja esto suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Sillä immuunifluoresenssivasta kaksinkertainen merkitseminen HCT116 solujen viljelyn jälkeen solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin kylmällä asetonilla, ja tukossa PBS, joka sisälsi 5% hevosen seerumia ja 0,1% BSA: ssa 2 tuntia. Kohdat tai soluja inkuboitiin sitten hiiren anti-T-antigeeni-vasta-aine (klooni pAb416, 1:100 laimennus, Oncogene Science) ja kanin anti-β-kateniinin-vasta-ainetta (klooni D13A1, 1:100 laimennus Cell Signaling) 16 tuntia ja sen jälkeen pesu PBS: ssä ja inkuboimalla anti-hiiri-rodamiini vasta-aine ja anti-kani fluoreskeiini-aineella (1:200 laimennus; Vector Laboratories). Lopuksi leikkeet pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin vesipitoisessa kiinnitysväliaineet DAPI (Vector Laboratories), ja visualisoida -konfokaalimikroskoopilla (Olympus FV1000).

Transient Transfektio ja Luciferase rakentaa

HCT116-solut ystävällisesti Dr. Hamid Boulares. Solut transfektoitiin käyttäen Xtreme Gene-HP (Roche). Seuraavat konstruktit käytettiin Lusiferaasimäärityksiä: M72 Super 16x TOPflash reportteri-konstrukti: Addgene plasmidi 17165; M51 Super 8x FOPflash: Addgene plasmidi 12457; c-Myc promoottori: Addgene plasmidi 16595; Sykliini D1-promoottori: Addgene plasmidi 32727. Nämä reportteri rakenteet transfektoitiin yksinään tai yhdessä pcDNA-T-Antigen ja /tai pcDNA-β-kateniinin ja niistä määritettiin lusiferaasiaktiivisuus käyttämällä Luciferase Assay System (Promega) 24 tuntia transfektion jälkeen.

Protein Extraction, Co-immunosaostus ja analyysi

Sytoplastiset ja tumaproteiiniuutteet HCT116-solut kerättiin käyttäen sytoplasman lyysipuskuria ja ydinvoiman lyysipuskuria kuten aikaisemmin on kuvattu [51]. Lyhyesti, solut trypsinoitiin, pelletoitiin 2000 g: ssä 5 minuutin ajan, ja suspendoitiin uudelleen 500 ul sytoplasman hajotuspuskuria 10 minuuttia jäillä. Seuraavat lyysi solukalvon, tumat pelletoitiin 14000 g 10 minuuttia. Tumat pestään kerran sytoplasman lyysipuskuria, pelletoitiin ja lyysattiin 250 ul ydin- hajotuspuskuria 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa ravistellen. 500 ug kokonaisproteiinia uutetta inkuboitiin 10 ug anti-T-antigeeni tai anti-β-kateniinin vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa ravistellen. Antigeeni-vasta-kompleksit immunosaostettiin sitten Protein A /G-magneettiset helmet (Pierce), pestiin HNTG-puskurissa (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% glyseroli, 0,1% Triton X-100), denaturoitiin ja analysoitiin SDS-PAGE .

Ethics lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti Louisianan osavaltion yliopiston Institutional Review Board ohjeita ja hyväksyntää. Kaikki 113 parafiiniin upotetut ihmisen näytteitä peräsuolen karsinoomat ja pre-neoplastisia polyyppeja, jotka kerättiin patologian arkistoista LSUHSC New Orleans (34 näytettä) ja Ochsner Clinic (79 näytettä). Louisiana State University Institutional Review Board (IRB) luopua tarvetta kirjallista suostumusta, koska näytteet ovat arkistointia, de-tunnistaa ja seurata alla NIH suuntaviivojen vapautusperusteet kudosta, joka heitetään pois eikä sitä voida jäljittää potilaille (IRB Protocol # 8077).

tulokset

Expression of T-antigeeni ja β-kateniinin paksusuolisyövän näytteissä

varhainen transkription tuote JCV, T-antigeeni, on hyvin -known voimakas onkogeeniset proteiinia, joka on havaittu eri kasvaimia. Voidakseen vahvistaa läsnäoloa JCV T-antigeeni, suoritimme immunohistokemiallinen kokeita yhteensä 113 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin tapauksissa paksusuolen syöpä 2 of New Orleans suurin hoitolaitosten. Suurin osa näistä näytteet sisälsivät normaalin limakalvon, pre-neoplastisia polyyppien ja molemmat

in situ

ja invasiivisen karsinooman. Olemme löytäneet ilmentyminen T-antigeenin immunohistokemiallisesti ytimet kasvainsolujen 73 näytettä (64,6%). Mielenkiintoista on, että T-antigeeni oli läsnä myös ytimet epiteelisolujen pre-neoplastisia polyypit, mutta täysin poissa normaalissa koolonin epiteelissä (kuvio 1, vasen paneeli).

immunohistokemia alueilla normaalissa paksusuolen epiteelin negatiivinen T-antigeenin, kun taas β-kateniinin ilmentyy sytoplasmassa ja kalvon (Paneelit ja B). T-antigeenin ekspressio on havaittu, että ytimien epiteelisolujen polyyppien ja neoplastisten solujen alueilla invasiivisia kasvain (paneelit C ja E, vastaavasti). Peräkkäistä leikettä samaa tapaukset osoittavat, että β-kateniinin sijaitsee nyt sytoplasmaan ja tumiin epiteelin ja kasvainsolujen (Paneelit D ja F vastaavasti). T-antigeenin negatiivinen tapauksissa kuitenkin, β-kateniinin pysyy sytoplasmassa (Paneelit G ja H). Tilastollinen analyysi paljastaa, että 67,6% T-antigeenipositiiviset paksusuolisyövän tapauksissa ilmaista ydin- β-kateniinin, kun taas vain 40,4% T-antigeenin negatiivinen tapauksissa ilmaista ydin- β-kateniinin (G; p = 0,006) (Panel I). Suhteellinen osuus ytimiä positiivisia β-kateniinin osio pisteytettiin asteikolla 0-4. T-antigeenin positiivisia tapauksia verrokkeja enemmän ytimiä positiivisia β-kateniinin kuin T-antigeeni negatiiviset näytteet (F; * p 0,05) (paneeli J). Double merkinnät immunofluoresenssilla osoittaa kolokalisaation T-antigeeni (rodamiini) ja β-kateniinin (Fluorescein) ytimet neoplastisten solujen taskussa kasvainsolujen alla epiteelin limakalvon T-antigeenin negatiivisista soluista, jossa β-kateniinin pysyy cytoplamic (Panel K). Alkuperäinen suurennos kaikista Immunohistokemian paneelit on 600x, ja immunofluoresenssilla 1000x.

Aikaisemmin olemme osoittaneet, että medulloblastoomien, T-antigeeni pystyy fyysisesti sitoa ja siirtävät β-kateniinin, keskeinen molekyyli Wnt-signalointireitin aktivaatio, tumaan [45], [52]. Sen määrittämiseksi, onko β-kateniinin on läsnä ja liittyvät T-antigeenin paksusuolen syöpä, suoritimme immunohistokemia samassa 113 näytteet ja analysoitiin ilmentymistä ydin- β-kateniinin T-antigeeni positiivisia ja negatiivisia ryhmiä. Huomasimme, että 71 koko T-antigeenipositiiviset paksusuolisyövän näytteitä, 48 osoitti ydin- ilmentymistä β-kateniinin (67,6%), kun taas vain 17/42 (40,5%) ja T-antigeenin negatiiviset näytteet olivat positiivisia ydin- β-kateniinin (p≤0.005, kuvio 1I). Kaikissa T-antigeeni negatiivinen tapauksissa β-kateniinin pysyi sytoplasmassa. Mielenkiintoista, samat huomiot olivat läsnä polyypit, jossa ydin- β-kateniinin korreloi ilmentymistä T-antigeenin. Normaalissa limakalvo, β-kateniinin pysyivät paikallisina sen tavanomaisen sijainnin sytoplasmassa ja kalvo. β-kateniinin ydin- positiivisia soluja pisteytettiin asteikolla 0-4, tuloksella 0 osoittaa, että -5% tai vähemmän soluja ja pisteet 4 osoittaa ~75% tai enemmän soluja ydin- β-kateniinin. T-antigeeni positiivista näytettä oli keskiarvo 1,463 (SD 1.164) ydinalan β-kateniinin, kun taas T-antigeeni negatiiviset näytteet oli keskiarvo 0,8182 (SD 0,9580; p≤0.05, kuvio 1J).

Lopuksi suoritetaan kaksinkertainen merkintä immunofluoresenssimenetelmällä positiivisessa tapauksessa joka sisälsi kolme aluetta (normaali paksusuoli, polyyppi ja syöpä) ja totesi, että normaalissa paksusuolessa, jossa T-antigeeni on negatiivinen, β-kateniinin ilmentyy solulimassa; kuitenkin polyyppien ja neoplastiset solut, jotka ilmentävät T-antigeeni, β-kateniinin on co-paikallistamisen kanssa JCV onkoproteiinia ydinvoima osastoon. Kuva 1, paneeli K osoittaa alueen, joka sisältää normaalin epiteelin huipulla, ilman ilmentymistä T-antigeenin ja sytoplasminen β-kateniinin, kun taustalla tasku kasvainsolujen, jotka voimakkaasti ilmentävät T-antigeeni esittävät ydinvoiman kolokalisaation β kateniinin.

toteaminen JC-viruksen T-antigeenin genomiset sekvenssit kolorektaalisyövässä näytteissä

vahvista läsnä ollessa T-antigeenin geenin, teimme PCR-monistus, jota seuraa Southern blot käyttämällä erittäin spesifinen ja herkkä koetin JCV T-antigeeni on valittu määrä 34 paksusuolensyöpä tapauksissa joka sisälsi korkealaatuista DNA. Kaavamainen esitys JCV genomin on esitetty, joka sisältää sijainti alukkeet Southern blot vahvistusta ja koettimen synteesi (kuvio 2A). Alueella koetin tunnustamista JCV genomin (emäsparia 4304-4405) vaihtelee suuresti välillä JCV, BKV, ja SV40, 20 nukleotidin epäsuhtaan JCV ja BK-virus, ja 33 nukleotidin epäsuhtaan JCV ja SV40 tällä alueella. Vaikka PEP1 ja Pep2 alukkeita monistamaan sekä JCV ja BKV T-antigeeni meidän koetin tunnustaa välisellä alueella PEP1 ja Pep2 alukkeilla on erittäin spesifinen JCV ja ei sitoudu BKV tai SV40 [53].

Kaavamainen edustus Mad-1-kanta JCV genomista rakennetta osoittaa viruksen geenejä punaisena, varhainen ja myöhäinen selostukset harmaana, ja sijainnit käytettyjen alukkeiden T-antigeenin vahvistusta (PEP1 ja Pep2) ja Southern blot koetinsynteesimenetelmiä (PEP INT1 ja PEP INT2) (paneeli A). Genomiset sekvenssit viruksen varhaisen alueen, joka koodaa T-antigeeni, havaittiin 28 34 valitut näytteet. Edustava Southern blot on esitetty, jossa tapauksessa numerot jokaisen kaistan yläpuolella. Negatiiviset tulokset havaittiin, kun samat asiat testattiin koettimia BKV ja SV40. Negatiiviset kontrollit osoittavat tulokset reaktioista, joissa ei ole DNA: ta, ja positiivinen kontrolli edustaa geenin monistus käyttämällä pBJC, plasmidi, joka sisältää JCV DNA: ta templaattina tai plasmideja, jotka sisältävät BKV ja SV40 T-antigeenejä. PCR GAPDH ja agaroosielektroforeesia käytettiin varmistamaan läsnäolo ehjän genomisen DNA: n kaikissa tapauksissa. (Paneeli B). Southern blotit sisältävien plasmidien T-antigeeni JCV, BKV ja SV40 testattiin spesifisiä koettimia kullekin polyoomavirus, osoittaa koettimien spesifisyys (paneeli C). Edustaja Southern blot PCR-monistus ohjaus säätelyalueen on esitetty (paneeli D, vasemmalla). Sekvensointi paljasti, että läsnä on Mad-1 ja Mad-4-kantojen kanssa pistemutaatioita eri näytteissä. Edustava järjestys on kuvattu sinisellä, alla tunnetun sekvenssin Mad-4 CR alue (musta); pistemutaatioita on korostettu punaisella (paneeli D, oikea).

monistettiin genomisista sekvensseistä peräisin T-antigeenin koodaavan alueen 28 näytettä 34 näytettä (82,4%), joista 21 osoittivat T -Antigen proteiinin ilmentyminen immunohistokemiallisesti. Ainoastaan ​​kuudessa tapauksessa löydettiin läsnä viruksen DNA mutta ei proteiinin ekspression, ja näistä tapauksista oli T-antigeenin ilmentymisen puuttuessa viruksen genomisten sekvenssien. Testasimme monistetut sekvenssit erityisiä koettimia BKV ja SV40, johtuva negatiivinen kaikissa tapauksissa. Korkealaatuinen genomista DNA varmistettiin kussakin näytteessä PCR: llä GAPDH. (Kuvio 2B). Lopuksi testattiin myös meidän antureista sisältävillä plasmideilla T-antigeenejä JCV, BKV SV40, joka vahvistaa spesifisyys meidän antureista, ja viittaa siihen, että immunohistokemia paljastaa T-antigeeni JCV eikä toisistaan ​​Polyoomavirusten (kuvio 2C ).

Seuraavaksi suoritettiin PCR-kokeita alukkeita ja koettimia, jotka ovat spesifisiä säätelyaluetta JCV. Amplifioimme virus- sekvenssit 14 34 tapauksessa. Kuviossa 2D esitetään edustava Southern blot, joka sisältää yhtä näistä tapauksista, jotka olivat positiivisia myös T-antigeenin alue. Sekvensointi näistä amplikonien paljasti, että Mad-1 ja Mad-4 olivat kaksi havaitaan tahroja JCV. Kuitenkin kaikki nämä sekvenssit sisälsivät yksittäisiä pistemutaatioita, eroavat toisistaan, mikä viittaa siihen, että nämä ovat todellakin ainutlaatuinen ja heitetään mahdollisuus laboratorion saastuminen. Edustava järjestys on kuvattu sinisellä, alla tietää sekvenssin Mad 4 kanta JCV mustana. Pistemutaatioita on korostettu punaisella (Kuva 2D). Lisäksi yksityiskohtainen yhteenveto tapauksista ja tulokset PCR-monistuksen ja sekvensointi sekä immunohistokemiallisesti on esitetty taulukossa 1.

T-antigeeni ja β-kateniinin kolokalisoituvat tumaan paksusuolen syöpäsoluissa ja co-immuunisaostumassa

in vitro

Aikaisemmat tutkimukset viittaavat siihen, että T-antigeeni ja β-kateniinin vuorovaikutuksessa suoraan muutoksia normaaliin sytoplasmisen solunosasijaintia β-kateniinin. Jotta vahvistaa nämä havainnot

in vitro

ja määrittää, onko T-antigeeni ja β-kateniinin ovat läsnä samassa soluosastoon paksusuolen syöpäsoluissa, suoritimme kahden merkintöjä immunofluoresenssimenetelmällä näiden kahden proteiinien HCT116-paksunsuolen tasyöpäsolulinja ohimenevästi transfektoitu T-antigeeni. Olemme havainneet, että solut, jotka ilmentävät onkoproteiinia osoittavat vahvaa ydin- ilmaus β-kateniinin (kuvio 3D-E, nuolet), kun taas solut, jotka eivät saa transfektoidut ja eivät ilmennä T-antigeeni, β-kateniinin pysyy sytoplasmassa (kuvio 3D-E, nuolenkärjet).

Double merkintöjä immunosytokemiassa varten β-kateniinin (paneeli B, Fluoreseiini), ja T-antigeeni (paneeli C, rodamiini), suoritetaan HTC116 koolonkarsinoomasoluissa transfektoitiin väliaikaisesti T-antigeeni näytettävä kolokalisaation sekä proteiinien ytimet suurin osa soluista (paneeli E, nuolet), kun taas ei-transfektoiduissa soluissa, joissa ei ole ilmentymistä T-antigeeni, β-kateniinin jää yksinomaan sytoplasmassa (paneeli E, nuolenpäät).

määritellä tarkemmin subsellulaarisen sijainnin fyysisen vuorovaikutuksen T-antigeeni ja β-kateniinin, teimme co-immunoprecipiation ydin- ja sytoplasmista uutteiden HCT116-soluja, jotka on transfektoitu T-Antigen ilmentämisvektoriin tai tyhjän vektorin verrokkeina. Ydin- ja sytoplasminen lysaatit inkuboitiin anti-T-antigeeni-vasta-aine ja immunokompleksien analysoitiin Western blotilla vasta-aineilla T-antigeeni ja β-kateniinin. T-antigeenin immunosaostumissa tumasta ja sytoplasmassa esittävät yhdessä saostumisen β-kateniinin molemmissa osastoissa (kuvio 4A). Me vahvisti tämän vuorovaikutusta käänteinen kokeessa (β-kateniinin IP, T-antigeenin Western blot- kuva 4B). Spesifisyys ydin- ja sytoplasman jakeet vahvistettiin hyvää tulo kaistaa Grb-2 (sytoplasmisen) ja Lamin A /C (ydinvoima).

HCT116-solut transfektoitu T-antigeeni tai tyhjän vektorin fraktioitiin eristämään ydin- ja sytoplasminen lokeroita ja immunosaostettiin vasta-aineella T-antigeeni (A) tai β-kateniinin (B). T-antigeeni vetää alas β-kateniinin sytoplasmassa (yläpaneeli, kaista 6) ja tumassa (yläpaneeli, kaista 8). Käänteisen koe (IP β-kateniinin) vahvistaa vuorovaikutusta T-antigeeni ja β-kateniinin sytoplasmassa (alapaneeli, kaista 6) ja nucleus (alapaneeli, kaista 8).

T -Antigen aktivoi TCF-riippuvaisen transkription

jälkeen vahvistus siitä, että T-antigeeni ja β-kateniinin co-paikantuvat ja vuorovaikutuksessa tumassa, tutkimme vaikutuksia tämän vuorovaikutuksen aktivointi β-kateniinin kohdegeenien. Hyödynsimme TOPflash reportterikonstruktio mittaamaan muutoksia β-kateniinin /TCF-välitteisen transkription. TOPflash rakenne sisältää 16 TCF sitovia osia (TBE-junia) ajo lusiferaasi-geenin. HCT116-solut transfektoitiin TOPflash ja joko T-antigeeni, β-kateniinin tai molemmat T-antigeeni ja β-kateniinin. Luminesenssi mitattiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Kaikki ryhmät erikseen transfektoitu FOPflash mitata perustason luminesenssin. T-antigeeni tai β-kateniinin yksin merkittävästi aktivoida TOPflash 2-kertaiseksi ja 5-kertaiseksi tyhjän vektorin ohjaus, vastaavasti. Silmiinpistävän, solut, jotka ilmentävät T-antigeeniä ja eksogeenisen β-kateniinin osoitti 113-kertainen TOPflash aktiivisuuden yli perustason (kuvio 5A, p≤0.001). Nämä tiedot osoittavat kyky T-Antigen ja β-kateniinin synergistisesti aktivoida promoottorit β-kateniinin kohdegeenien. Arvot on normalisoitu FOPflash-transfektoiduissa soluissa.

HCT116-solut ko-transfektoitiin Wnt-reitin reportteriplasmidilla TOPflash rakentaa ja T-antigeeni, β-kateniinin tai molemmat. Transfektoiduissa soluissa T-antigeeni tai β-kateniinin yksin lisääntynyt TOPflash aktiivisuus noin 2- 5-kertaiseksi lähtötasoon. Kotransfektioon sekä T-antigeeni ja β-kateniinin johti 113-kertainen TOPflash aktiivisuuden. Arvot on normalisoitu FOPflash (lähtötilanne) ryhmät (paneeli A). Mitata aktivoimalla tiettyjä β-kateniinin tavoitteet, samanlaisia ​​kokeita suoritettiin käyttämällä lusiferaasin konstrukteja, jotka sisältävät c-Myc (paneeli B) tai sykliini D1 (paneeli C) promoottorit. Expression of T-antigeenin lisää merkittävästi c-Myc ja sykliini D1 promoottorin aktiivisuutta HCT116-soluissa.