Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet epiteelin syövät, erityisesti ruoansulatuskanavan syöpien, pysyvät huono ennuste sairauksien takia resistenssin sytotoksista hoitoa ja paikallisia tai metastaattinen uusiutumisen. Olemme aiemmin osoittaneet, että apoptoosin epäpätevä ruokatorven syöpä solut indusoivat autophagy vastauksena kemoterapia-aineiden ja tämä voi helpottaa niiden hyödyntämistä. Kuitenkin tunnettuja farmakologisia estäjiä autophagy ei lisätä sytotoksisuutta. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet kaksi hyvin tiedossa, kliinisesti hyväksytty autophagy indusoijat, rapamysiini ja litiumia, sillä niiden vaikutukset kemosensi- apoptoosin epäpätevä syöpäsoluja. Sekä litiumin ja rapamysiini osoitettiin indusoivan autophagosomes ruokatorven ja peräsuolen syövän solujen Western blot analyysi LC3 isoformeja, morfologia ja FACS kvantitointiin Cyto ID tai mCherry-GFP-LC3. Analyysi autophagic flux osoittaa tehotonta autophagosome käsittely litium käsitellyissä soluissa, kun taas rapamysiini käsitellyt solut osoittivat tehokasta muutostilassa. Elinkelpoisuus ja toipuminen arvioitiin klonogeeniset määrityksissä. Kun yhdistetään kemoterapeuttisen aineen 5-fluorourasiili, rapamysiini oli suojaava. Sen sijaan litium osoitti vahvaa parantamiseksi ei-apoptoottisen solukuoleman. Litiumin ja 5-fluorourasiilin tai oksaliplatiinia sitten testataan syngeenisessä hiiren (BALB /c) kolorektaalisyövän malli-CT26. Kun joko kemoterapeuttinen aine yhdistettiin litiumin merkittävä väheneminen tuumorin tilavuudesta oli saavutettu. Lisäksi eloonjääminen dramaattisesti lisääntynyt yhdistelmän (p 0,0001), jossa 50% eläimistä saavuttaa pitkän aikavälin parannuskeinoa ilman uudelleen esiintymistä ( 1 vuosi kasvainta). Siten yhdistelmä käsittelemällä litium voi merkittävästi parantaa tehokkuutta kemoterapeuttisten aineiden apoptoosin puutteellisesta syöpäsoluja. Induktio vaarantuu autophagy voi edistää tätä sytotoksisuutta.

Citation: O’Donovan TR, Rajendran S, O’Reilly S, O’Sullivan GC, McKenna SL (2015) Litium moduloi Autophagy ruokatorven ja peräsuolen syövän solut ja Parantaa tehon Terapeuttiset aineet

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 10 (8): e0134676. doi: 10,1371 /journal.pone.0134676

Editor: Ilja Ulasov, ruotsalainen Neuroscience Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2015; Julkaistu: 06 elokuu 2015

Copyright: © 2015 O’Donovan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Rahoitusta saatiin Health Research Board HRA_POR /2011/55.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Macro-autophagy on kehittyvä säilynyt catabolic prosessi, jonka avulla solu kierrättää omaa makromolekyylien ja organelles. Sisäiset vaahtomuovista tulee sisällyttää kaksinkertainen membraned rakkulat kutsutaan autophagosomes, jotka myöhemmin salakuljetetaan lysosomiin heikentymisen. Autophagy on nyt tullut tärkeä prosessi, joka voi moduloida kasvaimen kehittymisen ja hoitovaste. Se voi olla kasvain tukahduttava, koska se tyhjentää vaurioituneet soluelimiin ja pysyy koskemattomana solun stressiä. Kuitenkin, kun kasvain on muodostunut, autophagy on osoitettu olevan tärkeä selviytymisen reitti, koska se suojaa erilaisia ​​jännityksiä, mukaan lukien hypoksia, metabolisen stressin, anoikis ja kemoterapia [1]. Lisäksi liiallinen autophagy on raportoitu aiheuttavan tyypin II solukuoleman, joka on kriittinen solukuolemareittiin ja kohde terapeuttiselle interventiolle, erityisesti kasvaimia, jotka ovat menettäneet apoptoosin pätevyyden [2] [3]. Autophagy on siis sopeutumisreaktio joka osoittaa korkea plastisuus ja on tilanneriippuvaista rooleja kasvain solubiologian. On yhä epäselvää, miten parhaiten moduloida sen terapeuttista hyötyä.

Olemme aiemmin osoittaneet, että on tärkeää autophagy terapeuttisissa resistenssin ruokatorven syöpään. Tutkimme soluvasteita valitsemattomat ruokatorven syöpä solulinjoja käsiteltiin kemoterapia-aineiden (5-fluorourasiili ja sisplatiini). Drug herkät solut ovat apoptoosin päteviä ja ei toipunut lopettamisen jälkeen huume. Sitä vastoin enemmän resistenttien solujen onnistunut indusoimaan apoptoosin, mutta esillä autophagy. Jotkut näistä soluista tehtiin tyypin II kaltainen kuoleman prosessi, mutta monet talteen lopettamisen jälkeen lääkkeen. Knockdovvn autophagy sääntelyviranomaisten vahvisti tärkeyden autophagy tämän elpymisen [4]. Tämä osuus autophagy syövän solujen selviytymistä on suuri haaste kemoterapiaa. Koska monet primaarisyöpien ja todennäköisesti toistuva syövät ovat puutteellisia apoptoosin signalointi, meidän on tarkasteltava uusia strategioita rajoittamiseksi autophagic selviytymistä ja /tai indusoi vaihtoehtoinen solukuoleman mekanismeja.

Kuten autophagy on raportoitu olevan mahdollisesti vastakkaisia roolit kasvainten kehittymiseen, kaksi terapeuttiset strategiat testataan parhaillaan kliinisissä kokeissa. Yksi strategia on estää soluja suojaava rooli autophagy, yhdessä tavanomaisten syöpälääkkeiden herkistää solunsalpaajaresistentti tuumorisoluja lääkkeet; toinen on aktivoida autophagic reittejä ja ajaa apoptoosin puutteellisen kasvainsoluja tehdään vaihtoehtona tai ”autophagic” solukuoleman [5]. Autophagy indusoijien kliinisissä tutkimuksissa sisältävät; mTOR-inhibiittorit (mukaan lukien rapamysiinianalogeja, everolimuusia, teserolimus) ja autophagy esto on ensisijaisesti joutuneet, lysosomaalisen estäjien klorokiini tai hydroksiklorokiini [1]. Suuri ongelma sekä strategioita on, että autophagy reitit tunnetaan edelleen huonosti, kuten on tapa, jolla tiettyjen syöpien käyttää niitä. Olemme vasta hiljattain alkanut ymmärtää korkean selektiivisyyden erityyppisten autophagy ja signalointi mukana. Monille nykyisistä tutkimuksista, on vaikea määrittää roolin autophagy onnistumisen tai epäonnistumisen järjestelmää, luotettavina molekyyli- merkkiaineiden autophagic vastauksia ei ole vahvistettu. Lisäksi sisällä rajallinen ohjelmistoon inhibiittorit ja induktorit on aineita, joilla on selviä eroja niiden vaikutusmekanismeja (useimmat ovat epäsuoria estäjät /aktivaattorit) ja data ei todennäköisesti ole siirrettävissä autophagy estäjää ja /tai indusoijan toiseen. Lisätutkimuksia siis tarvitaan ymmärtämään paremmin toimia autophagy modulaattorit syöpäsoluissa.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa testasimme autophagy estäjät (3-MA ja bafilomysiini) varten chemosentizing vaikutuksia ruokatorven syöpäsoluja. Mikään näistä agentit olivat tehokkaita kuin Kemiallisia herkistimiä [4]. Täällä tutkimme vaikutuksia kahdessa tunnettua, mutta mekaanisesti eri autophagy indusoijat, rapamysiini ja litium, on kemosensitiivisyys syöpäsoluissa. Molemmat aineet (tai niiden analogit) on lisensoitu kliiniseen käyttöön. Osoitamme, että molemmat aineet indusoivat autophagy syöpäsoluja. Rapamysiini ei paranna lääkkeen herkkyyttä, kun taas litium osoittaa vahvaa toksisuuden lisääntymistä kanssa

in vitro

ja

in vivo

malleissa ruoansulatuskanavan syöpiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Perustettu ihmisen ruokatorven syöpä solulinjoja OE19, OE21 ja OE33 saatiin suoraan European Collection of Cell Cultures. KYSE450 solut olivat DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Hiiren koolonkarsinoomasolulinja CT26, on saatu suoraan American Type Culture Collection (ATCC). OE19, OE21 ja OE33 solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Sigma R8758), KYSE450 soluja pidettiin 50:50 RPMI 1640: F-12 HAMS väliaineessa (Sigma N6658), ja CT26-solut ylläpidettiin DMEM-alustassa (Sigma D6429 ). Kaikkia viljelmiä täydennettiin 1%: lla penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco Life Technologies 15070-063), 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia (Sigma F7524) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kaikki reagenssit hankittiin Sigma ellei toisin ole mainittu. Litiumkloridia L9650, litiumkarbonaatti 255823, rapamysiini R8781, 5-fluorourasiili (5-FU) F6627, klorokiini C66288. Oksaliplatiini (ELOXATIN 5 mg /ml) oli Sanofi Aventis.

Cyto ID Autophagy tunnistus

Solut ympättiin kolmena kappaleena (3,0 x 10

4 solua /cm

2) ja käsiteltiin litium-(10-30 mM) tai rapamysiini (100-300 nM) yksin tai yhdessä klorokiinin (10 uM) 24 ja 48 tunnin kuopissa 6-kuoppaiselle levylle. Solut otettiin talteen trypsiinillä ja valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Cyto ID määritys (Enzo Life Sciences ENZ-51031-K200) sisältää 488 nm-innokkaaksi vihreä fluoresoiva detektioreagenssia että nimenomaan fluoresoi autophagic rakkulat. Kasvu määrän autophagic rakkulat, joka tahra vihreä havaitaan kasvua fluoresenssin FL-1 kanava. Soluja inkuboitiin Cyto-ID (1 ui Cyto-ID /1 ml soluviljelmän elatusainetta ilman fenolipunaista indikaattorina) 30 minuutin ajan ja pestiin ennen analysointia virtaussytometrisesti FACScan.

Western blotting ja vasta-aineet

Yhteensä solun uutteet valmistettiin raaputtamalla solut modifioitu RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 1 x Pefablocia, 1x proteaasiestäjäseostabletit , 1 mM Na

3Vo

4, 1 mM NaF). Kaikki proteiini näytteet erotettiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris geeleillä ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-kalvolle (Invitrogen Life Technologies NP0322 ja IB401001). Kalvoja inkuboitiin anti-LC3 (kanin polyklonaalista vasta-ainetta MBL PD014, 1: 500 laimennus), anti-LAMP 1 (hiiren monoklonaalinen vasta-aine-Abcam ab25245, laimennus 1: 5000), anti-LAMP 2 (kanin polyklonaalista vasta-ainetta Abcam ab101325 1: 500 laimennus) tai anti-katepsiini B: n (hiiren monoklonaalinen vasta-aine-Abcam ab58802, 1: 500 laimennos) vasta-aineita, yön yli 4 ° C: ssa ja anti-β-aktiini (kuormituksen valvonta) (Sigma A5441) ja yhden tunnin ajan huoneen lämpötila. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen asiaan IR-Dye konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Rockland) on Odyssey IR kuvantamisjärjestelmä (Li-Cor, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta).

arviointi morfologia

tarkastella solujen morfologia , käsiteltiin soluja Cytospin lasilevyille ja värjättiin käyttäen Pro-Diff (Braidwood Laboratories BAPROD1 -Kiinteä ja värjättiin puskuroidulla eosiinilla sen jälkeen metyyli-thionins). Apoptoottisen solukuoleman on ominaista läsnäolo kaksi tai useampi seuraavista morfologiset ominaisuudet: solu kutistuminen, kromatiinin tiivistyminen, DNA hajoaminen ja pirstoutumiseen ”apoptoottisia laitoksilla” ehjä solukalvon. Non-apoptoottisen solukuoleman tunnistettiin selkeä menetys sytoplasmisen materiaalin, pyknosis ytimen ja ehjän tumakalvoa. Cytospin kuvat edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. Kuvat otettiin käyttäen DP70 digitaalinen mikroskooppi kamera ja Olympus DP-Soft823 versio 3.2-ohjelmisto (Mason Technologies Dublin, Irlanti). Kaikki kuvat edustavat vähintään kolmea erillistä koetta.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

solujen kyky toipua hoitoja ja muodosta pesäkkeitä yhtenä kerroksena arvioitiin käyttäen pesäkemuodostusta. Hoidon, kaikki kiinnittyneet solut trypsinoitiin, laskettiin ja elinkelpoisuus määritettiin. Näistä elävää solua, 1500-soluja siirrostettiin uudelleen hyvin ja kuuden kuoppalevylle (kolmena kappaleena). Solujen annettiin tarttua ja kasvaa välillä 10-14 päivä. Visualisoida pesäkkeitä, väliaine poistettiin, solut kiinnitettiin 96% etanolilla 10 minuuttia ja värjättiin Prodiff C (Braidwood Laboratories E310). Levyjä skannata Odyssey IR kuvantamisjärjestelmä (Li-Cor, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta) ja pesäkkeitä määrällisesti. Tulokset on esitetty integroitu intensiteetti ± SEM vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kun pesäkemäärät olivat erittäin alhaiset, pesäkkeet laskettiin manuaalisesti.

pBabe-puro mCherry-EGFP-LC3B ilmentymisen

Solut transfektoitiin 1 ug: lla pBabe-puro mCherry-EGFP-LC3B ilmentymisen plasmidi (Addgene 22418) käyttäen TurboFect transfektioreagenssia (ThermoScientific R0531) suosittelemia valmistajat. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin litium-(20-30 mM) tai rapamysiini (200-300 nM) yksin tai yhdessä klorokiinin (10 uM) 24 ja 48 tunnin ajan. Arvioida ekspressiotasot mCherry-EGFP-LC3, solut analysoitiin läpi PE ja 488 2 kanavaa BD LSRII -virtaussytometriä (BD Bioscience, Oxford, Yhdistynyt kuningaskunta). Mean fluoresenssin intensiteetti mitattiin ja tiedot esitetään keskiarvona kolmen itsenäisen kokeen.

Eläimet ja kasvainten induktio

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Animal Ethics Experimentation komitea (AEEC) University College Cork ja Department of Health (Ethics numero 2010/009) mukaisesti esitettyjen suuntaviivojen mukaan Euroopan yhteisö (muutos eläinrääkkäystä toimimaan 1876) asetuksen 2002 2005 (lisenssinumero B100 /4499). Hiiret saatiin Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). Ne pidettiin taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa tasaisessa huoneenlämmössä (22 ° C), jossa on luonnollinen päivä /yö valosykliä tavanomaisessa eläimen siirtomaa. Peruslaboratoriolaitteisto ruokaa ja vettä tarjotaan

halun

. Ennen kokeita, hiiret saatiin sopeutumisajan vähintään 14 päivää. Naaraspuoliset BALB /c-hiiret on 6-8 viikkoa ikäisiä, painot on 18-22 g käytettiin kaikissa kokeissa. Tavanomaisesta syöpäkasvainten, 1 x 10

6 CT26 (kolorektaalisyöpää) solut suspendoitiin 200 ul: aan seerumitonta DMEM injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen, kun anestesia (vatsaonteloon (IP) annon 200 ug ksylatsiinin ja 2 mg ketamiinia ). Kaikki hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula alle yliannos anestesiaa.

In vivo

litiumin pitoisuus

Lithium pitoisuudet valittiin perustuu aikaisempien

in vivo

tutkimuksissa jotka ovat keskittyneet neurologisiin tutkimuksiin. Ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa, 0,6-0,8 mmol /l (mmol /l) on perustettu turvallinen terapeuttinen potilaille pitkän aikavälin litium. Haittavaikutukset voidaan kohdata ollessa alle 1,5 mmol /l. Lieviä tai kohtalaisia ​​haittavaikutuksia voi esiintyä 1,5-2,5 mmol /l, ja kohtalainen tai vaikea reaktiot voidaan nähdä tasoilla 2,0 mEq /l ja yli [6]. Voisimme saavuttaa Chemosensiti-

in vitro

at litiumpitoisuutta vastaa 1,6 mmol /L-tämä on korkeampi ääripäässä ihmisille. Mitä Eläinkokeissa seuraavia eri pitoisuuksia on aiemmin turvallisesti tuotto (60, 80, 100 ja 250 mg /kg) [7-10]. Tutkimuksessa, joka käytetään verrattavissa litium pitoisuudet, joita käytettiin tässä työssä, plasmatasot litiumin ilmoitettiin olevan 0,25 mM [11]. Tämä on alhaisempi kuin ihmisten terapeuttisen alueen (0,5-2,0). Olemme valinneet 200 mg /kg, jälkeen titraus myrkyllisyyden arvioimiseksi. Lupaavina vaikutukset saavutettiin eläimillä tässä pitoisuudessa-ilman myrkyllisyyden emme lisätä tätä keskittyminen.

In vivo

lääkeannostelun

Hiiret jaettiin satunnaisesti kokeellinen ryhmiä. Hiiriä käsiteltiin kasvaimen tilavuus on noin 100 mm

3 tilavuudessa (5-7 mm suurempi halkaisija). Kaikki käsittelyt jaettiin 50 ul määriä annetaan joko suoraan kasvaimeen, tai IP: n kautta injektio kolmen päivän välein. Ryhmissä olivat seuraavat; PBS: ää (kontrolli), litiumkloridia (200 mg /kg), 5-FU: ta (20 mg /kg), oksaliplatiinia (10 mg /kg) ja näiden yhdistelmät joko litium ja 5-FU: ta (200 mg /kg, 20 mg /kg ) tai litium ja oksaliplatiinin (200 mg /kg, 10 mg /kg). Litium oli saatettu steriiliin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen. Fluorourasiili toimitti Hospiran Irlanti (25 mg /ml injektionestettä). Oksaliplatiini toimitti Sanofi Irlanti (5 mg /ml). Kaikki lääkkeet injektoitiin aseptisesti- saastumisen välttämiseksi. Sen jälkeen lääkehoitoa, kasvaimia seurattiin toinen päivä mittauksia kahdessa ulottuvuudessa käyttäen työntömitalla. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla V = ab

2ᴨ /6, jossa ”a” on pisin halkaisija kasvaimen ja ”b” on pisin halkaisija kohtisuoraan halkaisija ’a’. Eläimet lopetettiin kun kasvainten ylittyä ~ 500/600 mm

3 (ei yli 15 mm halkaisijaltaan). Myrkyllisyys litium

in vivo

testattiin tutkimalla plasman natrium, kalium ja kreatiniini kaikissa hoitoryhmissä, 24 tuntia viimeisen hoidossa kolmen viikon tutkimuksessa. Ei ollut eroja tasojen natrium-, kalium- tai kreatiniinin missään hoitoryhmissä (PBS-kontrollin, litium, 5-FU, 5-FU litium). Tämä yhdistettynä moitteeton eläinten terveydelle osoittaa, että tasot litium ovat alhaisemmat kuin liittyy myrkyllisyyttä. Kokeiden aikana seuranta eläinten terveyden (mittaamiseksi painon, syömiskäyttäytyminen, juominen käyttäytyminen, kehon jätteitä, ja ihon kunnosta ja turkkiin) suoritettiin joka päivä.

MTT elinkelpoisuuden määritys

solut ympättiin 3 x 10

4 solua per cm

2, käsiteltiin 48 tunnin ajan, ja inkuboitiin vielä 60 minuuttia 37 ° C: ssa 0,5 mg /ml MTT-väriainetta (Sigma M2128). Elinkelpoinen, metabolizing solut pelkistävät MTT väriaine, tuottaa tumma formatsaanituotetta, jossa absorbanssi luetaan 562 nm: ssä, viitaten aallonpituus 620 nm.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 5 ohjelmisto . Kaplan-Meier eloonjäämiskäyrien arviointiin käytettiin hoidon vaikutusta eloonjäämiseen. Log-rank (Mantel-Cox) testiä käytettiin vertaamaan elossapysymisaikajakaumat kahden näytteen ryhmään. P-arvo pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun se oli alle 0,05. ** P 0,01, *** p 0,0001. Eloonjäämismediaani kunkin otoksen arvioitiin myös. Studentin t-testiä (parittomia) käytettiin arvioitaessa merkitystä keskimääräisen kasvaimen tilavuuden viimeisenä päivänä hoidon. ** P 0,005.

Tulokset

vaikutusten arviointi Litiumin ja rapamysiinin autophagy induktioon KYSE450 ruokatorven soluissa

aiemman neljän ruokatorven solulinjojen tutkimiseksi seurauksia apoptoottisten ja autophagic vasteita lääkehoidon [4]. Kaksi solulinjaa (OE21 ja OE33) osoitettiin olevan apoptoosin ja autophagy päteviä ja ovat suhteellisen huumeiden herkkiä. Sen sijaan kaksi solulinjaa (KYSE450 ja OE19), jotka vastata autophagy yksinään ovat lääkkeille vastustuskykyiset ja voi toipua seuraava vieroitusoireista. Kaksi jälkimmäistä solulinjat ovat erityisen tärkeitä, koska ne ovat todennäköisesti edustavat kasvaimia, jotka ovat menettäneet apoptoosin osaamista. Siksi arvioitiin vaikutuksia kahdessa mekanis- miltaan erilainen autophagy indusoijia, aluksi on KYSE450 soluihin.

Rapamysiini on tunnettu mTOR-estäjä [12], kun taas litium on raportoitu aiheuttavan autophagy estämällä inositoli monophosphatase (IMPase) [ ,,,0],13]. Olemme varmistaneet, että molemmat litium (litiumkloridin ellei toisin mainita) ja rapamysiini aiheuttama autophagy in KYSE450 soluissa käyttämällä Cyto ID autophagy detektiomäärityksen, arviointi LC3 I ja II isoformien western blottauksella ja morfologiset arviointi rakkulan kertymistä.

Lisääntynyt Cyto ID fluoresenssi osoitti autophagosome muodostumista litiumia (10, 20 ja 30 mM) ja rapamysiini (100, 200 ja 300 nM) käsiteltyjä soluja, 24 tuntia [kuvio 1A (i) ja (ii)] vastaavasti. Litium-indusoitu autophagy oli jyrkempi kuin se, minkä indusoivat rapamysiinin 9,2-kertainen havaittu ohjaus ja 30 mM litium-käsitellyissä soluissa, verrattuna 4,8-kertainen lisäys indusoi korkeamman pitoisuuden rapamysiinin. Esitetyt tiedot on tyypillinen kolmen erillisen kokeen. 48 tunnin kuluttua hoidon, Cyto ID havaittavissa autophagy pelkistettiin litium- käsitellyissä soluissa (2,3-kertainen lisäys havaittiin välillä ohjaus ja 30 mM käsiteltyjä soluja) ja huomaamaton rapamysiini käsitellyissä soluissa (tuloksia ei ole esitetty).

(A) KYSE450 soluja käsiteltiin litiumkloridia (litium) (10-30 mM) tai rapamysiini (100-300 nM) ja 24 ja 48 tuntia. Solut arvioitiin autophagy induktion 24 tunnin kuluttua hoidon litium (i) tai rapamysiini (ii) kanssa Cyto ID autophagy havaitseminen pakki. Paneelit vasemmalla osoittavat edustavat kuvat FACS, paneelit oikealle osoittaa vastaavan keskimääräisen fluoresenssin voimakkuutta. Data kuvassa on tyypillinen kolmen erillisen kokeen. (B) Western blot-analyysi LC3 ilmentymisen soluissa, joita käsiteltiin litium (i) tai rapamysiini (ii) 24 tuntia. LC3I ja LC3II kvantitoitiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR), normalisoidaan p-aktiini ja esitetään integroidut intensiteetit. (C) Morfologiset ominaisuudet KYSE450 seuraavaa solujen litiumia (30 mM, keskiosan) tai rapamysiiniä (300 nM, oikeanpuoleinen paneeli) hoitoa 24 tuntia. Mustat nuolet osoittavat kertyminen rakkuloiden sekä litiumin ja rapamysiini käsiteltyjä soluja, punaiset nuolet tarkoittavat oheislaitteiden rakkula kertymistä (suurennus 40x). (D) Soluja esikäsiteltiin klorokiinin (10 uM) kahden tunnin ajan, ennen käsittelemällä litium (10 mM) (i) tai rapamysiiniä (100 nM) (ii) 48 tuntia ja autophagy arvioidut tasot kanssa Cyto ID autophagy havaitseminen pakki. Edustavat kuvat FACS esitetään (n = 3), upotettu baari kaavioita vastaavan keskimääräisen fluoresenssi-intensiteetin (* p 0,05). E Elävät solut hoidon jälkeen joko litiumin tai rapamysiini 48 tuntia laskettiin ja yhtä monta (1500 solua kuoppaa kohti) reseeded kolmena kappaleena, ilman lääkettä. Solujen annettiin kasvaa 14 päivää, minkä jälkeen ne kiinnitettiin ja värjättiin ja pesäkkeiden uusiutumista arvioida.

Western blot-analyysi vahvisti tasojen nousu sekä LC3 I ja II seuraavat 24 tuntia käsittelemällä litium [ ,,,0],kuvio 1B (i)], vaikutus, joka säilyi jopa 48 tuntia (dataa ei esitetty). Tasot LC3 II oli myös merkittävästi esille rapamysiini 24 tuntia [kuvio 1B (ii)], ja ne osittain pelkistetty 48 tuntia hoidon jälkeen (tietoja ei esitetty).

morfologinen analyysi KYSE450 solujen vahvistettiin kertyminen Rakkulat solujen sytoplasmassa käsiteltiin litium-(30 mM) (kuvio 1C, keskimmäinen paneeli) ja rapamysiini (300 nM) (kuvio 1 C, oikea paneeli) 48 tunnin ajan (myös selvää, 24 tuntia, tuloksia ei ole esitetty). Nuolet osoittavat solujen merkittävää rakkula kertymistä. Litium käsitellyt solut osoittivat laajaa oheislaitteiden rakkula kertymistä (punaiset nuolet).

Autophagic vuo on termi, jota käytetään kuvaamaan koko prosessin autophagy ja toimitukseen eristettyä komponenttien lysosomiin ja niiden myöhempi erittely [14]. Jos kertyminen autophagosomes johtuu yksinomaan epäonnistuminen solujen liikevaihdon autophagosomes, lisäämällä klorokiinin-a lysosomotropic ainetta, joka estää lysosomaalisen aktiivisuutta ja lohkot autophagosome vaihtuvuus [15], ei ole enää vaikutusta rakkula kertymistä. Siksi erottaa autophagy induktio ja rakkulan keskittymisen vian vuoksi liikevaihdon, me esikäsitelty soluja klorokiinin (10 uM) ennen käsittelyä joko litiumin (10 mM) tai rapamysiiniä (100 nM) 48 tuntia. Kuten kuviossa 1D, hoito KYSE450 soluja klorokiinin kanssa yksin, kuten odotettua, aiheutti lisääntymisen kertyminen rakkulat (vihreä peitot) arvioituna Cyto-ID. Litium yksin, aiheutti merkittävän kasvun vesikkelin kertymistä, joka on parantunut, mutta ei merkittävästi, jota klorokiinin (sininen overlay), mikä viittaa siihen, vain kohtalainen vuon. Sen sijaan, rapamysiini yksin aiheutti vaatimattomampi muutos havaittavissa autophagosomes. Lisäämällä klorokiinin, huomattavasti tasoa rakkulat (* p = 0,0136) (sininen overlay), mikä osoittaa autophagosome induktio ja vaihtuvuus (flux) vastauksena rapamysiinin.

On tärkeää, että induktio autophagy jopa 48 tuntia vastauksena litiumia tai rapamysiini yksin kello eri pitoisuuksille, oli rajallinen vaikutus elinkelpoisuuden arvioimana pesäkemuodostusta (kuvio 1 E). Jotkut myrkyllisyys litiumin kanssa on ilmeinen yli 20 mM. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että molemmat yhdisteet voivat indusoida suhteellisen myrkytön kertyminen autophagosomes näissä ruokatorven syövän soluissa.

vaikutuksen arviointi rapamysiinin ja litium on kemosensitiivisyys

Sitten arvioitiin vaikutuksia yhdistämisen rapamysiinin tai litiumia ja 5-FU herkkyys ruokatorven solulinjoissa. Autophagy induktio 5-FU: n KYSE450 solujen on aiemmin osoitettu GFP-LC3, elektronimikroskopia, ja Western blot-analyysi LC3II [4]. Autophagic flux, aiheuttama 5-fluorourasiili (5-FU) on myös sisällytetty tähän, esittäen parantaminen rakkula kertymisen klorokiinin (S1 Kuva sininen overlay).

KYSE450 soluja käsiteltiin 30 mM litiumkloridia 300 nM rapamysiini, 40 uM 5-FU tai yhdistelmä autophagy indusoijan ja 5-FU jopa 48 tuntia. Yhtä suuret määrät elinkelpoisten solujen Kunkin ryhmän ympättiin seuraavan lääkehoitoa ja inkuboitiin jopa kaksi viikkoa, ilman lääkettä. Pesäkkeet, jotka on kehitetty, on esitetty kuviossa 2A. Pesäkkeet olivat harvinaisia ​​KYSE450 käsitellyissä soluissa yhdistelmä 5-FU: n ja litium, ja 11,9-kertaisesti alentunut pesäkkeiden lukumäärä toipumassa litium 5-FU hoitoon verrattuna 5-FU yksinään (*** p = 0,001) [kuvio 2A (i)]. Sen sijaan, lisäksi rapamysiini 5-FU käsitellyt solut parantaa niiden kykyä toipua, jossa on 2,3-kertainen määrä palaa pesäkkeiden rapamysiini 5-FU käsitellyissä soluissa verrattuna 5-FU yksin [kuvio 2A (ii)].

KYSE450 soluja käsiteltiin litiumkloridia (litium) (30 mM) tai rapamysiiniä (300 nM) yksin tai yhdessä 5-fluorourasiili (5-FU) (40 uM) 48 tunnin ajan. (A) Elävät solut hoidon jälkeen joko litiumin (i) tai rapamysiini (ii) yksinään tai yhdessä 5-FU 48 tuntia laskettiin ja yhtä paljon siirrostettiin kolmena kappaleena, ilman lääkettä. Solujen annettiin kasvaa 14 päivää, sitten kiinnitettiin ja värjättiin ja pesäkkeet mittaamaan Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR). Tiedot esitetään graafisesti keskiarvona +/- SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Tähdellä

osoittavat merkittävää eroa muodostuneiden pesäkkeiden määrästä yhdistettynä käsitellyissä soluissa verrattuna monoterapiana käsiteltyjen solujen (*** p 0,0005, ** p 0,005) (pariton

t

-testi). (B) Morfologiset ominaisuudet KYSE450 soluja tutkittiin hoidon jälkeen 48 tunnin ajan. Paneelit vasemmalle osoittavat morfologiaa indusoituu vasteena litiumia tai rapamysiini yksin, paneelit oikealle osoittavat morfologia lisäämällä 5-FU. Nuolet osoittavat kertyminen autophagic rakkulat litium, rapamysiini, 5-FU: n ja yhdistelmä käsiteltyjen solujen. CD tarkoittaa, että läsnä on ei-apoptoottisen solukuoleman morfologia (suurennus 40x).

Morfologiset analyysi paljasti, että samalla kun litium yksin aiheutti kertyminen sytoplasmisissa vesikkeleissä (vasen keskiosa, nuolet), oli merkittävä kasvu solujen määrän näyttämiseksi ominaisuuksia ei-apoptoottisen solukuoleman (CD) litium 5-FU käsitellyt solut (oikea keskiosa, CD). Rapamysiini yksin tai yhdessä 5-FU, aiheutti kertyminen soluliman rakkulat (nuolet), joka ei liittynyt kehittämiseen solukuoleman morfologioi- (kuvio 2B alempi paneeli).

Voit varmistaa, että tämä vaikutus oli ei solulinja eikä 5-FU erityisiä, vahvistimme Kemoherkistävien vaikutusta litiumin ylimääräinen lääkkeille vastustuskykyiset /apoptoosin epäpätevä ruokatorven syöpä solulinja (OE19) ja yhdessä lisäksi kemoterapeuttisen lääkeaineen sisplatiini (S2 kuvassa), joka meillä oli aikaisemmin vahvisti indusoi autophagy näissä soluissa [4].

yhdessä nämä havainnot korostavat, että vaikka sekä litiumin ja rapamysiini voi moduloida autophagy, niillä on vastakkaiset aktiivisuus yhdistettynä kemoterapeuttisen aineen; litium toimii voimakas chemosensitizer kun rapamysiini on suojaava.

arvioitiin myös vaikutukset yhdistelmä hoitoja apoptoosin toimivaltainen ruokatorven solulinjoissa. On tärkeää, että nämä aineet eivät häiritse apoptoosin ja vähennetään huumeiden herkkyyttä. Litiumin tai rapamysiinin 5-FU parannettu autophagy ja apoptoosia sekä OE21 (S3 kuvassa) ja OE33 (tietoja ei ole esitetty) soluja, jotka oli selvästi havaittavissa morfologia [S3A (i) S3B (i) Kuva]. Molemmat yhdistelmähoidot myös vähensi elinkelpoisuus määritettynä MTT: llä [S3A (ii) S3B (ii) Kuva].

Useat litiumsuoloja käytetään mielialaa vakauttava lääkkeitä, litiumkarbonaatilla yleisimmin määrätty alentuneiden myrkyllisyys. Voit varmistaa, että vaikutukset litiumin on autophagy ja Chemosensiti- eivät rajoitu litiumkloridia, käsittelimme KYSE450 solujen eri Litiumkarbonaatin pitoisuudet (10-20 mM). Data esitetään S4 kuvassa osoittaa, että litiumkarbonaatti indusoi lisääntyneen ilmentymisen LC3 II western blot (S4A Kuva kaistat 2,3 4). Immunofluoresenssivärjäystä LC3 (S4b kuvio keskiosan) ilmoitti myös silmiinpistävää kertyminen soluliman rakkulat niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 10 mM, ja levinneisyydestä samanlainen kuin havaittiin litiumkloridia käsitellyissä soluissa (S4C kuvio oikea paneeli). Yhdistettynä 5-FU, litiumkarbonaattiliuosta indusoi saman solukuolemaa morfologit (CD, alempi oikea paneeli) kuin havaitut litiumkloridin käsitellyissä soluissa. Tärkeää on, litiumkarbonaattiliuosta indusoi myös samanlainen Chemosensiti- 5-FU (40 uM) in KYSE450 soluissa, varsinkin alemmalla pitoisuuksilla 10 ja 15 mM (S4d kuvio). Yhdessä nämä havainnot korostavat tärkeää roolia litiumioni kuin autophagy modulaattori ja sen yhteys parantamiseksi solukuoleman yhdistelmähoitoa.

sytotoksisuusmekanismin

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset autophagic flux, joka johtaa liialliseen kertymiseen autophagosomes voi kääntyä autophagy osaksi tuhoisa prosessi [16]. Alkuperäiset tutkimuksemme kanssa Cyto ID määrityksessä osoitti, että litium vaikutti autophagosome vaihtuvuus (kuvio 1). Siksi etsineet lisänäyttöä loppupään eroista autophagosome käsittely, joka saattaa selittää kyky litiumin chemosensitize ruokatorven soluihin.

Vertasimme tasoon vuon litium ja rapamysiinin käsiteltyjä soluja käyttämällä fuusioproteiinia (mCherry- GFP-LC3) in KYSE450 soluissa, määrällisesti sekä vihreä ja punainen fluoresenssi virtaussytometrialla, jossa on kaksi erillistä laseria poistamiseksi korvausta vaatimuksia.