Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

CD44 on tärkeä solureseptoriksi hyaluronihaposta. Varsi rakenne CD44 koodaaman kymmenen normaalin eksonit voidaan laajentaa kymmenen variantti eksonit (v1-v10) vaihtoehtoisen silmukoinnin. Olemme onnistuneet valmistelussa MV5 kokonaan ihmisperäisen IgM ja sen luokan-kytketty GV5 IgG monoklonaalinen vasta-aine (mAb) tunnustaa solunulkoista aluetta CD44R1 isoformin, joka sisältää liitettävän alueen koodattu variantti (V8, V9 ja V10) eksonit ja ilmentyy pinta erilaisten ihmisen epiteelisyöpäsolujen.

menetelmät ja tärkeimmät havainnot

osoitti kasvun estämistä ihmisen syövän ksenograftien jonka GV5 IgG mAb muokannut peräisin MV5 IgM. Tunnistama epitooppi MV5 ja GV5 tunnistettiin V8-koodaavan alueen, jonka analyysi mAb sitoutumisen eri yhdistelmä-DNA-CD44-proteiinien entsyymi-immunologinen määritys. GV5 näytti etuoikeutettu reaktiivisuus vastaan ​​eri pahanlaatuiset ihmissolut ja normaalissa ihmisen soluissa arvioitiin virtaussytometrialla ja immunohistologisia analyysi. Kun ME180 ihmisen kohdunkaulan karsinoomasolut inokuloitiin subkutaanisesti ja kateenkorvattomissa hiirissä, joilla GV5, merkittävä tuumorin muodostusta ei havaittu. Lisäksi injektiot GV5markedly esti kasvua näkyvissä olevien kasvainten välillä HSC-3 ihmisen kurkunpään karsinooman soluja, jotka oli ihonalaisesti viikkoa ennen ensimmäistä hoitoa GV5. Vuodesta

in vitro

kokeissa vasta-aineista riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus ja sisäistäminen CD44R1 tuntui olevan mahdollista mekanismeja

in vivo

antituumorivaikutuksen by GV5.

Johtopäätökset

CD44R1 on erinomainen molekyylikohteena mAb syövän hoidossa, mahdollisesti parempi molekyylejä kohteena olemassa olevien terapeuttisten mAb, kuten trastutsumabi ja Setuksimabia tunnistamaan ihmisen orvaskeden kasvutekijän reseptorin perhe.

Citation: Masuko K, Okazaki S, Satoh M, Tanaka G, Ikeda T, Torii R, et al. (2012) antituumorivaikutuksen vastaan ​​ihmisen syövän ksenoqraftit jonka täysin ihmisperäinen monoklonaalinen vasta-aine on Variant 8-epitooppiin CD44R1 Ilmaistuna Cancer Kantasolut. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10,1371 /journal.pone.0029728

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 15 elokuu 2011; Hyväksytty: 02 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Masuko et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain ”Academic Frontier” projekti Kinki University (2005-2007) ja ”Antiaging Center” projekti Kinki University (2008-2012) for Private Universities: vastaavia rahasto avustusta MEXT (opetus-, kulttuuri-, urheilu- , Science and Technology), ja tukee myös ”A-STEP (Mukautuva ja saumaton teknologian siirto-ohjelma kautta Research Development)” Project (2009-2011): matching rahasto avustus Japanista Science and Technology Agency. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tässä tutkimuksessa vastaava kirjoittaja (TM) yhteistyötä KOHJIN Bio Co., Ltd tutkimuksessa ADCC, Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd käytön KM hiiriä, ja Link Genomics, Inc. tutkimuksessa immunohistokemian. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

CD44 on tyypin I solun pinnan glykoproteiini, joka toimii suurten soluadheesiota molekyyli hyaluronihapot [1] – [3]. Standard CD44 (CD44s) koodaama kymmenen normaalin eksonit (ex1-5 ja ex16-20) voi suurentaa inserttien koodaamia erilaisia ​​yhdistelmiä variantin eksonien (ex6-15 tai v1-v10) on CD44 vaihtoehtoisen silmukoinnin [3] [4]. Vaikka fysiologinen merkitys vaihtoehtoisen silmukoinnin CD44 jää epäselväksi, jotkut muunnelma CD44 (CD44v) molekyylejä raportoitu olevan yli-ilmentynyt oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia jyrsijöiden ja ihmisen järjestelmien [5] – [8].

Among monet CD44v, CD44R1 [7], [8], jolla on asetettu alueen koodaama v8 (ex13), v9 (EX14) ja v10 (EX15) eksonien selektiivisesti ilmaistu eri ihmisen epiteelisyövissä. Esimerkiksi, CD44R1 mRNA on kohonnut ihmisen paksusuolen, virtsarakon, keuhkojen, kurkunpään ja rintasyöpiä [8], ja immunohistologista analyysia (IHA) osoitti myös, että CD44R1 proteiini yli-ilmaistu keuhkojen keuhkopussin näytteissä verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa, käyttämällä kanin polyklonaalisia vasta-aineita rekombinantti-CD44-proteiinia [8]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että hiiren homologi ihmisen CD44R1 ilmaistaan ​​precancerous alueilla, joka mahdollisesti sisältää syöpä kantasolut (CSCS) tai kasvaimeen aloittamista solujen aikana hiiren mahasyövän [9], [10].

kuitenkin, koska erityisiä täysin ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden (mAb) tunnustaa solunulkoisen domeenin ihmisen CD44R1 ilmaistuna elävien kasvainsolujen ei ole ollut saatavilla tähän asti, tarkka arviointi terapeuttisen vaikutuksen anti-CD44R1 mAb ihmisen maligniteettien vielä toteuttaa. Tässä tutkimuksessa raportoimme kasvun estäminen ihmisen syövän ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä paikallisesti tai systeemisesti kokonaan ihmisen mAb tunnustaa CD44R1, ja keskustella spesifisyys, anti-kasvain mekanismeja ja hyödyllisyyttä täysin ihmisen anti-CD44R1 mAb syövän hoidossa.

tulokset ja keskustelu

CD44, joka sitoo hyaluronaatit, on uskottava markkerimolekyyli varten CSCS [11] – [16], ja on merkittävästi mukana etäpesäke syöpäsolujen [16] – [ ,,,0],19]. Näin ollen, CD44 pidetään lupaavana molekyyli- kohde syövän hoitoon käyttäen mAb. Koska CD44s ilmentyy erilaisissa normaaleissa kudoksissa [20], olemme keskittyneet tuumorin selektiivinen splice-variantti CD44v proteiineja. Niistä yli 1000 teoreettisesti mahdollinen liitos-variantti CD44v proteiinit [21], CD44R1 ottaa insertin koodattu V8, V9 ja V10 eksonit ekspressoituu selektiivisesti eri epiteelisyöpäsolujen [8].

Olemme äskettäin laadittu viisi anti -ihmisen CD44 täysin humaaneja IgM-mAb (MV1 vastaan ​​CD44s, ja MV2, MV3, MV4 ja MV5 vastaan ​​CD44R1) solusta välisiä fuusioita hiiren myeloomasoluja ja pernasoluja Kirin-Medarex (KM) hiirissä [22] rokotettu rekombinantti ihmisen CD44-proteiineja tuotettu

Escherichia coli

. Tässä artikkelissa esitämme valmistelu luokan kytkettyä anti-CD44R1 ihmisen IgG mAb (GV5), spesifisyys MV1, MV5 ja GV5, ja

in vivo

ja

in vitro

anti- kasvain vaikutus GV5.

täysin ihmisen IgM ja IgG mAb ihmisen CD44-proteiineja tuotettiin

Viisi anti-ihmisen CD44 kokonaan ihmisen IgM-mAb (MV1, MV2, MV3, MV4 ja MV5) olivat tuotettu vastaan ​​rekombinantin CD44 (R1a, Δex5-v8-v9-v10-Δex16) tuotetun proteiinin

Escherichia coli

[8]. MV1 reagoimaan RH7777 rotan hepatoomasolut ilmentävät CD44s tai CD44R1, ja MV2, MV3, MV4 ja MV5 reagoimaan spesifisesti RH7777-solut ekspressoivat CD44R1 (tuloksia ei ole esitetty). Arvioida reaktiivisuus ihmisen mAb

in vivo

kasvaimia, teimme IHA (Fig. 1). MV1 ja MV5 ehdottomasti värjätään solukalvon

in vivo

kasvaimen ME180 ihmisen kohdunkaulan syöpä kehittyi kateenkorvattomissa hiirissä, ja CD44R1 oli heterogeenisesti ilmaistu ihmisen syövän ksenografteissa, vaikka MV2, MV3 ja MV4 osoitti suhteellisen heikko reaktioita verrattuna MV5 (Fig. 1). Siksi olemme muokattava (luokka-kytketty) MV5 ihmisen IgM GV5 ihmisen IgG. Reaktiivisuus GV5 kanssa

in vivo

kasvaimia ME180 oli myös positiivinen solukalvon näiden tuumorisolujen (Fig. 2), ja CD44R1 oli heterogeenisesti ilmaistu kasvain kuten tapauksessa kanssa värjäys ME180 kasvaimeen MV5. Sitä vastoin ilmaus HER2 tunnustettu Trastutsumabi oli suhteellisen tasainen koko ME180 kasvain, ja ilmentymistä CD20 tunnustettu Rituksimabi oli täysin negatiivinen.

Kudosleikkeet ihmisen ME180 kasvaimia kehittyi kateenkorvattomissa hiirissä kiinnitettiin PFA , ja lisättiin peräkkäin inkuboitiin ihmisen mAb, lajispesifinen biotinyloitu anti-ihmis-IgG + IgM (H + L), ABC-reagenssia ja substraattia, joka sisälsi DAB ja H

2O

2. Tumat värjättiin hematoksyliinillä.

Kudosleikkeet ihmisen ME180 kasvaimia kehittyi kateenkorvattomissa hiirissä kiinnitettiin kylmällä asetonilla, ja lisättiin peräkkäin inkuboitiin ensisijaisen mAb, lajispesifinen biotinyloitu anti-ihmis-IgG Fcy, ABC reagenssin ja alustan sisältävän liuoksen DAB ja H

2O

2. Tumat värjättiin hematoksyliinillä. Ylempi tai alempi paneelit esittävät vastaavasti matala tai korkea suurennusta värjätyt kudokset.

spesifisyys ja epitooppiin kokonaan ihmisperäisen MV1 ja MV5 IgM, ja luokka-kytketty GV5 IgG mAb vastaan ​​CD44 määritettiin

erityispiirteet on MV1, MV5 ja GV5 verrattiin reaktiivisuus HEK293F ihmisen alkion munuais- soluja, jotka ilmentävät CD44R1 tai CD44s (Fig. 3A), kuten on kuvattu muualla [10], [23]. MV5 ja GV5 reagoivat nimenomaan CD44R1-vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) ilmentävillä solujen GFP-ilmentyminen riippuvaisella tavalla; kuitenkin, nämä mAb eivät reagoineet solut, jotka ilmentävät CD44s-GFP, osoittaa, että GV5 ylläpitää spesifisyys MV5 ja tunnistaa spesifisesti ihmisen CD44R1 proteiinin virtaussytometrialla (FCM). Sen sijaan, MV1 reagoimaan HEK293F soluja, jotka ekspressoivat CD44s-GFP tai CD44R1-GFP. Spesifisyys ihmisen mAb oli myös toteen FCM-analyysillä käyttäen RH7777 rotan soluja, jotka on transfektoitu cDNA ihmisen CD44s tai CD44R1 (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavaksi MV1, MV5 ja GV5 arvioitiin reaktiivisuus erilaisten yhdistelmä-ihmisen CD44-proteiinien fuusioitu glutationi S-transferaasi (GST) (Fig. 3B). R1a on immunogeeninä tuotanto anti-CD44 ihmisen mAb, ja R1b sisältää lyhyempiä polypeptidien EX5 ja V8 alueilla kuin R1a. Epitooppi määritellään täysin ihmisen mAb paikallistettu EX5-koodaavan alueen MV1, ja V8-koodittavan alueen MV5 ja GV5 entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Peptidiepitoopin määritelty MV5 tai GV5 näytti altistua ihmisen soluissa, koska nämä mAb varmasti ja reagoivat erityisesti HEK293F soluja, jotka ilmentävät CD44R1, vaikka CD44R1 on raskaasti glykosyloitunut ja ilmaisu näiden epitooppien voi vaikuttaa glykosylaation vaihtelee solutyyppien tai solun olosuhteissa.

(A) MV1 (vasemmalla), MV5 (keskellä) ja GV5 (oikea) verrattiin reaktiivisuus HEK293F soluja, jotka ilmentävät ihmisen CD44R1-GFP (ylempi) tai ihmisen CD44s-GFP (alempi) FCM. (B) reaktiivisuus vasta-aineiden eri GST-fuusioitu yhdistelmä-CD44-proteiineja (R1a ja R1b, Δex5-V8-v9-v10-Δex16, V8, V9, V10 ja EX5) fuusioitu GST määritettiin ELISA: lla. Ero pituus Δex5 ja Δex16 välillä R1a ja R1b rekombinanttiproteiinien kuvataan ”Materiaalit ja menetelmät”.

Anti-CD44R1 täysin ihmisen GV5 selektiivisesti reagoimaan ihmisen sinoomasolulinjoja, mutta ei eri ihmisen normaalit solut

Jotkut olemassa olevien terapeuttisten mAb on suunnattu ihmisen epidermaalisen kasvu- reseptorin (HER) perhe [24] – [27]. Vertasimme reaktiivisuus GV5, Setuksimabi (anti-HER1) ja Trastutsumabi (anti-HER2) HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, normaalin ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (NHEK) ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) (Fig. 4A, C) . GV5, Setuksimabi ja Trastutsumabi olivat varmasti reaktiivisia HCT116 ihmisen syöpäsoluja. GV5 heikosti reagoida NHEK, vaikka Setuksimabia voimakkaasti ja Trastutsumabi kohtalaisen reagoida NHEK. Lisäksi GV5 oli lähes reagoimattomia HUVEC, vaikka Setuksimabia ja Trastutsumabi olennaisesti reagoida HUVEC. Seuraavaksi tutkimme reaktiivisuus GV5 vastaan ​​eri ylimääräisiä ihmisen solulinjoja (Fig. 4B). GV5 varmasti reagoida useiden ihmisen viljellyissä epiteelisyövissä (BT20 rinta-, KATOIII vatsaan, LS-174T paksusuoli, ME180 kohdunkaula, KPK-1 munuaisen ja KU-1 virtsarakon), vaikka tämä mAb ei reagoi vain heikosti reagoimaan Molt-4 T leukemia, SK-MEL-37 melanooma ja ei-syöpä solulinjoja aikuisen ihon (EK325), sikiön suolen (Int407) ja alkion munuaisen (HEK293F). GV5 myös reagoida MKN-7 mahan ja HeLa-S kohdunkaulan karsinooma solulinjoissa, mutta ei U-2OS osteosarkooma, Jurkat, Daudi ja HL60 leukemiasolulinjoja (Fig. 4C). Expression of CD44R1 monissa karsinoomasoluja oli heterogeeninen (Fig. 4B), kuten tapauksissa ihmisen ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä (Fig. 1, Fig. 2). Lisäksi, GV5 ei reagoinut lepää pienistä lymfosyyteistä lainkaan; se on myös kiinnostava, että se ei reagoinut lymfosyyttejä stimuloidaan rekombinantti ihmisen interleukiini-2 (IL-2) 48 tuntia tai 12

O

-tetradecanoylphorbol-13-asetaatti (TPA) plus Ca ionoforin ( A23187) 24 tuntia, mikä osoittaa, että aktivoituneet T-ja B-lymfosyytit eivät ole reaktiivisia GV5 (Fig. 4C). Spesifisyys GV5 osoittaa, että CD44R1 on kasvain-selektiivinen ja ylivoimainen kohdemolekyyli verrattuna HER1 tai HER2. Itse asiassa, vakavia iho-oireita havaittiin hoitoon Setuksimabia paksusuolen syövän potilaille, luultavasti koska sitoutumisen HER1 ihon keratinosyyttejä. Yhteydessä ilmaus HER2, GV5 voimakkaasti reagoimaan BT20 triple-negatiivinen rintasyöpäsolulinja, joka ei ilmennä estrogeenin ja progesteronin reseptoreihin ja HER2, vaikka tämä mAb ei reagoi HER2-yli-ilmentävien SK-BR-3 rintasyövän solulinjassa (Fig. 4B, C). Siksi odotamme, että anti-CD44R1 terapeuttinen mAb voisi kompensoida anti-HER2 mAb terapiassa rintasyövistä.

GV5, Setuksimabia ja Trastutsumabi verrattiin reaktiivisuus HUVEC, NHEK ja HCT116 FCM (histogrammit ), jossa on Accuri C6 virtaussytometrillä (A). Reaktiivisuus GV5 eri ihmisen soluihin analysoitiin FCM, ja kuvataan histogrammit (B) käyttäen BD-LSR -virtaussytometrillä ja ΔMFI (C) käyttämällä Accuri C6 virtaussytometrillä.

CD44R1 oli erityisesti todetaan ihmisen epiteelin syöpä kudoksiin

Ensinnäkin jakelu CD44s ja CD44R1 ihmisen syövissä analysoitiin rotan mAb (Rv7 ja RV9) ihmisen CD44, koska immunovärjäystä ihmisen kudosten kanssa GV5 seurasi anti-ihminen immunoglobuliinit eivät johtaneet ilmeinen tulos (tuloksia ei ole esitetty). In IHA ihmisen rinta- ja paksusuolen kudoksiin (Fig. 5), sekä Rv7 määritelty CD44s ja RV9 määritelty CD44R1 (V8) on ehdottomasti ilmaistaan ​​solukalvon rinta- ja paksusuolen syövän soluja, vaikka CD44s mutta ei CD44R1 myös ilmentyy solut strooman. Expression of CD44R1 normaaleissa rinta- epiteelisolujen oli pieni ja se oli negatiivinen paksusuolen epiteelisoluissa. Lisäksi, CD44R1 oli heterogeenisesti ilmaistu syöpäsoluja, kuten tapauksessa, jossa värjäys ihmisen syövän ksenograftien (Fig. 1 ja Fig. 2) ja syöpäsolulinjoissa (Fig. 4B), jonka GV5 anti-CD44R1 ihmisen mAb. Vuonna IHA ihmisen risat, RV9 anti-CD44R1 (V8) mAb heikosti värjätään epiteelin, erityisesti solujen Tyvisolukerroksessa, mutta ei värjää lymfoblastoidisoluilla vuonna siemennestettä keskellä nielurisojen kudoksen, vaikka Rv7 anti-CD44s mAb ehdottomasti värjättyjen solujen tällä alueella, lisäksi solujen koko epiteelin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot osuvat hyvin reagoimattomuusvaatimukset on GV5 aktivoidulla ihmisen lymfosyyttien (Fig. 4C). Nämä tulokset FCM ja IHA ovat osoittaneet erinomaisia ​​syöpää spesifisyys CD44R1, epäilemättä parempi kuin CD44s. Olemme ensi tutkinut reaktiivisuus biotinyloidun GV5 ihmisen kudosnäytteiden. GV5 varmasti reagoimaan levyepiteelikarsinooma karsinoomat kohdunkaulan (ensisijainen syöpä), iho (ensisijainen syöpä) ja keuhkosyövän (metastaattinen pehmytkudoksiin), adenokarsinoomien mahan ja paksusuolen, mutta ei yhdistetyt imusuonten kyhmyjä of umpilisäke (Fig. 6). Siten ilmaus CD44R1 on rajoitettu epiteelisyöpien, ja ei ole koholla prosessissa lymfosyyttien aktivaation

in vitro

tai

in vivo

, vaikka ilmentyminen tietty luontainen onkoproteiini Lymfosyyttien usein ajan säädellään eri aktivaatio ärsykkeiden [28], [29].

reaktiivisuus anti-ihmisen CD44s tai anti-ihmisen CD44R1 (v8) rotan mAb rinta- ja paksusuolen kudosleikkeiden ihmisen kirurgisista näytteistä oli analysoitiin ABC immunoperoksidaasivärjäystä. Palasia PFA-kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut ihmisen rinta- ja paksusuolen kudokset käsiteltiin mikroaalloilla sitraattipuskurissa haettaessa antigeenejä, ja inkuboitiin Rv7 tai RV9 rotan mAb. Oltuaan huuhdeltiin PBS, kudosleikkeet peräkkäin inkuboitiin lajikohtaisia ​​biotinyloitu aasin anti-rotta IgG (H + L), ABC-reagenssia ja substraattia sisältävä liuos DAB ja H

2O

2. Tumat värjättiin hematoksyliinillä. Non-Cancer tai Cancer kudosten yksilöitä samanlaisesta potilaalle.

Palasia PFA-kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut ihmisen kudokset käsiteltiin mikroaalloilla sitraattipuskurissa haettaessa antigeenejä, ja inkuboidaan biotinyloidun GV5. Oltuaan huuhdeltiin PBS, kudosleikkeiden inkuboitiin ABC reagenssin ja alustan sisältävän liuoksen DAB ja H

2O

2. Tumat värjättiin hematoksyliinillä.

Anti-CD44R1 GV5 ihmisen mAb näytteillä

in vivo

terapeuttinen vaikutus ihmisen karsinoomia ksenograftimalleissa

GV5 arvioitiin anti- kasvain vaikutus ihmisen kasvaimia kateenkorvattomissa hiirissä. Koko kunkin kasvaimen muodostunut ajoittain mitattiin, kuten muualla on kuvattu [30] – [32]. Ensin GV5 tutkittiin sen vaikutukset kasvaimen muodostumisen ME180 ihmisen kohdunkaulan syövän solujen kasvaimen neutralointi malli [33]. Tämä malli arvioida paikallisen vaikutuksen vasta-aineita kasvaimen kasvun historiallisesti peräisin Winn testi [34], jotka on tarkoitettu arviointiin kasvaimen vastaisen vaikutuksen sytotoksisia T-lymfosyyttejä. Syöpäsolut istutettiin ihon alle kateenkorvattomissa hiirissä kanssa tai ilman GV5 (50 ug /kohta), ja kasvaimen kasvu GV5 treatedmice oli esti merkittävästi verrattuna vertailuhiiriin (Fig. 7). Seuraavaksi GV5 tutkittiin antituumorivaikutuksen vastaan ​​HSC-3 ihmisen kurkunpään syövän muodostuneen kasvaimen mallia [35]. Tässä systeeminen anto mAb on kasvain, me tietoisesti hyväksyi vatsaonteloon mutta ei suonensisäisen injektion antamista varten tarkkaa määrää mAb kullekin hiirelle. Seitsemän päivän kuluttua HSC-3-solut ympättiin ihon alle kateenkorvattomissa hiirissä ja näkyvä kasvaimen kunkin hiiren vahvistettiin, GV5or ajoneuvon ohjaus injektoitiin intraperitoneaalisesti kaksi kertaa välein viikossa. Tässä kokeellisessa mallissa tuumorin kasvua GV5 treatedmice oli jälleen merkittävästi inhiboi verrattuna vertailuhiiriin (Fig. 8).

Kasvaimen neutralointi malli on annettu. ME180 ihmisen kasvainsoluissa (1,0 x 10

6) kanssa tai ilman mAb (50 ug /site) 200 ul: ssa PBS: ää inokuloitiin subkutaanisesti oikeaan selän kylkeen kunkin eläimen. Koko kunkin kasvaimen muodostunut ajoittain mitattiin, ja kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin kaavalla 0,4 × (pituus) x (leveys)

2. Tulokset analysoitiin tilastollisesti kaksisuuntaisella ANOVA testit toistetaan toimenpiteet.

Perustettu kasvainmuoto hyväksyttiin. Seitsemän päivän kuluttua ihmisen kurkunpään karsinooma-johdettu HSC-3 kasvainsoluja (1,0 x 10

6) 200 ul: ssa PBS: ää, ympättiin ihon alle kateenkorvattomissa hiirissä ja näkyvä kasvaimen kunkin hiiren oli varmistettu, 500 ui PBS: ää kanssa tai ilman GV5 (100 ug) intraperitoneaalisesti päivänä 7 ja päivänä 14 (pystysuora nuolet). Koko kunkin kasvaimen muodostunut ajoittain mitattiin, ja kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin kaavalla 0,4 × (pituus) x (leveys)

2. Tulokset analysoitiin tilastollisesti kaksipuolista Studentin

t

testit (ylempi), ja kaksisuuntainen ANOVA testit toistetaan toimenpiteet (alempi). Pystyviivat osoittavat standardipoikkeamat.

GV5 aiheuttama sisäistämisen CD44R1 ja ADCC

in vitro

analysoimiseksi mekanismeja

in vivo

anti-kasvain vaikutus GV5 vastaan ​​ihmisen syövän ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä, internalizations on CD44R1, komplementista riippuva sytotoksisuus (CDC) ja vasta-aineista riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus (ADCC), jonka GV5 tutkittiin. Koska toimintahäiriö CD44R1 mAb voi johtaa kasvun estäminen tai solukuolema syöpäsolujen puutteen vuoksi signaalin tarttumista alustaan, tutkimme vaikutus GV5 jakautumiseen solun pinnan CD44-proteiineja. Lisäämällä GV5 kulttuuriin HSC-3-soluja 12 h, noin 50% CD44R1 proteiinien katosi solun pinnalla (kuvio. 9A). CDC käyttää GV5 yhdistettynä hiirellä, kanin tai ihmisen seerumin ei johtanut kuolemaan kasvainsolujen (Fig. 9B). ADCC, pernasolujen kateenkorvattomissa hiirissä olivat pre-viljeltiin IL-2: ssa 12 h parantaa tappavaa aktiivisuutta, efektorisolujen. Käyttämällä IL-2-käsitelty efektorisolujen, GV5clearly täydensi sytotoksisuutta HSC-3 kasvainsolujen ADCC (Fig. 9C, D).

(A) HSC3 soluja viljeltiin kanssa tai ilman GV5 ( 10 ug /ml) 12 h, ja immunovärjättiin GV5 seurasi FITC-konjugoidulla aasin anti-ihmis-IgG (H + L). Solupinnan CD44R1 proteiinit näissä soluissa havaittiin FCM. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin. (B) Kun HSC-3-solut ja seerumit komplementin ja mAb sekoitettiin ja inkuboitiin kussakin kuopassa U-pohjaisille 96-kuoppaiselle levylle 1 h, DAPI, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Prosenttiosuudet DAPI-värjättyjen solujen (kuolleita soluja) laskettiin FCM. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin. (C) HSC-3-soluja (1,5 x 10

5) sekoitettiin efektorisolujen pernasolujen (3 x 10

6 tai 9 x 10

6) KNS nude-hiirissä, jotka olivat pre-viljeltiin yön yli LL-2, kanssa tai ilman mAb, kuhunkin kuoppaan U-pohjaisille 96-kuoppaiselle levylle 5 h, ja PI lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sytotoksisuus analysoitiin käyttämällä Accuri virtaussytometrillä. R1, HSC3 ihmisen kohdesoluihin; R2, hiiren efektorisoluja; R3, PI-värjätty kuolleita soluja R1; R4, PI-värjäämätön elävien solujen R1. (D) Solukuolemaan (%) HSC-3-soluissa hiiren efektorisolujen (E /T = 0, 20 tai 60) kanssa tai ilman GV5 piirrettiin. E /T merkitsee efektori-kohde-suhde.

GV5 indusoi tehokkaasti ADCC ihmisen efektorisoluilla

Koska olemme vahvistaneet ADCC GV5 hiiren efektorisoluja, tutkimme seuraavaksi ADCC GV5 ihmisen efektorisolujen. GV5 osoitti merkittävää ADCC vastaan ​​HSC-3 kasvainsolut IL-2-stimuloitujen ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit (PBL) efektorisoluina, jopa matalina efektori /kohde (E /T) suhde 2,5 (Fig. 10 A). At E /T-suhteella 10, GV5 osoitti täydennetty sytotoksisuutta HCS-3-soluissa verrattuna ihmisen efektorisoluja yksin, kaikissa aikapisteissä välillä 2 h ja 7 h (Fig. 10B).

HSC-3 -solut leimattiin Calcein-AM, ja soluja (2 x 10

5) sekoitettiin efektorisoluja ihmisen PBL (5 x 10

5 tai 2 x 10

6), joka oli esi-viljeltiin yön yli IL-2 kanssa tai ilman mAb kuhunkin kuoppaan U-pohjaisille 96-kuoppaisen levyn 7 tuntia. Sytotoksisuus arvioitiin vapautumista Calcein-AM kuolleiden kasvainsolujen alustaan, ja tulokset tallennetaan automaattisesti käyttämällä Terascan VP microfluorocytometer 1 h välein 7 tuntia. Tulokset analysoitiin tilastollisesti kaksisuuntaisella ANOVA testit toistetaan toimenpiteet (A) ja kaksipuolinen Studentin

t

testit (A ja B). Täplät ja pystypalkit esittävät vastaavasti keinot ja keskivirheet.

Tässä tutkimuksessa olemme menestyksekkäästi tuottaa kokonaan ihmisen GV5 mAb spesifisesti tunnistavat CD44R1, ja osoitti kasvun estäminen ihmisen syövän ksenograftien kateenkorvattomissa hiirillä GV5 . Koska anti-kasvain mekanismeja ihmisen -ksenografteja mukaan GV5 kateenkorvattomissa hiirissä, me alustavasti ehdottaa panos aiheuttama sisäistäminen CD44R1 mukaan GV5 ja täydennetty sytotoksisuuden ADCC hiirellä efektorisolujen kanssa GV5. Odotamme myös, että GV5can näyttämään ADCC välittämä terapeuttista vaikutusta ihmisen maligniteettien, koska GV5has osoitti ADCC ihmisen PBL efektorisoluina. Effects of anti-CD44R1 mAb mahdollisuuksista ottaa hyaluronaattiin nyt tutkittavana; olemme kuitenkin jo vahvistaneet, että GV5 voivat aiheuttaa sisäistämisen CD44R1 solun pinnalta, mikä viittaa mahdollisia vaikutuksia sisällyttämistä hyaluronaattiin ja lisätyn anti-kasvain vaikutus tämän mAb lisäksi ADCCaktiivisuudessa.

Äskettäin erityisiä kimeeriset tai humanisoidut mAb vastaan ​​solunulkoisten domeenien HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] ja CD20 [36] – [38] on otettu käyttöön rintasyövän hoitoon, peräsuolen syöpä tai B solusyöpiä, vastaavasti. Vaikka vaiheen I kliinisissä kokeissa anti-CD44v6 kimeeristä mAb vastaan ​​okasolusyöpää on äskettäin tehty [39] – [41], vakava iho-oireita havaittiin luultavasti siksi sitoutumaan CD44v6 iholle keratinosyyttien [39], [40]. Tässä yhteydessä reaktiivisuus GV5 Ihmisen normaalin ihon keratinosyyttejä oli negatiivinen tai vähäinen (Fig. 3A), mikä viittaa alhainen iho-oireita meidän anti-CD44R1 (V8) kokonaan ihmisen mAb.

Kertyneet näyttö on osoittanut, että CD44 on tyypillisesti ilmaistaan ​​CSCS eri kudoksista peräisin [11] – [16]. Nyt keskittää huomiomme CD44v (CD44R1), mutta ei CD44s ilmaista pinnalla CSCS syövän vaiheessa alueella mahalaukun adenokarsinoomat

K19-Wnt1 /C2mE

siirtogeenisiä hiiriä [9], [10]. Reaktiivisuus GV5 kanssa ME180 tai HSC-3 näytti varsin heterogeeninen; kuitenkin, kasvaimen muodostuminen tai kasvaimen kasvu oli lähes kokonaan estää GV5, mikä viittaa siihen, että CSCS koostuvat pääasiassa GV5-reaktiivisen CD44R1

korkea soluja, mutta ei GV5-reagoimattomia CD44R1

alhainen soluja. Tässä yhteydessä meidän tuoreet tiedot ovat osoittaneet, että ilmaus CD44R1 ja sen yhdessä XCT kysteiini-glutamaatti antiporter, kevyen ketjun alayksikköä CD98 onkoproteiinia [10], [23], [30] – [32], [42 ], [43], estää reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) aiheuttaman stressin signalointi joka johtaa kasvun pysähtymisen, solujen erilaistumista ja vanhenemista, ja siten edistää syöpäsolujen lisääntymistä ja muodostumista tappava ruoansulatuskanavan kasvaimet [44]. Koska CD44R1 ilmentävä CSCS keskeisessä asemassa vastustuskykyä syöpähoidon olisi oletettu, että terapeuttinen mAb voisi kohdistaa CD44R1

korkealla solupopulaatio syöpää.

Nykyinen analyysit osoittavat selvästi, että syövän hoito anti-CD44R1 täysin humaaneja mAb on lupaava, erityisesti sellaisten erilaisten ihmisen epiteelisyöpien, kuten adenokarsinoomat rinta-, maha- ja paksusuoli, siirtymäkauden cell carcinoma virtsarakon ja munuaisten karsinooma, lisäksi okasolusyöpää eri kehon alueilla.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja solu- viljelyolosuhteissa

Solulinjat ihmisen kurkunpään syöpä (ca) (HSC-3), rinta ca (BT20, SK-Br-3) , mahalaukun ca (GAS-1, MKN-7, MKN-28, KATOIII), peräsuolen ca (LS-174T, HCT116), kohdunkaulan ca (ME180, HeLa-S), munuaisten ca (KPK-1, TOS-1 ), virtsarakon ca (KU-1), melanooma (SK-Mel-37), osteosarkooma (U-2OS), sikiön suolen (Int407) ja rotan hepatoomasolulinjassa (RH7777; jalomielinen lahjoitus Tanabe Mitsubishi Pharm.) viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 7% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) kosteutetussa inkubaattorissa (5% CO

2) 37 ° C. GAS-1, MKN-28 tai TOS-1 vastaavasti saatu Kotanagi H (Akita University), Japani Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank tai Satoh M (Tohoku University). T-solu-leukemiat (Jurkat, Molt-4), B-solu-leukemia (Daudi), promyelosyyttinen leukemia (HL60) ihmisestä peräisin ihmisen PBL kanssa tai ilman rekombinantin ihmisen interleukiini 2 (IL-2, 100 IU, Shionogi Co . Ltd., Osaka, Japani) ja hiiren pernasoluja IL-2 (100 IU) ja ADCC, hiiren myeloomat (SP2, X63) ja vakiintuneita hybridooma- soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (RPMI; Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 7% lämmöllä inaktivoitua FBS olosuhteissa edellä. Saada aktivoitu ihmisen lymfosyyteissä FCM, PBL-soluja viljeltiin myös ja stimuloitiin IL-2 (100 IU), 48 h tai 12

O

-tetradecanoylphorbol-13-asetaattia (TPA, 20 ng /ml; Sigma -Aldrich) plus Ca ionoforia (A23187, 0,3 uM; Calbiochem, La Jolla, CA, USA) 24 tunnin RPMI 7% FBS. HUVEC (Takara Bio Inc., Otsu, Japani) ylläpidettiin EGM-2 väliaine (Lonza, Walkersville, MO, USA) ja käytetään kolmas-viides kohtia. NHEK (Takara Bio Inc.) viljeltiin HuMedia-KG2 (Lonza) ja käytetään Kolmanteen neljännekseen kohtia. HEK293F ihmisen alkion munuaissoluissa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja ihmisen orvaskeden keratinosyyttien peräisin oleva solulinja (EK325) perustettu yhteyttä viljeltiin FreeStyle293 ilmentymisen väliaineessa (Invitrogen), kosteutetussa inkubaattorissa (5% CO

2 ). GFP geneettisesti fuusioitu sytoplasmisen karboksyylipäähän ihmisen CD44s tai CD44R1 on pAcGFP ekspressiovektoriin (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA), ja HEK293F ja RH7777-solut vastaavasti transfektoitiin näillä CD44-GFP plasmidien 293fectin (Invitrogen) tai Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden valittu kulttuuri media, joka sisältää G418 (Nacalai Tesque, Kioto, Japani) laimennettuna 400 ug /ml, ja klooni-lajitellaan solujen vihreän fluoresenssin käyttäen JSAN -solulajittelijalla (Bay Bioscience, Kobe, Japani). Nämä perustettu HEK293F ja RH7777, jotka ilmentävät CD44-GFP-proteiinien pidettiin FreeStyle293 ilmentymisen alustassa G418: aa (400 ug /ml). -Solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ellei toisin mainita. Useimmat solulinjat sisältävät HSC-3 mainittiin muualla [45].

Olemassa terapeuttisia monoklonaalisia vasta

Anti-HER1 kimeerinen Setuksimabia (MerckSerono, Rockland, MA, USA), anti-HER2 humanisoitu Trastutsumabi ja anti-CD20 Rituksimabi (Roche-Chugai, Tokio, Japani) käytettiin värjäytymisen ihmisen soluja tai kudoksia.

valmistaminen rekombinantti täysin ihmisen IgG1-mAb tunnustetaan CD44R1

MV1, MV2, MV3, MV4 ja MV5 kokonaan ihmisperäisen IgM mAb valmistettiin solufuusio välillä pernasolut Kirin-Medarex (KM) hiiriä (22) immunisoitu rekombinanttisen Δex5-v8-v9-v10-Δex16 (R1a) proteiini (8) fuusioitu glutationi S-transferaasi (GST) ja SP2 hiiren myeloomasolut. Menettely Solufuuusiota ja perustamalla hybridoomien tehtiin kuten seuraavassa osassa. Vuonna R1a rekombinanttiproteiineja, Δex5 tai Δex16 vastaavasti vastaa osittaisen lyhyen peptidin (Δex5, 19 aminohappoa; Δex16, 8 aminohappoa) vieressä V8 tai V10. Käänteistranskriptoidaan cDNA vaihtelevan alueen raskas- ja kevytketjujen, joka kloonattiin kokonais-RNA: erittävien hybridoomasolujen IgM (μ, κ ihmisen mAb vastaan ​​CD44R1 (MV5), oli geneettisesti muokattava cDNA ihmisen IgG1: n (γ1, κ