Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jotkut

Escherichia coli

kannoista tuottaa toksiineja nimetty cyclomodulins (CMS), jotka häiritsevät eukaryoottinen solusyklin isäntäsolujen, mikä viittaa mahdollisen yhteyden näiden bakteerien ja syöpiä. On suhteellisen vähän tietoja, jotka koskevat siirtokuntien paksusuolen kasvainten cyclomodulin- ja genotoksisten tuottavat

E. coli

. Teimme laadullinen ja fylogeneettiseen analyysi limakalvon liittyvien

E. coli

kätkeminen cyclomodulin koodaavia geenejä 38 potilailla, joilla on peräsuolen syöpä (CRC) ja 31 kanssa Divertikuloosi. Toimivuus näistä geeneistä tutkittiin soluviljelmissä ja genotoksinen kantojen vailla tunnettujen CM-koodaavaa geeniä tutkittiin. Tulokset osoittivat muita yleisemmin B2 phylogroup

E. coli

kätkeminen colibatin tuottavien geenien koepaloja potilailla, joilla on CRC (55,3%) kuin ne, potilailla, joilla on divertikuliitti (19,3%), (p 0,01). Samoin muita yleisemmin B2

E. coli

kätkeminen CNF1 koodaavat geenit koepaloja potilailla, joilla on CRC (39,5%) kuin ne, potilailla, joilla on divertikuliitti (12,9%), (p = 0,01). Toiminnallinen analyysi paljasti, että suurin osa näistä geeneistä oli toiminnallinen. Analyysi kyky

E. coli

kiinni suolen epiteelisolujen Int-407 osoitti, että korkeasti kiinnittyneet

E. coli

kannat enimmäkseen kuului A ja D phylogroups, alkuperästä riippumatta kantojen (CRC tai Divertikuloosi), ja että suurin osa

E. coli

kuuluvista kannoista B2 phylogroup näkyy hyvin alhainen tarttuvuus. Lisäksi, 27,6% (n = 21/76),

E. coli

kannat puuttuu tunnettujen cyclomodulin koodaavan geenien aiheuttamaa DNA vaurioita

in vitro

, arvioituna komeetan määrityksessä. Toisin kuin cyclomodulin tuottavat

E. coli

, nämä kannat pääasiassa kuulunut A tai D

E. coli

phylogroups, ja niillä ei merkittävää eroa jakelu CRC ja umpipussitauti näytteet (22%

vs.

32,5%, p = 0,91). Lopuksi cyclomodulin tuottavat

E. coli

kuuluvat lähinnä B2 phylogroup asuttaa paksusuolen limakalvon potilailla, joilla on CRC.

Citation: Buc E, Dubois D, Sauvanet P, Raisch J, Delmas J, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) Korkea yleisyys Mucosa-Associated

E. coli

tuottaminen Cyclomodulin ja Genotoxin Colon Cancer. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10,1371 /journal.pone.0056964

Toimittaja: John R. Battista, Louisiana State University ja A M College, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 12, 2012; Hyväksytty: 18 tammikuu 2013; Julkaistu: 14 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Buc et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ministère Français de l’Education Nationale de la Recherche et de la Technologie, l’Institut National de la Sante et de la Recherche médicale (Inserm U1071), l’Institut National de la Recherche Agronomique (USC-2018) ja la Ligue contre le syöpä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on nykyisin kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja naisilla, ja neljänneksi yleisin syy syövän kuolemaan ympäri maailmaa, ja 1,2 miljoonaa arvioitu tapauksissa ja 609000 arvioitu kuolemaa vuodessa [1]. Yksittäisiä CRC osuus on noin 95% ja peräsuolen tapauksista [2]. Geneettiset tekijät ovat yleensä ajatellaan olevan noin 20% syövän syy kanssa ympäristön osuus on loput 80% riski [3]. CRC on siten vahvasti sidoksissa ympäristöaltisteiden lukien bakteerit, jotka vaikuttavat merkittävästi paksusuolen ympäristöön. Todisteet on kertynyt osoittaa, että koostumus ihmisen suoliston mikrobiston vaikuttaa isännän terveydentilaa. Mikrobien dysbiosis havaitaan CRC potilailla ja todisteet bakteerin vuorovaikutukset CRC on raportoitu

Streptococcus bovis

,

Enterococcus spp.

,

Helicobacter pylori

,

Bacteroides fragilis

ja

Escherichia coli

(katsausta varten katso [4]). Eri tutkimukset osoittavat selvästi yhteys limakalvon kiinnittyneet

E. coli

ja CRC. Tutkimukset syöpäpotilaiden Britanniassa ja Saksassa osoitti, että limakalvo liittyvä

E. coli

ovat useammin tunnistetaan paksusuolikudos sairastavien potilaiden adenokarsinooman kuin että tarkastusten [5], [6]. Swidsinski

et al.

Ilmoitti, että vain 3% paksusuolen limakalvon koepalat oireeton valvonnan testattu olivat positiivisia

E.

Coli bakteerin universaali PCR [5]. Sen sijaan, koepalat 92%: lla potilaista paksusuolen adenoomia tai karsinoomia kanna bakteereja, jossa

E. coli

on hallitseva 70%: lla potilaista [5]. Samoin Martin

et al.

Todettu, että 70% CRC potilaista oli limakalvoon liittyvä bakteereja, ja että merkittävä osa bakteereista kuului

E. coli

lajeja. Mielenkiintoista, Bronowski

et al.

Osoitti, että jotkut

E. coli

kannoilla virulenssigeenit aiemmin luokiteltu ominaisia ​​uropatogeenisen

E. coli

(UPEC) [7]. Tällaiset

E. coli

kannat voivat laukaista solujen lisääntymistä suolistossa [8], joita nähdään muiden bakteerien [9], [10].

E. coli

on hallitseva aero-anaerobiset gram-negatiivisten lajien normaalin suolistoflooran ja osallistuu vakauden edistäjänä luminaaliselle mikrobikasvuston ja ylläpitää normaalia suoliston tasapainotukseen [11]. Kuten kommensaali,

E. coli

rinnalla sen nisäkäsisäntä hyvässä harmoniassa ja harvoin aiheuttaa sairauden. Kuitenkin jotkut kannat kuljettaa yhdistelmää virulenssigeeneissä joiden avulla ne voivat aiheuttaa suoliston (InPEC, Intestinal Pathogenic

E. Coli

) ja extra-suolikanavan (ExPEC, Suoliston Pathogenic

E. Coli

) infektiot (katsauksia katso [12] – [14]). Fylogeneettinen analyysi osoitti, että

E. coli

koostuu neljästä fylogeneettiseen ryhmässä (A, B1, B2, ja D) [15], [16]. Viruskannan kuuluvat pääasiallisesti ryhmiin B2 ja D, vaikka useimmat ulosteen kannat kuuluvat ryhmään A ja B1. Kantoja ryhmien B2 ja D kantavat usein virulenssitekijät, jotka puuttuvat ryhmästä A ja B1 kantoja [17] – [19].

joukossa

E. coli

virulenssitekijät, useita toksiineja, nimeltään cyclomodulins, houkuttelevat yhä enemmän huomiota, koska ne ovat genotoksisia ja /tai moduloivat solujen erilaistumista, apoptoosin, ja leviämisen (katsausta varten katso [4]). Sytotoksiset nekrotisoiva tekijä (CNF) aktivoi Rho-GTPaasit, joka johtaa solun tukirangan muutoksiin ja vaikuttaa solusyklin. Sykli-estävänä tekijänä (CIF) kohdistaa NEDD8-konjugoitu CULLINS kaapata isäntäsolun signalointipolkujen [20], [21]. Genotoxin colibactin on hybridi polyketide ei-ribosomaalinen peptidi yhdiste [22]. Sen biosynteesin koneet koodaa

PKS

genomista saari. Colibactin aiheuttaa DNA double-säikeen katkoksia ja kromosomaalinen epävakautta ihmisen eukaryoottisoluissa [22], [23]. Cytolethal distending toksiini (CDT) myös aiheuttaa DNA-vaurioita todennäköisesti läpi DNAasin toimintaa, ja läheistä sukua tuottama entsyymi

Helicobacter hepaticus

edistää etenemistä hepatiitti ennalta pahanlaatuinen, dysplastisia vaurioita ja lisää leviämisen hepatosyyttien, tarjoaa ensimmäiset todisteet siitä, että CDT on karsinogeeninen

in vivo

[24] – [26].

Tässä tutkimuksessa vertasimme esiintyvyys cyclomodulin- ja genotoxin koodaavien geenien limakalvolla -associated

E. coli

kannat resektio yksilöitä CRC ja Divertikuloosi. Tutkimme myös genotoksinen limakalvon liittyvien

E. coli

vailla tunnettujen genotoxin-koodaavat geenit ja niiden kykyä tarttua epiteeli- suoliston soluista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Eettinen hyväksyntä Tutkimus myöntämä Clermont-Ferrandin tutkimuksen eettisen komitean. Tämä IRB sallittu pidättämistä koskeva kirjallinen suostumus ja hyväksytty prosessi saada sanallinen suostumukset rajoituta, koska tutkimus ei liity mitään menettelyt, joista kirjallinen suostumus edellytetään yleensä ulkopuolelle tiedekontekstissa ja ei aiheuta vaaraa haittaa aiheista. Biologiset näytteet kerättiin paksusuolen asemointia, jotka tarvitaan potilaiden hoitoon. Tutkijat selitti tutkimuksessa mahdollisen aihe suullisesti, joka tarjoaa kaikki olennaiset tiedot, kuten tarkoitus, menettelyjä, otaksuttu riskejä. Tämän sanallinen selitys, mahdolliset aihe oli varustettu tutkimus tiedotuslomake. Sen jälkeen, kun potentiaalinen kohde aikaa lukea tutkimus tiedotteen, tutkija vastasi lisäkysymyksiä mahdollinen kohde on voinut olla. Sanallinen sopimus osallistua tutkimukseen saatiin kaikille potilaille mukana tutkimuksessa. Päivämäärät suullinen suostumus jäljitettiin ei-tunnistettavalla tavalla.

Potilaat

Jotta tutkia makroskooppiset näytteitä resektio paksusuolen yksilöitä, vertasimme potilaalla on CRC ja potilaat, joilla Divertikuloosi kuin ei-syöpä ryhmä. Kuusikymmentäyhdeksän potilasta tutkittiin välillä maaliskuussa 2007 ja marraskuussa 2009 yliopistollisen sairaalan Clermont-Ferrandissa Ranskassa. Kolmekymmentäkahdeksan oli CRC, ja 31 oli monimutkainen Divertikuloosi (taulukot S1, S2, S3). Potilaat päässä CRC ryhmässä oli mutkatonta ja kokoisen paksusuolensyöpä kehitetty joko proksimaalisessa paksusuolessa (mistä Umpisuoli huomiota maksan taipumisen nousussa paksusuolen) tai distaalisessa paksusuolessa (sigmasuolessa). CRC poikittaisen tai jälkeläinen paksusuolen jätettiin, koska niiden alhaisen esiintymisen ja riskien välttämiseksi puolueellisuudesta. Kaikissa tapauksissa toiminta koostui segmentaalinen resektio paksusuolen mukana kasvain välittömästi anastomosis ettei se siirrä avanne. Potilaat, joilla on monimutkainen CRC (tukkeuma, perforaatio tai infektio), suljettiin pois tutkimuksesta. Potilaat päässä Divertikuloosi ryhmällä oli Divertikuloosi joihin sigmasuolessa ja tarvitsi leikkaushoitoa koska historian komplikaatio (toistuvat divertikuliitti, paise, peritoniitti). Me poissuljettu potilaat, joilla on akuutti tai krooninen tulehdus leikkauksen aikana, ja ne, joilla on ahtauma. Siinä tapauksessa, että äskettäin hyökkäys divertikuliitti, antibiootteja lopetettiin vähintään 3 viikkoa ennen leikkausta. Sex suhde oli 1,05 ja 0,72 CRC ja DIV potilaista. Potilaiden ikä oli 35-95 vuotta syöpäpotilaille (mediaani-ikä, 71 vuotta ja keski-ikä, 67 vuotta) ja 34-81 vuotta varten Divertikuloosi potilasta (mediaani-ikä, 58 vuotta ja keski-ikä 60 vuotta). Näytteitä otettiin resektoitiin paksusuolen, paikalla pahanlaatuisia kasvaimia varten CRC potilaiden ja normaalissa limakalvolle diverticulosis potilaille. Patologinen analyysi vahvisti neoplastisia ominaisuuksia näytteiden CRC potilailla, ja puute tulehduksen tai dysplasian Divertikuloosi potilailla. CRC-sarja käsitti 21 proksimaalisen ja 17 distaalisen paksusuolen näytteitä. TNM raportoidaan taulukoissa S1 ja S2. Suolen valmistelu oli suun kautta natrium- picosulfate tai suullinen polyetyleeniglykoli illalla ennen leikkausta. Kaikki resektio potilaat olivat saaneet sefoksitiini (2 g laskimoon) ajankohtana viillon eikä yksikään saanut antibioottien 4 viikkoa ennen näytteenottoa.

Näytteen käsittely

limakalvon Näytteet laitettiin 10 ml steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, pH 7,4 (PBS) ja kuljetetaan jäissä laboratorioon. Näytteet punnittiin (50-100 mg kukin) ja pestiin perusteellisesti kolme kertaa 10 ml: lla PBS: ää poistamaan useimmat ulosteen bakteerien. Kukin pesuvaihe seurasi sentrifugointi 900g: ssa 5 minuuttia. Näytteet murskattiin sitten (Ultra-Turrax, IKA) ja inkuboitiin 15 minuutin ajan koeputkipyöritin huoneenlämpötilassa, kun läsnä Triton 0.1X. Kymmenkertainen laimennoksia lysaattia sitten maljattiin Drigalski agar ja kromogeeninen agar chromID CPS3® (bioMérieux), joka voitaisiin nimetä

E. coli

.

E. coli

pesäkkeet kerättiin 24 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa ja bakteerien tunnistamiseen varmistettiin automaattisen Vitek II® (bioMerieux) järjestelmä. Kun mahdollinen enintään 96

E. coli

pesäkettä näytettä kerättiin molekyylityypitysmenetelmän. Bakteerit jatkoviljeltiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa 96-kuoppaisille levyille Luria Bertani väliaineessa, jota oli täydennetty 15% glyserolia, ja sitten säilytettiin -80 ° C: ssa.

Molecular kirjoittamalla ja fylogeneettiset ryhmittely

Kymmenen pesäkettä näytettä tyypattiin molekyylimenetelmät tunnistaa

E. coli

kantoja (

E. coli

genotyyppien) asettumaan näytteitä. Kaksi genotyypitysmenetelmiä käytettiin, joka on ”suoliston Repetitive Intergeenisen konsensus” sekvenssi (ERIC) -PCR käyttäen aluketta ERIC2 (5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 ’) ja ”Random Amplified Polymorphic DNA” (RAPD) – PCR: llä käyttäen aluketta 1283 (5’-GCG ATC CCC A-3 ’) [27], [28]. Yksi edustaja kanta analysoitiin sen jälkeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa Luria-Bertani-väliaineessa, jota oli täydennetty 15% glyserolia.

E. coli

Sitten kannat luokitellaan

E. coli

Viite Collection (Ecor) järjestelmä [16] osaksi fylogeneettiseen ryhmiin A, B1, B2, ja D käyttäen multiplex PCR-tekniikkaa [29]. Kanta RS218, joka satamat kaikki geenit kohteena multiplex PCR, käytettiin positiivisena kontrollina.

havaitseminen ja tunnistaminen cyclomodulin tuottavien geenien

Cyclomodulin koodaavien geenien havaittiin dot-blot- DNA -hybridisaatiokokeissa kaikissa

E. coli

kantoja. Koettimet saatiin PCR kuten aiemmin on kuvattu [30] (taulukot S4 ja S5) käyttäen PCR DIG koetinsynteesimenetelmiä kit (Roche Applied Sciences,-Sveitsin) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kahden mikrogramman DNA-näytteet kiinnitetty positiivisesti varautuneita nailonkalvoille UV-valo 20 min. Hybridisaatio suoritettiin Rochen merkintöjä ja havaitseminen kit (Roche Applied Sciences) kuten valmistaja. Jokainen paikka tarkastettiin 16S rRNA anturi.

PKS

saari, joka sisältää colibactin tuottavat geeniklusterin, seulottiin koettimella päällekkäin

clbK

ja

clbJ

geenejä.

CNF

geenien havaittiin seoksella, jossa oli spesifisiä koettimia

cnf1

,

cnf2

, ja

cnf3

.

cdtB

geenien havaittiin kaksi -hybridisaatiokokeet

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

ja

cdtB-I-cdtB-IV

koetin seoksia.

CIF

geeni havaittiin käyttämällä sisäistä erityinen koetin. Herkkyydestä ja erityispiirteet koettimet tarkastettiin kummallakin kalvolle tiputtelua DNA otteita kaikista cylomodulin kontrollikannoilla. Positiiviset -hybridisaatiot cyclomodulin koetin varmennustutkimus PCR-määrityksissä, kuten aiemmin on raportoitu [30]. Reaktioseos sisälsi 50 ng DNA-näytettä, 0,2 mM kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia (dNTP), 0,4 uM kutakin aluketta, 3 mM MgCl2: a, ja 1,0 U RedGoldStar DNA-polymeraasia (Eurogentec, Belgia) vastaavan reaktiopuskuria. Alukkeita sijaitsevat 5 ’ja 3’ alueiden PKS saaren (jäljempänä clbA ja clbQ geenejä) käytettiin vahvistamaan koko läsnäolo colibactin tuottavien saari.

sytopaattisen määrityksissä

HeLa soluja (peräisin kohdunkaulansyöpä) hankittiin ATCC (ATCC® CCL-2

TM) pidettiin atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2, 37 ° C: ssa sopivassa väliaineessa. Solut viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% (tilavuus /tilavuus) vasikan sikiön seerumia (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamiinia (Life-Technologies), 200 U penisilliiniä, 50 mg streptomysiiniä, 0,25 mg ja amphoterocin B litraa kohti, ja 1% hEPES-puskuroidussa suolaliuoksessa (Lonza). Ne ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille 5 x 10

4 solua /kuoppa 24 H. sytopaattiset vaikutukset CNF ja CDT tutkittiin kaikkien kantojen solu-lysaatti, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, vaikutukset CDT ja CNF havaittiin solu- lysaattia-vuorovaikutuksessa testi. Sen jälkeen, kun 48 H viljelmää 37 ° C: ssa ravistellen Luria-Bertani elatuslientä, bakteeri- soluja sonikoitiin ja steriilisuodatettiin erikseen käyttäen 0,22 um huokoskoon suodattimien. HeLa-soluja käsiteltiin steriiliä sonikoitiin lysaatit (lopullinen proteiinipitoisuus: 4 ug /ml), kunnes analyysi. Vaikutukset colibactin ja cif havaittiin solu-bakteeri-vuorovaikutuksessa testi, joka perustuu vuorovaikutukseen HeLa-solut ja bakteerit. Yön yli Luria Bertani liemi viljelmistä

E. coli

pestiin kolme kertaa ja laimennettiin vuorovaikutuksessa väliaineessa. HeLa soluviljelmät infektoitiin infektiomultiplisiteettiarvoilla (MOI, määrä bakteerien solua kohden infektion alkamisen) 100 ja 200. Solut pestiin 4 H inokulaation jälkeen ja inkuboitiin soluviljelyelatusainetta 200 ug /ml gentamysiini, kunnes analyysi . Sen jälkeen, kun 72 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä, elatusaine poistettiin pesemällä kolme kertaa HeLa yksisolukerrokset. Morfologiset muutokset ominaisuus CDT, CNF, colibactin, ja Cif havaittiin värjäyksen jälkeen Giemsa tahra. Tunnistaminen perustuu kykyyn joko bakteeri- lysaattia, joka sisältää CNF ja CDT tai koko eläviä bakteereja tuottaa colibatin ja CIF aiheuttavan solutuhovaikutuksen epiteelisolujen analysoitiin 3-päivää infektion jälkeen. Colibactin, CDT ja CIF aiheuttama solutuhovaikutus vaikutuksia, on osoituksena laajentuneen ytimiä ja solujen pullistuma (megalocytosis), kun taas CNF aiheuttama multinucleation, ja laajentuminen HeLa soluja. Multinucleation havaitaan 50% soluista tartunnan CNF tuottavien bakteerien ja noin 10% ei-infektoituneiden solujen tai solujen tartunnan muiden CM-tuottavia kantoja. CNF ja CDT, sytopaattisen vaikutuksen näkyvät vasta kanssa bakteerilysaateista. Sitä vastoin colibactin ja CIF, yhteyksiä bakteerien ja isäntäsoluja, jotka on tarpeen. Havaitseminen alfa-hemolysiini tehtiin kaikille kantojen tutkitaan oli kasvatettu yön yli 37 ° C: ssa Columbia lampaan verta (5%)-agarissa (Oxoid, Dardilly, Ranska).

E. coli

25922 (ATCC) käytettiin vertailukohtana kanta alfa-hemolysiinia tuotantoa.

yksisoluiset geelielektroforeesilla

genotoksinen on

E. coli

kannat puuttuu tunnettujen CM-koodaavat geenit tutkittiin käyttäen yksisoluiset geelielektroforeesilla (comet). HeLa soluviljelmät infektoitiin MOI 500

E. coli

viljeltiin yön yli Luria-Bertani liemi. Solut pestiin kahdesti 3 H inokulaation jälkeen ja inkuboitiin yön yli soluviljelyelatusainetta 200 ug /ml gentamysiini, 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Ne pestiin sitten PBS: llä keskipitkän ja yhdistettynä 0,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia (Bio-Rad, Marnes La Coquette, Ranska) liuotettiin steriiliin PBS: ään 37 ° C: ssa. Solu-agaroosi-seosta levitettiin mikroskooppilevylle esipäällystetty 1,5% normaalia sulamispisteen agaroosia (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) liuotetaan steriiliin PBS: ään 37 ° C: ssa. Kansi slip levitettiin ja annettiin jähmettyä 4 ° C: ssa 60 min. Objektilasit pantiin sitten 50 ml: aan lysis-puskuria (10 mM Tris-HCl, 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA: ta, joka sisälsi 1% Triton X-100, 10% DMSO: ta, pH 10) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Objektilasit upotettiin elektroforeesin puskurissa (1 mM EDTA 300 mM NaOH, pH 13) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja sähkökentässä on sovellettu (1 V /cm) 40 minuutin ajan. Objektilasit neutraloitiin 400 mM Tris-HCI, pH 7,5, ja kuivataan. 40 ui 1: 10000 laimennos SybrGreen levitettiin suoraan dia. Yksittäiset solut tai komeettoja näytettiin Zeiss Axioplan2 fluoresenssimikroskooppiin. B2

E. coli

-kanta IHE3034 ja

E. coli

DH10β pBACpks käytettiin positiivisina kontrolleina [22]. B2

E. coli

-kanta IHE3034 Δ

clbP

ja

E. coli

DH10β pBAC käytettiin negatiivisina kontrolleina [22].

Adhesion määrityksessä

Int-407-soluja (jotka ovat peräisin ihmisen suoliston alkion jejunum ja ileum) hankittiin ATCC: ltä (ATCC® CCL -6

TM) pidettiin atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2, 37 ° C: ssa sopivassa väliaineessa. Ne viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% (tilavuus /tilavuus) vasikan sikiön seerumia (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamiinia (Life-Technologies), 200 U penisilliiniä, 50 mg streptomysiiniä, 0,25 mg amphoterocin B litrassa, ja 1% hEPES-puskuroidussa suolaliuoksessa (Lonza). Lyhyesti, solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /cm2 viljelmässä levyjä 48 H. infektio suoritettiin infektiokertoimella 10 bakteeria per solu. Infektoidut solut sentrifugoitiin 900 g: ssä 10 minuutin ajan 25 C: ssa ja laitettiin 37 ° C: ssa 3 H. Solut pestiin kolme kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS; pH 7,2). Epiteeli- solut lyysattiin 1% Triton X-100 (Sigma) deionisoidussa vedessä. Näytteet laimennettiin ja maljattiin Luria-Bertani (LB) agarmaljoille lukumäärän määrittämiseksi CFU vastaava kokonaismäärä soluun liittyvien bakteereja. Kannat

E. coli

K12 ja

E. coli

LF82 käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti [32]. Tulokset ilmaistaan ​​useita tarttuneiden bakteerien solua kohti, kun 3 H-infektion aikana.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Fisherin eksakti ja khi-neliö-testejä. Usean ryhmän vertailuja, aluksi chi-neliö testi heterogeenisuus tehtiin, ja vain jos tämä tuotti P-arvo 0,05 olivat yksittäisiä pareittain vertailuissa testattiin.

Tulokset

E. coli

kantojen paksusuolensyöpä ja umpipussitauti näytteet

analyysi

E. coli

kantoihin, että näytteiden määrä ilman

E. coli

oli merkitsevästi suurempi divertikuliitti potilailla (19,4%, n = 6/31), kuin niillä, joilla on CRC (2,6%, n = 1/38), p = 0,04 (Taulukko 1). Monet paksusuolen yksilöitä kanna vain yksi

E. coli

genotyyppi. Tämä havaittiin 42,1% (n = 16/38) CRC yksilöitä ja vain 25,8% (n = 8/31) ja divertikuliitti, mutta ero ei ollut merkittävä (p = 0,12). Useimmat kannat eristettiin CRC kuului B2 phylogroup (73,7%, n = 28/38), toisin kuin eristetty divertikuliitti (41,9%, n = 13/31), p 0,01 (taulukko 2). Ei ole merkittävää eroa

E. coli

phylogroup jakelu havaittiin, mukaan lukien B2

E. coli

eristettyjen kantojen proksimaalisesta (82,4%, n = 14/17) ja distaalisen paksusuolen kasvaimet (66,7%, n = 14/21), p = 0,23 (taulukko 2). Kaiken

E. coli

kannat, jotka kuuluvat B2 phylogroup colonized koolontuumoreissa useammin kuin he tekivät diverticulosis näytteitä.

Distribution of CM-koodaavat geenit mukaan

E. coli

phylogenetic ryhmien

Jakelu CM-koodaavien geenien

E. coli

kannat on esitetty taulukossa 3 ja taulukot S1, S2, S3. Yleisin piirre oli colibactin-koodaus

PKS

saari (80% CM tuottavien

E. Coli

, n = 28/35 ja 24,1% kaikista

E. Coli

kantoja, n = 28/116). Kaikki kannat liittyvät paksusuolen limakalvon potilaiden CRC tai divertikuliitti kätkeminen colibactin-koodaus

PKS

saari kuului phylogroup B2 (p 0,001 ryhmässä B2

verrattuna

ryhmiin A, B1 ja D, yksittäinen tai yhdistetty). Lisäksi 16,4% (n = 19/116) kantojen hallussaan

CNF

geeni; Näiden vain yksi oli

cnf2

positiivisten ja mikään ei ollut

cnf3

positiivisia, mikä osoittaa, että nämä kannat eivät olleet eläinperäisiä [33], [34]. Kaikki

cnf1

-harboring kannat kuuluivat myös phylogroup B2, ja osuus 36,7% (n = 18/49) kantojen tämän phylogroup. Mitä

PKS

saari, yhdistys

cnf1

kanssa phylogroup B2 oli vahva (p 0,001 ryhmässä B2

verrattuna

ryhmiin A, B1 ja D, yksittäisiä tai yhdistettyjä ), ja 33% (n = 16/49) ja B2 kantojen hallussaan sekä

PKS

saaren ja

cnf1

geeni (p 0,001 ryhmässä B2 verrattuna ryhmiin A, B1 ja D , yksittäisiä tai yhdistettyjä), kuten aikaisemmin havaittu [30], [35]. Kaikki mutta kolme kannoissa

cnf1

geeni näytteillä alfa-hemolyyttinen fenotyyppi. Kuitenkin kolme ei-hemolyyttinen

cnf1

positiivisia kantoja kanna

hlyC

geeni.

cdtB

geenien havaittiin kuudessa kantoja. Vaikka neljä kuudesta

CDT

positiivisia kantoja kuului phylogroup B2, ei merkittävää yhteyttä tiettyyn fylogeneettiseen ryhmää havaittiin, vaikka eri

cdtB

geenin alatyyppejä.

cdtB-I Twitter /

cdtB-IV

geenit (n = 5) havaittiin useammin kuin

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

geenin ryhmä (n = 1). Ainoa

CDT-III

positiivisten rasitusta myös kanna

cnf2

geenin yhdistelmä geenien usein raportoitu pVir plasmidissa ja pääasiallisesti nähtävissä kannoissa naudasta [36], [37 ].

cdtB

geenejä ei osoittanut erityistä yhdessä colibactin-koodaus

PKS

saari tai

cnf1

geeni. Koska

CDT

geenejä on tutkittu laajasti Shiga toksiinia tuottavan

E. coli

(STEC) kannat [38] – [40], päätettiin tutkia

cdtB

positiivisia kantoja varten

STX

ja

EAE

geenejä. Ei

STX

tai

EAE

geeni havaittiin

cdtB

-positiivisille kantoja.

cif

geenin havaittiin kolmessa kannassa, jotka kuuluivat phylogroups A (n = 1) ja B1 (n = 2) ja kanna muita CM-koodaavat geenit. CIF on efektori tyyppiä 3 eritystä järjestelmä koodaama uran suoliston effacement (LEE) havaittiin enteropatogeeniset

E. coli

(EPEC) ja enterohemorraginen

E. coli

(EHEC) [41], [42] ja kolme positiivista kantoja tässä tutkimuksessa hallussaan

EAE

geeni mutta ei

Stx1

eikä

Stx2

geenit , ja siksi kuului EPEC patotyypille.

fenotyyppinen havaitseminen cyclomodulins

Cell-lysaatin kanssa vuorovaikutuksessa testejä käytettiin tutkimaan CNF ja CDT tuotannon kaikissa kannoissa. Havaitsemiseksi colibactin ja CIF tuotantoa, jotka vaativat solujen bakteeri-vuorovaikutuksessa testeissä, oli mahdollista vain ei-hemolyyttinen kantoja, koska hemolysiinia tuottavien kantojen, toisin kuin vastaavat lysaatit, indusoi nopeaa solukuolemaa. Tulokset on esitetty taulukoissa S1, S2, S3. Colibactin, CDT ja CIF indusoi sytopaattisia vaikutuksia, on osoituksena suurennettu ytimet ja solujen turvotus (megalocytosis), kun taas CNF indusoi multinucleation on ≥50% soluista ja laajentumisen HeLa-solujen (kuvio 1). CNF ja CDT, sytopaattisen vaikutuksen oli vain havainnoida bakteerilysaateista, kun taas kontakti bakteerien ja isäntäsolujen vaadittiin colibactin ja CIF, kuten aiemmin on raportoitu (kuvio 1) [22], [31], [42]. Jos havaitaan sytopaattinen vaikutus liittyi läsnäolo CM-koodaavan geenejä. Kolme kannoissa

PKS

saari eristetty Divertikuloosi, distaali- ja proksimaalinen paksusuolen yksilöitä ei aiheuttanut solutuhovaikutus. Yksi kanta, joka on eristetty Divertikuloosi näytteestä oli toimimaton

cnf1

geeni ja kaksi

CDT

positiivisia kantoja ei todettu solutuhovaikutus. Sillä -kanta

cnf2

ja

CDT

-III geenit, 50% cell multinucleation todistivat tuotantoa CNF ja laaja megalocytosis johtuvan CNF tuotantoon tai sen yhdessä CDT-III . Solutuhovaikutuksen ei havaittu kannoissa,

cif

geenin. Kaiken kaikkiaan useimmat CM-koodaavat geenit olivat toiminnallisia, varsinkin

CNF

ja

CIF

(93% ja 100%, tässä järjestyksessä).

CNF ja CDT, sytopaattisen vaikutuksen näkyvät vasta kanssa bakteerilysaateista. Sitä vastoin colibactin ja CIF, välinen kosketus bakteerien ja isäntäsoluja, jotka on tarpeen. Colibactin, CDT ja CIF aiheuttama sytopaattiset vaikutukset näkemää laajentuneen ytimiä ja solujen pullistuma (megalocytosis), kun taas CNF aiheuttama multinucleation ja laajentumisen HeLa-soluissa.

Distribution of CM-koodaavat geenit mukaan näytteen alkuperästä ja phylogroupe

tulokset on esitetty taulukossa 4, kuvio 2 ja taulukot S1, S2, S3. Kaksikymmentäviisi CRC yksilöt joukossa 38 (65,8%) sisälsi CM-positiivisia

E. coli

ja vain 6 umpipussitauti yksilöt joukossa 31 (19,4%), mikä osoittaa, että CM-kätkeminen kannat ensisijaisesti liittyy CRC (p 0,01). Tämä ero liittyi suuri määrä CM-positiivisten B2

E. coli

CRC yksilöitä verrattuna havaittiin Divertikuloosi yksilöt (kuva 2). Niinpä kannoissa colibactin-koodaus

PKS

saari oli läsnä 55,3% CRC näytteistä (n = 21/38) ja vain 19,3% Divertikuloosi näytteistä (n = 6/31), mikä osoittaa, että

PKS

positiivinen kannat olivat merkitsevästi (p 0,01) yleisempää CRC. Vähemmässä määrin,

CNF

ja

CDT

positiivinen

E. coli

olivat merkitsevästi (p≤0.02) yleisempiä CRC kuin diverticulosis näytteissä. Nämä erot johtuivat pääasiassa korkeasta esiintyvyydestä

PKS

-,

CNF

– ja

CDT

positiivisten

E. coli

distaalisessa CRC yksilöitä verrattuna että Divertikuloosi yksilöt (p≤0.01). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että CM-positiivisia

E. coli

jakelu se vaihtelee näytteen alkuperästä.

,

E. coli

kannat (n = 70) eristettiin CRC näytteistä (n = 38), ja B,

E. coli

kannat (n = 46) eristettiin Divertikuloosi näytteistä (n = 31).

genotoksisuus

E. coli

vailla CM-koodaavat geenit

olivatko

E. coli

vailla tunnettujen CM-koodaavat geenit voivat aiheuttaa DNA-vaurioita isäntäsoluissa. Käyttämällä HeLa viljeltyjen solujen genotoksisuuden kantojen tutkittiin yksisoluiset geelielektroforeesi määrityksessä (tai komeetta määritys), state-of-the-art tekniikkaa havaitsemiseksi DNA aiheuttamia kemiallisia genotoxins. Kaikkiaan 76 kliinisen

E. coli

kannat tutkittiin; 15 peräisin proksimaalisesta paksusuolensyöpä, 21 distaalisesta paksusuolen syövän ja 40 Divertikuloosi. Nämä kannat kuului A (n = 29), D (n = 21) ja B2 (n = 17) phylogroups. Mielenkiintoista, 27,6% (n = 21/76) on

E. coli

kantoja, joilta puuttuu tunnetaan CM-koodaavat geenit indusoi muodostumista komeettoja, jotka ovat tyypillisiä isäntäsolun DNA-vaurioiden (kuvio 3 ja taulukot S1, S2, S3). Lisäksi, toisin kuin CM tuottavat

E. coli

kantoja, jotka kuuluvat pääasiassa B2 phylogroup, nämä komeetta positiivisia kantoja kuuluivat pääasiassa A (52%, n = 11/21) ja D (29%, n = 6/21) phylogroups. Comets havaittiin 13 kantoja (32,5%) keskuudessa 40 eristettiin potilailta, joilla Divertikuloosi, ja 8 kantojen (22%) kesken 36 potilailla, joilla on CRC. Jakautuminen näiden oletettujen genotoksinen kantoja näytteet oli siis erilainen kuin CM-koodaavaa kantoja.

DNA-vaurioita ei havaittu HeLa-soluissa tartunnan

E.