Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Diklofenaakki on yksi vanhimmista tulehduskipulääkkeitä käytössä. Lisäksi sen inhibition syklo (COX), diklofenaakki estää voimakkaasti fosfolipaasi

2 (PLA

2), jolloin saadaan laajan anti-inflammatorinen vaikutus. Koska tulehdus on tärkeä tekijä kehitettäessä haiman kasvaimia tutkimme mahdollisuuksia diklofenaakin ja estää kasvaimen kasvua hiirillä, jotka inokuloitiin PANCO2 solujen ortotooppisesti.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

Huomasimme, että diklofenaakki hoidon (30 mg /kg /bW 11 päivää) ja hiirillä, jotka inokuloitiin PANC02 soluja, vähensi tuumorin paino 60%, korreloi lisääntynyt kasvainsolujen apoptoosin. Koska tätä vaikutusta ei havaittu

in vitro

viljellyillä PANCO2 soluissa, me teorian, että diklofenaakki hyödyllistä hoitoa mukana muiden välittäjien läsnä

vivo

. Todellakin, diklofenaakki jyrkästi vähentynyt kasvain vascularization mukaan vähen- tämisessä VEGF kasvain ja vatsaonteloon nestettä. Lisäksi diklofenaakki suoraan esti verisuonten itäminen

ex vivo

. Yllättäen toisin kuin muut COX-2-estäjät, diklofenaakki lisääntynyt arginase aktiivisuus /arginase 1 proteiinipitoisuus kasvain stroomasoluilla, peritoneaalimakrofageille ja valkosolujen 2,4, 4,8 ja 2 kertaiseksi. Ehdotamme, että myöhemmät arginiini ehtymisen ja lasku NO tasoilla sekä seerumin ja vatsaonteloon, lisää kasvaimen kasvun inhibitiolle aliravitsemuksesta ja huonosta verisuoniston kehittämiseen.

Päätelmä /merkitys

Yhteenvetona diklofenaakki näkyy voimakas kasvaimia torjuvaa ominaisuuksia haimasyövän malli, joka voi osaltaan edistää hoidon kehittämiseen. Kyky diklofenaakin aiheuttamaan arginase aktiivisuutta kasvaimen strooman peritoneaalimakrofageille ja valkosolujen tarjoaa työkalun tutkia kiistanalainen pro-ja kasvaimen kasvua estävä vaikutus arginiini ehtyminen.

Citation: Mayorek N, Naftali-Shani N, Grunewald M (2010) Diklofenaakki kasvaimen kasvu estyy hiirimallissa haimasyövän mukaan modulaatio VEGF tasot ja Arginase Activity. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10,1371 /journal.pone.0012715

Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 31 tammikuu 2010; Hyväksytty: 06 elokuu 2010; Julkaistu: 15 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Mayorek et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat heprealaisen yliopiston-Hadassah Medical School (avustus # 0463435). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tulehdus on erittäin liittyy sekä syövän synnyn ja etenemisen kasvaimen kasvu [1]. Epidemiologiset tutkimukset osoittavat, että krooninen tulehdus predisposes potilaiden syövän kehitystä ja pitkäaikainen käyttö steroideihin kuulumattomia tulehduskipulääkkeitä (NSAID) vähentää useiden syöpien [2].

syklo (COX-1 ja – 2) ovat nopeutta rajoittavia entsyymejä prostaglandiinien tuotanto (PG) arakidonihaposta.

COX-1 ekspressio on yleensä konstitutiivinen, kun taas COX-2 on yleensä indusoi ärsykkeiden mukana tulehdusreaktioita. Prostaglandiini E2 (PGE2), joka on päämetaboliitti COX-2, on osoitettu edistävät solujen eloonjäämistä, proliferaatiota ja angiogeneesiä ja estää apoptoosin ja antitumor immuunivasteen, kaikki prosessit edistävät syövän kehitystä [3].

Haiman syöpä on tappava sairaus hyvin rajalliset hoitoon. Krooninen haimatulehdus altistaa yksilöt kehittää haiman adenokarsinooma [4] ja haiman tuumori strooman on ominaista eri tulehdussolujen [5] mikä viittaa siihen, tulehduksellisten prosessien tämä syöpä. COX-2-yli-ilmennetään noin 75% ihmisen karsinoomien mukaan lukien haiman. Viimeaikaiset tutkimukset siirtogeenisillä hiirillä [6], [7], [8] ovat osoittaneet, että COX-2 yliekspressio haimassa aiheuttama haimatulehdus-like-tilassa. Puhkeamista syöpä näissä hiirissä estettiin pitämällä hiiret selektiiviset COX-2-estäjät, mikä myös osoittaa merkittävää roolia tulehduksen haimasyövän kehittämiseen.

Human kokeita ehkäistä paksusuolen syöpää äskettäin suoritettiin käyttäen COX 2-inhibiittorit. Vaikka rohkaisevia tuloksia paksusuolen syövän ehkäisyyn ja vähentämiseen ilmaantuvuuden paksusuolen adenoomia, tulehduskipulääkkeiden ja selektiivisten COX-2-estäjät voivat aiheuttaa vakavia sydän- ja mahasuolikanavan haittavaikutusten eikä niitä siksi rutiininomaisesti suositella näiden tautien [9], [10].

diklofenaakki, yksi vanhimmista NSAID on ollut käytössä vuodesta 1976. Diklofenaakki inhiboi syklo ei-valikoivasti. Tutkimukset ihmisillä osoittivat, että se vähentää 94% COX-2 ja 49% COX-1 aktiivisuutta [11]. In vitro se estää voimakkaasti fosfolipaasi A2: n (PLA2) [12], entsyymiä, joka vapauttaa arakidonihappoa ja lysofosfolipidi tuottamaan perheen pro-inflammatoristen eikosanoidien (mukaan lukien PGE2) ja verihiutaleita aktivoivan tekijän. Muita todisteita siitä, että diklofenaakki estää myös PLA2 in

vivo

. PLA2 uskotaan olevan keskeinen rooli ensiaskeleita tulehduksellinen Cascade johtaa akuuttiin haimatulehdukseen [12]. Alustavassa tutkimuksessa [13], jota seurasi useita muita ryhmiä, on osoittanut, että diklofenaakki voi merkittävästi hidastaa akuutin haimatulehduksen aiheuttama endoskooppinen retrogradinen kolangiopankreatikografia.

Kun otetaan diklofenaakin kyky estää voimakkaasti sekä COX-2 ja PLA2 olemme tutkineet sen syövän vastaista potentiaalia hiirimallissa haimasyövän. Kirjoittajat raportoivat, että diklofenaakki hoito aiheuttaa 60%: n lasku kasvaimen koon. Tämä johtuu lisääntynyt kasvainsolujen apoptoosin. Tulosten mukaan tämä vaikutus on epäsuora ja toimii läpi ainakin kaksi mekanismia. Ensimmäinen, diklofenaakki tuottaa merkittävää antiangiogeeninen vaikutus, kuten on osoitettu voimakas väheneminen verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) kasvaimen pitoisuus laski mikroverisuonten tiheys ja morfologisia muutoksia kasvaimen verisuoniin. Toiseksi, diklofenaakki hoito kasvaa merkittävästi arginase aktiivisuutta kasvaimen stroomasoluilla, peritoneaalimakrofageille ja valkosolujen. Tämä on odottamaton havainto, koska COX-2-estäjät oli osoitettu vähentävän kasvaimen kasvua arginase estäminen [14], [15] Tuloksemme ovat sopusoinnussa aiempien tutkimusten, jotka viittaavat kasvaimia torjuvaa [16] ja angiogeneesin vastainen vaikutus [17] arginiinia ehtyminen ja tuetaan varsin kiistanalainen lähestymistapa syöpähoidon tehostamalla arginase toimintaa [18], [19].

Methods

Ethics selvitys

Kokeelliset eläimen menettelyjä hyväksynyt eettinen komitea heprealaisen yliopiston, joka toimii alla valvontaa AAALAC International.

Eläimet ja PANCO2 solulinja

Nainen CB6F1 hiiriä (9-10 viikkoa vanhoja) ja Sprague-Dawley-rottia (200 g) saatiin Harlan, Israel. Nainen CX3CR1

GFP /+ hiirillä [20] oli jalomielinen lahjoitus S. Jung (Rehovot, Israel). Näissä hiirissä GFP toimittaja ohjaa CX3CR1-promoottori. Aktiivisuus tämän kemokiinireseptorin promoottori on rajoitettu mononukleaariset myeloidisoluissa, mukaan lukien kaikki kiertävän CD116

+ monosyyttien, ja on olennaisesti poissa solujen imukudossolulinjasolut. Kaikki kokeet paitsi kokeen esitetty kuvassa S3 suoritettiin käyttäen CB6F1 hiiriä.

PANC02 soluja antelias lahja M Dauer (München, Saksa). Soluja ylläpidettiin RPMI, jossa on 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Orthotopic-syngeenisiä malli haimasyöpä

Hiiret nukutettiin seoksella, jossa oli ketamiini-ksylatsiini. Haima injektoitiin 4 x 10

5 (CB6F1 hiiret) tai 6 x 10

5 (CX3CR1

GFP /+ hiirillä) PANC02 solujen 30 ul: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Hiiret poistettiin kokeesta jos vatsakalvon vuoto epäiltiin. Valeleikatuilla hiiret kävi läpi saman menettelyn injektoitiin 30 ui PBS. Hiiret jaettiin ryhmiin 6-8 eläintä ryhmää kohti. Käsitelty ryhmä sai 30 mg /kg ruumiinpainoa diklofenaakki juomavedessä alkaen päivänä 3 siirrostuksen jälkeen. Annostus laskettiin arvio, että hiiren alkoholijuomien noin 3 ml vettä päivässä. Hiiret tapettiin 14 päivää ymppäyksen jälkeen, ellei toisin mainita.

veren valkosoluja (WBC) valmistelu, VEGF: n ja typpioksidin (NO) pitoisuus otettiin sydämen. Vatsaontelo huuhdottiin 2 ml: lla PBS: ää, jossa oli 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja makrofagien valmistamiseksi, mittaamiseen VEGF: n ja NO: n pitoisuuksia.

vatsakalvon solujen ja vatsakalvon makrofagien eristäminen

vatsakalvon solut saatiin sentrifugoimalla vatsaonteloon huuhtelu. Peritoneaalimakrofageille eristettiin vatsakalvon soluista ero tarttuvuus muovia. Makrofaagit viljeltiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 20 tuntia. Mitata arginase aktiivisuutta, solut pestiin PBS: llä ja liuotettiin 0,1% TritonX100 vedessä 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa.

Kasvaimen homogenaatit

Kasvaimen homogenaatit valmistettiin kasvaimen näytteitä, jotka säilöttiin -80 ° C: ssa, vedessä, joka sisälsi 0,1% Triton X 100 ja proteaasiestäjäseostabletit (Sigma P8340). Homogenaatteja sentrifugoitiin 30 minuuttia 13400 g ja supernatantit käytetään mittaamaan arginase aktiivisuus, arginase 1, sileän lihaksen aktiini ja VEGF sisältöä ja kaspaasi-3 aktivaation.

Luuytimen solut eristäminen

koipiluut ja reisiluu kasvaimen omaavien hiirten poistettiin ja huuhdottiin PBS: llä. Sentrifugoinnin jälkeen talteen otettuja soluja Ficoll-gradientilla 4000 g 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa mononukleaarisia soluja eristettiin PE-konjugoidulla primaari-vasta-ainetta anti-CD 115 ja anti-PE-mikrohelmien (Biolegends). CD-115 positiiviset ja negatiiviset solut analysoitiin arginase toimintaa.

Valkoinen verisolujen eristäminen (WBC) B

WBC eristettiin käyttäen Ficoll tiheysgradienttia (Amersham). WBC jae pestiin solut laskettiin, hajotettiin vedessä, joka sisältää 0,1% Triton X 100 ja analysoitiin arginase 1 valkuaispitoisuus.

aortan rengas itäminen määritys

aortan renkaat valmistettiin rinta aorttoja of Sprague-Dawley-rottia, kuten on kuvattu [21]. Rings upotettiin kollageenigeelissä ja ylläpidetään Bio mpm väliaineessa (Biological Industries, Israel). Käsittely 10pM diklofenaakin aloitettiin yksi päivä sen jälkeen kylvöön ja kesti 5 päivää. Rings kiinnitettiin sitten 4% puskuroituun formaliiniin, värjättiin 0,02% kristalliviolettia absoluuttista etanolia. Itäneet alue arvioitiin käyttäen Image Pro-ohjelman.

kaspaasi-3 aktivaatio

kaspaasi-3-aktivaatio mitattiin kasvaimen homogenaateissa erottamalla ei-pilkottiin ja pilkottiin kaspaasi-3: 20% akryyliamidi SDS-PAGE-elektroforeesilla geelillä ja blottauksella monoklonaalinen anti-kaspaasi-3 (Cell Signaling).

VEGF ja NO-pitoisuus

VEGF pitoisuus mitattiin seerumissa, supernatanttiin vatsaonteloon huuhtelu, kasvaimen homogenaateissa, PANC02 ja viljeltiin makrofagit hiirellä VEGF Quantikine immunomääritys kit (R Sigma ja DNaasia 0,33 mg /ml; Sigma) 45 min 37 ° C: ssa. GFP-positiivisten väestö puhdistettiin nopea solun lajittelua käyttämällä FACS Aria (Becton, Dickinson). Solut laskettiin ja hajotettiin vedessä, joka sisälsi 0,1% Triton X 100, ja analysoitiin arginase 1 proteiinipitoisuus.

PANCO2 solujen kasvu

PANC02 soluja siirrostettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Diklofenaakki (10 tai 50 uM) lisättiin seuraavana päivänä ja sen jälkeen 4 päivän kuluessa, solujen pitoisuus mitattiin käyttäen solujen lisääntymistä Kit (Biological Industries, Israel).

immunohistokemia, TUNEL värjäys ja morfometria

Parafiinisektioista kasvainten värjättiin käyttäen seuraavia primaaristen vasta-aineiden: rotan anti-hiiren F4 /80 (Serotec), monoklonaalinen anti arginase-1 (BD Transduction Laboratories), monoklonaalinen anti-α-sileän lihaksen aktiini (Sigma), monoklonaalisia vasta- Ki 67 (Neomarkers), kanin anti fosfori-histoni H3 (Cell Signaling), kanin anti-VEGF (Calbiochem) ja monoklonaalisia vasta- von Willebrandt tekijä (DACO). (HRP) konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin kromogeeninen havaitsemiseen.

TUNEL värjäys [23] suoritettiin käyttäen in situ solukuoleman havaitseminen kit (Roche).

kvantifiointi immunostaning tietojen suoritettiin joko suuri teho kenttäanalyysiin laskenta vähintään 10 alueilla /slide 4 eri kasvainten jokaisessa ryhmässä tai tuella kuva-analyysi-järjestelmän (Ariol SL-50).

tilastollinen

kaikki tiedot analysoitiin SigmaStat ohjelmisto (Aspire ohjelmisto kansainvälinen). Mann-Whitneyn testiä käytettiin laskettaessa merkittäviä eroja käsittelemättömän ja diklofenaakki käsiteltyjen näytteiden. Arvo p≤0.05 hyväksyttiin merkittävä.

Otoskoko ja toistojen määrä on ilmoitettu legendoja.

Tulokset

Diklofenaakki estää kasvaimen kasvua käytettäessä potilaalle tehdä mallin haimasyövän hiirillä

PANC02 solut injektoidaan hännän haiman. Jälkeen 4 päivää syöpäsolujen muodostivat pieniä kasvaimia on noin 4 mm pitkä. Kasvaimet kehittynyt nopeasti; päivänä 8 he kaksinkertaistui pitkä ja johdonmukaisesti metastasized vatsakalvon alue vatsan viillon suoritetaan kasvaimen istuttamisen jälkeen. Päivänä 14, kasvaimia, jotka kasvoivat paikalla rokotus (ensisijainen kasvaimia), punnitaan 300-500 mg ja olivat erittäin verisuonittuneita. Metastaattisen kasvaimia vatsan leikkaus ja pernassa oli myös merkittävä (kuvio 1A).

Hiiret inokuloitiin 4 × 10

5 PANC02 soluista loppuosan haima. Päivänä 3 inokulaation jälkeen (päivä inokulaation nimettiin päivä 1) hiiret satunnaistettiin käsittelemättömän ja diklofenaakki käsiteltyjen ryhmien (7-8 hiirtä kussakin ryhmässä) ja diklofenaakki 30 mg /kg b.w käsittely aloitettiin. 14. päivänä istutuksen jälkeen hiiret tapettiin ja primaariset ja metastaattiset kasvaimet poistettiin ja punnittiin. A, edustaja valokuvia

in situ

ensisijainen (

ympyrät

) ja etäpesäkkeitä (

nuolet

). Insertit näyttää eristetty ensisijainen kasvaimia. B, keskiarvo ± SE kasvaimen painot 8 käsittelemätöntä ja 7 diklofenaakki hoidetuissa hiirissä * P≤0.01. Edustaja koe neljästä näkyy.

kolme-neljä viikkoa ymppäyksen jälkeen, vatsaonteloon oli täynnä verisiä askites. Lukuisia etäpesäkkeitä löytyivät vatsaonteloon, mukaan lukien imusolmukkeiden ravitsemuskulttuurin radan, ja hiiret alkoivat kuolla. Etäpesäkkeitä maksaan tai keuhkoihin ei havaittu.

Seuraavat kokeet siis lopetettiin päivänä 14 inokulaation jälkeen. Hiiret näytti normaalilta tässä vaiheessa ja ei ollut painonlaskua.

diklofenaakki (30 mg /kg) annettiin päivittäin juomavedessä aloittaen päivänä 3 siirrostuksen jälkeen. Sen vaikutukset tutkittiin 11 päivän kuluttua hoidon. Kuten kuviossa 1B, paino primaarikasvaimen (kasvaa haima) oli merkitsevästi pienempi (60%) on diklofenaakki käsitellyissä hiirissä verrattuna käsittelemättömiin eläimiin. Metastaattinen kasvaimia, jotka kasvoivat vatsan leikkaus myös punnitaan vähemmän diklofenaakki käsitellyissä hiirissä, kaikissa kokeissa, mutta tämä vaikutus ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä.

diklofenaakki lisää kasvainsolujen apoptoosin

in vivo

, mutta ei

in vitro

laski kasvaimen paino havaittu diklofenaakki käsiteltyjen hiirten johti meidät tutkimaan lisääntymistä ja kasvainsolujen apoptoosin.

Kasvaimet värjättiin Ki 67 (läsnä kaikki aktiiviset vaiheet solusyklin: G1, S, G2 ja mitoosi) ja fosfo-histoni H3 (erityinen merkki mitoosi soluja) ei osoittanut mitään eroa käsittelemättömän ja diklofenaakki käsiteltyihin hiiriin, kuvio S1.

kuitenkin, kuten on esitetty kuviossa 2, diklofenaakki-hoito lisäsi apoptoosia 6 kertaiseksi, kuten TUNEL värjäys kasvainten ja kvantifiointi (kuvio 2A). Tätä löydöstä tuki lisäksi tehostettu läsnäolo pilkotun kaspaasi 3 homogenaateissa kasvaimista leikattiin diklofenaakin käsiteltyjen hiirten (kuvio 2B).

A ja B, hiiret ympättiin PANC02 soluja ja käsiteltiin diklofenaakki kuvatun Kuva 1.,

LEF

t, TUNEL värjäys superpositioned yli DAPI värjäystä kiinteiden kasvainten,

oikeus

, keskiarvo ± SE% Tunel positiivista ytimiä pois DAPI värjättyä ytimeksi. Noin 9000 ytimiä kasvaimista 4 käsittelemätöntä ja 4 diklofenaakki käsitellyistä hiiristä laskettiin * P≤0.001. B, kaspaasi-3-aktivaation kasvain homogenaateista 4 käsittelemätöntä ja 3 diklofenaakki käsiteltyjen hiirten mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, yksi kahdesta kokeesta. C, PANC02 (3000 solua /kuoppa) ympättiin 96-NUNC kuoppiin. Päivänä ymppäyksen jälkeen 10 tai 50 uM diklofenaakki lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 4 päivää. Solujen lukumäärä mitattiin käyttäen Cell Proliferation Kit. Keskiarvo ± SE OD 6 kaivojen kussakin ryhmässä. Eräässä kokeessa edustaja 3.

Parannettu apoptoosin aiheuttaman diklofenaakki

in vivo

voitu toisteta

in vitro

. PANC02 soluja viljeltiin 4 päivää läsnäollessa 10 ja 50 uM diklofenaakin kasvoi samaan tahtiin kuin käsittelemättömien solujen (kuvio 2C), joka ilmaisee, että

in vivo

vaikutukset diklofenaakin edellyttää joitakin välittäjiä, jotka ovat poissa, että

in vitro

järjestelmässä.

antiangiogeeninen vaikutus diklofenaakin

in vivo

ja

ex vivo

Kasvaimet alkaen diklofenaakin hoidettujen eläinten oli erittäin vaalean (kuvio 1A), mikä viittaa siihen, että hoito aiheutti antiangiogeeninen vaikutus. Itse asiassa, kuten on esitetty kuviossa 3A ja B, värjäys verisuonen endoteelin markkeri von Willebrand -tekijän ja laskenta verisuonten paljasti 4-kertainen määrä laskee suurten verisuonissa ja 2-kertainen lasku hiussuonten tiheys kasvaimia diklofenaakin käsiteltyjen hiirten. Lisäksi sileän lihaksen aktiinivärjäyksen (kuvio 3C) paljasti ohut, suora aluksia kohdellaan kasvaimissa verrattuna, moninaisten, monimutkainen verisuonten kasvaimia käsittelemättömän hiirillä. Analyysi sileän lihaksen aktiinin ilmentymistä kasvain homogenaateissa Western blot osoittivat merkittävää laskua (2,5-kertainen) in diklofenaakki käsitellyissä hiirissä (kuvio 3D ja E).

A-F, hiiret ympättiin PANC02 soluja ja käsiteltiin diklofenaakki, kuten on kuvattu kuviossa 1. A-D, diklofenaakki hoito aiheuttaa morfologisia muutoksia kasvaimen verisuoniin. A, von Willebrand värjäys suuri Ääreisverisuonille (

top) B ja hiussuonia (

alhaalla

). B, keskiarvo ± SE suurten Ääreisverisuonille /slide. lasketaan kehän ympäri kunkin dian (

Top) ja keskimääräinen ± SE kapillaareja /alue laskettiin 10 eri keskiosiin kasvaimia alle X40 suurennos (

alhaalla

). Alukset count arvioitiin kasvainten 4 käsittelemätöntä ja 4 diklofenaakki käsitellyissä hiirissä * P≤0.01. C, sileän lihaksen aktiinivärjäyksen paljasti hyvin ohuet verisuonien seinämien diklofenaakin käsitellyissä hiirissä. D ja E, sileän lihaksen aktiini proteiinipitoisuus kasvaimen homogenaateissa (50 ug proteiinia kaistaa kohti) 4 käsittelemätöntä ja 3 diklofenaakki käsitellyillä hiirillä mitattiin osassa Materiaalit ja menetelmät, keskiarvo ± SE mielivaltaiseen yksikköä /kaista, * P≤0.01. F, diklofenaakki vähentää VEGF sisältö kasvain ja vatsaonteloon, mutta ei seerumia. VEGF-tasot mitattiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät kasvaimen homogenaateissa-pg /mg proteiinia (

Top), vatsaontelossa-pg /hiiri (

keskusta

) ja seerumin -pg /ml (

alhaalla

). Tulokset ovat keskiarvo ± SE 4-6 hiirtä ryhmää kohti. *, ** Ja # poikkeaa merkittävästi hoitamatta, kasvain hiirille P≤0.02. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdessa riippumattomassa kokeessa. G, Diklofenaakki estää verisuonten itämistä.

ex vivo

estävää vaikutusta Diklofenaakin versoja mitattiin rotan aortan renkaat kasvatettiin ilman tai läsnäollessa 10pM diklofenaakin 5 kuvattu päivien Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvo ± SE vesasta alueen 5 rengasta kussakin ryhmässä mitattuna käyttäen Image Pro ohjelmaa. * Merkittävästi erilainen käsittelemättömän ryhmän P≤0.01 valokuvat edustavien renkaiden käsittelemättömien (

jäljellä

) ja diklofenaakki (

oikeus

) käsiteltiin ryhmät. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 4 itsenäisestä kokeesta.

VEGF: n on osoitettu olevan merkittävä proangiogeeninen tekijä kasvainten [24]. Siksi mittasimme kasvain VEGF tasot diklofenaakin käsitellyn ja käsittelemättömän hiirillä (kuvio 3F). Käsitellyt hiiret kasvaimia sisälsi 3 kertaa pienempi VEGF verrattuna kasvaimiin käsittelemättömästä hiiristä, mikä viittaa siihen, että lasku kasvaimen verisuonistossa seurausta alas säätely VEGF (kuvio 3F,

Top). Koska kasvainsolut nopeasti leviävät vatsaonteloon, me seuraavaksi mitattuna VEGF sisällön vatsaontelonesteessä. Flushable määrä VEGF peräisin vatsaonteloon kasvain- kantavien hiirten oli 13 kertaa suurempi kuin valeleikataan terveillä hiirillä. Tämä määrä laski 2,8 kertaiseksi jälkeen diklofenaakin hoidon (kuvio 3F,

keskusta

).

Nämä lausutaan vaikutuksia VEGF sisällöstä sekä vatsaonteloon ja kasvainkudoksessa, eivät näy muutoksia VEGF seerumissa (kuvio 3F,

alhaalla

). Siten seerumin VEGF pitoisuudet olivat samat seerumissa terveen valeleikatuilla hiirten kasvain- hiirillä, ja kasvain käsitellyissä hiirissä diklofenaakin.

Sen määrittämiseksi, diklofenaakki voi suoraan inhiboivat angiogeneesiä, mittasimme itäneet angiogeneesin rotan aortan renkaat

ex vivo

vastauksena lääkehoidon. Kuten on esitetty kuviossa 3G, itäneet alueella estyi 2,5-kertaiseksi, kun aortan renkaat inkuboitiin 10 uM diklofenaakin (C max diklofenaakin hoidetuilla potilailla), mikä osoittaa, että diklofenaakki voivat suoraan inhiboida verisuonten kehitystä.

Diklofenaakki lisää arginase aktiivisuutta haiman kasvaimissa ja vatsakalvon makrofageissa, mutta ei luuytimessä-CD 115 positiiviset ja CD 115 negatiivisia soluja

Yksi tulosten COX-2 yliekspressio kasvainsolujen on suuri tuotanto PGE2 mikä johtaa heikentynyt T-soluvasteen [14] [25]. PGE2 indusoi arginase 1 toimintaa ja arginiini sisäänottoa myelooisissa johdettujen vaimennin soluja (MDSCs), mikä aiheuttaa arginiini heikkeni kasvaimen ympärillä. Suhteellinen puute arginiini aiheuttaa vika CD3ζ ilmentyminen kasvaimeen infiltroivien T-soluja. Koska COX-2-estäjät osoitettiin osittain pysäyttää kasvaimen kasvua arginase eston MDSC [14], [25] mittasimme arginase toimintaa haimakasvain hashomogenaattien käsittelemättömän ja diklofenaakki käsiteltyihin hiiriin (kuvio 4A,

top

).

A-C, kaikki hiiret paitsi merkitty ympättiin kasvaimia päivänä 1 ja tapettiin päivänä 14., arginase aktiivisuus mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät kasvaimen homogenaattia

( top) B, makrofageissa eristettiin vatsaonteloon huuhtelu ja viljeltiin 20 tunnin (

keskusta) B, ja vasta eristetyssä vatsakalvon solujen (

alhaalla)

. Hiiriä käsiteltiin diklofenaakki 30 mg /kg 11 päivän ajan (

päällä keskellä

) tai 2 päivää ennen kokeen loppuun (

alhaalla

). Tulokset ovat keskiarvo ± SE arginase toiminnan kasvain homogenaateissa 6-7 hiirtä kussakin ryhmässä (

Top) tai Triton X-100 liuotetaan saatuja soluja 3-7 hiiristä kautta vatsakalvon huuhtelu ja mitattiin neljänä rinnakkaisena (

keskus ja alhaalla

). Jokainen koe toistettiin vähintään 3 kertaa ja tulokset edustavasta kokeesta on esitetty. * Merkittävästi erilainen käsittelemättömän ryhmän P≤0.01. # Poikkeaa merkittävästi käsittelemättömän ryhmän kasvain- vapaasti hiirillä. B, arginase-1 värjäys kasvaimia. Päähuomio kasvaimia värjättiin arginase 1, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Valokuvia kohdat otettiin alle X 10

(ylin) B tai X 40 (

alhaalla

) suurennos. C, identifiointi kaksi erillistä populaatioiden solujen kasvain (diklofenaakki-käsitelty) strooman: F4-80 positiivinen ja arginase positiivisia soluja. Sarja- leikkeet värjättiin F4 /80

(vasen

) sekä arginase 1,

(oikealla)

. Samoilla alueilla tunnistettiin ja verrattiin läsnäolon sekä markkerit. Valokuvia kohdat otettiin alle X 20 suurennus. Eräässä kokeessa edustaja 2. D, diklofenaakki ei aiheuta arginase aktiivisuutta inkuboitaessa makrofageihin soluviljelmässä. Peritoneaalimakrofageille eristettiin tuumoriin hiiriin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja inkuboitiin 48 tunnin ajan 10 tai 30 uM diklofenaakin seuraa arginase mittaus. Keskiarvo ± SE arginase aktiivisuuden 3 kaivojen kussakin ryhmässä. Eräässä kokeessa edustaja 3.

Meidän yllätykseksemme arginase aktiivisuus ei estä diklofenaakin hoitoa, vaan merkittävästi aktivoitiin 2,4 kertaiseksi.

Immuno-histologinen värjäys osoitti arginase 1 positiiviset solut kehällä kasvainten sekä käsittelemätöntä ja diklofenaakki käsiteltyihin hiiriin (kuvio 4B). Määrä arginase 1 ilmentävien solujen ja niiden värjäytymisen intensiteetti näytti lisäävän alle diklofenaakin hoitoa. Merkittävä, 1,8-kertainen lisäys arginase 1 proteiinipitoisuus kasvaimissa diklofenaakin käsiteltyjen hiirten mitattiin myös western blot-analyysi kasvaimen homogenaatit (kuvio S2). Käyttämällä vasta-ainetta vastaan ​​makrofagimarkkeri F4 /80 (kuvio 4C) Emme havainneet päällekkäisyydet arginase 1 värjäystä.

Jotta edelleen luonnehtia arginase 1 ilmentävien solujen PANC02 kasvaimissa, emme ympätty PANC02 solujen siirtogeenisiä hiiriä, joissa GFP-reportteriplasmidilla ohjaa CX3CR1-promoottori. Aktiivisuus tämän kemokiinireseptorin promoottori on rajoitettu mononukleaariset myeloidisoluissa, mukaan lukien kaikki kiertävän CD116

+ monosyyttien, ja on olennaisesti poissa solujen imukudossolulinjasolut. Me eristetty GFP-positiivisten solujen kasvaimia ja totesi, että nämä solut ilmentävät korkeita arginase 1 (Kuva S3).

Näin ollen lisääntynyt aktiivisuus arginase löydetty kasvaimia diklofenaakin käsitellyistä hiiristä johtuu ainakin osittain aktivointi arginase 1 monosyytti johdettujen CX3CR1

+ soluja. Arginase aktiivisuus oli poissa viljellyissä PANC02 (tuloksia ei esitetä) ja arginase 1-proteiinia ei ole koskaan havaittu tuumorisoluissa

in vivo

immunovärjäyksellä.

silmiinpistävä vaikutus diklofenaakin hoidon arginase toimintaa haiman kasvaimet johti meidät tutkimaan arginase toimintaa peritoneaalimakrofageille. Peritoneaalimakrofageille voi olla mukana kasvaimen valvonta [26] ja niillä on parannettu arginase ilmentyminen tuumoria kantavissa hiirissä [27]. Makrofagien vatsakalvon huuhtelu eristettiin suosituimmuusjärjestelmistä kiinnityksen kulttuuriin maljoihin ja viljellään yli yön. Immunovärjäys osoitti, että ne olivat molemmat F4 /80 positiivinen ja arginase 1 positiivinen (tuloksia ei esitetä). Arginase aktiivisuus voimistunut (4,8-kertainen) makrofageissa, jotka ovat peräisin kasvain- laakerin käsitellyillä hiirillä diklofenaakin ja 11 päivää, verrattuna käsittelemättömiin hiiriä, (kuvio 4A

keskellä

).

Koska makrofagi arginase ilmaisu voi muuttua vastauksena viljelymaljalle tartunta [28] me mitataan myös arginase aktiivisuutta kuin viljellyissä vasta eristettyjä soluja hiiren vatsaonteloon, mikä vaarantaa makrofageissa puhtaus, (kuvio 4A

alhaalla) -iin.

diklofenaakki tehokkaasti stimuloi arginase aktiivisuutta kuin viljellyissä soluissa, jotka ovat peräisin sekä kasvain-vapaa ja jolla on kasvain käsiteltiin diklofenaakki ja 2 päivää vain 7 ja 3-kertaiseksi, vastaavasti. Kasvain olotilatiedot arginase aktiivisuutta 4 kertaisesti lisäämällä aktiivisuus 0,03 (soluja ei ollut kasvainta kantavien hiirten) ja 0,12 mg ureaa /min /mg proteiinia (solujen kasvain -pitoista hiiriä), joka on linjassa aiempien raportoituihin [27] .

lasketaan myös määrä vatsakalvon solujen uutetaan kustakin hiirestä ja totesi, että 2 päivää diklofenaakin hoito tuotti 3 kertainen nousu solujen kasvain-hiiriin. Keskimääräinen solujen lukumäärä ± SE oli 0,6 x 10

6 ± 0,06 x 10

6 uutettu käsittelemättömien hiirien ja 1,5 × 10

6 ± 0,4 × 10

6 alkaen diklofenaakin käsiteltyihin hiiriin (p≤ 0,02, 7 hiirtä kussakin ryhmässä).

Tämä havainto osoittaa, että kun lyhyen diklofenaakin hoito, koko arginase aktiivisuus vatsakalvon soluissa (enimmäkseen makrofagit) on erittäin korkea, johtuen sekä voimakas kasvu tiettyä toimintaa tämän entsyymin ja koska määrän kasvu aktivoitujen solujen.

aktivointi arginase aktiivisuuden diklofenaakkia ei voitu osoittaa

in vitro

. Inkubointi vatsakalvon makrofagien 48 tunnin ajan (kuvio 4D) ei lisätä arginase aktiivisuutta, vaan tuotti tietyn lasku spesifinen aktiivisuus tämän entsyymin. Samat tulokset saatiin, kun makrofageja inkuboitiin 96 tuntia diklofenaakin (tuloksia ei esitetty). Siten samalla vaikutus Diklofenaakin kasvainsolujen apoptoosin, välittäjiä hetkellä

in vivo

ja poissa viljellyissä makrofageissa vaadittiin saavuttamiseksi induktion arginase aktiivisuutta tätä lääkettä.

Tutkimme myös, onko arginase aktivoitumisen diklofenaakki voidaan havaita luuytimessä makrofaagiesiasteiden. Me eristetty mononukleaarisoluja sääriluu ja reisiluu kasvainta kantavien hiirten käsittelemätön ja käsitelty 11 päivää diklofenaakin. Löysimme erittäin alhainen arginase aktiivisuutta sekä CD 115

+ ja CD 115

– soluja. Siten arginase aktivaatio diklofenaakki tapahtuu joko eriytetty makrofageissa tai välittäjiä tarvitaan edistämään diclofenac- induced- aktivointi arginase eivät pääse luuytimestä osastoon.

diklofenaakki vähenee NO tasolla vatsaonteloon ja seerumin

tutkimme seuraavaksi, onko korostunut aktivointi arginase sekä kasvainkudoksessa ja vatsakalvon makrofageissa vaikuttaa NO-tuotantoa.