Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on toiseksi yleisin syöpä ja suurin syy syöpään liittyvien kuolemien. Huolimatta viimeaikainen edistys kehittämiseen kohdennettujen hoitomuotojen, joilla on pitkälle edennyt sairaus jäävät parantumaton, lähinnä koska metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyövän (NSCLC) mahdollisesti kehittää resistenssiä tyrosiinikinaasiestäjät (TKI). Estäjät on potentiaalia kohde vapaita koska kinaasi Super perhe on suurin perheen druggable geenejä, joka sitoutuu yhteiselle alustalle (ATP). Tämän seurauksena, TKI kehitetään usein tiettyä tarkoitusta varten, on havaittu toimimaan muihin kohteisiin. Drug affiniteettikromatografiaa on käytetty osoittamaan, että dasatinib vuorovaikutuksessa TGFp tyypin I reseptori (TβR-I), seriini-treoniini-kinaasi. Voit selvittää mahdolliset biologista merkitystä tämän yhdistyksen, tutkimme yhdessä vaikutukset Dasatinibin TGFp keuhkosyöpään solulinjoissa. Huomasimme, että dasatinibi hoito yksinään oli hyvin vähän vaikutusta; kuitenkin, kun ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat käsiteltiin yhdistelmällä TGFp ja dasatinibihoidon, apoptoosi indusoitiin. Yhdistetty TGF-1 + dasatinibihoidon hoito ei ollut vaikutusta aktiivisuuteen Smad2 tai muiden ei-kanoninen TGF solunsisäisiä välittäjiä. Mielenkiintoista, yhdistetty TGFp ja dasatinibin hoito johti ohimenevää p-Smad3 (näkyvissä sen jälkeen 3 tuntia). Lisäksi kun NSCLC soluja käsiteltiin Yhdistelmän pro-apoptoottinen proteiini BIM säädeltiin. Knockdown ilmentymisen Smad3 käyttäen Smad3 siRNA myös johti vähenemiseen BIM proteiinia, mikä viittaa siihen, että TGF-1 + dasatinibia aiheuttama apoptoosin välittyy Smad3 sääntelyn BIM. Dasatinibi on vain tappaa tehokkaasti EGFR mutantti soluja, jotka on esitetty vain 10% NSCLCs. Siksi havainto, että villin tyypin EGFR keuhkosyövässä voidaan manipuloida niiden tekemiseksi herkkiä tappaminen dasatinib voisi olla merkittäviä vaikutuksia kehittämällä innovatiivisia ja mahdollisesti tehokkaampi käsittely strategioita tähän sairauteen.

Citation: Gordionin E, Li J, Pevzner Y, Mediavilla-Varela M, Luddy K, Ohaegbulam K, et ai. (2014) transformoivan kasvutekijän β Signaling voitetaan Dasatinibia Resistance in Lung Cancer. PLoS ONE 9 (12): e114131. doi: 10,1371 /journal.pone.0114131

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 03 lokakuu 2014; Julkaistu 11 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Gordionin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health SPORE Grant P50 CA119997-02-S2. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on toiseksi yleisin syöpä ja osuus on noin 15% kaikista syövän diagnoosit. Huolimatta viimeaikainen edistys kehittämiseen kohdennettujen hoitomuotojen, joilla on pitkälle edennyt sairaus jäävät parantumaton. Koska geneettinen monimuotoisuus kasvaimet, solut aktivoituvat vaihtoehtoisia kasvun polkuja lopulta esiin; näin ymmärtämään mekanismeja, joiden erilaisia ​​reittejä kytketään päälle ja pois päältä on tärkeää suunnitella uusia hoitomuotoja kehitettäessä. Vaikka jotkut syövät ovat aluksi hyvin herkkiä tyrosiinikinaasiestäjät (TKI), vastus lopulta kehittyy. Esimerkiksi suurin osa metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, joilla on EGFR-aktivoivia mutaatioita reagoimaan hoitoon erlotinibin; kuitenkin, kaikki potilaat lopulta edetä. Siksi vaihtoehtoinen hoitoja tarvitaan kiireesti potilaille, joilla on EGFR mutaatioita, jotka aluksi vastata EGFR TKI hoitoihin mutta lopulta kehittää resistenssin sekä potilaille, joilla esiintyy villityypin EGFR genotyyppi [1]. Tämä vastus voi olla osittain monimutkaisuuden vuoksi, joka on ominaista signalointi tämäntyyppisten proteiineja sekä heterogeenisyys keuhkojen adenokarsinooman [2]. Dasatinibi, TKI useita kinaasin tavoitteiden testataan parhaillaan kohdella eri syöpäsairauksia joissa näitä tavoitteita yliekspressoituina lukien krooninen myelooinen leukemia ja rinta- ja keuhkosyöpää [3], [4], [5]. Kliiniset tutkimukset ovat testanneet tehoa dasatinibin NSCLC monoterapiana [6], yhdistettynä nykyisin käytössä kemoterapiahoitoihin kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjä erlotinibille [7], ja potilailla, joille on kehittynyt resistenssi erlotinibille n ja gefitinibin [8]. Song

et al

osoittivat, että dasatinibi indusoi apoptoosia useissa NSCLC-solujen, jotka ilmentävät mutantti EGFR fenotyyppi; mutta tämä vaikutus ei havaittu NSCLC solulinjoissa villityypin EGFR fenotyyppi [9].

Transforming kasvutekijä β (TGFli) on sytokiini mukana lukuisissa solun toiminnoissa, mukaan lukien kasvu, leviämisen, tarttuvuus , muuttoliike, ja apoptoosin. Lisäksi menetys vastata TGFp-1 on korreloitu tuumorigeenisyyden kanssa monissa eri syöpätyypeissä [10]. TGF signaalitransduktion alkaa ligandin sitoutumista TGFp tyypin II reseptori (TβR-II), jota seuraa rekrytointi tyypin I reseptori (TβR-I) ja muodostamalla hetero-oligomeerisen kompleksin TGFp-1, TβR-II, ja TβR -I [11]. Sen jälkeen kompleksin muodostuminen, konstitutiivisesti autofosforyloidun TβR-II fosforyloi TβR-I, aloittaa fosforylaatio cascade loppupään sytoplasmisen substraatteja, mukaan lukien Smad proteiinit, minkä jälkeen aktivointi kohdegeenien [10]. Ylikuulumisongelman välinen TGFp polku ja monet muut signaalintransduktioreitteihin johtaa muutosta alun perin TGFp signaalin ei-kanoninen reittejä ja sitä käytetään selittämään useita vaikutuksia TGFp [12], [13], [14]. Normaalissa epiteelisolujen, TGFli estää solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia, mikä toimii tuumorisuppressorina; Kuitenkin monissa syövän tyypit, TGFli toimii kasvain promoottori (soluinvaasiota, etäpesäke, immuuni asetus, ja mikroympäristölle muutos) [15].

Drug affiniteettikromatografialla kokeet paljastivat, että dasatinibin, alunperin kehitetty SRC estäjä [16], on vuorovaikutuksessa yli 40-kinaasien, mukaan lukien tyrosiinikinaasit, reseptorityrosiinikinaasit, seriini /treoniini-kinaasit, ja MAP-kinaasien. Yksi seriini /treoniini-kinaasit, jotka tunnistettiin käyttämällä tätä lähestymistapaa on TGFp-tyypin I reseptori (TβR-I) [17]. Sen määrittämiseksi mahdollisten biologista merkitystä tämän yhdistyksen, tutkimme yhdessä vaikutukset Dasatinibin TGFp on NSCLC solulinjoissa. Huomasimme, että dasatinibi hoito yksinään oli hyvin vähän vaikutusta; kuitenkin, kun ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat käsiteltiin yhdistelmällä TGFp ja dasatinibihoidon, apoptoosi indusoitiin. Dasatinibi on vain tappaa tehokkaasti EGFR mutanttisoluista [9], jonka osuus 10% NSCLCs; Siksi havainto, että keuhkosyövässä voidaan manipuloida niiden tekemiseksi herkkiä tappaminen dasatinib voisi olla merkittäviä vaikutuksia kehittämällä innovatiivisia ja mahdollisesti tehokkaampi käsittely strategioita tähän sairauteen.

Materiaalit ja menetelmät

soluviljely

ihmisen keuhkoadenokarsinooma NCI H292 ja A549-solulinjoja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Thermo Scientific, Waltham, MA), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Inc., Lawrenceville, GA), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 1 mM glutamiinia. Solulinjoja pidettiin kosteassa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Vasta-aineet ja yhdisteet,

Polyklonaalisia anti-Shc1-vasta-aine saatiin Thermo Scientific Pierce (Rockford , IL), ja polyklonaalinen anti-MADH7 (Smad7) vasta-aine hankittiin Abcam Inc. (Cambridge, MA). Anti-HDAC2 hankittiin Millipore (Billerica, MA). Seuraavat vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA): anti-pSma2 (linkkeri ja COOH erityisiä fosforylaatio), anti-Smad2, anti-pSmad3, anti-Smad3, anti-Pakt, anti-Perk, anti-BIM, anti-PARP, ja anti-GAPDH. Rekombinantti ihmisen TGF-1-proteiini hankittiin R Näiden rankattiin perustuu ominaisuuksiin, jotka sisältyvät hydrofobisuus, liuotinainealtistumisesta, ja vetysidosten potentiaalia. Alustava Glide [32], [33] SP (normaali tarkkuus) ja sen jälkeen XP (extra tarkkuus) telakointi neljä yhdistettä suoritettiin alkuun 3 sitoutumiskohdista. Tämän perusteella alkuperäisestä telakka, Site 1 valittiin todennäköisemmin sitoutumiskohtaan. Site 1, joka korreloi tasku, johon dorsomorphin kuvattiin, oli myös sijoittui korkeimmat SiteMap.

Seuraavat telakat tutkimusta suoritettiin käyttämällä Raskauden Fit Docking (IFD) [32], [34] työnkulun Maestro. IFD työnkulku tilit reseptorin joustavuutta ottamalla näytteitä painotuksista sivuston ketjujen sisällä sitovan alueen päälle telakointi ligandin. Useita ligandi konformaatioita telakoituna siten ja pisteytetty Glide. Kukin ligandi telakoitu johonkin Site 1 määritelty ligandin paras pisteytys aiheuttavat alkuperäisestä SP telakointi osaksi Site 1. Kunkin ligandin IFD teki maalin ja raportoitu useita (-50) proteiini-ligandi konformaatioita josta keskimääräinen IFD pisteet laskettiin.

leviämisen /Cytotoxiticy

A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti kolmena kappaleena. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla TGFp-1, dasatinibille tai TGFp + dasatinibille yhdistettynä. Sen jälkeen, kun 48-tunnin inkubaation, proliferaatio /sytotoksisuus mitattiin lisäämällä CellTiter 96 One Solution (Promega Corporation, Madison, WI). Lisäyksen jälkeen solut jätettiin inkuboitua 1 tunti, ja absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä BioTek EL808 -mikrolevylukijaa (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT). Käsitellyt näytteet normalisoitiin käsittelemättömiin verrokkeihin, ja tulokset on esitetty prosentteina.

Western blotting

Koko-solu-proteiinin uutto suoritettiin ja hylätä solut kylmään 1X fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), seurasi sonikoimalla ja lyysi 1X CHAPS puskurissa (Cell Signaling Technology). Määrittää solunosasijaintia Smad: ien proteiinien, solut fraktioitiin ydin- ja sytoplasman komponenttien kuten aikaisemmin on kuvattu [35]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bradfordin määritys (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiini lysaatit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE), siirrettiin polyvinylideenifluoridi (Millipore Corporation, Billerica, MA), blokattiin 1 tunnin ajan 1X TBST, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa, ja inkuboitiin yön yli, joka vastaa primaarista vasta-ainetta 4 ° C: ssa. Blotit valmiiksi inkuboimalla piparjuuriperoksidaasileimattua sekundaarinen vasta-aine ja kehitettiin käyttäen Amershamin ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Caspase määritys

A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla TGFp-1, dasatinibille tai TGFp + dasatinib yhdistettiin, ja Cell soitin 96-kineettisen kaspaasi 3/7 reagenssia lisättiin samanaikaisesti (Essen Bioscience). Käsittelyt tehtiin kolmena kappaleena. Inkubaatio tehtiin kosteassa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 kanssa IncuCyte elävien solujen kuvantamisjärjestelmä (Essen Bioscience), joka antoi meille mahdollisuuden kaapata yhden kuvan kustakin kuopasta läpi × 20 tavoite ja GFP suodatin kuutio 2 tunnin aikavälein 48 tunnin ajan. Ensimmäinen ja viimeinen kuvaa kustakin kuvasta set uutettiin analysoitavaksi Definiens Developer versio 1.5 (Definiens Inc., Munich, Saksa), ja kaspaasi 3/7-positiiviset solut tunnistettiin ja segmentoida kanssa autothreshold segmentointialgoritmi. Tämä segmentointi edelleen puhdistettu tarkoituksellisen koon, ja lopulta lukumäärä kaspaasi 3/7 solujen lueteltu. Arvot esitetään keskimääräisenä kaspaasi 3/7-positiivisten solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Solusyklianalyysiä

A549-soluja ympättiin 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti 6-kuoppaisille viljelylevyille. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 5 ng /ml TGF-1, 100 nM dasatinibille, tai vehikkeliä (DMSO). Käsittelyn jälkeen kelluvat solut kerättiin ja myöhemmin yhdistää tarttuneet solut korjattu trypsinaatiolla. Solut suspendoitiin uudelleen 1 x PBS, kiinteä 2 ml: ssa jääkylmää 70% etanolia, ja inkuboitiin 2 tuntia -20 ° C: ssa. Solupelletit kerättiin sentrifugoimalla (5000 rpm, 5 minuuttia) ja suspendoitiin uudelleen 400 ui propidiumjodidia (0,6 mM), Triton X-100 (0,1% v /v), ja RNaasi A: ta (0,2 mg /ml). Sen jälkeen 30 minuutin inkubaatio 37 ° C: ssa, solut analysoitiin DNA sisällön käyttämällä FACS Calibur (BD Bioscience, San Jose, CA), ja tiedot analysoitiin käyttäen ModFit LT V3.3.11 ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME).

siRNA kokeita

ON TARGETplus SMART allas siRNA vastaan ​​

Shc1

,

Smad3

, ja negatiivinen kontrolli ostettiin Dharmacon (Thermo Scientific) . Kukin allas oli rekonstruoitu 1X siRNA-puskurissa (Dharmacon) ja laimennettiin DEPC-käsiteltyä vettä siten, että lopullinen pitoisuus oli 20 uM. Ohimenevä transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Grand Island, NY). Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin 24 tunnin kuluttua 60-70% konfluenssiin. Lipofektamiini RNAiMAX, OptiMEM (Invitrogen), ja 200 pmol siRNA seosta inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lisättiin soluille inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan, väliaine poistettiin. Sen jälkeen solut pestiin kerran 1 x PBS, ja yhdiste, joka sisältää median lisättiin soluihin. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion proteiinin uuttamalla valmistelua.

Tulokset

TβR-I telakka tutkimukset

Kokeet käyttäen lääkettä affiniteettikromatografiaa tunnistaa molekyylejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa suoraan dasatinibille ovat tunnistaneet yli 40-kinaasien, mukaan lukien tyrosiinikinaasit, reseptorityrosiinikinaasit, seriini /treoniini-kinaasit, ja MAP-kinaasien. Yksi seriini /treoniini-kinaasien tunnistaa käyttämällä tätä lähestymistapaa on TβR-I [17]. TβR-I on kysteiinirikkaan N-terminaalinen domeeni osallistuu ligandin sitoutumisen, yksi transmembraaninen kierre, sääntely sytoplasminen jukstamembraani- alue, ja C-terminaalinen seriini treoniinikinaasi verkkotunnuksen [36]. Tutkia dasatinibi sitoutuu TβR-I, teimme telakka tutkimukset käyttäen aiemmin raportoitu kiderakenne TβR-I sytoplasminen domeeni [18]. Kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, sivuston nimetty Site 1 valittiin todennäköisesti sitoutumiskohdan. Tutkimuksissamme, vertasimme sitova dasatinibin, bosutinib (rakenteellisesti sukua dasatinibille), LY-364947 (TβR-I-kinaasi kaupallisesti saatavilla inhibiittori [37]), ja dorsomorphin (alun perin käytetty TβR-I kiteyttäminen tutkimukset). Kukin ligandi telakoitu johonkin Site 1 määritelty ligandin paras pisteytys aiheuttavat alkuperäisestä standardin tarkkuus telakka osaksi Site 1. Kunkin ligandin aiheuttama Fit Docking (IFD) pisteytettiin, useita (-50) proteiini-ligandi konformaatioita raportoitu josta keskimääräinen IFD pisteet laskettiin (Fig. 1 C). Meidän telakointi tulokset neljän ligandien kohteita osoitti, että dasatinibi sijoitettiin korkein. IFD protokolla raportoitu että TβR-I -dasatinib muodostunut paras pisteytys monimutkainen (IFD pisteet noin -14742 kcal /mol) sekä sai paremmin keskimäärin (IFD pisteet noin -14694 kcal /mol) kaikkien raportoitu komplekseja. Paras TβR-I-dorsomorphin kompleksi oli IFD pisteet noin -14519 kcal /mol kanssa keskimäärin -14469 kcal /mol. Bosutinib ja LY-364947 suoritettu köyhimpiin, paras proteiini-ligandikompleksit teki noin -14353 kcal /mol ja -14154 kcal /mol, vastaavasti, ja keskimäärin -14313 kcal /mol ja -14119 kcal /mol. Analyysi alkuun pose tuottama joustava telakointi malli paljastaa, että bosutinib vuorovaikutus sitoutumiskohdan kuuluu neljä vetysidoksia jäämiä Pro-439, Thr-378, Asn-341 ja Tyr-219 etäisyyksillä 2,4, 2,18, 2,37 ja 2,25 Å ja vastaavien kulmien 120,7, 144,8, 154,1 ja 151,6 astetta (Fig. 1A). Kääntäen, dasatinibi muodostaa kolme vetysidoksia Arg-218, Asn-341 ja His-284 etäisyyksillä 1,97, 2,00 ja 2,32 Å ja kulmien 145,9, 150,3 ja 139,7 astetta (Fig. 1 B).

Ligandi vuorovaikutus kaavio (A) bosutinib ja (B) dasatinibille telakoitu johonkin TβR-1. Ligandi on edustettuna musta. Vetysidoksia merkitty luvuilla vieressä joukkovelkakirjalainan. Etäisyyksiä ja kulmia kunkin vetysidoksen kuten merkitty kaaviossa esitetään taulukoissa kussakin kuvassa. (C) Site 1 IFD tulosta. Keskiarvo (musta) ja paras (valkoinen) IFD tulokset neljästä yhdisteiden typistetty toimipaikkakohtaisiksi 1 perustuu -50 raportoitu aiheuttaa kunkin yhdisteen. IFDScore kerrotaan -1 esityksen selkeys.

Dasatinibi vaikuttaa vaste TGF-1 in NSCLC solulinjoissa

Voit selvittää mahdolliset biologista merkitystä yhdistyksen välillä Dasatinibin TβR-I, A549 keuhkosyövän soluja kasvatettiin täydellisessä väliaineessa, joka sisältää TGF-1 inkuboitiin läsnä ollessa tai ilman eri pitoisuuksilla Dasatinibihoidon kuten aiemmin on kuvattu [9]. Yhden hoidon TGFli-1 tai dasatinibille esti solujen lisääntymistä (45% ja 34%, tässä järjestyksessä, Fig. 2A, tähdellä). Kiinnostavaa kyllä, tämä proliferaation esto lisääntyy, kun soluja käsiteltiin yhdistelmällä TGFp-1 ja dasatinibi (75%: n esto, Fig. 2A, kaksinkertainen tähdellä). Kasvu proliferaation esto oli riippuvainen dasatinibiryhmän annoksen. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun solujen elinkelpoisuuden määrittämiseen käytettiin solujen määrä (S1 kuva). Edelleen ymmärtää havaittu esto soluproliferaatioon, tutkimme vaikutus tämän yhdistelmähoito solusyklin etenemisen. 48 tunnin kuluttua hoidon TGFp-1 ja dasatinibia kasvu soluissa G1 ei ollut merkittävästi erilainen kuin silloin, kun soluja käsiteltiin TGF-1 yksin (Fig. 2B, yhtenäinen viiva). Vastaavasti, kaksinkertainen hoidon, oli kasvu solujen määrä G2 /M jälkeen TGF-1 hoitoa, mutta kasvu soluissa ei ollut erilainen kuin silloin, kun soluja käsiteltiin dasatinib yksinään (Fig. 2B, katkoviiva) . Siksi väheneminen solujen määrä sen jälkeen, TGFp-dasatinibihoidon yhdistelmä hoitoa ei voida selittää muutokset solusyklin.

(A) A549-soluja käsiteltiin DMSO: ta, eri konsentraatioita TGFp-1 (0-10 ng /ml; valkoiset pylväät), eri konsentraatioita dasatinib (0-400 nM; mustat pylväät), tai yhdistelmä TGFp-1 ja dasatinib (katkoviiva baaria) 48 tuntia. Solujen käsittely molempien aineiden johti lisäys inhibition (**), verrattuna siihen, kun soluja käsiteltiin joko aineella yksinään (*). (B) A549-soluja käsiteltiin DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM dasatinibin, tai niiden yhdistelmää 5 ng /ml TGF-1 ja 100 nM dasatinibia 48 tuntia. 48 tunnin kuluttua, propidiumjodidia värjätyt solut analysoitiin sen määrittämiseksi solusyklin jakautuminen ja analysoitiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

Lisääntynyt solujen apoptoosia käsitelty TGF yhdessä dasatinibille

TGFp on liitetty pro-apoptoottisen vasteita, sekä anti-apoptoottisen vasteita [38]; Siksi tutkimme onko proliferaation esto näkyvissä sen jälkeen yhdistettynä TGFli + dasatinibin A549-soluja oli seurausta apoptoottisen solukuoleman. Apoptoosi mitattiin poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) pilkkoutumisen käsittelyn jälkeen TGFp-dasatinibille yhdistelmä. Dasatinibi tai TGF-1 yksinään ei indusoinut apoptoosia mitattuna PARP pilkkominen (Kuva. 3A). Tämä on yhtäpitävä sen kanssa, mitä on raportoitu aikaisemmin, jos hoito A549 dasatinibihoidon ei aiheuttanut apoptoosia [4]. Sen sijaan yhdistelmä TGFp + dasatinib johti apoptoosin, spesifinen yhteistyössä dasatinibihoitoon, kuten inkubaatio EGFR-inhibiittorin (erlotinibi) tai muun SRC-estäjä (AZD0530) ei aiheuttanut PARP pilkkominen (Fig. 3A). Sen arvioimiseksi, onko

de novo

proteiinisynteesiä tarvitaan TGF + dasatinib: n indusoiman apoptoosin, A549-soluja esikäsiteltiin 10 ug /ml sykloheksimidiä 1 tunnin ajan, minkä jälkeen TGFp-1 hoidon kanssa tai ilman dasatinibille. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, lisäksi sykloheksimidin ei estänyt apoptoosin lisääntyminen, mikä viittaa siihen, että

de novo

proteiinisynteesiä ei tarvita. Olemme tutkineet vaikutusta yhdistelmähoidon 15 NSCLC solulinjoissa (13 EGFR WT ja 2 EGFR MU) ja todettu lisääntynyt PARP pilkkominen 5 heistä, kun heitä hoidetaan yhdistelmällä TGFp + dasatinibi hoito (S2 kuva).

(A) A549-soluja käsiteltiin 100 nM dasatinibin, 1000 nM AZD0530, tai erlotinibi tai ilman 5 ng /ml TGF-1 48 tunnin ajan. (B) A549-soluja esikäsiteltiin 10 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen TGFp-1 plus tai miinus dasatinibille. Inkubaation jälkeen solut otettiin talteen, hajotettiin, ja PARP pilkkominen havaittiin Western blot analyysillä. (C) A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille 5 x 10

3 per kuoppa.

C

ells hoidettiin, ja Cell Player 96-Well Kinetic Caspase 3/7 Reagent lisättiin samanaikaisesti. Käsittelyt tehtiin kolmena kappaleena. Arvot on esitetty keskimääräisenä kaspaasi 3/7 positiivisten solujen 3 erilliselle kokeelle.

Vahvista TGFp + dasatinibiryhmän: n indusoiman apoptoosin, kaspaasi-3/7-määritys (Incucyte) käytettiin mittaamaan samanaikaisesti solukuoleman ja kaspaasi 3/7 toimintaa. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, TGFp + dasatinibihoidon yhdistelmä-hoito johti merkittävään kasvuun (92%) määrän solujen apoptoosin verrattuna joko hoito yksinään (22% ja 19%, vastaavasti). Lisäksi TGFp-dasatinib yhdistelmä johti mitokondrion sähköinen potentiaali ja vapautumista sytokromi c: n päässä mitokondrioiden (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että apoptoosi havaittiin on seurausta aktivaation luontainen (mitokondrion) apoptoottisten reittien.

TGFp-1-dasatinib vaikutus aktiivisuuteen TGFp solunsisäisten välittäjien

TGFp on osoitettu stimuloivan useita solunsisäisiä reittejä, mukaan lukien Smad reitin (kanoninen reitti) ja muiden solunsisäisten välittäjien, kuten p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasi (MAPK), AKT, ja ERK (Kaanonisoimaton väyliä) [39]. Siksi me seuraavaksi tutkittava, onko TGF-dasatinibihoidon käsittely aktivoidaan Näitä reittejä käyttäen vasta-aineita, jotka tunnistavat fosforyloidun (aktivoitu) muodossa välittäjiä sekä kanoninen ja ei-kanoninen reittejä. Kuten on esitetty kuviossa. 4, ilmaus aktivoitua Smad2 tai Smad3 ei havaittu kokosoluekstraktien joko käsittelemättömiä tai dasatinibia käsiteltyjä soluja mutta jälkeen havaittiin TGF-1 hoito tai hoidon jälkeen TGF + dasatinibille. Mielenkiintoista, tasot fosforyloidun Smad3 käsittelyn jälkeen TGFli-dasatinibille ovat korkeammat kuin tasot nähdään TGFli-1 hoito yksinään. Lisääntyminen p-Smad3 nähdä 1 tunnin TGFp-dasatinibihoidon yhdistelmän käyttöä Smad3 aktivointi on ohimenevä, sillä se ei voi nähdä 48 tunnin käsittelyn jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Tämä on toisin kuin Smad2 fosforylaatio, jota voidaan pitää jo 5 minuutin ja pysyy fosforyloitu, kunnes 48 tunnin aikana. Tämä voi johtua huomattavasti lyhyempi puoliintumisaika Smad3 (4,7 tuntia) verrattuna Smad2 (12,5 tuntia) [40]. Esikäsittely kanssa TβR-I: n estäjä LY364947, lohkot Smad2 fosforylaatio läsnä ollessa tai poissa ollessa dasatinibia (Fig. 4B). Kuten odotettua, SRC fosforylaatio estyy läsnäollessa dasatinibin, ja inkubointia TGFp-1 ei ole vaikutusta tähän esto.

A549 NSCLC-soluja käsiteltiin DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM dasatinibi tai yhdistelmä 5 ng /ml TGF-1 ja 100 nM dasatinibin eri määriä aikaa (1 tunti havaitsemista varten pSmad2 ja pSmad3, ja 48 tunnin havaitsemiseksi pSrc). Inkubaation jälkeen, kokosolulysaateista kerättiin ja alistettiin Western-blottauksella mainituilla vasta-aineilla.

Localization ja aktiivisuus Smad: ien proteiinit ovat riippuvaisia ​​fosforylaation aseman COOH ja kytkytfragmenttialueet [41]. Sen määrittämiseksi, oliko apoptoosin lisääntyminen yhdistelmällä havaittu hoito on muutosten vuoksi sijainti Smad: ien, tutkimme vaikutus yhdistetyn TGFp-dasatinibihoidon käsittely lokalisoinnin aktiivisen Smad: ien. 48 tunnin jälkeen ja TGFp-1 tai yhdistelmähoidon TGFp-dasatinibihoidon, solu-uutteet fraktioitiin ja fosforyloidun Smad: ien tutkittiin kussakin fraktiossa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A Smad2 fosforyloituu karboksipäissä (p-Smad2 COOH) kasvaa pääasiassa tumassa. Smad2 fosforyloidun linkkerialueeseen (p-Smad2 Linker) lisää myös käsittelyn jälkeen TGFli-1, mutta suurempi määrä pysyy sytoplasmassa. Mielenkiintoista on, että määrä fosforyloidun Smad3 jälkeen TGF-1 hoidon kertyy myös tumaan, riippumatta dasatinibihoidon hoitoa (kuvio. 5B).

A549-soluja käsiteltiin DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM dasatinibin, tai niiden yhdistelmää 5 ng /ml TGF-1 ja 100 nM dasatinibia 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solulysaatit kerättiin ja ydin- ja sytoplasman fraktiot erotettiin, kuten on kuvattu aiemmin [35]. Fraktioinnin jälkeen, lysaatit alistettiin Western blotting kanssa mainituilla vasta-aineilla.

Hoito yhdistelmällä TGFli-Dasatinibin ei ollut merkittävää vaikutusta muiden kuin ensisijaisen TGF-reitin solunsisäisiä välittäjiä ERK, AKT, tai p38 (S3 kuva). Lisäksi, hoito TGFp-1 ei aiheuttanut kasvua Shc aktivaatio A549-soluissa, kuten aiemmin on raportoitu muiden solutyyppien [42], [43], ja pudotus ilmentymisen SHCA käyttäen SHCA siRNA ei ole vaikutus apoptoosin SHCA-negatiivinen A549-solut (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että tämän reitin ei ole mukana indusoiman apoptoosin havaittu TGF-dasatinibihoidon hoitoon.

TGFp-1-dasatinib apoptoosia välittävät Smad3- indusoi BIM

Smad3 on raportoitu herkistää soluja apoptoottisen vaikutusten TGFp [40], ja yksi ehdotetuista mekanismeista on induktio ekspression pro-apoptoottinen proteiini BIM (Bcl-2- vuorovaikutuksessa välittäjänä solukuoleman) [44]. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, 24 tunnin kuluttua seos hoidon, havaitsimme kasvu BIM-proteiinin ekspression korkean molekyylipainon isoformin ja alemman molekyylipainon ja sytotoksisen BIM. Viime aikoina on raportoitu, että BIM poisto polymorfismit (johtaen BIM isoformin ilman BH3 domain) ovat mukana vastustuskykyä tyrosiinikinaasiestäjiksi useissa syöpätyypeissä [45], [46]. Seulonta kaikki 15 solulinjoissa käyttämällä alukkeita kuvataan kirjallisuudessa [45] emme pystyneet havaitsemaan BIM isoformin missään meidän solulinjojen (S5 kuva). Kuitenkin pudotus ilmentymisen Smad3 käyttäen Smad3 siRNA vähensi määrän BIM yhdistämisen jälkeen hoidon, mikä osoittaa, että Smad3 ilmentyminen on välttämätöntä lisääntyneen ilmentymisen BIM (Fig. 6B). On raportoitu, että ilmentyminen Smad7 estää apoptoosia estämällä ilmentymistä BIM [47]. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 6A TGFp-dasatinibia hoito, joka johti PARP pilkkominen, havaitsimme alennettu ilmaus Smad7. Tämä lasku Smad7 ehdottaa mekanismi pitää TGFp reitin aktiivinen. Tuloksemme viittaavat siihen, että yhdistelmähoidon TGFp ja dasatinibin indusoi apoptoosia lisäämällä TGFli aktivoituminen BIM ja alas-säätely TGFp koulutusjakson estosignaaleista, kuten Smad7.

(A) A549-soluja käsiteltiin DMSO, 5 ng /ml TGF-1, 100 nM dasatinibin, tai niiden yhdistelmää 5 ng /ml TGF-1 ja 100 nM dasatinibia 48 tuntia. Hoidon jälkeen, kokosolulysaateista kerättiin ja alistettiin Western-blottauksella mainituilla vasta-aineilla. (B) siRNA vastaan ​​Smad3, ja negatiivinen kontrolli transfektoitiin A549-soluja. Kun 4 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin ja väliainetta, joka sisälsi yhdisteitä lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen proteiinin uuttamisen valmistamiseksi ja Western blotting -analyysi.