Krooninen sairaus

tiivistelmä

Plants MELIACEAE perheessä tiedetään olevan mielenkiintoinen biologisia vaikutuksia, kuten antimalaral, verenpainelääkkeiden ja kasvaimen vastainen toiminta. Aiemmin ryhmämme raportoitu kasviperäinen yhdiste cycloart-24-eeni-26-oli-3-oni eristettiin heksaani uutteet

Aglaia Exima

lehdet, mikä osoittaa sytotoksisuutta kohti eri syöpäsolulinjoissa, erityisesti , paksusuolen syövän solulinjat. Tässä raportissa, me osoittavat lisäksi, että cycloart-24-eeni-26-oli-3-oni, tästä eteenpäin kutsutaan cycloartane vähentää elinkelpoisuus koolonsyöpäsolulinjaa HT-29 ja CaCO-2 annoksesta ja aika-riippuvaisella tavalla. Edelleen selventämiseksi yhdistettä mekanismia osoitti, että se sitoutuu tuumorinekroositekijä-reseptori 1 (TNF-R1), joka johtaa aloittamisesta kaspaasin 8 ja aktivoitumisen kautta Bid, että kaspaasi-9. Tämä toiminta aiheuttaa alentaa mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) ja vapauttamaan sytokromi-C. Aktivointi kaspaasin 8 ja -9 molemmat toimivat sitoutumaan syöpäsolujen apoptoosia alavirtaan kaspaasi-3/7 aktivointi, PARP pilkkominen ja puute NFkB translokaation tumaan. Molekyylikerros telakointi tutkimus osoitti, että cycloartane sitoutuu reseptoriin hydrofobisen vuorovaikutuksen kysteiini-96 ja vetysidoksia lysiiniä-75 ja -132. Tulokset osoittavat, että kehittäminen edelleen cycloartane kuin syöpälääke on kannattavaa.

Citation: Leong KH, Looi CY, Loong X-M, Cheah FK, Supratman U, LITAUDON M, et al. (2016) Cycloart-24-eeni-26-oli-3-oni, New Cycloartane eristetty lehdet

Aglaia Exima

laukaisee tuumorinekroositekijä-Receptor 1-välitteistä Caspase-riippuvaista apoptoosia in Colon Cancer Cell Line . PLoS ONE 11 (4): e0152652. doi: 10,1371 /journal.pone.0152652

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2015; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2016 Julkaistu: 12 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Leong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Malayan yliopisto [avustusten RP001 /2012A, RP001A-13BIO]; University Malaya High Impact Research [avustus H-20001-E00002]; ja opetusministeriön korkeakoulu Malesian [myöntää FP006-2011A]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on heikentävä sairaus, joka vaikuttaa merkittävä osa maailman väestöstä, ja se on todellakin maailmanlaajuinen terveysongelma. Peräsuolen syöpä on edelleen yksi yleisimmistä syövistä potilailla Yhdysvalloissa, muodostavat 8% ja 9% kaikista syöpätapauksista miehillä ja naisilla, vastaavasti [1]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleista syövän hoitojen, kuten kehittäminen täsmähoitoihin [2], suhteellinen eloonjäämisasteesta kärsivien potilaiden peräsuolen syöpä ei ole parantunut merkittävästi [3]. Lisäksi kemoterapiaa käyttävät synteettisiä huumeita aiheuttaa usein sivuvaikutuksia, kuten hiustenlähtö, verenvuoto, ripuli ja myelotoksisuus [4]. Tutkijat edelleen etsiä uusia terapeuttisia aineita, jotka ovat valikoivia syöpäsoluja vastaan ​​ja jotka tuottavat vähemmän sivuvaikutuksia.

Kasvit ovat edelleen yksi suurimmista lähteistä luonnollisia tuotteita, joita käytetään löytää uusia kemoterapia-aineiden [5-6 ]. Huomattakoon, että joitakin uusia yhdisteitä löydettiin kasveista, jotka oli ainutlaatuinen toimintamekanismi, suurempi teho tai pienempi haittavaikutuksia kuin nykyisin käytössä lääkkeet [7]. Yhteistyössä Ranskan laitokset etsimään uusia lääkeaineiden, teimme alustavan phytochemical profilointi kasvin

Aglaia Exima

. Aglaia on suurin suvun MELIACEAE perheen, ja Aglaia puut yleisesti kasvaa trooppisilla ja subtrooppisilla metsien Manner-Kiinassa, Indo-Malesian ja Tyynenmeren saarilla. Aglaia kolmesta osiosta (lehdet, kukat ja syötävät hedelmät) hallussaan useita lääkinnällisiä ominaisuuksia, kuten tulehdusta, anti-syöpä, diabeteslääkkeiden ominaisuuksia. Kuusi triterpenoids ja kaksi steroidit aiemmin eristettiin lehdistä

Aglaia Exima

ryhmämme. Aikaisemmin osoitimme, että uusi cycloartane, osoitti suurinta sytotoksinen vaikutus koolonisyöpäsolulinja HT-29 kaikkien yhdisteiden eristetty

Aglaia Exima

ryhmämme, jossa IC

50 11,5 uM [8]. Mielenkiintoista, edellinen tutkimus kertoo cycloartane iältään

Aglaia

lajien näytetään 10-kertainen selektiivisyys koolonisyöpäsolulinja HT-29 verrattuna normaaliin koolonsolulinjassa CCD-112CoN [9].

Suurin osa nykyisten kemoterapiaa huumeita laukaista apoptoosin aiheuttavan syöpää solukuoleman. Apoptoosi on aktiivinen prosessi ohjelmoidun solukuoleman, joka tapahtuu erityisiä morfologisia ja biokemiallisia muutoksia soluissa [10]. Nämä morfologiset muutokset kuuluvat ulkoistamista fosfatidyyliseriinin päälle solun pintaan, kalvon kupliminen, kromatiinin kondensaatio ja muodostumista apoptoottisten kappaleiden [11]. Progress ymmärtämisessä signalointi apoptoosin on johtanut kaksi suurta väyliä aloittamisesta laajalti hyväksytty, eli ulkoisten ja sisäisten apoptoosin polkuja. Ulkoista reitti laukaisee kuoleman kautta reseptorien läsnä solun pinnalla, kun taas sisäisen reaktiotien laukaisee vapautumisen proapototic tekijöistä, kuten sytokromi c, alkaen solun mitokondrioiden [12]. Tuumorinekroositekijä-reseptoreihin, transmembraaniproteiineja, ovat tunnettuja ulkoisia syöttämällä reseptoreihin. Nämä reseptorit ovat kahta tyyppiä: tuumorinekroositekijän reseptori-1 (TNF-R1) ja -2 (TNF-R2). TNFR-1 ilmentyy kaikkialla useimmissa soluissa, kun taas TNFR-2: ta esiintyy pääasiassa oligodendrosyyttien, astrosyytit, T-solut, myosyytit, tymosyyttejä, endoteelisolut ja mesenkymaaliset kantasolut [13]. Selviytyminen ja kuoleman prosessi säätelee pääasiassa TNF-R1, koska tämä reseptori sisältää solunsisäisen kuolindomeenin joka ei ole läsnä TNF-R2. Kun aktivoitu, kuolemadomeeniksi värvää muita kuoleman signaaleja, kuten TRADD FADD ja pro-kaspaasi-8, muodostaa kuoleman indusoivaa signalointi-kompleksi (DISC). Vapautuminen kaspaasin 8 signaaleja Bid aktivoida Bax, Bad, ja sytokromi C solun mitokondrioissa. Aktivointi: ääri-R1 uskotaan aiheuttavan metalloproteaasia TACE vapauttamaan ekstrasellulaarisen komponentin reseptorin liukoisen TNF-R1 (sTNF-R 1), joka on sytokiini, joka kykenee aktivoimaan muiden TNF-R1S laajentaa kuoleman signaaleja [ ,,,0],14].

kuitenkin tärkein pyövelien apoptoottisten reittien ovat proteaasit kaspaasin perheen proteolyyttisesti hajottaa solujen muodossa apoptoottisten kappaleiden. Tämä perhe proteaaseja on jaettu executioner kaspaasit, kuten kaspaasi 3 ja 7, ja initiaattorin kaspaasit, kuten kaspaasi 8 ja 9. aloittajan kaspaasi-8: n tiedetään aktivoidaan kuoleman reseptoreihin, kun taas kaspaasi-9 aktivoituu sytokromi c vuoto mitokondrioita. Nämä alullepanija caspases johtavat alavirtaan kaspaasi 3 ja 7, sitoutumalla solun apoptoottista kuolemaa. Toisin kuin nekroosi, apoptoosin on ei-tulehduksellinen solukuolemareittiin, jolla on se etu, että minimoidaan ei-toivottuja vaikutuksia viereisiin soluihin [15]. Siksi tutkijat ovat jatkuvasti etsimään pieniä molekyylejä, jotka voivat laukaista apoptoosin syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa arvioimme syövän potentiaalia cycloartane ihmisen koolonisyöpäsolulinja HT-29, keskittyen apoptoottinen mekanismi taustalla tätä toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja sytotoksisuusmääritys

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat (HT-29 ja CaCO-2) saatiin American Tissue Culture Collection (Rockville, MD). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, 50 ug /ml gentamysiiniä ja 2,5 ug /ml amfoterisiini B: tä (Gibco, Carlsbad, CA) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa atmosfäärissä 5% CO

2.

sytotoksisuus cycloartane arvioitiin vastaan ​​2 koolonsyöpäsolulinjaa (HT-29 ja CaCO-2). Solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja käsitelty jatkuvasti yhdisteen (0,39-200 uM) tai sisplatiinin (3,9-2000 uM) tai 5-fluorourasiilin (200- 8 x 10

-6 mmol) 24, 48 ja 72 tuntia. Sisplatiinin ja 5-fluorourasiilin yli 99,9%: n puhtaudella saatiin Sigma-Aldrich. Kontrollikuopat käsiteltiin 0,05% v /v DMSO: elatusaineet. Lopussa hoidon, media oli kevyesti virkeänä, ja 20 ui MTS-reagenssia (CellTiter 96 AQ

ueous® One Solution, Promega, Madison, WI) lisättiin. Levyjä inkuboitiin 2 tuntia, ja absorbanssi luettiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Infinite 200, Tecan, Männedorf, Sveitsi) 490 nm: ssä, jossa on 690 nm: ssä taustan aallonpituuden. Elävien solujen prosenttiosuus laskettiin suhteessa Kontrollikuoppiin, ja IC

50 määritettiin käyttäen annos-vaste-käyrä sovitettiin käyttäen Prism 5,02 ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena, ja tulokset raportoidaan aritmeettinen keskiarvo ± SD.

Apoptoosi ja solusyklin analyysit

Apoptoosi ja solusyklin analyysit suoritettiin erikseen käyttäen kaupallisia anneksiini V: FITC Apoptosis Detection Kit I ja CycleTest ™ Plus DNA reagenssipakkauksen vastaavasti (BD Bioscience, San Jose, CA). Solut ympättiin 5 x 10

5 solua per kuoppa kahdentoista kuoppalevyillä. Yön yli kiinnitys, soluja käsiteltiin yhdisteellä on 12,5, 25 ja 50 uM 24 tuntia apoptoosin analyysin ja 2,5 uM 12, 24 ja 48 tuntia solusyklin analyysi. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin varovasti trypsinisaatiolla ja sentrifugoitiin 1500 x g 5 minuutin ajan. Soluvärjäys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA QC Hiukkaset kit käytettiin kalibroida FACSCanto II virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA). Solupopulaatiot tehtiin sytometrinen analyysi ja kvadranttien asetettiin mukaan populaation elävien solujen käsittelemättömän näytteen. FacsDiva 5.0.3 ohjelmisto (BD Biosciences, San Jose, CA) käytettiin laskettaessa prosenttia soluja vastaavassa kvadranteissa apoptoosin analyysi, ja Mod Fit LT-ohjelmisto (Verity Software House Inc., Topsham, ME) käytettiin solusyklin analyysi.

Mitokondrioiden kalvon potentiaalia Δѱm (MMP), sytokromi c release analyysi ja NFkB translokaation

Cellomics Multiparametrimäärityksessä Sytotoksisuus 3 Kit MMP ja sytokromin vapautumista ja Nucleus Factor kappa B aktivointi Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) käytettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Solut maljattiin 1 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille yön yli. Solut pestiin ja niitä inkuboitiin yhdisteen 24 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla (3,125-50 uM). Kuten NFKB translokaatio aktiivisuutta, soluja käsiteltiin 12,5 uM cycloartane yksin tai 10 ng /ml TNF-α yksin tai 12,5 uM cycloartane ja 10 ng /ml TNF-α yhdessä hoidossa. Sitten solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan ja sitten läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (PBS). Kiinnityksen jälkeen soluja inkuboitiin MMP väriaineita tai blokattiin 3% naudan seerumin albumiinia, jota seuraa NFkB ensisijainen kanin vasta-aine tai sytokromi-c: ensisijainen hiiren vasta-aineen ja sitten vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu DyLight

TM 488 tai vuohen anti- hiiri-vasta-aine konjugoituna DyLight

TM 649 1 tunti kutakin. Solut huuhdeltiin kolme kertaa pesupuskurilla II (1 X PBS, jossa 1% Tween-20). Tumat värjättiin Hoechst 33258. Sitten värjättiin solut tehtiin näkyviksi, ja kuvat otettiin käyttäen Cellomics ArrayScan HCS lukija ((ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Solu terveyttä profilointi bioapplication moduulia käytettiin määrittämään fluoresenssin voimakkuus kukin väriaine.

kaspaasiaktiivisuus ja Inhibiittorimääritykset

solut valkoinen 96-kuoppalevyille 1 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja annettiin kiinnittyä. Sitten solut käsiteltiin yhdisteen (50 uM) eri aikoja (1, 3, 6, 12, 18, 24 ja 30 tuntia). kaspaasi-aktiivisuus mitattiin lisäämällä 50 ui kaspaasi-Glo® 3/7 (Z- DEVD-aminoluciferin), kaspaasi-Glo® 8 (Z-LETD-aminoluciferin) tai kaspaasi-Glo® 9 (Z-LEHD-aminoluciferin) (Promega, Madison, WI), ja sitten lukemalla luminesenssi käyttäen mikrolevyn lukijaa (Infinite 200, Tecan, Männedorf, Sveitsi). toimintaa yksittäisten kaspaasien ilmaistiin kertaiseksi kasvaa suhteessa käsittelemättömään kontrolliin. varten inhibiittorimäärityksessä, soluja esi-käsiteltiin 10 uM kaspaasi 3-estäjällä (Z-DEVD-FMK), kaspaasi 8-estäjä (Z-IETD-FMK), kaspaasi 9 estäjä (Z-LEHD-FMK) tai yleisen kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD-FMK) 30 minuutin ajan. Sitten soluja inkuboitiin yhdisteen kanssa (50 uM) 18 tunnin ajan, ja kaspaasi-määritykset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Kun toinen 6 tunnin inkuboinnin yhdisteen kanssa, solujen elinkykyisyys mitattiin käyttämällä MTS-reagenssia, kuten on kuvattu soluviljelmässä ja sytotoksisuusanalyysin osiosta.

Protein uuttamalla, proteiinijärjestelmän ja Western blotting-analyysit

yhteensä 1 x 10

6 soluja käsiteltiin yhdisteellä (50 uM) tai TNFa (10 ng /ml) positiivisena kontrollina NFKB translokaatio, ja muutokset proteiiniekspressiossa seurattiin ajan välein 6, 12, 18 ja 24 tuntia. Solut kerättiin, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja hajotettiin M-PER, joka sisälsi Pierce 1x Halt proteaasiestäjäseostabletit täydelliseen solu-uutteiden tai NE-PER puskurina solu tumaekstrakteilla in NKkB kokeita tai Mem-PER Plus puskurina solukalvon proteiinia otteet TNF-R1 kokeita (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Proteiinin array, ekspressiotasoja 43 apoptoosiin liittyviä proteiineja solulysaattia määritettiin käyttäen RayBio Human Apoptosis Array G1 kit, mukaan toimittajan protokollan. Kertamuutoksia välillä käsitellyn ja käsittelemättömän näytteet analysoitiin käyttäen RayBio Vasta-Array Analysis Tool (RayBiotech, Norcross, GA). Western blot, solulysaateista (20 ug proteiinia /kuoppa) keitettiin 5 minuutin ajan ja sitten eroteltiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin elektroforeettisesti polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,5% Tween 20: tä (TBST) 1 tunnin ajan ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Sarjat käytettiin apoptoosin vasta-aineen näytteenottolaitteen Kit (# 9915), pro-apoptoosi Bcl-2-perheen vasta-aineen näytteenottolaitteen Kit (# 9942), ja kuolema reseptorin näytteenottolaitteen Kit (# 8356), ja vasta-aineet käytettiin ydin- factor-kappa B p65 (# 8242), beeta-aktiini (# 8457) ja lamiinivektori B2 (# 13823) vasta-aineita (Cell Signaling, Tanssijat, DA). Tämän jälkeen kalvot pestiin TBST: llä ja inkuboitiin sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-kani-IgG) (# 7074). Kalvot kehitettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi kit (Super Signal West Dura, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

Computational molekyyli- telakointi ja tilastollisia analyysejä

X-ray kiderakenne tuumorinekroositekijän reseptori 1 (TNF-R1) haettiin Protein Data Bank (PDB merkintä 1 ncf) ja valmistettiin käyttämällä CHARMM- voimakenttä. Telakointi suoritettiin käyttämällä c-DOCKER moduuli Discovery Studio 4.1 ohjelmistoa (Acceryls, San Diego, CA) simuloida vuorovaikutuksia yhdisteen ja TNF-R1. Sidosvuorovaikutukseen energia laskettiin käyttäen

in-situ

minimointi työkalu sisällyttämään joustavat telakka on telakoituna sivuston jälkeen aikaisemmin kuvatun protokollan [17]. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen opiskelijan t-testissä tai ANOVA Bonferronin testin jälkeen in Prism 5.02 ohjelmisto määrittää merkittäviä eroja koe- ja kontrolliryhmissä (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA), ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin p ≤ 0,05 tai p ≤ 0,01.

tulokset

Sytotoksinen vaikutus cycloartane HT-29 ja CaCO-2 paksusuolisyövän solulinjoja

kemiallinen rakenne cycloartane on kuviossa 1. sekä, HT-29 ja CaCO-2-soluja käsiteltiin eri annoksilla 0,39-200 uM yhdistettä, 24, 48 ja 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Kuten kuvassa 2, yhdiste vähensi solujen elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Lisäksi IC

50-arvot cycloartane olivat 3-30 kertaa pienempi kuin standardin chemodrug sisplatiini (3,9-2000 uM) jokaisen hoidon ajankohdassa, 42-862 kertaa pienempi kuin 5-fluoriurasiili on 24 ja 48 tunnin aikapisteissä, mutta 16-27 kertaa voimakkaampi 72 tunnin kuluttua hoidon (taulukko 1). IC

50-arvoja käytettiin ohjaimena myöhemmissä kokeissa.

Yhdiste on syklopentano per hydro fenantreeniä telineen kanssa syklopropaanirenkaan välillä C-9 ja -10. Sivuketjun kiinnitetty C-17 on hydroksyyliryhmä substituentti C-26.

cycloartane (0,39-200 uM) HT-29 (A) ja CaCO-2 (B) solujen linjat, sisplatiini (3,9-2000 uM) HT-29 (C) ja CaCO-2 (D) solulinjat 24, 48 ja 72 tuntia, 5-fluorourasiili (200-8 x 10

-6 mm) HT-29 ja CaCO-2 solulinjoja 24 (E), 48 (F) ja 72 (G) tuntia. Merkittäviä eroja on merkitty: * p 0,05; ** P 0.01.

Cycloartane indusoi solukierron pysähtymisen ja apoptoosin HT-29-solujen

arvioimiseksi tila solukuoleman aiheuttama cycloartane, HT-29 koolonsyöpäsoluihin hoidettiin yhdisteellä 24 tuntia. Seuraavaksi suoritettiin virtaussytometria-analyysi soluista, joita on kaksinkertainen värjättiin anneksiini-V: n ja propidiumjodidin (PI). Ohjaus soluja käsiteltiin ajoneuvon (0,1% v /v DMSO

4) ja oli 99,4% solujen elinkelpoisuuden, ja 0,6%: solujen apoptoosin. Käsittely yhdisteellä on kasvavia pitoisuuksia, 12,5 uM 50 uM, aiheutti alentunut solujen elinkelpoisuuden välillä 68,6%: sta 30,6% ja samanaikainen kasvu prosentuaalinen apoptoottisten solujen 30,7%: sta 59,6%: iin ja osuus nekroottisen solujen 0,7% 9,8% (kuvio 3A).

(A) Suhteellinen solujen osoittaa fosfatidyyliseriinin translokaation, mitattuna solupinnan anneksiini V: n sitoutumisen ja vapaa PI: solut negatiivisia anneksiini V ja positiivinen PI ovat nekroottinen (Q1 ); positiivisten solujen sekä anneksiini V ja PI ovat myöhässä apoptoosin (Q2); solut negatiivisia sekä anneksiini V ja PI (Q3) ovat eläviä soluja; ja solut positiivisia anneksiini V ja negatiivisia PI ovat alussa apoptoosin (Q4). Soluja inkuboitiin 24 tuntia 0,1% v /v DMSO

4 (ajoneuvon kontrolli) tai cycloartane pitoisuuksina 12,5, 25 tai 50 uM, kuten on esitetty. (B) Virtaussytometria histogrammien jakautuminen solujen eri vaiheissa solusyklin (G

1, S: n ja G

2 /M) alussa kokeen (0 tuntia) ja 12, 24 ja 48 tuntia hoidon 2,5 uM cycloartane. Tuloksena on tyypillinen yksi kolme toistoa, jotka olivat olennaisesti samanlaisia ​​tuloksia.

Seuraavaksi tutkimme solusyklin profiilin cycloartane käsitellyn HT-29-soluja. Kuten kuviossa 3B virtaussytometria-analyysi osoitti ajasta riippuva nousu solujen G

1 vaihe, jossa 45,6%, 56,8%, 64,3% ja 76,2% soluista ollessa G

1 vaihe jälkeen 0 , 12, 24 ja 48 tuntia hoidon, vastaavasti.

Cycloartane indusoi kaspaasien aktivaatio 3/7, 8 ja 9

kaspaasit keskeisessä asemassa apoptoosin induktion ja kuten on esitetty Kuva 4A, HT-29-solujen käsitelty yhdisteellä oli jyrkässä toiminnan kasvuun kaspaasien 3/7, 8 ja 9 6 ja 12 tuntia. Niiden toiminta oli korkeimmillaan 18 tuntia kaspaasi 9 ja 24 tuntia kaspaasi 3/7 ja 8, jota seurasi laskeva. Esikäsittely joko kaspaasi 8 (Z-IED-FMK) tai yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä (Z-VAD-FMK), jota seuraa cycloartane johti korkeampi solujen elinkelpoisuus kuin soluissa ilman esikäsittelyä. Kuitenkin estäjät kaspaasi 3 (Z-DEVD-FMK) ja 9 (Z-LEHD-FMK) ei pelastaa solut cycloartane-indusoitua apoptoosia (kuvio 4B).

(A) ajan funktiona ( 0-30 tuntia) kertainen kaspaasi 3/7, 8 ja 9 toiminta HT-29-solujen jälkikäsittelyn kanssa cycloartane (50 uM). (B) Vaikutukset kaspaasin estäjät käsitellyissä HT-29-soluja. Muutokset kaspaasi 3/7, 8 ja 9 toimintaa, ja solujen elinkelpoisuus solujen esikäsitelty kaspaasi 3-estäjällä (Z-DEVD-FMK), kaspaasi 8: n estäjä (Z-IETD-FMK), kaspaasi 9 estäjä (Z-LEHD -FMK) tai yleisen kaspaasi-inhibiittori (Z-VAD-FMK), jota seurasi inkubaatio cycloartane (50 uM). 18 tunnin käsittelyn jälkeen kaspaasi aktiivisuudet määritettiin, ja 24 tunnin kuluttua hoidon solujen elinkyky mitattiin. Kaikki tulokset ovat kolmen itsenäisen määrityksen kanssa kertaisesta ja prosenttia elinvoimaisten solujen lasketaan käsittelemättömään kontrolliin. Symbolit osoittavat huomattavasti korkeampi kuin 0 tuntia tai ei inhibiittoria esikäsittelyn * p 0,05; ** P 0.01.

Effects of cycloartane apoptoosiin viestintäproteiinit

Seuraavaksi keräsimme proteiinilysaattien 6, 12, 18, ja 24 tunnin kuluttua hoidon cycloartane ja ladataan ne sitten RayBio Human apoptosis Array havaita tasot 43 apoptoosia aiheuttavaa proteiinia. Suurin kasvu proteiiniekspressiossa nähtiin kaspaasi 8, joka nousi 2-4 kertainen 12- ja 18-tunnin ajankohtina. Kaspaasi 3 ja Bid kasvoi vain 18 tunnin kuluttua yhdisteen käsittely (kuvio 5A ja 5B).

(A) yliaktiivista proteiinit todetaan ihmisen apoptoosin vasta-array. (B) kertamuutoksia apoptoosin signalointimolekyylejä verrattuna ohjata kanssa katkaisi raja 1,5 kertaiseksi. (C) Western blot-analyysi apoptoottisten signalointia proteiinien cycloartane käsiteltiin HT-29-solujen ja TNF-α-käsitelty positiivisena kontrollina NFkB translokaatio ajan eri aikavälein (6, 12, 18 ja 24 tuntia).

Koko solulysaateista käsiteltyjen solujen kanssa cycloartane kerättiin eri ajankohtina ja sille suoritettiin Western blotting -analyysi. Yhdenmukainen proteiinijärjestelmän tulokset (kuvio 5A ja 5B), ajasta riippuva nousu Bid ja halkaistut kaspaasi 3 ja 8 proteiineja (kuvio 5C) havaittiin. Myös TNF-R1, FADD, ja TRADD-proteiini ilmaisut olivat säädelty, mikä osoittaa, että yhdiste indusoi ulkoista apoptoosin signalointireitin kautta TNF-R1-reseptoriin (kuvio 5C); sTNF-R1 osoitettiin myös olevan ajan säädellä proteiini array tulokset (kuvio 5A ja 5B). Mitokondrioiden liittyvät pro-apoptoottisia proteiineja Bax ja Bad lisääntyi huomattavasti 6-24 tuntia. Lisäksi mitään translokaatiota NFkB sytoplasmasta tumaan havaittiin ajan ja taso pilkkoa PARP kasvoi ajan mittaan. Soluja käsiteltiin 10 ng /ml TNF-α toimi positiivisena kontrollina NFKB translokaatio kokeissa (kuvio 5C).

Cycloartane vähentää mitokondrion kalvon potentiaali (MMP), lisää sytokromi c release ja NFkB translokaation tapahtumia

tutkittava yhdiste aiheuttaa mitokondriovaurioita ja sytokromi c release, käsittelimme HT-29-solujen kanssa yhdisteen 24 tuntia ja sen jälkeen suorittaa korkea pitoisuus solun seulonta-analyysi. Kuten kuviossa 6A cycloartane 6,25 uM ja 12,5 uM vähentynyt (p 0,01) MMP. Lisäksi havaitsimme, sytokromi c: n vapautumisen sytosoliin HT-29-solut, joita käsiteltiin 6,25 uM yhdisteen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (kuvio 6B). Tutkiessaan yhdiste kilpailevat luonnollisen ligandin, TNF-α, loppupään NFKB translokaation tumaan mitattiin. Kuviossa 6C, TNF-α (10 ng /ml) johti NFkB fluoresenssi-intensiteetin kasvu (p 0,01) tumassa alueella. Kuitenkin hoito cycloartane (12,5 uM) eivät merkittävästi (p 0,05) lisäävät NFKB fluoresenssin intensiteetti verrattuna kontrolliin. Yhdistelmä hoito cycloartane (12,5 uM) ja TNF-α (10 ng /ml) johti merkittävään (p 0,05) lasku NFKB fluoresenssin intensiteetti verrattuna TNF-α hoito yksinään.

(A) Kuvat ja pylväsdiagrammi mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) vähennys. (B) Sytokromi c lokalisointi (punaiset nuolet) valvonta soluissa tai vapauttaa cycloartane saaneista HT29 koolonsyöpäsoluihin. (C) NFKB fluoresenssin voimakkuus tumassa alueella on samankaltainen ohjaus ja cycloartane käsiteltyjä soluja, vähentää intensiteetti yhdistelmänä hoidossa cycloartane ja TNF-α tai lisätä intensiteetti TNF-α yksin. Kuvat otettiin 100 kertaa suurennus ja merkittäviä eroja on merkitty: * p 0,05; ** P 0,01.

Tutkimus cycloartane telakka TNF-R1

Computational molekyyli- telakka havainnollisti yhdisteen sitoutuminen TNF-R1 (kuvio 7), ja se paljasti yhteensä sitovan energian – 67,032 kcal. Sitova sivusto cycloartane TNF-R1 eroaa aktiivisen luonnollisen ligandin, TNFa: n. Yhdiste sitoutuu solunulkoiseen domeeniin lähellä solukalvon. Hydrofobisen vuorovaikutuksen välillä havaittiin yksi sykloheksaani ja syklopentaani ryhmiä yhdisteen ja kysteiini-96, ja vetysidokset välille muodostuu hydroksyyli C-26 ja karbonyyliryhmä C-3 mukaisen yhdisteen, jossa lysiini-75 ja -132 ja -reseptorin, vastaavasti.

suurennus näytetään vetysidosten (vihreä katkoviivat) välillä hydroksyyli- ja karbonyyliryhmiä yhdisteen lysiinillä-75 ja -132 ja hydrofobisia vuorovaikutuksia (violetti katkoviivat) välillä sykloheksaani ja syklopentaani yhdisteen kysteiinin-96-reseptorin.

keskustelu

edellisen sytotoksinen seulonta paneelin syöpäsolulinjoissa osoitti, että cycloartane on eniten sytotoksinen kohti koolonisyöpäsolulinja HT 29 [8]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme samanlainen sytotoksisia vaikutuksia toisessa ihmisen koolonisyöpäsolulinja, CaCO-2. Tulokset MTS määritykset osoittavat, että käsittely yhdisteellä aiheuttaa annoksesta ja ajasta riippuvaa vähenemistä solujen elinkelpoisuuden sekä HT-29 ja CaCO-2-soluissa. Koska IC

50 yhdistettä oli alhaisin HT-29-solulinja, lisäkokeita suoritettiin että solulinjassa.

fosfatidyyliseriini ulkoistamista solun pinnalla on yksi tunnusmerkkejä apoptoosin [15 ]. Virtaussytometria tutkimukset osoittivat pitoisuudesta riippuvaa kasvu anneksiini-V FITC solupopulaatioiden verrattuna PI solupopulaatioiden, mikä osoittaa, että tämä yhdiste indusoi apoptoosia sijaan kuolion. Lisäksi, kertyminen solujen G

1 vaiheessa ajan havaittiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun cycloartane hoidon. Normaalin solun kasvua ja erilaistumista edellyttää asianmukaista sääntelyä solusyklin. Vapautuneilla solusyklin kontrolli, koska mutaation, deleetion ja transkription repression geenien, kuten FBXW7, pRB, ja p53, on osoitettu myötävaikuttavan peräsuolen syövän etenemistä [18-20]. Siten estämällä solusyklin etenemisen voisi pysäyttää valvomattoman leviämisen koolonkarsinoomasoluissa ja aiheuttaa niiden tulla apoptoosin.

Toinen tunnusmerkki apoptoosin on kaspaasien aktivaatio, ja on olemassa kaksi perustettu väyliä perustuu aloitteentekijä caspases: kuoleman reseptori reitti, johon liittyy kaspaasi-8, ja mitokondriaalisen reitti, johon liittyy kaspaasi-9 [16]. Aloittaminen tai molempien caspases aktivoi pyöveli kaspaasin (kaspaasi 3/7), mikä lopulta johtaa hyvin säänneltyä solujen kuoleman. Inkubointi yhdisteen aiheuttaa ajasta riippuva kaspaasi 3/7 päässä 6

th tunti alkaen. Kasvu kaspaasi-8 aktivaatio oli samanaikainen kasvu kaspaasi-9 aktivoinnin, mikä viittaa siihen, sekä syöttämällä reseptorin ja mitokondrioiden reittejä apoptoosin, jonka cycloartane. On kuitenkin epäselvää, mikä kaspaasi on ensisijainen aloitteentekijä perustuu suuntaus kaspaasin aktivaation. Tämän selvittämiseksi teimme kaspaasiestäjä kokeilu. Kaspaasi 8-estäjä (Z-IETD-FMK) pystyi tukahduttamaan kaspaasi 9 ja 3/7 toiminta johtaa lisääntymiseen eläviin soluihin. Näin ollen, kaspaasi 8 on ensisijainen aloitteentekijä, kun taas kaspaasi-9 on toissijainen välittäjänä, joka vahvistaa apoptoottista signaalia.

lisätutkimus apoptoottisen reitin proteiinin erilaisia ​​analyysi osoitti vapautumisen liukoisen tuumorinekroositekijän reseptorin 1 ( sTNF-R1) peräisin kokosoluekstraktien. Aktivoituminen TNF-R1 uskotaan aiheuttavan metalloproteaasia TACE vapauttamaan ekstrasellulaarisen komponentin reseptorin liukoisen TNF-R1 (sTNF-R 1) [14], joka johtaa meidät uskomaan, että TNF-R1 on lauennut ylävirran tapauksessa . Western blot-analyysi solukalvon uute käsiteltyjen solujen vahvisti säätelyä TNF-R1. TNF-R1 kuuluu syöttämällä reseptorin perhe, ja sytoplasminen häntä TNF-R1 sisältää death-domeenin (DD), joka on välttämätön apoptoosin [21, 22]. Tutkimukset osoittivat, että TNF-R1 aktivoi apoptoottisen ohjelman peräkkäin rekrytointi sovittimen TRADD-proteiinin, The TRADD-vuorovaikutuksessa adaptoriproteiini FADD ja FADD-, kuten ICE-proteiinia (FLICE, jota kutsutaan myös pro-kaspaasi-8) muodostamiseksi ja syöttämällä indusoiva signalointikompleksiin (DISC) [23, 24]. Aktivointi TNF-R1-reseptorin lääkkeet on osoitettu lisäävän hoidon tehokkuutta sekä lääkkeille vastustuskykyisiä solulinjoja ja primäärikarsinoomaan soluihin [25].

TNF-R1 aktivointi edelleen indusoi Bid, joka aktivoi Bad ja Bax aiheuttaen mitokondrion kalvon kyky alentaa, sytokromi c voidaan vapauttaa ja kaspaasi 9 aktivoidaan. Rooli Bid ja Bad transdusoinnissa apoptoottisen signaalit syöttämällä reseptorit luontaisia ​​mitokondriot reittiin kuuluu monistus apoptoottisten signaalien [26]. Bad ja Bax kuuluvat Bcl-2-perheen jäsentä, jotka säätelevät solujen kuoleman ja selviytymisen. Esimerkiksi säätelyä Bax: n on osoitettu indusoivan apoptoosia vähentämällä mitokondrion läpäisevyyden vapauttaa sytokromi c: [27]. Seurauksena sytokromi c release ja kaspaasi 9 aktivointi on aktivointi alavirran kaspaasien 3 ja 7, joka aiheuttaa lohkaisu PARP ja johtaa apoptoottista kuolemaa ilman translokaatiota NFkB tumaan. Lisäksi fluoresenssin merkintöjä NFkB osoitti yhdisteen eivät merkittävästi (p 0,05) lisätä NFkB translokaatiota tumaan verrattuna kontrolliin.