Krooninen sairaus

tiivistelmä

vapautettiin MikroRNA osansa kehittymistä ja etenemistä paksusuolen syöpä, mutta vähän tiedetään niiden kudosten ja solujen jakelua jatkumoon normaalin limakalvon läpi premalignien adenooman ja invasiivisia adenokarsinooma. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia ekspressiokuviota MIR-17-92 klusteri (miR-17, miR-18, miR-19, miR-20 ja miR-92) sekä miR-21, miR-31 , miR-135b, ja miR-145 alussa kliinisesti todettu paksusuolen syöpä. MikroRNA analysoitiin kromogeenista

in situ

hybridisaatio normaalissa-adenooma-adenokarsinooman sekvenssin yhdeksän adenokarsinoomia kehitetty limakalvon paksusuolen polyypit. Sen jälkeen, ilmentyminen valitun MikroRNA on validoitu 24 limakalvon paksusuolen syövän polyypit. Expression of miR-17 rajoittui epiteelisolujen ja ilmaisua pinta nousi muutosvyöhykkeellä normaalista adenomatoottisen kudokseen. MIR-17-92 klusterin jäsenet, miR-19b, miR-20a, ja miR-92a, noudatti samaa ekspressiokuviota, mutta miR-17 oli kaikkein hallitseva. Lisääntynyt ilmentyminen miR-21 havaittiin kasvaimeen liittyvä strooman kanssa dramaattisin nousua adenooma ja adenokarsinooma, kun taas useita myönteisiä miR 145 fibroblastin kaltaisia ​​soluja normaalissa lamina propriassa (strooman) väheni vaiheittain koko normaalin-adenooma-adenokarsinooma järjestyksessä. Voidaan päätellä, että ilmaus miR-17, miR-21, ja miR-145 muutoksista varhaisessa vaiheessa normaalin-adenooma-adenokarsinooma järjestyksessä. Niinpä nämä MikroRNA voi olla rooli kehitettäessä paksusuolensyöpä.

Citation: Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) microRNA-17 on kaikkein Up -Regulated jäsen miR-17-92 Cluster aikana Early Colon Cancer Evolution. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10,1371 /journal.pone.0140503

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 24 syyskuu 2015; Julkaistu: 14 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Knudsen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tutkimuksen rahoittivat Etelä Tanskan PhD Fund (lupanumeroon 12/6786, https://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), The University of Southern Denmark (www.sdu.dk), The Research Council Lillebaeltin Hospital (https://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), kuningas Christian X Foundation (https://kongehuset.dk/Menu/Fonde–legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), Perhe Spogaard Foundation (https://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase ja Ejnar Danielsen Foundation (lupanumeroon 10-000789, http: //www.danielsensfond .dk /Default.aspx), ja kansanedustaja J. Christensen ja vaimo K. Christensen Foundation. Kaikki avustukset edellä mainitut annettiin KNK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. BSN työskentelee kaupallinen yritys (Bioneer A /S, Tanska). Rahoittaja antoi tukea muodossa palkkaa, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: BSN on palveluksessa kaupallinen yritys (Bioneer A /S, Tanska). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Paksusuolisyöpä kuuluu yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti [1]. Huomattava osa näistä syövistä uskotaan kehittää vaiheittain normaalista paksusuolen limakalvon läpi syöpää edeltävä adenooma että invasiivisen adenokarsinooma seurauksena monimutkainen geneettisten ja epigeneettiset muutokset [2-4]. MikroRNA (miRNA) ovat luokka ei-koodaavan RNA välittävä transkription jälkeisen sääntelyn jotka ovat sekaantuneet peräsuolen syövän synnyn ja syövän etenemistä toimimalla onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [5-7]. MiRNA, jotka yleensä sisältävät ~ 22 nukleotidia, kohdistaa enemmän kuin 60% kaikista proteiinia koodaavan geenien [8], ja kukin miRNA voi mahdollisesti tukahduttavat satoja kohdegeenien [9].

MikroRNA ilmaistaan ​​selostukset sisältää yhden miRNA kuten miR-21 tai useampia kypsän miRNA (polycistrons), kuten miR-143/145 ja miR-17-92 klustereita. MIR-17-92 klusteri sisältää kuusi erilaista miRNA: miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a, ja miR-92a, jossa on hyvin samankaltainen sekvenssin välillä miR-19a ja miR-19b ja välillä miR-17 ja miR-20a [10]. Kaikki klusterin jäsenet on havaittu kohonnut peräsuolen syöpäkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen, vaikka vaihtelevia ekspression yksittäinen komponentti [11-13]. Muita usein kuvattu säädelty miRNA peräsuolen syöpä ovat miR-21 ja miR-31 [14-16], kun taas miR-145 on yksi johdonmukaisesti alassäädetty miRNA [15-18]. Lisäksi miR-135b on raportoitu olevan mukana alkupuolella tuumorigeneesin [19,20].

Huolimatta massiivinen meneillään tutkimus miRNA kolorektaalisyövässä, vain harvat tutkimukset ovat tutkineet miRNA muutoksia pitkin koko normaali- adenooma-adenokarsinooma (NA-AC) sekvenssin [20-24]. Bartley

et al

löytyi yhteensä 230 ilmentyvät eri miRNA NA-AC evoluutiomallin lukien miR-17, miR-19, miR-92a, ja miR-21 [21], kun taas muut tutkijat ovat raportoineet miR-31 ja miR-135b joukossa yleisimmin muutetut miRNA [20,22,25]. On myös osoitettu, että miR-21 up-sääntely adenooma ja adenokarsinooma on lisääntyneen ekspression syöpään liittyvää strooman fibroblastien kasvaimen mikroympäristössä [26]. Kuitenkin tietoa kudosten ja solujen jakautumista miRNA jatkumoon N-A-AC sekvenssi on vielä vähäinen. Tieto miRNA lokalisointi ja ilmaisu on olennaisen tärkeä ymmärtää niiden tarkka rooli aloittamisen, kehitys, ja etenemiseen paksusuolensyöpä.

adenokarsinooman kehittyy limakalvon polyypit (AKT) tarjoavat ainutlaatuisen mahdollisuuden tutkia aikaisin peräkkäinen kehittäminen adenokarsinooma samassa potilaassa. Käyttäen AKT paksusuolen mallina NA-AC sekvenssin Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kuvata ilmentymisen kuviot miR-17-92 klusterin jäsenet sekä miR-21, miR-31, miR-135b ja miR-145 paksusuolen syövän kehitykseen keskittyen niiden esiintyvyyttä jakautumista kudoksiin ja solujen alkuperä.

Materiaalit ja menetelmät

kudoksen tutkitaan tässä tutkimuksessa koostui kahdesta toisistaan ​​riippumatonta kliiniset, diagnostiset näytteet: testi joukon yhdeksän formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) ACP ja validointi joukko 24 FFPE ACP paksusuolessa. Kaikki kudosblokeista saatiin diagnostisten patologian arkisto Kliininen patologia, Vejle sairaala. Koekappaleet Testissä tutkimuksen alun perin diagnosoitu aikana paksusuolen syövän seulontaan toteutettavuustutkimuksen vuodesta 2005 vuoteen 2006 läänissä Vejle, Tanska, kun validointi asettaa peräisin tarkoitetuista potilaista diagnosoidaan Vejle sairaalassa vuodesta 2005 kautta 2009. Vain tavanomaisen adenokarsinoomat olivat mukana, ja limakalvon polyypit sisältäviä serrate adenoomia suljettiin pois. Vahvistus diagnoosi ja uudelleen luokittelu on adenomatoottisten komponenttien polyyppeja aikaan kokenut ruoansulatuskanavan patologi. Yksityiskohtaiset potilastiedot on esitetty taulukossa 1.

tutkimus puhkeamista, kukin histologinen jakso sisälsi kaikki kolme osatekijää AKT-maiden,

i

.

e

. normaali limakalvo, adenomatoottisen kudos, ja invasiivisia adenokarsinooma. Koska enemmän osat leikattiin kudosblokeista joillakin alueilla kohteisiin puuttui, ja näin kaksi yksilöitä testipakkauksesta ja jopa kuusi validointi asetettu laiminlyönyt täydellisiä tietoja kaikista kolmesta osastojen NA-AC järjestyksessä.

tutkimus hyväksytty maakunnan tiede- eettiset komiteat Etelä-Tanska (ID # S-20120075) ja myönsi luopuminen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimus rekisteröitiin Tanskan Data Protection Agency, ja Tanskan Registry of Human Tissue Käyttöaste oli kuultava ennen kudosnäytteitä käytettiin.

In situ

hybridianalyysi

In situ

hybridisaation (ISH) mir-17, miR-21, miR-145, miR-126, miR-31, miR-125b, miR-135b, miR-200b, miR-18a, miR19b , miR-20a, ja miR-92a suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Mirna koetin sekvenssit ja kokeellisia yksityiskohtia on esitetty S1 taulukossa. Lyhyesti, ISH analyysi tehtiin 6 um: n paksuisia leikkeitä käyttämällä Tecan Evo väline (Männedorf, Sveitsi). Pitoisuus optimointi voidaan määrittää optimaaliset koetinpitoisuudet ja hybridisaatio lämpötilat toteutettiin ennen analyysiä. Leikkeitä ennalta digestoitiin proteinaasi-K: n (15 ug /ml) 37 ° C: ssa 8 minuutin ajan, ennen hybridisoitiin 57 ° C: ssa 15 minuutin ajan, ja hybridisoitiin kahden-karboksifluoreseiini (FAM), joissa Lukittu Nucleic Acid (LNA) koettimien (Exiqon A /S, Tanska). Sen jälkeen, kun tiukat pesujen suolaliuoksella natriumsitraattipuskurissa, koettimet havaittiin alkalisella fosfataasilla konjugoidulla lampaan anti-FAM Fab-fragmenttien ja sen jälkeen inkuboimalla substraatti, joka sisältää 4-nitrosinitetratsoliumia ja 5-bromi-4-kloori-3′-indolyylifosfaatti (Roche , Tanska), joten tummansininen värjäystä, ja lopuksi vastavärjättiin ydin- nopea punainen (Vector Laboratories, CA) B

morfologinen arviointi miRNA ilmaisun ja β-kateniinin

Kaikki objektilasit arvioitiin subjektiivisesti ja teki semi-kvantitatiivisesti mukaan miRNA voimakkuuden (0 = negatiivinen, 1 = heikko, 2 = voimakas) ja osuus värjättyjen solujen (0 = 50%, 1 = 50%) lukuun ottamatta miR-21. Kokonaispistemäärä määritettiin lisäämällä intensiteetti ja osuus tulokset ja dichotomising summan osaksi ”matala” (pisteet 0-1) tai ”korkea” (pisteet 2-3) ilmaisua. Koska monenlaisia ​​miR-21 positiivisten solujen näytteissä, osuus miR-21 värjätään solut luokiteltiin 0 = 1%, 1 = 1% -50% ja 2 = 50%, ja intensiteetti pisteet käytettiin edellä kuvatulla tavalla. Yhteenlaskettu miR-21 pisteet jaettiin kolmeen ryhmään: 0-1 = alhainen; 2-3 = kohtalainen; 4 = voimakas ilmentyminen.

β-kateniinin ilmentymistä arvioitiin kalvomainen, soluliman ja tumavärjäystä. Koska sytoplasman reaktio homogeenisesti jakautunut kasvaimen osastoissa, vain voimakkuus pisteytettiin (heikko, kohtalainen, ja vahva). Koska sytoplasminen värjäys peitettynä kalvomainen immunoreaktiotuotteet monissa adenomatoottisen ja invasiivisia alueilla, kalvo värjäys ei teki näissä tiloissa. Tumavärjäystä jaettiin kahteen ryhmään: negatiivinen = ei ydinreaktiota nähnyt ja positiivinen = vaihtelevat harvoilla positiivisia soluja, polttoväli reaktio, tai moniin reaktio.

Kuva-analyysi

morfologista arviointia dokumentoitu lausutaan säätely ylöspäin miR-17 epiteelisoluissa, jossa vaadittiin tarkempaa analysointia käyttäen seuraavia lähestymistapa: Digital koko dia kuvat saatiin kanssa x20 tavoite käyttämällä Axio Scan Z1 kirkas skanneri (Carl Zeiss, Saksa). Kuva-analyysi digitaalisen dioja suoritettiin käyttäen VisiomorphDP ohjelmistoa (Visiopharm, Tanska). Vuonna 16 tapauksessa määrälliset MIR-17 ISH signaali saatiin alueilla, joilla on normaalia koolonin limakalvoa (N), huono laatu adenooma (LGA), korkealaatuista adenooma (HGA), ja adenokarsinooma, jos homogeeninen kudos komponentteja näkyivät . Alueet tunnistettiin kokenut ruuansulatuskanavan patologi ympäröimässä kuten kiinnostavat alueet (ROI) digitaalisessa koko dioja. Kahdeksan tapausta analysoitiin kahtena kappaleena ja kahdelta dioja yhdistettiin. Keskimääräinen alueet arvioitiin (of ROI) olivat: N: 5,2 mm

2 (n = 24); LGA: 6,1 mm

2 (n = 9); HGA: 7.4 mm

2 (n = 21), ja adenokarsinooma: 8,2 mm

2 (n = 24), missä n on määrä edustavia ROI. Pikseli luokittelija on koulutettu erottamaan sinisen ISH signaalin punainen vastavärinä, The unstained ja heikosti värjätään kudos, ja kudos-vapaita alueita, ja intensiteetti kynnys erotteleva keskipitkällä sininen sinistä. Seuraavat parametrit saatiin kuvankäsittelyn aikana kultakin ROI: alue keskisininen, alueen sinistä, ja kokonaispinta-ala yksittäisten ROI. Suhteellinen alue jakeet, alueet keskipitkän + sinistä jaettuna kokonaispinta-ala (mielivaltainen yksikkö), katsottiin edustavan suhteellisen miR-17 ekspressiotasot.

immunohistokemia (IHC) B

IHC suoritettiin 4 um: kudosleikkeiden samasta lohkoja käytetään ISH analyysiä. EnVision FLEX +, hiiri, korkea pH, (Link) (Dako, Glostrup, Tanska koodi K8002) käytettiin epitoopin haku ja IHC värjäystä.

fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) analyysi, laseja inkuboitiin jossa PTEN-vasta-aine (1: 200, Dako, Tanska, koodi M3627) 30 minuuttia, monistettiin hiiren linkin vasta-aineella 20 minuutin ajan ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin polymeerin havaitseminen 30 minuuttia. Vasta-aine värjäys suoritettiin Dako Autostaineriin Plus (Dako, Tanska) käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä kromogeeni ja Mayers hematoksyliinillä kuin vastavärinä. Täydellinen negatiivinen IHC reaktiota pidettiin menetys PTEN.

Mismatch korjaus proteiini tila oli tehty rutiininomaisesti IHC on noin puolet yksilöiden aikana ensisijainen patologis-anatominen diagnostinen toimenpide. Loput tapaukset värjättiin vasta-aineita MLH1 (1: 100, Novocastra, UK, code NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, UK, code NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, USA, koodi 610919) ja PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, USA, koodi 556415). Ei-neoplastisia solujen sisällä ja ympärillä kasvain toimi sisäisenä positiivisena kontrollina, ja negatiivisten kontrollien ensisijaisen vasta-aine jätettiin pois.

IHC analyysit sileän lihaksen aktiini (1: 1000, Dako, Tanska, M0851), desmiinille (1: 400, Dako, Tanska, M0760) ja h-caldesmon (1: 200, Dako, Tanska, M3557) tehtiin yksilöitä testipakkauksesta, kun analyysi β-kateniinin (1: 2000, BD Biosciences, USA , koodi 610153) suoritettiin validointi asetettu.

tilastollinen

Jatkuva miR-17 saadut tiedot kuva-analyysi oli log-transformoitiin, jolloin saatiin normaalijakaumaa jäännösten. Sopeuttaa sisäinen vaihtelu, Monimuuttuja sekoitettu vaikutuksia lineaariregressiomallin satunnaisella vaikutuksia näytteen ID käytettiin tutkimaan korrelaatioita log-miR-17 ja kiinteän kovariaatit: kudoksen tyyppi, ikä, sukupuoli, ja histologia kasvain. Jälkeenpäin lineaarikombinaatioita estimaattoreiden käytettiin vertaamaan miR-17 ekspressiotasot ryhmien välillä. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki analyysit suoritettiin STATA versiossa 13 (STATACorp, TX, USA).

Tulokset

Testitapaukset: morfologista arviointia

Perustuu kirjallisuuskatsauksista [5-7,21 , 22,28-30], päätimme tutkia ilmentymistä miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145, ja miR-200b testissä yhdeksän ryhmä AKT-maiden.

kahdeksasta testattu miRNA, miR-17, miR-21, ja miR-145 osoitti ero ilmaisun NA-AC-sekvenssin (kuvio 1A-1F). Seitsemässä yhdeksästä tapauksissa lisääntynyt miR-17 ilmentyminen epiteelisoluissa nähtiin muutosvyöhykkeellä normaalista adenomatoottisen kudokseen. Ilmaisu ylläpiti cancerous epiteelisolujen. Kaikissa yksilöt, miR-21 ilmentyminen oli pääasiallisesti löytyi fibroblastien kaltainen strooman solut dysplastic ja invasiivisia alueiden AKT-maiden kanssa vain harvaa ja polttoväli reaktion cancerous epiteelisolujen. Ekspressiokuvioanalyysi näytti lisäävän vaiheittain koko N-A-C-sekvenssin. Kaikki tapaukset osoittivat vahvaa ilmaisua miR 145 nähdään sileän lihaksen soluissa (SMC) ja verisuonten sileän lihaksen soluissa (VSMC) sekä fibroblastien kaltaisia ​​stroomasoluissa. Jälkimmäiset solut lokalisoitu lähellä epiteelin kryptissa ja näytti vähenevän adenomatoottisten ja syöpäkudoksen kuudessa seitsemästä saatavilla tapauksia. IHC samalla näytteistä paljastui positiivinen reaktio sileän lihaksen α-aktiini ja desmiinin, kun h-caldesmon oli negatiivinen, mikä viittaa siihen, että nämä miR-145-positiiviset solut ovat myofibroblastic alkuperää.

(A B ) miR-17 normaalissa (N) ja adenomatoottisen (A) kudosten ja adenokarsinooma (AC); (C (E) miR-145 nähdään sileän lihaksen soluissa (nuoli) ja verisuonten sileän lihaksen soluissa (nuolenkärki); in suurennuksen (F) määrä väheni miR 145 positiivinen fibroblastien kaltaisia ​​soluja löytyy kasvain (nuoli) verrattuna normaaliin kudokseen (nuolenkärki); (G) muodostama heikko miR-125b signaali nähtiin muscularis limakalvon (mm); (H) miR-200b nähtiin epiteelisolujen tyvestä kryptissa, mutta tässä tapauksessa myös epiteelisyöpäsolujen; (I) miR-126 on yksinomaan nähdään endoteelisolujen; (J) hajotuskoo- koetin oli vain diskreetti taustavärjäyksen.

Positiivinen signaali miR-125b, miR-126, ja miR-200B oli läsnä näytteitä ei kuitenkaan differentiaalikaavojen mistään näiden kolmen Mirs havaittiin verrattaessa kolme osastoa (kuvio 1G-1I). Heikko miR-125b signaali nähtiin fibroblasteissa normaalissa limakalvon ja SMC viidessä yhdeksässä tapauksessa. Kaikki näytteet osoittivat miR-200B positiivisia epiteelisolujen, erityisesti jalustan normaalin paksusuolen kryptat sekä positiivisen signaalin adenomatoottisten ja syöpä- epiteelin. miR-126 ilmentyminen rajoittui endoteelisoluihin ja oli läsnä kaikissa kolmessa osastoissa.

Ei ilmentymistä miR-31 ja miR-135b havaittiin yhdeksän testinäytteet.

Validation tutkimus : Morfologiset arviointi miR-17, miR-21, ja miR-145 ilmaisu

tulosten perusteella saatujen testipakkauksesta, analyysit miR-17, miR-21, ja miR-145 oli jatkettava validoinnissa joukko 24 AKT-maiden. MIR-17-signaali havaittiin ainoastaan ​​epiteelisoluissa. Alhainen ilmentyminen havaittiin normaalissa epiteelisolujen juuressa kryptissa, kun taas korkea ilmentyminen havaittiin muutosvyöhykkeellä normaalista adenomatoottisen kudoksen 96% (23/24) tapauksista (taulukko 2). Ilmaisu säilyi vuonna adenokarsinooma 96% (22/23) tapauksista, kun taas signaali väheni yhdessä asiassa (4%). Vain yksi näyte oli kohonnut ilmentyminen adenooma ja adenokarsinooma. Nämä kaksi tapausta eivät eronneet kliinisesti muista tapauksista validointi asetettu.

Vastaavat havaintoihin testissä set, miR-21 ilmentyminen oli pääasiassa löydetty stroomasoluissa ympäröivä dysplastic ja syöpä rauhaset. Yksi tapaus kuitenkin osoitti miR-21 ilmentyminen syöpä- epiteelisoluissa ja kolme muuta yksilöitä polttoväli ilmaisun epiteelikasvainsolut havaittiin myös. Ei histopatologisia tai kliinisiä eroja dokumentoitu näistä neljässä tapauksessa verrattuna muihin 20 tapauksessa. Kohtalainen ilmentyminen miR-21 ilmestyi muutosvyöhykkeellä normaalista adenooma vuonna strooman soluja 71% (17/24) tapauksista. Muissa tapauksissa oli kohonnut ilmentyminen adenooma ja adenokarsinooma (taulukko 2). 41% (9/22) ja tapauksissa ylössäätöä tiivistyi koko NA-AC sekvenssin kohtuullisella miR-21 ilmentymistä adenooma ja korkea ilmaisun invasiivisia pesäkkeitä.

analyysi Mir-145 osoitti positiivisen pericryptal fibroblastin kaltaisen strooman solujen normaalin lamina propria lisäksi SMC valtimoiden ja lihaksen kerrokset paksusuolen seinään. Puolessa tapauksista, määrä miR 145 positiivinen pericryptal, fibroblastien kaltaisia ​​soluja väheni muutosvyöhykkeellä normaalista adenomatoottisen kudokseen. Lasku oli vielä selvemmin verrattaessa normaalia syöpäkudokseen vähenemisen kanssa nähdään 86% (19/22) tapauksista (taulukko 2). Positiivinen signaali SMC ja VSMC pysyivät ennallaan kaikissa kolme osastoa.

Analyysi miR-135b toistettiin kaikilta 24 validointi yksilöitä, mutta ei ISH signaalia löytynyt. Asianlaita mismatch korjaus proteiinin puutos ei näy miRNA ilmaisun profiili eroaa taitavia tapauksissa eikä myöskään kolme tapausta metastasiaa.

Expression of β-kateniinin NA-AC-sekvenssin

Erilliset hallitseva kalvomainen ja heikko sytoplasmista värjäytymistä varten β-kateniinin oli läsnä kaikissa 24 tapauksessa (100%) ei-neoplastisia epiteelin, mutta ei tumakertymään nähtiin (S2 taulukko ja A S1 kuvassa). Vuonna adenomatoottisen komponentit, sytoplasminen ilmentyminen on lisääntynyt 95% (20/21) tapauksista (S2 taulukko). 62% (13/21) ja adenoomien näytetään myös positiivinen tumavärjäystä, tämä nähtiin 95% (20/21) ja adenokarsinoomien, useimmiten leviämisrintamassa ja /tai kasvaimen orastava soluissa (B + C S1 Kuva). Lisääntynyt sytoplasminen reaktio nähtiin kaikissa 21 (100%) adenokarsinoomat (S2 taulukko).

Kuva-analyysi miR-17

osajoukko 16 satunnaisesti valitun yksilöitä validointi asetettu tutkittiin tarkemmin kuva-analyysin saamiseksi kvantitatiivinen miR-17 ilmentyminen arvioita alueilla, joilla on normaali kudos, LGA, HGA ja adenokarsinooma. Arviot miR-17 ilmentyminen saatiin alue jakeet (

i

.

e

. Värjätään alue jaettuna kokonaispinta-alasta) ja tilastolliset analyysit tehtiin log siirretyt tiedot. Tulokset monimuuttuja sekoitettu lineaarinen regressio on esitetty taulukossa 3. Log-miR-17 nousi normaalin kudoksen matala ja korkea laatu adenomatoottisten kudosten ja myös kohdunkaulan syöpä (p = 0,03, p 0,001 ja p 0,001 vastaavasti; intra- class korrelaatiokerroin = 0,19). Kuvio 2 esittää korottaa yhteensä 10% (mielivaltainen yksikkö) koko NA-AC järjestyksessä, ja että ylössäätöä tapahtui vaiheittain aloittaen 2,4% nousu normaalista LGA (p = 0,03) ja lisäksi 6,9% enemmän kuin huono laatu ja HGA (p 0,001). Eroa log-miR-17 ilmentyminen nähtiin etenemistä HGA kohteeseen adenokarsinooma (p = 0,84). Histologinen tyyppi adenooma, putkimainen, villous tai tubulo-villous, ei liittynyt kirjautua miR-17 ilmentyminen kuitenkin yhdistys iän miespotilaiden nähtiin (p 0,001) (taulukko 3).

Lisääntynyt ilmentyminen miR-17 huono laatu adenooma (LGA), korkealaatuista adenooma (HGA) ja adenokarsinooma (AC) paksusuolen verrattuna normaaliin kudokseen

ilmentäminen miR-17-92 klusterin jäsenet

miR-17 on yksi kuudesta kypsä miRNA koodattu polykistroninen miR-17-92 klusteri. Siten kuusi tapausta validointi asetettu subjektiivisesti vahvin miR-17 ilmentyminen valittiin edelleen ISH analysoitaisiin klusterin jäsenet miR-18a, miR-19b, miR-20a, ja miR-92a. MIR-19b koetin pidettiin yhteistä kahden miR-19 isoformeja, kuten miR-19a eroaa miR-19b vain yhden nukleotidin tekeminen 100% syrjintää epätodennäköinen ISH määrityksessä. MIR-17 Koetinsekvenssi eroaa miR-20a kolmella nukleotidipaikoissa (S1 taulukko). Signaalit miR-19b, miR-20a, ja miR-92a olivat, kuten miR-17, rajoittuu epiteelisoluihin, mutta ekspressio oli heikompi kuin nähty miR-17 (kuvio 3A ja 3C-3E). Up-asetus havaittiin muutosvyöhykkeellä normaalista adenomatoottisen kudokseen, ja ylös-säädeltyä ekspressiota säilyi vuonna adenokarsinooma. Erittäin heikko miR-18a signaali epiteelisoluissa havaittiin neljässä kuudesta tapausten muutosvyöhykkeellä normaalista precancerous kudokseen (kuvio 3B), kun taas voimakkaampi ISH signaali löytyi muutama pieni, pyöristetty lymfosyytti kaltaisia ​​soluja stroomaan lamina propria.

(A) Expression of miR-17; (B) miR-18a; (C) miR-19b; (D) miR-20a; (E) miR-92a ja (F) ryntäily koetin normaalissa (N) ja adenomatoottisen (A) kudosta. Huomautus lisääntynyt värjäyksen intensiteetin adenomatoottisten crypts verrattuna normaaliin krypta.

PTEN ilmaisua ei liity miR-17 tai miR-21 ilmentyminen

Kaikki tapaukset sekä tutkimuksen sarjaa värjättiin PTEN, validoitu tavoite sekä miR-17 ja miR-21 [31,32]. Vuonna validointi asetettu, 21% (5/24) ja AKT-maiden oli täydellinen menetys PTEN vaan ainoastaan ​​fokaalisesti kuuluvaa epiteelin adenomatoottisten ja /tai invasiivisia alueilla. Kuitenkin käänteinen yhdistys PTEN ja miR-17 ilmentyminen ja miR-21 ilmentyminen ei havaittu. Ei PTEN menetys nähtiin yhdeksän testitapauksia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme kliininen, diagnostiset näytteet on koolonin vammojen sisälsi NA-AC sekvenssi tutkia ilmaus sarja miRNA kirjallisuudesta tunnettuja [5-7,28] voidaan ilmaista kehityksen aikana paksusuolen syöpä; miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145, ja miR-200B. Käyttävät kromogeeninen ISH, huomasimme, että ilmentyminen miR-17, miR-21, ja miR-145 oli erityisen dynaaminen alkuvaiheessa paksusuolen syövän kehittymisen. Kuva analyysi miR-17 värjättyä vaurioita osoitti, että tämä miRNA indusoituu alussa siirryttäessä N LGA ja vielä dramaattisesti HGA. MIR-17 ilmentyminen havaittiin olevan epiteelin alkuperää tehtiin myös muiden miRNA MIR-17-92 klusteri. miR-17 havaittiin olevan yleisin miRNA päässä miR-17-92 klusteri.

tutkimus on ensimmäinen osoittaa, että miR-17

in situ

ilmaisun kasvaa varhain normaalista limakalvon LGA ja tasaantuu ilmaisuvapautta HGA jota ei liioiteltu ilmeisessä adenokarsinooma. Tämä havainto on yhdenmukainen havainnot Bartley

et al

, jotka ilmoittivat samanlainen miR-17 ekspressiokuviota käyttäen qRT-PCR [21]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-17 kohosi jatkuvasti välillä adenooma ja adenokarsinooma [11,33,34], mutta toisin kuin tutkimuksemme ja havaintojen Bartley

et al

, näissä tutkimuksissa ei verrattu kudosta saatu samoilta henkilöiltä, ​​ja voi siten liittyä lisääntynyt yksilöiden välisiä eroja.

Perustuu yksinkertaiseen, morfologinen vertailu ISH-signaalin värjäytymisvoimakkuuksia, löysimme miR-17 on kaikkein säädelty klusterin jäsen sekä adenomatoottisen ja syöpäkudoksen, jonka jälkeen miR-92a, miR-20a, miR-19b, ja miR-18a. Humphreys

et al

käyttäen qRT-PCR-tekniikkaa, myös löytänyt miR-17 on korkein ilmaistu miR MIR-17-92 klusteri Dukes A ja C kolorektaalisyövissä [13], kun taas qRT-PCR muista tutkimuksista saatuja tuloksia löytyi miR-92a olevan kaikkein syvästi ilmaistu miRNA in adenomatoottisen ja /tai syöpä- peräsuolen kudokseen [11,12,33]. Kaikki nämä kolme tutkimusta, kuitenkin tukevat meidän havainto, että miR-18a on ainakin ilmaissut klusterin jäsen, ja että miR-19a /b ja miR-20a ilmaisu ovat jatkuvasti korkeampia kuin miR-18a [11-13,33]. Sitä ei voida sulkea pois, että sitoutumisaffiniteetti (sulamisen lämpötilat) LNA koettimet palveluksessa saattanut vaikuttaa eri värjäytymisvoimakkuuksia havaittu.

Olemme löytäneet ilmaus kaikkien tutkittujen miR-17-92 klusterin jäseniä olemaan rajoittuu epiteelisoluihin. Samanlaisia ​​havaintoja miR-17 ja miR-92a ilme on raportoitu Muut tutkijat [31,33-35], vaikka yksi ryhmä myös havaittu joitakin miR-17 positiivisia stromasoluja [35]. Mielenkiintoista on, että olemme havainneet intensiivisen miR-18a signaalin muutamia pieniä, pyöristetty lymfosyytti-, kuten strooman solujen lamina propriassa neljässä kuudesta näytteestä. Koska mikään muu klusterin jäsen ilmaistiin, signaali on todennäköisimmin edustaa rajat hybridisaatio toisen RNA-kohteen.

rooli miR-17 paksusuolen epiteelisoluissa syövän kehittymisessä on vielä epäselvä. Yksi mahdollinen toiminto voi olla esto E2F transkriptiotekijän 1,

E2F1

, otaksutun tuumorisuppressorigeeniä. Lisääntynyt ilmentyminen E2F1 on yhdistetty vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin peräsuolen syöpä [36,37]. Mielenkiintoista on, että käänteinen suhde E2F1 ja miR-17 on esitetty paksusuolisyöpäkudoksessa [35,38]. Monzó

et al

osoitti, että transfektio anti-miR-17 lisännyt E2F1 ilmaisun ja laski soluproliferaatiota [35], ja Kanaan

et al

osoitti, että transfektointi miR-17 kielelle HT-29 peräsuolen adenokarsinoomasolua johtaa tehon heikkenemiseen E2F1 ilmaisun [39]. Tutkimuksessa, hermosolujen sukujuuret erilaistumista vapaan somaattisten kantasolujen, suoraa vuorovaikutusta miR-17 ja E2F1 on dokumentoitu [40]. Siten lisääntynyt ilmentyminen miR-17 paksusuolen epiteelisoluissa voisi edistää tuumorigeneesin edistämällä solujen lisääntymisen. Lisätutkimukset ovat todellakin tarpeen arvioida suhdetta miR-17 ja E2F1 kolorektaalisyövässä ja edellyttää huolellista tutkimista niiden ilmaisun riittävän morfologisesti ominaisuus alueilla läsnä tällaisissa ainutlaatuinen näytteistä. Tutkimus sarjaa käytettiin tässä tutkimuksessa ei mahdollistavat lisäanalyysi koska edustavat alueet eivät enää käytettävissä merkittävän osan materiaalista.

otaksuttu onkopsykologista miR, miR-21, oli esiintyy pääasiassa stroomasoluja, jotka ympäröivät dysplastic, adenomatous ja syöpä- epiteelisolujen. Intensiteetti miR-21 ilmentyminen kasvoi koko N-A-AC-sekvenssi, jolla on korkein ilmaus nähdään syöpään liittyvien strooman. Tuloksemme vahvistavat havaintoja Yamamichi

et al

[26]. Paitsi yksi tapaus, jossa miR-21 positiivinen kasvain epiteelin vain, pääasiassa strooman miR-21 ilmentyminen näkyy jäljellä 23 + 9 yksilöitä. Ottaen huomioon pieni otoskoko käytetty tutkimuksessa Yamamichi

et al

sekä tämä nykyinen, sitä ei voida kokonaan sulkea pois, että varhainen miR-21 ilmentyminen voi olla epiteelin ilmiö. Kuitenkin suuri tutkimuksia miR-21 kehittyneempien kolorektaalisyövissä osoittavat selvästi miR-21 on lokalisoitu strooman osastossa [27,41,42].

Havaitsimme, että määrä miR 145 positiivinen, pericryptal fibroblastien kaltaisten solujen vähennettiin asteittain NA-AC järjestyksessä. Alentuneet miR 145 kolorektaalisyövässä verrattuna normaaliin paksusuolen mitattuna qPCR, on todettu lukuisissa tutkimuksissa, ja miR-145 on pitkään pidetty mahdollisena kasvain vaimennin. Kuitenkin viime aikoina tämä teoria haastettiin [43]. Käyttämällä ISH, Chivukula

et al

havaittu, että miR-145 ilmentyy vain mesenkyymisolujen eikä epiteelisolujen hiiren paksusuolen, kun taas miR-145 oli lähes ei havaita qRT-PCR puhdistetussa hiiren ja ihmisen suoliston epiteelissä [ ,,,0],44]. Tekijät päättelivät, että miR 145 toimii epiteelin kasvain vaimennin oli epätodennäköistä, ja että aiemmat tulokset miR 145 tappion todennäköisemmin liittyvät eroihin solukoostumuksesta normaalin ja syöpäkudoksen [43,44].