Krooninen sairaus

tiivistelmä

maitorauhasen kehitykseen ja rintasyövän kasvua vaativat useita tekijöitä sekä hormonitoimintaa ja paracrine alkuperää. Analysoimme roolit epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja hepatosyyttikasvutekijä Receptor (Met) in maitorauhasen epiteelisoluissa ja nisäkasvainsoluja peräisin mutatoidun-ErbB2-siirtogeenisiä hiiriä. Käyttämällä erittäin spesifisiä tyrosiinikinaasiestäjiksi huomasimme, että MCF-10A ja NMuMG maitorauhasen epiteelisolujen linjat ovat täysin riippuvaisia ​​EGFR aktivointia niiden kasvua ja selviytymistä. Lisääntymistä ja 3D-monogeneesin määritykset osoittivat, että HGF ei ollut rooli ylläpitää rintarauhasen solujen elinkelpoisuus, mutta oli ainoa sytokiini voi pelastaa EGFR inhiboimatonta rintarauhasen soluihin. Insulin-Like Growth Factor-I (IGF-I), perus-fibroblastikasvutekijää (b-FGF) ja Neureguliini, jotka ovat hyvin tunnettuja rintarauhasen morfogeeniset tekijät, ei pelastus leviämiseen tai morfogeneesin näissä solulinjoissa, seuraavat EGFR estoon. Samoin ErbB2-ajettu kasvainsoluja EGFR-riippuvaista ja myös näyttää HGF välittämän pelastus. Western-blot-analyysi signalointireittien mukana pelastus jälkeen EGFR esto osoitti, että samanaikainen ERK1 /2 ja AKT aktivointi yksinomaan ohjaavat Met, mutta ei IGF-I tai b-FGF. Nämä tulokset kuvaavat ainutlaatuinen rooli EGFR ja Met nisäepiteelisoluissa osoittamalla, että samanlaiset reitit voidaan käyttää kasvaimia synnyttäviä solujen kasvun ylläpitämiseksi ja vastustaa EGFR-suunnatun antituumorigeenistä huumeita.

Citation: Accornero P, MIRETTI S, Bersani F, Quaglino E, Martignani E, Baratta M (2012) Met Reseptori Acts Ainutlaatuisen Survival ja morfogeneesi EGFR-Dependent Normal rintaepiteelisolulinja ja syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (9): e44982. doi: 10,1371 /journal.pone.0044982

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2012 Hyväksytty: 16 elokuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Accornero et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kansallista avustusta Ministry of Instruction, korkeakoulujen ja tutkimuksen, PRIN 2009 ja paikallisten avustuksia Università di Torino ja Compagnia di San Paolo. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kiertävä hormonien kuten estrogeenin, progesteronin, kasvuhormonia ja prolaktiinia olivat ensimmäisiä hormonitoimintaa tekijät tunnistettiin olevan välttämätön maitorauhasen morphogenesis ja erilaistumista kasvun aikana, lisääntymis- syklisyyden ja raskaus [1]. Vaikka suora rooli näiden hormonien tiedetään, viime todisteet osoittavat, että niiden pääasiallinen biologinen toiminta saavutetaan vapauttamaan paikallisen kasvutekijöiden mukaan rintaepiteelisolulinja ja strooman soluja. Nämä tekijät jälkeen hajanainen ja aktivoida niiden reseptorien strooman tai epiteelin osastoja edistää epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä vuorovaikutus. Sekä solun osiin rauhanen, minkä vuoksi tarvitaan oikea kehittämistä tämän elimen [2] – [4]. Nämä epäsuorat signalointimekanismeja että systeemistä ärsyke monistetaan sisällä kohde-elimeen ja että erilaisia ​​solutyyppejä osallistua morfogeeniseen tapahtumiin koordinoidusti ja hienosäädetty paikallisten määräysten mukaisesti.

Useimmat näistä paikallisesti vapautuu molekyylejä toimia erityisten tyrosiinikinaasin reseptorit (RTK) edistetään useita biologisia vasteita, kuten proliferaatiota, remodeling soluväliaineen ja motiliteettia kohdesoluissa. Vaikka jotkin näistä tekijöistä on tarkka ja ainutlaatuinen rooli aikana morphogenesis tai remontin rauhanen, monet signalointireiteissä aktivoituu alavirran eri RTK: iden ovat identtiset. Niinpä nämä reitit voivat toimia tarpeeton aktivoituna samanaikaisesti samassa solussa tyyppi, mahdollisesti vahvistamalla fosforylaatiota Cascade ja sen lopullinen biologinen vaikutus.

Yksi parhaista kuvatun RTK jotka toimivat olennainen morfogeenisiä modulaattori rintarauhasen rauhanen on epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR). Sisällä jyrsijä rintarauhasen, paikallisesti vapautuu amfireguliini, jonka ainoa tunnettu reseptori on EGFR, havaittiin välittävän estrogeenia signaloinnin aikana murrosiän maitorauhasen kehitykseen. Steroidihormoniriippuvainen säädökset stimuloimalla amfireguliini julkaisu estrogeenireseptoripositiiviset epiteelin osastoon rauhanen. Amfireguliini sitten edistää EGFR aktivointia strooman osastoon rauhanen ajo oikeaan haaroitus tämän elimen [5], [6]. Vaikka pääkohteina amfireguliini ovat stroomasolujen, tämä ei sulje pois, että EGFR signalointi on myös rooli epiteelin. EGFR ilmentyy sekä strooman ja epiteelin osastojen [7], [8], ja muut EGFR ligandien, erityisesti EGF, ovat erittäin ilmaistaan ​​rauhaset raskauden aikana [9]. Niinpä ensimmäinen tavoitteena oli arvioida, onko EGFR on rooli maitorauhasen epiteelisolujen kasvuun ja liikevaihdon. Teimme kohdistamalla tämän reseptorin erittäin spesifinen estäjiä. Vaikeus selvennetään EGFR aikuisten rintaepiteelisolulinja osasto on mahdollisesti johtuu siitä, että muihin reseptoreihin, joilla on samanlainen ilme kuvio, voidaan korvata ilman EGFR tai sen ligandien

in vivo

. Itse asiassa, strooman fibroblastit tuottavat monia signaaleja lähialueiden epiteelisoluihin. Useat kasvutekijät, kuten insuliini-like Growth Factor (IGF), fibroblastikasvutekijää (FGF), Neureguliini ja hepatosyyttikasvutekijä (HGF) on ilmaistu rintarauhasen strooman, kun taas niiden reseptoreita löytyy epiteelissä [1]. Erityisesti IGF-I on merkittävä rooli duktaalinen morphogenesis, ja saattaa olla tarpeen myöhempien vaiheiden maitorauhasen kehitykseen [10]. FGFR2 on mukana maitorauhasen kehitykseen, erityisesti leviämisen ja hyökkäystä loppupää silmuja, mutta näyttää tarpeeton kypsillä rauhanen [11], [12]. Neureguliiniproteii- toimii aikana lobulo-keuhkorakkuloiden kehityksen raskaus [13], [14]. Lopuksi tyrosiinikinaasin reseptori HGF, Met, todettiin rooli maitorauhasen aluevaltaus morfogeneesiä

ex vivo

ja

in vitro

kokeiluja [15], [16]. Met voisi olla hyvä ehdokas EGFR korvaavan koska viimeaikainen näyttö on osoittanut, että tämä reseptori ja EGFR voi toimia yhteistoiminnassa aikana munuaisen kehityksen säädellä ureteric alkuunsa haarautuminen ja välittävät ylläpito normaalin aikuisen kerätä kanavaan [17].

tässä tutkimuksessa arvioitiin rintaepiteelisolulinja solulinjoissa onko muita reseptoreita, yleensä läsnä maitorauhasen voisivat auttaa ylläpitämään samanlaisia ​​EGFR-tyyppistä toimintaa ja signaalitransduktioreaktioteiden kun EGFR signalointi ablatoitu antamalla erittäin erityisiä estäjiä. Lopuksi testasimme jos tällainen korvausmekanismien olivat läsnä myös kasvainsolujen eristää hyvin kuvattu siirtogeeninen hiirimallissa ErbB2 rintarauhasen kasvaimien syntyyn.

Tulokset

nisäepiteelisoluissa Express EGFR ja Met reseptorit ja reagoivat HGF tai EGF-hoito fosforylaatio niiden reseptorit ja aktivointi ERK1 /2 ja AKT Väylät

ensin analysoidaan ilmentyminen EGFR ja Met-reseptoreihin ja biokemiallinen vaste niiden ligandien 3 rintarauhasen epiteelisolujen linjat eri alkuperää. Kaikki solut ilmensivät Met ja EGFR (Fig. 1A). MCF-10A ja NMuMG stimuloitiin HGF tai EGF 10 min, 30 min tai 60 min näytetään kasvu fosfo-EGFR, fosfo-Met, fosfo-ERK1 /2 ja fosfo-AKT tasoilla, jotka palasivat vähitellen lähellä perustasoille (kuvio . 1 B). Vastaavia tietoja on jo kuvattu BME-UV-solulinja [18].

Western-blot-analyysi EGFR ja Met ilmentymistä ihmisen MCF-10A, hiiren NMuMG ja naudan BME-UV-nisäepiteelisoluissa. Hiiren maksauute käytettiin positiivisena kontrollina sekä Met ja EGFR. B. Western-blot-analyysi EGFR, Met, ERK1 /2 ja AKT: n fosforylaatiota MCF-10A ja NMuMG soluja viljellään seerumin nälkää väliaineessa ja käsiteltiin EGF: llä tai HGF (20 ng /ml) 10, 30 ja 60 min. EGFR, Met, ERK1 /2 ja AKT käytettiin vertailukelpoiset kuormitusten välillä rataa.

EGFR tarvitaan elinkelpoisuus alajoukko rintaepiteelisolulinja Cell Lines, kun taas Met Aktivointi on Kulutus

Voit testata, onko EGFR tai Met aktiivisuutta moduloida elinkelpoisuus rintarauhasen solulinjoissa käytimme erittäin spesifinen reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (RTKi; AG1478 EGFR ja PHA-665752 Met) nanomolaarisilla pitoisuuksilla. Ensin testataan spesifisyys nämä inhibiittorit stimuloimalla seerumia MCF-10A solujen HGF tai EGF yhdessä AG1478 tai PHA-665752 250 nM (kuvio. S1). Western blot-analyysi osoitti, että AG1478 ja PHA-665752 esti yksinomaan fosforylaation EGFR ja Met vastaavasti.

Nämä inhibiittorit käytettiin sitten elinkelpoisuuden määrityksessä testata riippuvuutta eri rintarauhasen solulinjojen on Met tai EGFR signalointia ( kuva 2A). Solut, viljeltiin niiden kasvualustaan, käsiteltiin AG1478 ja PHA-665752 (250 nM) ja tarkkailtiin MTT 24 ja 48 tuntia. Kaikki rintaepiteelisolulinja solulinjat eivät vaikuttaneet Met estäjä PHA-665752. EGFR inhibitiota AG1478, ei muuttanut BME-UV elinkelpoisuutta, kun MCF-10A ja NMuMG solujen elinkelpoisuus oli suuresti heikentynyt.

MTT-määritystä MCF-10A, NMuMG ja BME-UV solut 0 h, 24 h ja 48 h. Soluja viljeltiin niiden kasvualustaan ​​(katso materiaalit ja menetelmät) ja joko jätettiin käsittelemättä (Ctrl) tai käsitelty PHA-665752 (PHA) tai AG1478 (molemmat 250 nM). MTT arvo 0 h oli asetettu 100%. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baareja, S.E.M. * P 0,01. B. Western-blot-analyysi ERK1 /2 ja AKT: n fosforylaatiota maitorauhasen soluissa viljeltyjen niiden kasvualustaa (Ctrl) tai RTK-estäjien (250 nM, 1 h) PHA-665752 (PHA) tai AG1478 (AG). EGFR, Met, ERK1 /2 ja AKT käytettiin vertailukelpoiset kuormitusten välillä kaistaa.

mekanismin määrittämiseksi elinkelpoisuuden eston välittämä EGFR inhibition me määritettiin aktivaatiotilasta ERK1 /2 ja AKT seuraavat AG1478 tai PHA-665752 kohtelun viljeltyjen solujen lisääntymistä väliaineessa (Fig. 2B). Vasteena hoitoon AG1478, mutta ei PHA-665752, MCF-10A ja NMuMG solujen vähensi sekä ERK1 /2 ja AKT-fosforylaation. Suostumuksella kyvyttömyys estäjien vähentää elinkelpoisuuden, ERK1 /2 ja AKT aktivointi maat olivat muuttumattomina kaikissa olosuhteissa BME-UV-soluissa.

HGF-Met Axis Palauttaa leviämisen, Survival ja morfogeneesiä NMuMG ja MCF-10A Cells menettäneiden EGFR Activity

seuraava tutki Met aktivointi voisi pelastaa soluja kasvun hidastuminen seuraavista EGFR esto. HGF toimi palautusagentin MCF-10A ja NMuMG soluja käsiteltiin AG1478 (Fig. 3A). Koska IGF-I, b-FGF ja Neureguliini on kuvattu tärkeänä välittäjinä maitorauhasen kehitykseen [10], [11], [14] testasimme niiden vaikutuksen mahdollisina vaihtoehtoisina Palautusagentit samassa solulinjoissa. Molemmat ei kasvanut leviämisen vastauksena näihin kasvutekijät seuraavaa AG1478 hoidon (Fig. 3A). HGF välittämä elpyminen käsitellyissä soluissa AG1478 havaittavasti lisääntynyt yhtymäkohdassa MCF-10A (joka kasvaa kompaktin saaria, Fig. 3B vasen paneelit) ja lisääntynyt solujen tiheys NMuMG soluissa (joka kasvaa hajallaan soluja, Fig. 3B oikeanpuoleiset ruudut) .

elävien solujen määrä trypan-sinisellä värjäyksen 48 h MCF-10A (vasen paneeli) ja NMuMG (oikea paneeli) solut viljellään niiden kasvualustaan ​​ja käsiteltiin osoitetuilla tekijät (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), Neureguliini 20 ng /ml (N); AG1478 250 nM (A)). Käsittelemätön kontrolli (Ctrl) on asetettu 100%. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baareja, S.E.M. * P 0,05. B. MCF-10A-solujen (vasemmanpuoleiset paneelit, komposiitti 9 kentät) ja NMuMG solut (oikea paneeli) viljellään omilla kasvualustaan ​​24 tuntia, jossa on esitetty tekijät (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM). Bar = 1000 pm. C. laajennettu kuolema kentän yhdistelmäkuva saatu useista Z-pinoaminen kuvat MCF-10A-solujen (vasemmanpuoleiset paneelit) ja NMuMG solut (oikea paneeli) viljellään kollageenin 4 päivää, jossa on esitetty tekijät (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM). Bar = 500 pm. D. Cell cycle jakelu tutkinut propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysiä MCF-10A-solujen (vasemmanpuoleiset paneelit; 8 h) ja NMuMG solut (oikea paneeli, 16 h) on viljelty kasvualustassa ja käsiteltiin osoitetuilla tekijät (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM).

NMuMG ja MCF-10A solulinjoja hallussaan morfogeenisiä ominaisuuksia kun resuspendoitiin ja viljeltiin 3-D matriisi kuten kollageeni [16], [19]. AG1478 oli dramaattinen vaikutus 3D-monogeneesin Molempien solulinjojen, kuoleman aiheuttaminen kaikkien solujen (Fig. 3C, AG ja video S1). HGF oli ainoa testattu kasvutekijä voi periä solujen EGFR esto (Fig. 3C, AG + HGF ja video S2). EGF, IGF-I, b-FGF ja Neureguliini eivät pysty palauttamaan seuraavan solu- kuoleman AG1478 hoitoon (ei esitetty). Met spesifisyys HGF elpymistä MCF-10A ja NMuMG solujen varmistettiin käyttämällä erittäin spesifinen Met estäjä PHA-665752 250 nM yhdessä AG: n ja HGF. Läsnäollessa tämän RTKi, HGF menettänyt kyky toipua maitorauhasen soluja EGFR esto (Fig. S2, A + P + H).

Solut kaarianalyysin FACS osoitti, että EGFR esto johti kasvuun prosenttiosuus solujen G0 /G1 vaiheeseen (Fig. 3d, AG). HGF hoito kumosi olevien solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheeseen kontrolliarvoihin (Fig. 3d; AG + HGF).

HGF on Survival Factor nisäkasvainsoluja Johdettu konstitutiivisesti aktivoitu ErbB2 Siirtogeeniset hiiret

Testasimme onko vaikutuksia havaittu normaalissa maitorauhasen soluissa voitaisiin soveltaa soluihin, jotka on eristetty hyvin kuvattu malli mutatoidun-ErbB2-siirtogeenisiä hiiriä (MMTV-neu, [20]). Ensin visualisoida, western-blot-analyysi, kun läsnä on ErbB2, EGFR ja Met nisäkasvain lysaateista saatu eri hiirissä (Fig. 4A). Ensisijainen saatuja soluja näiden kasvainten tehtiin seuraavan solu- kuoleman 72 tunnin hoidon AG1478 (250 nM), kun taas PHA-665752 (250 nM) ei ollut vaikutusta (kuvio. 4B). Sen testaamiseksi, onko AG1478-solukuolema voitaisiin talteen Met aktivaation, solut käsiteltiin AG1478 täydennettiin HGF. Solujen elinkelpoisuus palautui kontrolliarvoihin, kun taas täydentäminen IGF-I, b-FGF ja Neureguliini ei ollut vaikutusta (kuvio. 4C). Solusyklin analyysi propidium–jodidia värjäys ja virtaussytometria lisääntyi solujen G0 /G1 vaiheen jälkeen AG1478 lisäksi (Fig. 4D, AG). Sen jälkeen HGF hoito solut palautuivat arvoihin samanlainen käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 4D; AG + HGF). Vahvista Met panoksen määrättävät käytimme PHA-665752 yhdessä AG: n ja HGF. Huomasimme, että esiintyminen Met TKI, HGF menettänyt kyky palautua ErbB2 syöpäsolujen EGFR inaktivaation (Fig. S3A; A + P + H). Edelleen spesifisyyden varmistamiseksi AG1478, käsittelimme nämä solut kahden muun EGFR: n estäjien käytetty kliinisissä protokollat ​​(IRESSA ja Tarceva; 1 uM). HGF säilytti kyky toipua ErbB2 kasvainsoluja käsiteltiin IRESSA ja Tarceva (Fig. 4E ja kuvio. S3B). Näin ollen ErbB2 saadut kasvainsolut tämän siirtogeenisen mallin ovat riippuvaisia ​​aktivoituu EGFR kasvua ja selviytymistä, ja voidaan pelastaa Met aktivointi.

Western-blot-analyysi ErbB2, EGFR ja Met ekspression nisäkasvaimia saatu kolmesta erillisestä siirtogeenisiä ErbB2 mutatoitunut hiirissä (katso materiaalit ja menetelmät). Tubuliinia käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. B. Faasikontrasti- kuvia primaarisoluja ErbB2 nisäkasvaimia (bar = 500 um). Soluja kasvatettiin leviämisen keskipitkällä ja joko hoitamattomana (Ctrl) tai käsitelty AG1478 (250 nM) tai PHA-665752 (250 nM) 96 tuntia. C. elävien solujen määrä trypan-sinisellä värjäyksen 48 h, immortalisoitujen ErbB2 kasvainsoluja käsiteltiin osoitetuilla tekijät (HGF 10 ng /ml (H), IGF-I 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), Neureguliini 20 ng /ml (N); AG1478 250 nM (A)). Käsittelemätön kontrolli (Ctrl) on asetettu 100%. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baareja, S.E.M. * P 0,05. D. Cell cycle jakelu tutkittiin propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysi ErbB2 nisäkasvainsoluja viljellään kasvualustassa ja käsiteltiin osoitetuilla tekijät 16 h (HGF 10 ng /ml, AG1478 250 nM). E. Immortalisoidut ErbB2 kasvainsoluja viljellään niiden kasvun väliaineessa 48 h, jossa on esitetty tekijät (HGF 10 ng /ml; AG1478 250 nM; IRESSA 1 uM; TARCEVA 1 uM). Bar = 500 pm.

Met-fosforylaation aktivoi samanaikaisesti ERK1 /2 ja AKT kun EGFR Signaling estyy: suhteellinen tärkeys ERK1 /2 ja AKT väyliä leviämisen ja 3D morfogeneesi

ymmärtää mekanismia elpymisen välittämän HGF, suoritimme western-blot analyysi fosforyloidun EGFR, Met ja niiden alavirran efektorien ERK1 /2 ja AKT (Fig. 5A). Tätä tarkoitusta varten seerumin puutteessa MCF-10A ja NMuMG soluja käsiteltiin EGF: llä (10 ng /ml), HGF (20 ng /ml) tai IGF-I (100 ng /ml) puuttuessa tai läsnä AG1478.

Western-blot-analyysi EGFR, Met, ERK1 /2 ja AKT-fosforylaation tila MCF-10A ja NMuMG solut ja ErbB2 tuumorisoluja viljellään nälkää väliaineessa 16 h ja sitten käsiteltiin RTK-estäjien AG1478 (250 nM , 1 h) ennen kuin lisättiin ilmoitettu sytokiinien (10 min; EGF 10 ng /ml HGF: ää 10 ng /ml, IGF-I 100 ng /ml). B. elävien solujen määrä trypan-sinisellä värjäyksen 48 h NMuMG solujen viljellään kasvualustassa ja ilmoitetusta inhibiittorit (AG /A = AG1478 250 nM; UO /U = UO126 15 uM; vierteen /W = wortmanniini 100 nM) in läsnä ollessa tai ilman HGF 10 ng /ml (H). Käsittelemätön kontrolli (Ctrl) on asetettu 100%. %. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baareja, S.E.M. * P 0,05. C. Edustavia kuvia NMuMG soluja kasvatetaan kollageenigeeleissä 4 päivää kasvatusliuoksessa, jossa on esitetty tekijät (pitoisuuksina kuin B; bar = 250 nm).

Kaikki kasvutekijät aktivoida sekä ERK1 /2 ja AKT polkuja ilman EGFR inhibition (Fig. 5A, kaistat 3, 5, 7). Sen jälkeen AG1478 hoito, HGF jäi ainoa sytokiini pystyy ylläpitämään sekä polkuja aktiivisia samanaikaisesti, kanssa, että fosfo-Met on edelleen läsnä EGFR esti soluissa (kuvio. 5A, kaista 6). Vaikka IGF-I-aktivoitua fosfo-AKT tasot eivät vaikuttaneet AG1478, fosfori-ERK1 /2 tasossa luovuttiin EGFR esto (Fig. 5A, kaista 8, katso keskustelu). Siksi HGF-välittämää pelastus leviämisen ja morfogeneesiä maitorauhasen soluissa mahdollisesti tarvitsee samanaikainen aktivoituminen sekä ERK1 /2 ja AKT polkuja.

Samanlaisia ​​western blot-analyysit suoritettiin seerumin puutteessa ErbB2 kasvainsoluja osoitti pohjapinta fosfo-EGFR, fosfo-ERK1 /2 ja fosfo-AKT tasoa, jotka luovuttiin AG1478 hoitoa. Analogisesti normaalit rintarauhasen soluihin, HGF vain oli kyky palauttaa samanaikaisesti ERK1 /2 ja AKT fosforylaatio läsnä EGFR eston. Näin ErbB2-odotuksiin kasvainsolujen mahdollisesti käyttää mekanismia elpymisen verrattavissa muissa kuin pahanlaatuinen NMuMG ja MCF-10A-soluissa (kuvio. 5A, ErbB2). Edelleen spesifisyyden varmistamiseksi AG1478, western-blot kokeet toistettiin käyttämällä IRESSA (1 uM) in NMuMG ja ErbB2-ajettu solut, joissa vertailukelpoiset tulokset (Kuva. S4A).

Koska EGFR ja Met näyttävät toimivan samantyyppisistä alavirran -efektiboksejamme testasimme ovatko EGF ja HGF samanaikainen hoito voisi lisätä rintarauhasen solun kasvu, scatter ja morfogeneesiin. Solut käsiteltiin samalla kuin kaksi sytokiinien näkyy kasvuun yhtymäkohdassa prosentteina (MCF-10A solujen Video S3 ja Fig. S4b), hajottaa ja morfogeneesiin (NMuMG solujen kuvio S4C) suhteessa EGF ainoa tai HGF vain käsiteltyihin soluihin.

Olemme vihdoin analysoineet suhteellinen merkitys ERK1 /2 ja AKT polkuja aikana lisääntymistä ja morfogeneesiä EGFR esti maitorauhasen soluja (kuvio. 5B). Tätä varten me inhiboivat selektiivisesti ERK1 /2 ja /tai AKT-reitit, joilla UO126 15 uM ja Wortmanniini 100 nM. Tällaiset inhibiittorit kytkettiin AG1478 käsittelyn avulla ymmärtää, onko HGF säilyi kyky toipua kasvuun maitorauhasen soluissa puuttuu nämä reittejä. Estyminen ERK1 /2 ja PI3K-AKT polkuja, erikseen ja yhdessä EGFR saarto, vähennä solujen elinkelpoisuutta. Mielenkiintoista, kaikissa estävä olosuhteissa, HGF lisääntynyt solujen määrä, vaikkakin erilaisilla tehoilla mukaan hoitoon. Tämä käyttäytyminen osoittaa, että ilman mitään yhdistelmän EGFR /ERK1-2 /AKT signalointi, Met edelleen parantaa leviämisen 2D viljellyissä soluissa (kuvio. 5B yläpaneeli ja Fig. S5) luultavasti aktivoivat vaihtoehto signalointireitteihin.

analyysi suoritettiin NMuMG kasvatettujen solujen 3D-kollageenin suspensioita (Fig. 5B alempi paneeli) antoi meille erilaisia ​​tuloksia ja osoittivat, että ERK1 /2 signalointi oli aina tarpeen ylläpitää elinkelpoisuuden: HGF täydentämistä voinut palauttaa elinkelpoisuuden UO126 käsitellyissä soluissa (UO ; UO + HGF; AG + UO; AG + UO + HGF). Toisaalta, estämällä PI3K-AKT signalointireitin pysähtyi ductal venymä mutta ei tappaa soluja (vierteen). HGF lisäksi jälleen kasvuun ja morfogeneesiin (vierteen + HGF) in Wortmanniini käsitellyissä soluissa. Mielenkiintoista, kun EGFR esti soluja käsiteltiin samanaikaisesti Wortmanniini, HGF ei toimi palautusagentin (AG + vierteen ja A + W + HGF). Nämä tiedot osoittavat, että ilman EGFR viestitään ERK1 /2 ja PI3K-AKT reitit ovat molemmat toisistaan ​​riippumatta tarpeen kasvua 3-ulotteinen matriisi mutta ei 2D proliferaatiomäärityksessä.

Keskustelu

Elinten kasvu, homeostaasin normaalien kudosten ja kasvainten kehittymiseen voi olla yhteisiä biologisia polkuja. Tässä tutkimuksessa olemme käsitelleet suhdetta EGFR ja Met signalointireittejä normaaleissa nisäepiteelisoluissa sekä solut, jotka ovat peräisin hyvin kuvattu siirtogeeninen malli rintarauhasen kasvaimien syntyyn. Olemme havainneet, että 2 out of 3 testattu rintaepiteelisolulinja solulinjoja, hiiren NMuMG ja ihmisen MCF-10A solulinjoja, ovat riippuvaisia ​​EGFR toimintaa voidakseen kasvaa 2D lulisäkasvumäärityksessä ja selviytyä 3D-monogeneesin määrityksessä. Pääasiallisesti varten EGF-reseptorin rintarauhasen morfogeneesissä aikana on käynyt ilmi ennen murrosikää kasvu strooman osastoon elimessä [5], [21], mutta jo nyt, ei ole tiedossa toimintoa tälle reseptorin epiteelin osastossa aikuisen maitorauhasen. Täällä kuvattu, että EGFR on olennaista kasvun ja kannattavuuden tietyillä ei-tuumorigeeniset rintarauhasen solulinjoja, jotka on saatu aikuisen rintarauhaskudosten. Alentuminen EGFR, mutta ei täyty signalointi näissä solulinjoissa häiritsi morphogenesis ja indusoi täydellisen solukuolemaa. MCF-10A riippuvuus EGFR voi johtua näiden solujen on viljelty EGF sisältävässä alustassa. Mahdollinen selitys EGFR riippuvuuden NMuMG soluissa on, että tämä solulinja tuottaa oman EGFR ligandien. Itse asiassa huomasimme, korkea amfireguliini mRNA: n ekspression NMuMG soluissa (tuloksia ei ole esitetty), mahdollisesti ajo proliferaation autokriininen silmukka. Muut nisäepiteelisoluissa on osoitettu tuottamaan ja vapauttamaan EGFR-ligandien [22], siis tämä mekanismi kasvu voi olla yhteinen epiteelisoluihin myös aikuisen maitorauhasen. Se, että BME-UV naudan maitorauhasen solut eivät reagoi EGFR inhibitio johtuu todennäköisesti siitä, että tässä solulinjassa ylläpitää ERK1 /2 ja AKT reittejä aktiivinen alle AG1478 hoitoon. Yksi mahdollinen selitys on, että prosessin aikana kuolemattomaksi, inaktivaatio tärkeitä tuumorisuppressoreilla (kuten PTEN) ovat tuoneet BME-UV solujen konstitutiivisesti aktivoida nämä perustavaa laatua signalointireitteihin. Toinen spekulatiivinen hypoteesi on, että naudat, jotka eivät ole alttiita kehittää Rintasyöpien Näitä reittejä ovat olennaisesti korkeammat fosforylaation tasoja jopa ei-tuumorigeenisiä solulinjoja. Ero EGFR herkkyyden löytyy solulinjoissa, pohditaan, jotkut maitorauhasen soluja kuuluvat eri osastojen rauhasen (esim pohjapinta tai luminal) voi olla erilaisia ​​vaatimuksia kasvua. Laajentamalla tutkimusta muiden maitorauhasen soluja linjoja eri alkuperää voi selventää tätä epäilystä. Tämä seikka on myös tärkeää, koska kasvaimia, jotka johtuvat soluista tietyn osasto voi näyttää erilaisia ​​vastauksia tiettyihin estäjiä.

Vaikka Met oli tarpeeton kasvu kaikilla testatuilla solulinjoilla, HGF oli ainoa sytokiini pysty palauttamaan leviämisen ja morfogeneesiä EGFR esti soluissa. Jotkut kirjoittajat ovat kuvattu suora rooli HGF maitorauhasen [23], [24], mutta täydelliset tiedot, jotka selventävät sitä roolia, Met-reseptori näytelmät

in vivo

ei vielä ole. Meidän laboratorio arvioi parhaillaan roolin täyttää geenikohdennuksen kanssa rintarauhasen promoottorit (MMTV-cre ja Wap-CRE), mutta johdonmukaisesti

in vitro

tiedot tähän esittelyyn, emme ole vielä löytänyt rooli että HGF-reseptorin näissä siirtogeenisissä malleissa (käsikirjoitus valmisteilla). Mielenkiintoista, muut kasvutekijät (IGF-I, b-FGF ja Neureguliini), joka on kuvattu yhtä tärkeitä välittäjiä maitorauhasen morphogenesis [10] – [14], [25], eivät kyenneet toimimaan Palautusagentit näissä soluissa. Emme voi sulkea pois, että nämä tekijät voivat olla tärkeä rooli solujen peräisin eri maitorauhasen alajoukkoihin tai rintasyövän hoitoon. Äskettäin on osoitettu, että EGFR voi olla merkittävä rooli joissakin HGF /Met biologisiin vasteisiin maitorauhasen kasvain ja epiteelisolujen. Tässä järjestelmässä esto EGFR kinaasin gefitinibi tai erlotinibi poistettava HGF-indusoitua proliferaatiota ja liikkuvuus noin karsinoomasoluja [26]. Päinvastoin meidän koeasetelmia Met pystyi toimimaan palautusagentin EGFR esti solujen ja fosfo-Met ja fosfo-EGFR näytti aktivoidaan ainakin osittain erikseen. Vaikka emme voi sulkea pois tietty Met-EGFR transaktivaatiota meidän järjestelmässämme, useimmat loppupään signalointi herää riippumaton, EGFR-odotuksiin tai Met perustuvan mekanismin. Ero tulokset voivat riippua eri solulinjoilla että jos käytetään tai niiden viljelyolosuhdetta (aina käyttää täydellistä kasvualustaan ​​seerumin ja kasvutekijöiden useimpien kokeiden). Tämä tulos osoittaa, kuinka kaksi erityistä polkuja, jotka ovat peräisin eri reseptoreihin voi kuljettaa samanlainen soluvasteita (esim elinkelpoisuutta ja jakaantumista) toisistaan ​​riippumatta.

Olemme myös havainneet, että synkroninen aktivointi EGFR ja Met lisää kasvua, hajottaa ja morfogeneesiä NMuMG ja MCF-10A soluissa. Tämä vaikutus, jossa kaksi erillistä tyrosiinikinaasireseptorit voi toimia tarpeeton ja lisäaine muoti edistää solujen kasvua, ei ole ainutlaatuinen rintarauhasen soluihin.

In vivo

, munuaisten morfogeneesin aikana, Met kudosspesifisiä knock-out ovat vähentäneet lopullinen Nefroni numero. Ylittävät näitä hiiriä heiluttivat-2 spontaani mutantteja, kuljettaa yhden pisteen mutaatio, joka vähentää EGFR kinaasiaktiivisuutta, vaikuttaa ureteric nuppu aluevaltaus sekä lopullinen munuaiskerästen määrä [17]. Olemme äskettäin osoitti, että samanlainen mekanismi EGFR /Met redundanssin tapahtuu myös maitorauhasen [27].

ErbB2 on tärkeä aloitteentekijä rintarauhasen kasvaimien syntyyn yli 30% ihmisen rintasyövistä näytteille ErbB2 vahvistusta ja yli-ilmentyminen [ ,,,0],28]. EGFR on usein dimeroitumisen kumppani ErbB2 sekä fysiologisesti aikana maitorauhasen kehitykseen [13], [29], ja patologisesti in ErbB2 ajettu kasvaimissa [30]. Meillä on siis arvioinut vaikutuksia EGFR inaktivoinnin on hyvin kuvattu siirtogeeninen malli rintarauhasen kasvaimien syntyyn. Tämä siirtogeeninen line ilmentää MMTV-promoottori-ajettu rotan-ErbB2, joilla on mutaatio, joka pakottaa konstitutiivisen aktivaation reseptorin [20]. Kaikki kasvaimet saadut ErbB2 mutatoitunut hiiret osoittivat EGFR, ErbB2 ja Met ilme. EGFR esto aiheutti kuoleman ensisijainen ja kuolemattomien solujen eristettiin tästä kasvain. Koska EGFR esto AG1478 käytetyn pitoisuuden meidän määrityksissä on valikoiva (IC 50 3 nM, ErbB2 IC50 on 100 uM) ErbB2 mutaatio mahdollisesti aktivoi EGFR kautta hetero-dimerisaatio. Itse asiassa havaitsimme lasku sekä fosfo-EGFR ja fosfo-ErbB2 (ei esitetty) ErbB2 kasvainsolujen käsittelemällä AG1478. Siksi olemme huomanneet, että tässä siirtogeenisiä mallissa, ErbB2 aktivointi, joka ajaa kasvaimen kasvua on kytketty EGFR kinaasiaktiivisuuden, mikä on olennaista solujen elinkelpoisuus. HGF hoito pelastettiin EGFR inhiboi kasvainsolujen, mikä osoittaa, että reitit samanlaisia ​​kuin läsnä NMuMG ja MCF-10A maitorauhasen soluja voidaan myös käyttää syöpäsolujen ylläpitämään niiden kasvua. Se, että kasvainsolut reagoivat HGF lisääntynyt leviämisen ja eloonjäämiseen EGFR esto on myös käsitelty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Osajoukko NSCLC potilaat, jotka kehittävät vastustuskyvyn EGFR: n estäjien osoittavat lisääntynyt HGF tasoilla tukeva rooli strooman peräisin HGF edistämisessä lääkeresistenssin [31], [32]. Tämäntyyppinen vastarintaa, joissa normaalit reseptorin tasot mukana on korkeampi ilmaus omassa kasvutekijän ympäröivällä strooman voi siten edustaa mekanismi, jota tuumorisolut paeta RTKi hoitoon. Meidän havainnot HGF välittämän elpyminen, laajentaa aiemmin julkaistu tulokset nisäepiteelisoluissa ja ErbB2 nisäkasvainsoluja korostaen sitä, että molekyyli tapahtumia läsnä ei tuumorigeenisiä soluissa voitaisiin säilyttää kasvaimen kasvun aikana ja tullut perusta lääkeresistenssin.

Yksi mahdollisista mekanismien rintarauhasen solujen elpymistä HGF hoitoa seuraavien EGFR inaktivaatiota oli kyky tämän sytokiinin aktivoimaan sekä ERK1 /2 ja AKT polkuja. Siten tutkimme suhteellinen merkitys näiden kahden reitin ajo vastustuskyvyn EGFR esto. Tuloksemme osoittavat, että HGF oli ainoa sytokiini, jolla on kyky aktivoida ERK1 /2 ja AKT kautta ilman EGFR signalointi. Vahvistaminen huomautukset muiden kirjoittajien [33] – [35], jotka osoittivat, että knockdown tai saarto EGFR esti IGF-I-indusoi MAPK (mikä viittaa siihen, että IGF-I-reseptori voi toimia ylävirtaan EGFR) huomasimme, että IGF-I voinut pelastaa ERK1 /2-reitin, mutta voisi pelastaa AKT reitin kaikissa EGFR esti solulinjoissa. Mukaisesti sen kyvyttömyys pelastamiseksi EGFR estyy solujen, perus-FGF kyennyt aktivoimaan kumpikaan ERK1 /2 eikä PI3K-AKT väylän NMuMG ja MCF-10A solulinjoja (tuloksia ei esitetty). Lisäksi molemmat näistä solulinjoista ei lisännyt proliferaatiota seuraavia b-FGF tai Neureguliini hoitoon. Näin ollen, on mahdollista, että b-FGF ja Neureguliini eivät toiminnallisia meidän solumallissa, lopulta puutetta niiden reseptorien, tunnistaa rintarauhasen solulinjoissa erilaisilla, kasvutekijä vaatimukset.