Krooninen sairaus

tiivistelmä

hoito ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) huumeita kohdistaminen kasvutekijän reseptorin (EGFR), esim gefitinibi ja erlotinibi, lopulta kaadu laatimalla johdettuun mutaatioita tällaisten kuten T790M EGFR. Strategiat voittaa tämän resistenssin ovat siis pikaisesti. Tässä tutkimuksessa olemme syntetisoitiin kymmenkunta uusien gefitinibin analogit ja arvioida niiden vaikutukset L858R /T790M-EGFR kätkeminen NSCLC-soluja, ja on raportoitu, että yksi näistä gefitinibin jäljittelijät, N- (2-bromi-5- (trifluorimetyyli) fenyyli) – 6-metoksi-7- (3- (piperidin-1-yyli) propoksi) kinatsolin-4-amiinin (jäljempänä, V1801), laukaista apoptoosin NSCLC-solujen ja voitti gefitinibin-resistenssin hiirillä, jotka inokuloitiin NCI-H1975-soluissa. Vaikka V1801 vain hieman esti EGFR-kinaasiaktiivisuuden, on merkittävästi indusoi ilmentymisen BH3 vain proteiinia Noxa, ja Noxa hiljentäminen merkittävästi vähentää V1801: n indusoiman apoptoosin NCI-H1975-soluissa. On osoitti, että V1801 häiritsi ilmentymistä transkriptiotekijä c-Myc, ja solunulkoisen signaalin säännelty kinaasin (Erk) kautta. V1801 yhdistettynä proteasomin estäjä bortetsomibilla kohdistama tehostetun sytotoksisuuden NCI-H1975-soluissa johtuen mahdollisesti voimisti induktion Noxa ilmaisua. Nämä tiedot osoittavat, että gefinitib analogit, joilla on heikko EGFR inhiboivaa aktiivisuutta voidaan voittaa lääkeresistenssideterminantit aktivoimalla BH-3 ainoastaan ​​pro-apoptoottisia proteiineja, ja V1801 voi olla terapeuttista mahdollisuudet NSCLC.

Citation: Zhang B, Jiao J Liu Y, Guo LX, Zhou B, Li GQ, et ai. (2012) Gefitinibi Analoginen V1801 indusoi apoptoosia T790M EGFR-kätkeminen Lung Cancer Cells by Up-asetus BH-3 Vain Protein Noxa. PLoS ONE 7 (11): e48748. doi: 10,1371 /journal.pone.0048748

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 27 helmikuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 21 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Key Program for Basic Research (2012CB910800, 2010CB833200, 2010CB529201), National Natural Science Foundation (nro 81071930, 81171925, 20972160 ja 21172220), Special Foundation presidentti ja Key Project of Knowledge Innovation Program on Kiinan tiedeakatemia (KSCX1-YW-R-26 ja KSCX2-YW-R-235), ja National Major tieteellistä ja teknologista ohjelma Drug Discovery (2009ZX09103-101). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä kasvain maailmanlaajuisesti käsittää 17% kaikista uusista syöpätapauksista ja 23% koko syöpäkuolemista miehillä [1]. Keuhkosyövän hoidossa määräytyy histologisen tyypin ja vaiheessa diagnoosi, ja sisältää lähinnä leikkaus, platina dubletti terapiassa, sädehoito ja täsmähoitoihin, ja vain 15% viiden vuoden yleinen eloonjäämisaste kaikissa vaiheissa yhdistetyn [2]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) -targeting aineet, mukaan lukien EGFR-spesifisiä vasta-aineita ja tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), kuten gefitinibi ja erlotinibi, hyödyttää potilaiden osuus, etenkin ei-savun ja aasialaista alkuperää [3] – [5] . Kuitenkin hoito gefitinibi ja erlotinibin lopulta kaadu kehittymisen hankitun lääkeresistenssin johtuvat monistuminen MET esikasvaintekijän tai treoniini-to-metioniini aminohapposubstituutio asemassa 790 (T790M) EGFR, joka havaitaan 50% kliinisesti resistenttien potilaiden [6], [7]. T790M mutaatio EGFR vaikuttaa portinvartija jäännös katalyyttinen domeeni kinaasin, joka heikentää vuorovaikutuksen estäjien kohteen kanssa [6]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että T790M mutaatio on ”yleinen” mutaatio, joka vähentää tehon tahansa ATP-kilpailukykyinen estäjä [8]. In T790M EGFR-kätkeminen soluja, EGFR, jonka tällä hetkellä saatavilla toisen sukupolven EGFR-TKI ei riitä fysiologisesti syntymisen estämiseksi solut, jotka ovat edelleen riippuvaisia ​​EGFR signalointi [9]. Siksi strategioita voittaa EGFR-TKI vastus pysyvät käytännön tarpeisiin pidentämiseksi elinaika potilaiden keuhkosyöpä.

kiertämästä apoptoosin on yksi tunnusmerkkejä syövän, ja kohdentamalla apoptoosin on tullut syöpä terapeuttinen strategia [10 ]. Kriittinen apoptoosin säätelijät, B-solujen kroonista lymfaattista leukemiaa /lymfooma-2 (BCL-2) ja sen perheen proteiineja, voidaan jakaa pro- ja anti-apoptoottisen jäsentä, ja pro-apoptoottisten proteiinien voidaan jakaa proapoptoottiset proteiineja ja BH3-only subfamilies, joka perustuu niiden rakenteellinen yhtäläisyys eri Bcl-2 homologia (BH) verkkotunnuksia [11], [12]. Noxa on BH3 vain proteiini, joka on osallisena apoptoosin liittyvät DNA-vaurioita, hypoksia tai altistuminen proteasomin estäjinä [13] – [15]. Expression of Noxa HeLa-soluissa voimakkaasti edistää solujen apoptoosin, kun taas estää endogeenisen Noxa tukahduttaa ohjelmoidun solukuoleman [16]. Kertyminen Noxa herkistää apoptoosin sitoutumalla ja neutraloimaan antiapoptoottisten proteiini Mcl-1, mikä vapauttaa ja myöhemmän aktivoinnin Bax (BCL2 liittyvä X-proteiini) tai BAK (BCL2-antagonisti /killer) alkaen Bax /Bak-Mcl-1 kompleksi [13], [17], [18]. Sen lisäksi, että sen rooli apoptoosin, Noxa säätelee myös erilaisia ​​solun toimintoja autophagic solukuoleman ja aineenvaihduntaa [19], [20]. Apoptosis liittyvä Noxa aktivointi ensisijaisesti saavutetaan transkription säätelyä p53, E2F1, HIF1α, c-Myc, ATF3, ja solun signaali säännelty kinaasia (Erk) reitin [14] – [16], [21] – [23]. Kuitenkin identiteetti kriittisen BH3 vain proteiineja ja mekanismi niiden toiminnan hoidon jälkeen monenlaiset apoptoottisen ärsykkeen vielä täysin ratkaistu.

seulomiseksi tekijöille voittaa gefitinibin-vastus, me täällä synteettisesti useita uusia gefitinibin rakenteellisesti vastaavat ja testattiin niiden estovaikutusta EGFR kinaasiaktiivisuutta ja leviämisen NCI-H1975-soluissa [24], jotka tarjoavat sataman L858R /T790M-EGFR [6], [7], [25] ja villityypin MET ilman genomista vahvistus [26], jotka ovat vastustuskykyisiä gefitinibin ja erlotinibin. Löysimme gefitinibiä jäljittelevää, N- ​​(2-bromi-5- (trifluorimetyyli) fenyyli) -6-metoksi-7- (3- (piperidin-1-yyli) propoksi) kinatsolin-4-amiinin (jäljempänä, V1801), kohtalaisen esti EGFR-kinaasiaktiivisuuden mutta merkittävästi tukahdutti solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosia T790M EGFR-kätkeminen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin in vitro ja in vivo. Olemme lisäksi osoittaneet, että säätely ylöspäin Noxa underlain V1801: n toimintaa NSCLC-soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

Agents

gefitinibin vastineita (taulukko 1) syntetisoitiin meidän kemia ryhmä, ja

N

– (3-kloori-4-fluori-fenyyli) -7-metoksi-6- (3-morfolin-4-yylipropoksi) kinatsolin-4-amiinin (gefitinibin) hankittiin J K Chemical Ltd. Kaikki yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jotta varastossa pitoisuuteen 10 mM ja pidettiin -20 ° C: ssa. 3- (4,5-dimethylthiahiazozy1) -3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) hankittiin Sigma. Bortetsomibi saavutettiin Millennium Pharmaceuticals Inc. anneksiini V /propidiumjodidia (PI) Apoptosis Detection Kit saatiin BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

Vasta

vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: anti-β-aktiini (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12), anti-Casp-3 (3G2), anti-PARP, anti-fosfo-p44 /42 MAPK: n, anti-EGFR (L858R), anti-STAT3 , anti-fosfo-STAT3 (Soluviestintä); anti-c-Myc, anti-Noxa, anti-fosfo-EGFR (Y1173), anti-Pakt ja AKT (Santa Cruz Biotechnology); anti-ERK2 (Abcam); anti-kani tai anti-hiiri-HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Pierce). Detektio suoritettiin käyttäen Chemiluminescent Western havaitseminen kit (Cell Signaling).

Soluviljely

keuhkosyövän solulinjoja NCI-H1975, A549 ja HCC827 saatiin American Tissue Culture Collection. A549-soluja viljeltiin Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä. NCI-H1975 ja HCC827-soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä.

RNA: n valmistaminen ja RT-PCR-

kokonais-RNA solujen eristettiin käyttäen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen) ja fenoli-kloroformi-uutolla mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA (2 ug) hehkutettiin satunnaisia ​​alukkeita 65 ° C: ssa 5 min. CDNA syntetisoitiin käyttäen 1-juosteen cDNA-synteesi Kit (Fermentas). PCR-monistamiseen, alukkeita ovat seuraavat: Actin, forward-aluke: 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC’-3 ’, käänteinen aluke: 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACATC’-3′; Puma, forward-aluke: 5′-GTCCTCAGCCCTCGCTCT-3 ’; reverse-aluke: 5’-CTAATTGGGCTCCATCTCG-3 ’; Bim, forward-aluke: 5’-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3 ’; reverse-aluke: 5’-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3 ’; Bcl-xl, forward-aluke: 5’-GGTGGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3 ’; reverse-aluke: 5’-GGAAAGCGTAGACAAGGAGATGC-3 ’; Ui-1, forward-aluke: 5’-CACGAGACGGTCTTCCAAGGCATGCT-3 ’; reverse-aluke: 5’-CTAGGTTGCTAGGGTGCAACTCTAGGA-3 ’; Noxa, forward-aluke: 5’-AAGAAGGCGCGCAAGAAC-3 ’; reverse-aluke: 5’-CGTGCACCTCCTGAGAAAAC-3 ’.

Western blot -määritys

Solut suspendoitiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCI, 1% triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, täydellinen proteaasiestäjäseostabletit) ja kirkastetaan sentrifugoimalla, jolloin saatiin kokonaisessa solulysaateista. Yhtä suuret määrät näytteitä erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosalle ja immunoblot-vasta-aineen kanssa osoitti [27].

valmistaminen sytoplasmisen jakeet

havaitsemiseen sytokromi c vapautuu mitokondrioissa sytoplasminen fraktiot kerättiin NCI-H1975-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen 0,1 mg /ml digitoniinia 3 min 37 ° C: ssa sytosoliin Lysis Buffer (0,01% digitoniinia, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, proteaasi-inhibiittorit cocktailit 1 x PBS, pH 7,4). Sentrifugoinnin jälkeen eriä supernatanttia (solulimafraktio), ja pelletti, joka sisältää mitokondrioita analysoitiin Western-blottauksella.

arviointi solujen lisääntymisen ja apoptoosin

Soluja käsiteltiin V1801 tai gefitinibin varten osoitettu pitoisuudet ja ajankohtina. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymisen [27]. Externalization fosfatidyyliseriinin testattiin käyttämällä anneksiini V /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeita. Värjäyksen jälkeen Hoechst 33258 10 ug /ml 10 min, solukuolemaa arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla (Leica).

In vitro EGFR-kinaasin analyysit

In vitro-kinaasia inhiboiva kyky määritettiin käyttäen ADP-Glo ​​™ Kinase Assay Kit ja EGFR-kinaasi-entsyymi System (Promega), seuraten valmistajan ohjeita.

siRNA määrityksissä

käyttäminen HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Crawley, UK) mukaisesti valmistajan protokollan, solut transfektoitiin 100 nM kaksijuosteisia siRNA oligonukleotideja. SiRNA-sekvenssit olivat 5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3 ’(Noxa siRNA1), 5′-AACUUCCGGCAGAAACUUC-3′ (Noxa siRNA2), ja 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’(negatiivinen kontrolli (NC) siRNA), 5’-CAGAAATGTCCTGAGCAAT- 3 ’(c-Myc siRNA1), 5′-AAGGTCAGAGTCTGGATCACC-3’ (c-Myc siRNA2).

klonogeeninen määritys

inkuboinnin jälkeen V1801 (3 uM) tai gefitinibin (3 uM ) 12 h, joka on pehmeässä agarissa pesäkkeiden määritys suoritettiin. Tätä varten, trypsiinillä solut suspendoitiin RPMI 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja alhaisen sulamispisteen 0,3% agaroosia (Amresco, Solon, OH) ja tämän jälkeen päällekkäin päälle jähmettynyt kerros RPMI 1640 -alustaa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,6% agaroosia 35 mm: n levy (5000 solua /levy) kolmena kappaleena. 2 viikon kuluttua, pesäkkeet kiinnitettiin 90% etanolilla ja värjättiin 0,005% kristalliviolettia (Sigma). Pesäkkeitä muodostavat yksiköt, joissa on enemmän kuin 100-solut laskettiin valomikroskoopilla [28].

Yhdistelmä-indeksi

vuorovaikutus yhdisteet kvantitoitiin määrittämällä yhdistelmä-indeksi (CI) lasketaan Chou-talalay yhtälö [29], [30]. Yleinen yhtälö klassinen isobologram- saadaan: CI = (D) 1 /(Dx) 1+ (D) 2 /(Dx) 2. Jos Dx osoittaa annos yhtä yhdistettä yksinään tarvitaan tuottamaan vaikutus, (D) 1 ja (D) 2 ovat annoksia yhdisteiden 1 ja 2, vastaavasti, tarvitaan tuottamaan sama vaikutus yhdistelmänä. Tästä analyysistä, yhdistetyt vaikutukset kahden yhdisteet voidaan tiivistää seuraavasti: CI 1 osoittaa synergiaa; CI = 1 tarkoittaa lisävaikutus; ja CI 1 tarkoittaa antagonismia.

Hiirimallit

Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksynyt eläinten eettisen komitean Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia, suostumuksella ID of AEC2011030205. Kaikki hiiret käytettiin tässä tutkimuksessa kasvatettiin ja pidettiin tietyssä taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä. NCI-H1975-soluja (2,5 x 10

6) injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen nude-hiirten. Kun kasvain saavutti käsin kosketeltavan koon, eläimet satunnaistettiin 3 ryhmään (n = 11 kussakin ryhmässä) ja käsiteltiin V1801 (30 mg /kg /päivä), gefitinibi (30 mg /kg /päivä) tai ajoneuvon ohjaus 3 viikkoa. Eläimet lopetettiin, kun kasvaimet saavuttivat 2 cm: n, tai jos hiiret ilmestyi kuolemaisillaan estää tarpeettoman sairastuvuus hiirille. Tuolloin eläinten kuolema, kasvaimet irrotettiin; solut erotettiin ja hajotettiin Western blottaus käyttämällä anti-Noxa vasta-aine ja anti-Actin vasta-aineita. Noxa ilmentyminen kvantitoitiin sitten densitometrialla analyysi ja normalisoidaan Actin ilmentymistä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja tiedot esitettiin keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita.

P

arvot alle 0,05 osoittavat tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Effects gefitinibin jäljittelijät keuhkosyöpään solujen ja EGFR-kinaasiaktiivisuuden

Tässä työssä neljätoista gefitinibin analogit syntetisoitiin vaihtamalla asemat C5 ja C6 substituentit ja vaihtelemalla C4-amino toiminnallisuutta kinatsoliini ydin gefitinibin, ja niiden vaikutukset NCI-H1975-solut arvioitiin käyttäen gefitinibin kontrollina (taulukko 1). Näiden yhdisteiden joukossa, V1801, V1802 ja V1807 havaittiin omaavan huomattavasti tehokkaampi sytotoksisuutta NCI-H1975-soluissa kuin gefitinibi, ja V1801 on voimakkain yksi, jonka IC50-arvo on 3 uM on enemmän kuin kolme taittuu pienempi kuin gefitinibin ( Pöytä 1). Yleensä käyttöönotto trifluorimetyylianiliinia osan sen C4 asema kinatsoliini ydin on tehokas tapa parantaa sytotoksisuuden. Bromi substituentti C2 ’kannan havaittiin olevan sopiva muutos korkeamman aktiivisuuden (V1801 vs. V1802, V1805 ja V1808). Lisäksi, piperidiiniryhmän terminaalissa C6-substituentin näiden yhdisteiden on myös ylivoimainen verrattuna vastaaviin morfoliini, sykloheksaani, atsido, triatsoli ja tetratsoli toimintoja.

Käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol -2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), osoitimme, että V1801 näkyy merkittäviä estäviä vaikutuksia vastaan ​​leviämisen NCI-H1975 (Fig. 1a) ja villityypin EGFR: ää ilmentävä A549 (Fig. 1b) solut annoksesta riippuvalla tavalla. Trypaanisinieksluusiolla analyysi, huomasimme, että V1801 nopeasti pienentää elinkelpoisten NCI-H1975 (Fig. 1 c) ja A549 (Fig. 1 d) solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Arvioimme V1801 vaikutuksista pesäkkeiden muodostumisen solujen aktiivisuutta, ja on raportoitu, että verrattuna gefitinibin tai ajoneuvon ohjaus, V1801 merkittävästi esti klonogeenisten aktiivisuus NCI-H1975-solujen (kuviot. 1e ja 1f).

(a , b) soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801: ssa 48 tuntia, ja analysoitiin MTT-määrityksellä. (C, d) Soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801 ja ilmoitettuina ajankohtina ja arvioidaan trypaanisiniekskluusiolla analyysi. (E) Pehmeä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys NCI-H1975 käsiteltyjä soluja tai ilman V1801 tai gefitinibi. (F) kvantitointi pesäkkeitä laskentaa. Keskiarvo + SD kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. (G, h) NCI-H1975 (g) ja HCC827 (h) solut käsiteltiin V1801 tai gefitinibin 12 tuntia, hajotettiin, ja Western blot -määritys suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita.

Testasimme näiden vaikutukset gefitinibin analogeja on EGFR ja osoitti, että V1801, V1802 ja V1805 kohdistama kohtalainen inhiboiva aktiivisuus EGFR-kinaasiaktiivisuuden (taulukko 1). V1801 oli IC

50 EGFR paljon suurempi kuin gefitinibin (701,9 nM vs 11,2 nM; taulukko 1), mikä osoittaa, että uusi tehdyt muutokset analogisessa V1801 ovat toimivia, mutta vähemmän ylivoimainen EGFR-kinaasiaktiivisuuden. Western blot-analyysi NCI-H1975-soluissa, sekä gefitinibi ja V1801 ole alas-säädellä fosforyloidun EGFR (p-EGFR) (Fig. 1 g), kun taas gefitinibi herkkien HCC827 soluja, gefitinibi mutta ei V1801 indusoi de-fosforylaation p -EGFR (Fig. 1 h). Nämä tulokset osoittavat V1801 saattavat aiheuttaa solun apoptoosin mekanismilla riippumaton EGFR-signalointireitin estyminen.

V1801 indusoi apoptoosia NSCLC solujen caspases riippuvaisesti

Seuraavaksi testasimme ovatko V1801 indusoi apoptoosin soluissa. Hoechst 33258 värjäys, se osoitti NCI-H1975-soluissa V1801 aiheutti kromatiinin tiivistymistä ja hajanaisuus, jotka ovat tyypillisiä apoptoottisia ydin- morfologisia muutoksia (Kuva. 2a). Anneksiini V /propidiumjodidi (PI) -staining ja virtaussytometria määrityksissä vahvisti, että hoito V1801 24 tunnin aiheuttaman apoptoosin NCI-H1975 ja A549-solut (Fig. 2b). Western blot-analyysi, V1801 hoidon havaittiin johtaa huomattavaan kasvuun aktiivisessa muodossa kaspaasi-9, kaspaasi-8 ja kaspaasi-3 ja lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) NCI-H1975-solujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (Kuva. 2c) ja A549-solut (Fig. 2d). Kun NCI-H1975-soluja esikäsiteltiin laajuisen kaspaasiestäjä bentsyylioksikarbonyyli-Val-Ala-Asp fluoromethylketone (z-VAD.fmk; 20 uM) 1 tunti ja sen jälkeen käsittelemällä V1801 3 uM: ssa 12 h, V1801- indusoiman apoptoosin tukahdutettiin (Fig. 2e), mikä osoittaa, että kaspaasi cascade on välttämätöntä V1801-indusoitua apoptoosia in gefitinibin-resistenssin soluille.

(a) NCI-H1975-soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801 varten 24 h, ja arvioidaan Heochst33258 määrityksessä. (B) Soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801: ssa 24 tuntia, ja apoptoottista solukuolemaa analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. (C) NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 tai gefitinibin (3 uM), hajotettiin, ja Western blot -määritys suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (D) A549-soluja käsiteltiin V1801 tai gefitinibin (3 uM) 24 tunnin ajan, hajotettiin, ja Western blot -määritys suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (E) NCI-H1975-soluja esikäsiteltiin z-VAD-fmk (20 uM) 1 tunti ja sen jälkeen käsittelemällä V1801 3 uM: ssa 12 h, ja apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaus cytometry analyysi. Keskiarvo + SD kolmen itsenäisen kokeen on esitetty. **,

P

0,01.

V1801 up-regulation Noxa in NSCLC soluissa

selvittämiseksi vaikutusmekanismi V1801, sen vaikutukset ilmaus antiapoptoottisten proteiinien (Bcl-xl ja Mcl-1) ja proapoptoottiset proteiinit (Noxa, Puma ja Bim) Bcl-2-perheen testattiin NSCLC solujen RT-PCR-analyysillä. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että V1801 voimakkaasti lisääntynyt ilmentyminen Noxa ajassa riippuvalla tavalla (kuvio. 3a). Sitten arvioitiin vaikutus V1801 proteiinin tasoon Noxa, ja totesi, että hoito V1801 klo 3-4 uM 24 tunnin selvästi säädelty Noxa NCI-H1975-soluissa (kuvio. 3b). NCI-H1975-solut käsiteltiin V1801 3 uM 3-6 h, Noxa oli voimakkaasti kohonneet (Fig. 3c). A549, HCT116, BGC823 ja SGC7901 solujen käsittely V1801 klo 3-6 uM 24 tuntia myös säädelty Noxa (Fig. 3d). Kuitenkin, gefitinibi ei säätää ylös Noxa näissä solulinjoissa (kuviot. 3a-3d), mikä osoittaa, että nämä kaksi yhdistettä ovat täysin erilliset mekanismit apoptoosin keuhkosyövän soluja.

(a) RT-PCR analyysi ilmentymisen

Noxa

,

Puma

,

Bim

,

Bcl-xl

, ja

Mcl-1

at mRNA-tasolla NCI-H1975-solut käsiteltiin gefitinibin (3 uM) tai V1801 (3 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina. (B) NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 ilmoitetuilla pitoisuus 24 h, hajotettiin ja analysoitiin Western blot -analyysillä käyttämällä anti-Noxa vasta-aine. (C) NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 3 uM ilmoitettuina ajankohtina, hajotettiin ja analysoitiin Western blot -analyysillä käyttämällä anti-Noxa vasta-aine. (D) Indikoitu soluja käsiteltiin V1801 tai gefitinibin 24 tuntia, hajotettiin ja analysoitiin Western blot-analyysi. (E) NCI-H1975-solut transfektoitiin kontrolli tai Noxa erityisiä siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman V1801 (3 uM) 24 tunnin ajan, hajotettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin. (F) transfektoitiin siRNA ja käsiteltiin V1801, kuten on kuvattu (e), sitten analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. (G) NCI-H1975-soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801, hajotettiin, ja immunosaostus /Western blot-määritykset suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (H, i) NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 tai gefitinibin 24 tuntia, hajotettiin, sytosolissa ja mitokondrioiden fraktiot eristettiin sentrifugoimalla, ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita (h). Ilmaisu sytokromi C kvantitoitiin densitometrialla analyysi ja normalisoidaan GAPDH tai Hsp75 (i).

Up-regulation Noxa tarvitaan V1801: n indusoiman apoptoosin NSCLC-solujen

arvioimiseksi sen rooli V1801: n indusoiman apoptoosin, Noxa hiljennettiin erityisiä siRNA (Fig. 3e), ja solut, kun V1801 analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. Olemme havainneet, että pudotus on Noxa vaimensi merkittävästi V1801: n indusoiman apoptoosin NCI-H1975-soluissa (kuvio. 3f), mikä osoittaa, että säätely ylöspäin Noxa on välttämätöntä V1801: n indusoiman apoptoosin. Kuitenkin Noxa hiljentäminen voinut täysin kumottu V1801 aiheuttamaa apoptoosia (kuvio. 3f), mikä viittaa siihen, että muut tekijät saattavat olla mukana ohjelmoidun solukuoleman laukaisee tämän gefitinibille analoginen.

Noxa voi suoraan sitoa Mcl-1 ja kilpailukykyisesti vapauttaa Bim tai Bak tästä apoptoosin antagonisti, mikä johtaa mitokondrioiden ja aloittamisen ohjelmoidun solukuoleman [18], [31]. Suoritimme samanaikainen immunosaostus ja Western blot analyysit V1801 saaneilla NCI-H1975-soluissa, ja totesi, että V1801 mutta ei gefitinibi tehostetun Mcl-1-Noxa sitoutumisaffiniteettia (Fig. 3G). Sitten tutki solunosasijaintia sytokromi c: Western blot, kun taas ilmaus sytokromi C kvantitoitiin densitometrialla analyysi ja normalisoidaan GAPDH tai Hsp75. Olemme havainneet, että NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 (3 uM), mutta ei gefitinibin (3 uM) 24 tunnin ajan, sytokromi c: osittain kulkeutua välillä mitokondrioita sytosoliin (Fig. 3 h ja i). Nämä tulokset osoittavat, että lisääntynyt ilmentyminen Noxa välittää indusoiman apoptoosin V1801 kautta mitokondrioiden kautta.

tutkiminen mekanismeista V1801 aiheuttama Noxa up-regulation

Tutkimukset ovat osoittaneet, että p53, c-Myc ja E2F1 voi kopiointia lisätä Noxa ilmaisun kautta suoran sitoutumisen Noxa promoottori [32]. Testasimme ilmentyminen näiden transkriptiotekijöiden, ja on raportoitu, että vain C-Myc on yliaktiivista NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 3 uM: ssa 3 h (Fig. 4a). Määrittää sen roolia V1801 aiheuttama Noxa ylössäätöä ja NCI-H1975-solujen apoptoosin, c-Myc hiljennettiin erityisillä siRNA (Fig. 4b). Olemme havainneet, että c-Myc hiljentäminen hieman tukahdutetaan V1801 aiheuttaman Noxa ilmentymistä (Fig. 4c) ja ohjelmoitua solukuolemaa NCI-H1975-solut (Fig. 4d). Näiden tulosten vahvistamiseksi, c-Myc-inhibiittori 5- (4-etyyli-bentsylideeni) -2-tioksotiatsolidin-4-oni (10058-F4) [33], käytettiin estämään c-Myc transkription toiminto. Tulokset osoittivat, että 10058-F4 osittain tukahdutettu V1801 aiheuttama Noxa up-regulation (Fig. 4e) ja sytotoksisuus NCI-H1975-solut (Fig. 4f).

(a) NCI-H1975-soluja käsiteltiin gefitinibin (3 uM) tai V1801 (3 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina, hajotettiin, ja Western blot -määritys suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (B) Western blot-analyysi käyttämällä lysaatit NCI-H1975 transfektoitujen solujen kontrolli tai c-Myc erityisiä siRNA ja anti-c-Myc-vasta. (C) NCI-H1975 transfektoitujen solujen c-Myc erityinen siRNA hoidettiin tai ilman V1801, hajotettiin, ja Western blottaus suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (D) NCI-H1975 transfektoitujen solujen c-Myc erityinen siRNA hoidettiin tai ilman V1801, ja arvioidaan Anexin V /PI-värjäys ja virtaussytometria. (E) NCI-H1975-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollat ​​24 h, hajotettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin. (F) NCI-H1975-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollat ​​24 h, ja arvioidaan MTT-määrityksellä. *,

p

0,05; **,

p

0,01.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että sisplatiini voi säätää ylös Noxa in Erk riippuvaisella tavalla, ja esto Erk siRNA tai pieni yhdiste estäjä U0126 selvästi heikennettyjä sisplatiinin aiheuttama solukuolema sekä Noxa ilmaisun [15]. Testasimme vaikutukset V1801 on Erk, ja havaitsi, että NCI-H1975-solut käsiteltiin V1801 3 uM 12 tuntia, fosfo-Erk (p-Erk) lisättiin (Fig. 5a). Hoidettu V1801 24 tunnin myös alassäädetty fosfo-signaalimuunta- ja aktivaattoreita transkription 3 (p-STAT3), mutta ei fosfo-Ras-seriini /treoniini-proteiinikinaasi (p-Akt) (Fig. 5a). Se osoitti, että U0126 voisi heikentää V1801 aiheuttamaa Noxa ilmentymistä (Fig. 5b), ja hieman (p = 0,06) pienensi V1801: n indusoiman apoptoosin NCI-H1975-solut (Fig. 5c).

(a) NCI -H1975 soluja käsiteltiin gefitinibin (3 uM) tai V1801 (3 uM) ja ilmoitettuina ajankohtina, hajotettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin. (B) NCI-H1975-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollat ​​12 tai 24 h, hajotettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin. (C) NCI-H1975-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollat ​​24 h, ja apoptoottista solukuolemaa arvioitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. (D) NCI-H1975-soluja käsiteltiin 24 h BOR ja /tai V1801, ja sitten arvioitiin MTT-määrityksellä. (E) NCI-H1975-soluja käsiteltiin V1801 (2 uM), gefitinibi (2 uM), BOR (10 nM), tai niiden yhdistelmät ja ilmoitettuina ajankohtina. Sitten solut hajotettiin ja niille suoritettiin Western blottaus käyttämällä vasta-aineiden kanssa.

manttelisolulymfooma, Noxa aktivoitumista tarvitaan proteasomin inhibiittoria bortetsomibilla indusoiman apoptoosin [13]. Testasimme yhdistetty vaikutus V1801 ja Bortetsomibin on NCI-H1975-soluissa ja havainneet, että bortetsomibin klo 10-15 nm merkittävästi parannettu V1801 (2 uM) -caused soluproliferaation inhibointi (kuvio. 5d). Analyysi yhdistelmän indeksi (CI) [29], [30] osoitti, että CI-arvot olivat alle 1, mikä osoittaa, että nämä kaksi aineet voisivat käyttää synergiavaikutukset NSCLC soluihin. Molekyylitasolla, osoitimme, että hoito NCI-H1975 solujen V1801 ja bortetsomibiin johti tehostettu säätely ylöspäin Noxa ja aktivointi Casp-3 ja lohkaisu PARP (Fig. 5e). Kuitenkin säätely ylöspäin p-Erk aiheuttama V1801 oli hieman heikennetty bortetsomibilla (Fig. 5e).

In vivo

antituumoriteholla of V1801 on ksenografti hiirimallissa

Testasimme

in vivo

antituumoriteholla of V1801. Voit tehdä tämän, nude-hiiriin inokuloitiin subkutaanisesti oikeaan kylkeen 2,5 × 10

6 NCI-H1975 solua 0,1 ml: aan PBS. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet palpoitavissa koon, hiiret satunnaistettiin 3 ryhmään (n = 11 kussakin ryhmässä) ja suun kautta V1801 (30 mg /kg /päivä), gefitinibi (30 mg /kg /päivä) tai ajoneuvon ohjaus 3 viikkoa. Kiehtovan, huomasimme, että V1801 merkitsevästi esti kasvaimen kasvua verrattuna ajoneuvon ohjaus- tai gefitinibin (P 0,05) (kuviot. 6a kautta 6c). Eläimet lopetettiin, kun ne hoidettiin 3 viikkoa ja kasvaimen näytteet eristettiin ja kuvaamisen (Fig. 6c). Proteiinit uutettiin tuumorinäytteistä ja Western blot -määritys suoritettiin. Olemme havainneet, että näytteissä käsiteltyjen hiirien V1801, ilmaus Noxa oli säädelty verrattuna, että näytteet on erotettu ajoneuvon tai gefitinibin kontrollihiiriin (Fig. 6d ja e). Nämä tulokset osoittavat, että antaminen V1801 osoittaa valtava terapeuttinen potentiaali.

(a) Nude-hiiriä inokuloitiin subkutaanisesti NCI-H1975-soluja käsiteltiin gefitinibin tai V1801 ja 3 viikkoa, ja mittaharppimittauksilla pisin kohtisuorassa kasvaimen halkaisijat olivat suoritettiin kahden päivän välein arvioida tuumorin tilavuus. (B) Kuvia hiirissä kahden viikon kuluttua hoidon aloittamisen. (C) Kuvia ksenograftikasvaimissa saatu hiirillä. Kahdeksan edustaja kasvaimet kussakin testiryhmässä näkyvät. (D, e) Western blot -analyysi lysaatit kasvaimen näytteitä osoitti vasta-aineita (d). Noxa ilmentyminen kvantifioitiin densitometrialla analyysi ja normalisoidaan Actin ilmentymistä (e).

Keskustelu

EGFR on solun pinnan reseptori aktivoituu yli puolet potilaista NSCLC, ja tämä aktivointi voi olla seurausta proteiinin yli-ilmentyminen kasvoi geenin kopioluvun tai geneettisiä mutaatioita [2]. Gefitinibi vastaisen keuhkosyöpä vaikutukset määrite sen sitoutumisen Adenosiinitrifosfaatti sitoutumiskohta tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR, mikä rajoitti EGFR-kinaasiaktiivisuuden [3], [5], [34], [35]. Vaikka monet potilaat aluksi vastaamaan gefitinibin, kestävyys ja kasvaimen uusiutumisen lopulta kehittää. Voittamiseksi lääkeresistenssi, uusi mutantti-selektiivisiä EGFR-kinaasi-inhibiittoreita EGFR T790M on raportoitu [36], ja 4-pyrrylamino kinatsoliinit uusia gefitinibin analogit syntetisoitiin [37]. Tässä tutkimuksessa suunnittelemme, koota ja arvioida useita uusia kinatsoliinijohdannaisten vaihtamalla kannat C5 ja C6 substituenttien ja vaihtelemalla C4-aminofunktionaalisuuden gefitinibin, ja raportoivat, että yhdiste V1801 jolla trifluorimetyyliryhmä on C5′- asemassa ja bromia on C2′-asema aniliiniosan substituoitu C4 asemaan kinatsoliini ydin voittaa gefitinibi vastuksen kautta lisäävä säätely Noxa, mikä viittaa uusi strategia taistella NSCLC EGFR T790M mutaatio.