Krooninen sairaus

tiivistelmä

alas-säätely mikroRNA-196b (miR-196b) on raportoitu, mutta sen osuus kohdunkaulan syövän etenemistä vielä tutkittava. Tässä tutkimuksessa ensin osoitettiin, että miR-196b alassäätöä oli merkitsevästi yhteydessä huonompi tautivapaan elinajan (DFS) kohdunkaulan syövän hoidetuilla potilailla yhdistetyn Kemoterapia. Toiseksi, käyttämällä tri-modaalinen lähestymistapaa tavoite tunnistamista, olemme päättäneet, että homeobox-B7 (HOXB7) oli

bona fide

kohde miR-196b, ja puolestaan ​​endoteelikasvutekijä (VEGF) oli alavirtaan transkripti säätelee HOXB7. Ennastus miR-196b ilmentymistä lyhytaikaisella transfektiolla johti alentuneeseen solujen kasvua, kyky muodostaa klooneja, muuttoliike ja invaasio

in vitro

sekä vähensi kasvainten angiogeneesin ja kasvainsoluproliferaation

in vivo

. Yhtäpitävästi, siRNA knockdovvn HOXB7 tai VEGF phenocopied biologiset vaikutukset miR-196b yli-ilmentyminen. Meidän havainnot ovat osoittaneet, että miR-196b /HOXB7 /VEGF-reitin tärkeä rooli kohdunkaulan syövän etenemisen; joten kohdistaminen tämän reitin voisi olla lupaava terapeuttinen strategia tulevaisuuden hallintaan tämän taudin.

Citation: Miten C, Hui ABY Alajez NM, Shi W, Boutros PC, Clarke BA, et al. (2013) MicroRNA-196b Säätelee Homeobox B7-endoteelikasvutekijä Akseli Kohdunkaulan syöpä. PLoS ONE 8 (7): e67846. doi: 10,1371 /journal.pone.0067846

Editor: Rolf Müller, Philipps University, Saksa

vastaanotettu: 11 tammikuu 2013; Hyväksytty: 21 toukokuu 2013; Julkaistu: 04 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Miten et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Ontario Institute for Cancer Research (Grant Number: 10NOV-399). Christine Miten on CIHR strateginen koulutus Fellow Excellence in Radiation Research for the 21st Century (EIRR21) Program, ja tukee Lawrence, Ila ja William Gifford stipendirahastossa. Tuki on myös päässä Campbell Family Institute for Cancer Research ja terveysministeriön ja pitkän aikavälin suunnittelua. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailmanlaajuisesti kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi eniten diagnosoitu maligniteetti ja neljänneksi suurin syy syövän kuolleisuus naisilla, arviolta 530,000 uutta tapausta ja 275000 kuolemantapausta vuosittain [1]. Vaikka kohdunkaulan syövän ilmaantuvuus ja kuolleisuus ovat vähentyneet viimeisten kolmenkymmenen vuoden Yhdysvalloissa [2], 5 vuoden pysyvyys on pysynyt alle 40% potilaista on diagnosoitu vaiheen III tai IV sairaus [3]. Novel oivalluksia tarvitaan paremmin ymmärtää mekanismit, jotka edistävät taudin etenemistä, jotta suunnitella parannettu hoitoja potilaille, joilla on paikallisesti edennyt kohdunkaulansyöpä.

Micro-RNA: t (miRNA) ovat lyhyitä, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geeniekspression transkription jälkeen [4], [5], ja poikkeava miRNA ilmentyminen on osoitettu olevan tärkeitä monissa ihmisen maligniteettien [6]. Gene tavoitteet, jotka edistävät kasvaimen etenemistä on kuvattu useita miRNA [7], [8], [9]; kuitenkin, biologista funktiota enemmistön miRNA edelleen tuntematon. Yksi suurimmista haasteista miRNA kohde tunnistaminen on kyky miRNA sitoutua mRNA tavoitteita epätäydellinen täydentävät; joten yksittäinen miRNA voi mahdollisesti säädellä useita satoja tai tuhansia geenejä [10]. Valitettavasti tällä hetkellä saatavilla

in silico

miRNA tavoite Ennustusalgoritmien on korkea vääriä löytö ja väärien negatiivisten hinnat [11], [12]; Näin Valtuutusmenettelyistä kokeellinen validointi miRNA tavoitteita.

Down-regulation of miR-196b kohdunkaulan syöpä on aikaisemmin raportoitu [13], mutta sen rooli syövän etenemisen tätä tautia ei ole aiemmin tutkittu. Tässä raportoimme alas-säätely miR-196b primaarisissa ihmisen kohdunkaulan syövän kudoksissa ja solulinjoissa. Lisäksi olemme tunnistaneet HOXB7 transkriptiotekijä uutena, suora ja konkreettinen tavoite miR-196b, joka puolestaan ​​säätelee VEGF kohdunkaulan syövän. Tärkeintä on, miR-196b alassäätöä liittyi huonompi DFS hoidetuilla potilailla Kemoterapia, korostaen biologinen merkitys miR-196b kohdunkaulan syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Kirjallinen suostumus saatiin potilailta, protokollan mukaisesti hyväksytty tähän yliopiston tutkimuksessa Health Network Research Ethics Board. Kokeet eläimillä suoritettiin tiukasti pöytäkirjan mukaisesti hyväksymän Animal Care Committee (ACC) Ontario Cancer Institute, University Health Network (Animal Käyttö Protocol: 342,18).

Solulinjat ja transfektoinneilla

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat (ME-180, SiHa ja HT-3) saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä kasvatettiin α-MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kaikki solut todennettu puolivuosittain Centre for Applied Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada) käyttämällä AmpF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), ja sen määritettiin olevan vapaita

Mycoplasma

saastuminen käyttämällä MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza). ME-180 ja SiHa solut transfektoitiin käyttäen LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) eteenpäin transfektioprotokolla, mukaan valmistajan ohjeiden. Pre-miR Negative Control # 1 (NC), pre-miR-196b (Ambion), All Stars negatiivinen kontrolli (siNEG), siHOXB7 ja siVEGF (Qiagen) olivat kaikki transfektoitiin loppukonsentraatioon 30 nmol /l.

miRNA Expression profilointi Cell Lines

Kokonais-RNA eristettiin SiHa-, ME-180 ja HT3 kohdunkaulan syövän solulinjoissa käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. FirstChoice® Total RNA: Ihmisen normaali kohdunkaula Tissue (Ambion) 3 eri kudoksesta luovuttajia käytettiin normaalisti vertailuvalmisteita. Ekspressiotasot 377 miRNA ja 3 snoRNAs (valvonta) analysoitiin kohdunkaulan syövän solulinjoista ja normaali kohdunkaulan kudoksissa käyttäen TaqMan® Low Density Array (TLDA) Human MicroRNA Panel (Applied Biosystems), jossa Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR järjestelmä, kuten olemme aiemmin kuvattu [14].

miRNA Expression profilointi Potilaan kudoksia

Flash-pakastetut punch koepaloja saatiin potilailta, joilla on paikallisesti edennyt kohdunkaulansyöpä, jotka oli tarkoitus saada mekaanisesti standardin kemoterapia, joka koostuu ulkoisen säteen sädehoito ensisijaisen kohdunkaulan kasvainta ja lantion imusolmukkeiden (45-50 Gy yhteensä 1,8-to-2-Gy päivittäin fraktiot 18-to-25-MV fotonit), yhdistetyt viikoittain annoksia sisplatiinia (40 mg /m

2 yhteensä 5 annosta). FIGO (International Federation of gynekologien ja synnytyslääkärit) lavastus määritettiin käyttäen yhdistelmää: esikäsittely arviointi nukutuksessa, tietokonetomografia (CT) skannaa vatsan ja lantion, rintakehän röntgen-, ja magneettikuvaus (MRI) lantion. MRI käytettiin myös määrittämään imusolmuke asema; lantion ja para-aortan imusolmukkeiden luokiteltiin positiivisiksi etäpesäkkeitä jos MRI lyhyen akselin ulottuvuus oli 1 cm ja moniselitteisiä jos se oli 8-10 mm. Sen jälkeen koepala, näytteet sijoitettiin optimaalinen leikkaamiseen lämpötila (MMA) tallennusväline histopatologinen tutkimus, sitten flash-jäädytettiin nestetypessä. H 70% kasvainsoluja katsottiin lisäanalyysiä varten (n = 79). Kliinistä ominaisuuksien on 79 potilaille annetaan taulukossa 1. mediaani seuranta-aika Kohortin oli 3 vuotta. Flash-jäädytetty normaalia kohdunkaula kudoksista saatuja 11 potilasta, joille tehtiin kohdunpoisto hyvänlaatuisen syitä saatavilla normaalisti vertailuvalmisteita.

Kaksi kohdat 50 mikronin paksuus leikattiin MMA-sulautettujen flash-jäädytetty kudoksia ja sijoitettiin joka nukleaasitonta microtube. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Norgen kokonais-RNA Purification Kit (Norgen Biotek), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Global miRNA ilmentyminen mitattiin kohdunkaulan syövän ja normaali kohdunkaulan kudosten kanssa TaqMan® Low Density Array (TLDA) Human MicroRNA array v2.0 (Applied Biosystems) käyttäen Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System, kuten on jo kuvattu [14 ].

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR analyysi miRNA ja mRNA: iden

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä kokonais-RNA Purification Kit (Norgen Biotek), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ekspression miR-196b mitattiin kvantitatiivisella reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) käyttäen standardi TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Lyhyesti, RNA oli ensimmäinen käänteistranskriptio käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (RT) Kit ja varsi-silmukka-spesifinen aluke miR-196b (Applied Biosystems) [15]. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskettaessa suhteelliset tasot miR-196b ilmentyminen, käyttäen RNU44 referenssinä geenin [16].

RT-tuotteet monistettiin miR-196b-spesifisiä alukkeita, kuten olemme aiemmin on kuvattu [14]. Ilmentymistasojen aikaisemmin on kuvattu (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1), ja ehdokas mRNA tavoitteet miR-196b (ANKHD1, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140), ja HOXB7 (VEGF, Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) mitattiin myös qRT-PCR: llä. Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja PCR-alukkeet (taulukko S1) on suunniteltu käyttäen Primer 3 Input. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskettaessa suhteellisia tasoja geeni-ilmentymisen, jossa GAPDH viitteenä geenin [16].

elinkykyyn, lisääntyminen ja pesäkkeitä muodostavat määritykset

elinkelpoisuus transfektoitujen solujen arvioi trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. ME-180 ja SiHa-solut transfektoitiin kolmena rinnakkaisena 30 nmol /l pre-miR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF tai siNEG ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä, värjättiin trypaanisinisellä ja laskettiin hemosytometrillä. Soluproliferaatiota tutkittiin käyttämällä CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS-määritys) (Promega Biosciences), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pesäkkeiden muodostumisen määritykset, solut transfektoitiin 30 nmol /l pre-miR-196b, Pre-miR Negative Control # 1, siHOXB7, siVEGF tai siNEG ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 48 tuntia transfektion jälkeen, solut ympättiin uudelleen alhaisella tiheydellä 6-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 10-12päivä, sitten kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 50% metanolia. Pesäkkeiden lukumäärä, jotka sisältävät vähintään 50 solua laskettiin, ja eloonjääntifraktio laskettiin vertaamalla transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli.

Cell Migration ja Invasion Analyysit

BD BioCoat matrigeelin Invasion Chambers ja ohjaus insertit (BD Biosciences) käytettiin määrityksen maahanmuuttoa ja invaasion transfektoitujen solujen. Chambers sisälsi polyetyleenitereftalaatti kalvo 8 um huokosia. ME-180 ja SiHa-solut transfektoitiin 30 nmol /l pre-miR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF tai siNEG ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 24 tuntia transfektion jälkeen, 1,5 x 10

5-solut ympättiin uudelleen jokaisen sisällä kammio alustassa, joka sisälsi alhaisen seerumin (1% FBS). Kammiot asetettiin 24-kuoppalevylle, jossa korkea seerumin (20% FBS) väliaine kussakin alemman kammion palvelemaan chemo-houkutinta. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 48 tuntia, sitten kalvot pestiin, värjättiin, ja asennettu dioja. Kevyt mikroskooppia käytettiin laskemaan määrä vaeltavia tai tunkeutuvat soluihin. Kulkeutuminen suhteessa laskettiin vertaamalla solujen, jotka oli transfektoitu negatiivisena kontrollina. Prosentuaalinen invaasio laskettiin solujen määrän, jotka tunkeutuivat läpi Matrigel insertin, jaettuna solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat tarkastusalueen läpi insertin.

Cell Cycle Analysis

Solusyklianalyysiä suoritettiin ME-180 ja SiHa solujen transfektion jälkeen 30 nmol /l pre-miR-196b tai NC, mitata osa solujen osa-G

1 vaihe solusyklin. Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa FACS-puskurissa (PBS /0,5% BSA), suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan FACS-puskuria, kiinnitettiin sitten 1 ml: ssa jääkylmää 70% etanolia. 1 h kuluttua inkuboinnin jäissä, solut pestiin uudelleen ja suspendoidaan uudelleen 500 ul: aan FACS-puskuria, joka sisälsi 40 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma) ja 50 ug /ml propidiumjodidia, sitten inkuboitiin pimeässä huoneen lämpötilassa 30 minuutit. Solut analysoitiin BD FACScalibur (Becton Dickinson) käyttäen FL-2A ja FL-2W kanavia. Virtaussytometria Aineisto analysoitiin FlowJo 7.5 ohjelmistoa (Puu Star).

In vivo kokeet

Kuudesta 8 viikon ikäisten sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) naarashiirtä hyödynnetty ksenografti kokeet, mukaan suuntaviivoja Animal Care komitea, Ontario Cancer Institute, University Health Network. Solut transfektoitiin pre-miR-196b tai NC, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. 48 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja 5 x 10

5 elävät solut laimennettiin 100 ul: aan elatusainetta. Solut injektoitiin lihaksensisäisesti vasempaan kaksoiskantalihas naisten SCID-hiirissä. Kasvain ja jalka halkaisija mitattiin kaksi kertaa viikossa ja hiiret tapettiin, kun tämä 15 mm saavutettiin. Kasvaimet poistettiin 25 päivää istutuksen jälkeen, ja välittömästi kiinnitettiin 10% puskuroidussa formaliinissa 24 tunnin ajan, asetettiin 70%: sta etanolia 24 tuntia, upotettiin parafiiniin, ja leikattiin (5 uM) ja immunovärjäyksellä. Lisäksi hematoksyliinillä ja eosiinilla (H ii) mRNA: t sääteli vähintään 2-kertaisesti kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna normaaliin kohdunkaula kudoksiin käyttämällä kahta itsenäistä julkisesti saatavilla mikrosirujen aineistoja [17], [18]; ja iii) mRNA: t alassäädetty ainakin 0,5-kertainen sekä 24 ja 72 tuntia transfektion jälkeen 30 nmol /l pre-miR-196b, jossa transkriptio mitattiin käyttäen kaikkiaan Human Genome 4 × 44 K Yhden Color Array (Agilent).

Luciferase Reporter Assay

villityypin tai mutantti-fragmenttien 3′-transloimaton alue (UTR) ja HOXB7 sisältävät ennustettu sitoutumiskohta (asema 220-226) ja miR-196b yksilöllisesti monistettiin AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) käyttäen alukkeita taulukossa S1. PCR-tuotteet puhdistettiin, kloonattiin sitten alavirtaan Firefly

lusiferaasin

geenin pMIR-REPORT vektorin (Ambion) on

Spel

I ja

Hind

III restriktiokohtia , tuottaa pMIR-HOXB7 tai pMIR-HOXB7-mut vektori. ME-180 ja SiHa-solut kotransfektoitiin 100 nmol /l pre-miR-196b tai NC, ja 100 ng reportteri vektorin kohteisiin. Koska viittaus ohjaus, 50 ng PRL-SV vektorin (Promega), joka sisältää

Renilla lusiferaasi

geeni transfektoitiin myös jokaisen kunnossa. Firefly ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 24 tuntia transfektion käyttäen Dual-Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden.

Immunoblottausmääritys

Solut transfektoitiin joko 100 nmol /l pre-miR-196b tai NC, ja kokonaisproteiinin uutteet korjattu jäillä jälkeen 48 ja 72 tuntia. Kiinnostavia proteiineja koetettiin kanin anti-HOXB7 (1:500 laimennus; Invitrogen) tai hiiren anti-GAPDH (1:10,000 laimennos, Sigma), ja havaittiin IRDye fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineita (1:20,000 laimennus, LI-COR). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Immunoblotit skannattiin ja mittaamaan Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

Enzyme immunosorbenttimääritys (ELISA) B

Solut transfektoitiin 30 nmol /l siHOXB7 tai siNEG, ja taso eritetyn VEGF mitattiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen käyttäen ihmisen VEGF DuoSet ELISA: lla (R 0,001; kuva 1A). Tärkeää on, potilailla, joilla on vähemmän kuin mediaani miR-196b ilmentymisen tason aikaan diagnoosi kokenut huonompi DFS verrattuna niihin, joilla on korkeampi miR-196b lauseke (

P

= 0.02; riskisuhde = 0,39; Fig. 1 B). miR-196b ilmentyminen ei korreloi merkitsevästi kasvaimen kokoa (

P

= 0,12), FIGO vaiheessa (

P

= 0,14), tai imusolmukestatuksesta (

P

= 0,60 ). Global miRNA ilme profilointi toteutettiin kolmella kohdunkaulan syövän solulinjoissa (ME-180, SiHa ja HT-3) vahvisti myös alas-säätely miR-196b kohdunkaulan syöpä. Vuodesta 55 miRNA joka vapautui vähintään 2-kertainen kaikissa kolmessa solulinjoissa verrattuna 3 normaaliin kohdunkaula kudoksissa, miR-196b oli yksi merkittävimmin alassäädetty miRNA (Fig. 1 C), sopusoinnussa aiemmin julkaistu miRNA ilmaisun profilointi tutkimuksessa [13].

A) miR-196b ekspressiotasot mitattiin qRT-PCR 79 ensisijainen kohdunkaulan syövän näytteitä, verrattuna 11 normaaliin kohdunkaula epiteelikudosta valvontaa. B) Kaplan-Meier analyysi DFS potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä. Punainen, potilailla, joilla on korkeampi kuin mediaani miR-196b ekspressiotason (n = 39); sininen, potilailla, joilla on vähemmän kuin mediaani miR-196b lauseke (n = 39); yksi potilas poistettiin selviytyminen analyysin puuttuvien selviytymisen tietoja. C) Basal tasot miR-196b kolmella kohdunkaulan syövän solulinjat (SiHa-, ME-180, ja HT-3), verrattuna normaaliin kohdunkaula epiteelikudosten, määritettiin qRT-PCR: llä. **

P

0,01.

Tutkitaan onko miR-196b alassäätöä oli epigeneettiseltä määritettiin lisäksi kromosomi menetystä [19], ME-180 ja SiHa solujen käsiteltiin demetyloiva aineen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-DCT). Tämä hoito aiheutti ainoastaan ​​minimaalisen kasvun miR-196 b ilmaisu, joka osoittaa, että promoottori metylaatio oli tuskin olla merkittävä mekanismi miR-196b ali-ilmentyminen (kuvio. S1A). Lisäksi tarkastelu julkisesti saatavista microarray aineistoja geenien ilmentymisen ensisijainen kohdunkaulan syövän kudoksissa ei havaittu merkittäviä muutoksia ilmaisua Dicer, drosha, DGCR8, Exportin-5, tai alayksiköiden RNA Polymerase II, jotka kaikki osallistuvat miRNA biogeneesissä ja käsittelyä (aineistoa ei esitetty).

miR-196b Over-ilmaisun vähensi elinkykyyn, kyky muodostaa klooneja, leviämisen ja invaasion

arvioimiseksi biologisen merkityksen miR-196b alassäätöä solut transfektoitiin 30 nmol /l NC tai pre-miR-196b. Up-regulation miR-196b ilmentymistä ennallaan jopa 72 tuntia transfektion jälkeen (kuvio. S1B). Transfektio ennalta miR-196b johti merkittävästi vähentynyt solujen elinkelpoisuuden kontrolleihin verrattuna 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen (ME-180:25% 48 h, 41% 72 h, SiHa: 29% 48 h; 54 % 72 h) (Fig. 2A). Lisäksi miR-196b yli ilmentyminen johti merkittävästi vähentää kyky muodostaa klooneja (ME-180:57% verrattuna NC, SiHa: 64% verrattuna NC) (Fig. 2B), lisääntymistä (ME-180:36% 48 h , 35% 72 tunnin, SiHa: 22% 48 h; 21% 72 h) (Fig. 2C), ja muuttoliike (32% verrattuna NC), plus invaasio (32%

vs

. 63% NC) (Fig. 2D). Soluja käsiteltiin valmiiksi miR-196b osoittaneet pientä, mutta ei tilastollisesti merkitsevä, kasvu solujen prosenttiosuus sub G

1 väestö, mukana pieni lasku G

0-G

1 väestöstä (Fig. S1C).

A) suhteellinen kannattavuus ME-180 ja SiHa solut arvioitiin 48 ja 72 tuntia transfektion ennalta miR-196b (30 nmol /l), verrattuna Negative Control pre-miR (30 nmol /l), käyttäen Trypan Blue-määritystä. B) kyky muodostaa klooneja ME-180 ja SiHa solut arvioitiin transfektiolla 30 nmol /l valmiiksi miR 196b tai Negative Control valmiiksi miR. 48 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin sitten laskettiin ja uudelleen ympättiin alhainen tiheys 6-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen, kun 10 päivää inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin, ja pesäkkeiden lukumäärä ( 50 solua) laskettiin. C) Suhteellinen leviämisen ME-180 ja SiHa-soluja tutkittiin 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ennalta miR-196b (30 nmol /l), kun negatiivinen kontrolli ennalta miR (30 nmol /l) käyttäen MTS-määritystä. D) Kuvat ovat (vasemmalla) ja histogrammit (oikealla) kuvaa leviämiskyky (ylhäällä) ja invasiivisuus (alhaalla) ME-180-solut, jotka oli transfektoitu 30 nmol /l valmiiksi miR 196b tai Negative Control valmiiksi miR, kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, sitten laskettiin ja uudelleen kylvetään hyökkäystä kammioissa. Solujen vaeltamiseen (ylhäällä), ja invaasio (alhaalla), arvioitiin 48 tunnin kuluttua kylvö sisään Transvvell- kammioissa. Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. NC, pre-miR Negative Control; *

P

0,05; **

P

0,01.

miR-196b Over Expression Tukahdetut tuumoriangiogeneesissa ja kasvainsoluproliferaation in vivo

transfektoituja soluja pre-miR-196b ei osoittanut tilastollisesti merkitsevää eroa kasvaimen kasvu hiirillä, verrattuna NC-käsitellyt solut (Fig. S2). Klo 25 vuorokauden kuluttua implantaatiosta kuitenkin CD31 Immunovärjäys kuitenkin havaittiin alennetaan 69% pre-miR-196b-käsiteltyjen kasvainten verrattuna hallita kasvaimia (Fig. S3, ylhäällä). Lisäksi tämä liittyi vaatimaton mutta vähentää merkittävästi Ki-67 lauseke (46%

vs

. 53% käsiteltyjä soluja NC) (Fig. S3, keskellä), ja pieni, mutta ei tilastollisesti merkittävä kasvu TUNEL värjäytymistä (kuvio. S3, alhaalla). Siksi meidän tiedot osoittivat, että pre-miR-196b osaltaan pienentää angiogeneesin ja kasvaimen solujen lisääntymistä.

miR-196b Suoraan tavoitteet HOXB7

alas-säätely miR-196b kohdunkaulan syövän kudoksissa ja solulinjat, ja merkittävät fenotyyppivaikutukset Mir-196b yliekspressio sekä

in vitro

ja

in vivo

, osoitti että miR-196b näyttää olevan tärkeä välittäjä kohdunkaulan syövän etenemisen . Siten tri kulkumuodon strategia [8] käytettiin tunnistamaan mahdolliset mRNA tavoitteet, jotka voisivat selittää näiden fenotyyppisten muutosten (Fig. S4). Tämä menetelmä tunnistaa 15 päällekkäisten Ehdokaskohteiden (ANKHD1, CALM3, CLK2, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PCCB, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140). Kohde validointi, ME-180-solut transfektoitiin valmiiksi miR-196b tai NC, ja transkriptipitoisuuksissa 24 tuntia transfektion mitattiin qRT-PCR 12 Ehdokaskohteiden (sopivia alukkeita ei olla suunniteltu muiden 3 selostukset ), plus 4 aikaisemmin kuvatut tavoitteet miR-196b (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1). Mikään edellä kuvatut tavoitteet muuttunut merkittävästi sen jälkeen, kun miR-196b over-ilmentyminen (kuvio S5a). Vain 5 12 testattujen Ehdokaskohteiden olivat merkittävästi alassäädetty jälkeen miR-196b over-ilmentyminen (kuvio. S5B); HOXB7 valittiin edelleen toiminnallisia arviointia, koska se oli ehdokas tavoite, jotka osoittivat korkeimman tason alassäätöä (40% verrattuna kontrolleihin). Lisäksi HOXB7 on jäsenenä

Hox

geeni klusterin, perheen geenejä, jotka on raportoitu väärin säädellystä eri pahanlaatuisia kasvaimia [20], ja miR-196 perheen tiedetään kohdistaa nisäkkäiden

Hox

geenejä [21].

lusiferaasin sitoutumismääritys vahvisti, että miR-196b välittömästi ja nimenomaisesti vuorovaikutuksessa 3′-UTR HOXB7. Verrattuna kontrollisoluihin, jotka on transfektoitu pMIR-REPORT, transfektoidut solut pMIR-HOXB7 oli vähentynyt lusiferaasiaktiivisuutta (ME-180:68%, SiHa: 71%), kun ko-transfektoitiin pre-miR-196b (Fig. 3A). Tämä inhiboiva vaikutus oli täysin kumotaan pMIR-HOXB7-mut, joka sisälsi mutaation miR-196b sitoutumiskohdan. Lisäksi transfektio ennalta miR-196b tuloksena merkittävästi vähentää HOXB7 mRNA-transkripti (ME-180:49% 48 h, 62% 72 h, SiHa: 55% 48 h, 69% 72 h) (kuvio . 3B), ja proteiini (74%: 48 h, 80% 72 h) (Fig. 3C) tasot 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen. Ei näyttänyt olevan suurempi kertainen muutos HOXB7 mRNA-tasolla verrattuna proteiiniin, joka ei ole yllättävää, koska miRNA vuorovaikutuksessa suoraan mRNA-transkriptien ja ei-proteiineja. Lisäksi proteiini käännös voidaan vaikuttaa useilla mekanismeilla, joita esiintyy ylävirtaan, kuten tumasta RNA-transkriptien ja rekrytointi ribosomaalisten alayksiköiden.

A) suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ME-180 tai SiHa solujen 24 tunnin kuluttua kotransfektion pMIR-REPORT, pMIR-HOXB7 tai pMIR-HOXB7-mut vektoreita ja pre-miR-196b tai NC (30 nmol /l). B) Suhteellinen HOXB7 mRNA: n ekspression tasojen ME-180 tai SiHa-soluissa transfektion jälkeen (48 ja 72 tuntia) ja pre-miR-196b tai NC (30 nmol /l), mitattuna qRT-PCR: llä. Ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. C) edustaja Western blot kuva (ylhäällä), ja suhteellinen kvantifiointi HOXB7 proteiinin tasot (alhaalla) transfektion jälkeen (48 ja 72 tuntia) ennalta miR-196b tai NC (30 nmol /l). Kaikki tiedot edustaa keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. OD, optinen tiheys; NC, pre-miR Negative Control; *

P

0,05; **

P

0,01.

VEGF on merkitykselliset Loppupään Tavoite HOXB7

Koska HOXB7 on transkriptiotekijä, oli tarpeen määrittää, mitkä geeni (t) säätelee HOXB7 voisi olla merkitystä tässä yhteydessä kohdunkaulan syöpään. Näin ollen, solut transfektoitiin 30 nmol /l siHOXB7 tai siNEG, ja mRNA-tasot tunnettuja HOXB7 tavoitteita, kuten Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, thrombospoindin 2 (THBS2) ja VEGF: n [22] , [23], [24], [25] mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. VEGF osoitti korkeimman tason alassäätöä (43%) seuraavien HOXB7 taintumisen (Fig. S6A). Yhtäpitävästi, vähennetään merkittävästi VEGF-mRNA: ta (ME-180:63% 48 h, 33% 72 h, SiHa: 69% 48 h, 41% 72 h) (Fig. 4A) ja erittyvä proteiini (ME-180 :82% 48 h, 77% 72 h, SiHa: 84% 48 h, 75% 72 h) (Fig. 4B) tasoja on havaittu sekä 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, jossa siHOXB7, mikä vahvistaa, että VEGF oli todellakin merkityksellinen myötävirtaan HOXB7 tavoite tässä sairaudessa. Lisäksi muita angiogeneesiä tunnettujen tavoitteet HOXB7 (FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) ei muuttunut merkittävästi seuraavien HOXB7 pudotus (kuvio. S6A) tai miR-196b yli-ilmentymisen (Fig. S6E), mikä viittaa siihen, että HOXB7 välitteisen angiogeneesin

kautta

VEGF tässä yhteydessä.

A) Suhteellinen VEGF lauseke mRNA-tasolla transfektion jälkeen ME-180 tai SiHa solujen siHOXB7 tai siNEG (30 nmol /l), määritettynä qRT -PCR. Ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. B) suhteelliset tasot eritetyn VEGF-proteiinin transfektion jälkeen ME-180 tai SiHa solujen siHOXB7 tai siNEG (30 nmol /l), kuten määritettiin ELISA: lla. Kaikki tiedot edustaa keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. siNEG, All Stars Negative Control; *

P

0,05; **

P

0,01.

knockdovvn HOXB7 tai VEGF kertasi Biological Effects havaittu miR-196b Over Expression

Edelleen tukevat tätä vastikään kuvataan polun miR-196b kohdistaminen HOXB7 joka puolestaan ​​säännellään VEGF, ME-180 ja SiHa soluja käsiteltiin siHOXB7 tai siVEGF onko nämä toimet voisivat kerrata vaikutuksia miR-196b yli-ilmentyminen. Knockdovvn HOXB7 ja VEGF otteen ja proteiinin tasot olivat ennallaan jopa 72 tunnin kuluttua siRNA transfektion (Fig. S6b, S6c, ja S6D). Havaitsimme, että solujen elinkelpoisuus väheni merkittävästi transfektion jälkeen joko siHOXB7 (ME-180:77% 48 h, 66% 72 h, SiHa: 80% 48 h, 70% 72 h) (Fig. 5A, vasemman ) tai siVEGF (ME-180:78% 48 h, 60% 72 h, SiHa: 77% 48 h, 68% 72 h) (Fig. 5A, oikealla), on samanlainen kuin havaitut vaikutukset transfektion jälkeen pre-miR-196 b (ME-180:25% 48 h, 41% 72 h, SiHa: 29% 48 h, 54% 72 h) (Fig. 2A). Kyky muodostaa klooneja pieneni merkittävästi seuraavien joko siHOXB7 (ME-180:69%; SiHa: 71%) (kuvio. 5B, vasen) tai siVEGF (ME-180:78%; SiHa: 75%) (kuvio. 5B, oikealla) transfektion, kuten aiemmin havaittu ennalta miR-196b transfektio (ME-180:57% verrattuna NC, SiHa: 64% verrattuna NC) (Fig. 2B).