Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on erittäin tappava tauti ominaista myöhäinen diagnosointi ja hoito vastus. Toistuva geneettisten muutosten määritellään geenejä yhdessä häiriöiden kehittävän solun signalointipolkujen on yhdistetty PDAC kehittymistä ja etenemistä. Tässä osoitamme, että GATA6 edistää haiman syövän synnyn aikana ajallista etenemistä haiman intraepiteliaalisten kasvain nojalla Wnt-reitin aktivoinnin.

GATA6

on toistuvasti vahvistetaan sekä määrällisiä-PCR ja fluoresoiva in situ -hybridisaatio ihmisen haiman intraepiteliaalisten neoplasian ja PDAC kudoksissa, ja

GATA6

kopioluvun merkittävästi korreloi yleistä potilaan selviytymistä. Pakko yliekspressio GATA6 syöpäsolulinjoissa solujen lisääntymisen tehostuneen ja pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa

in vitro

ja kasvu

in vivo

, sekä lisääntynyt Wnt signalointia. Sen sijaan siRNA välittämä knockdovvn GATA6 johti vastaavaan laskua näissä samat parametrit. Vaikutukset GATA6 todettiin, koska sen kyky sitoa DNA, kuten pakotti yli-ilmentyminen DNA-sitova mutantti GATA6 ei vaikuttanut solujen kasvuun

in vitro

tai

in vivo,

eivätkä ne vaikuta Wnt signalointia tasolla näissä samoissa soluissa. Mikrosiru-analyysi paljasti Wnt antagonisti Dickopf-1 (DKK1) kuin säädeltyyn geeni yhdessä GATA6 Knockdown, ja suora sitoutuminen GATA6 että DKK1 promoottori vahvistettiin chromatin immunosaostuksella ja elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritykset. Ohimenevä transfektoimiseksi GATA6, mutta ei mutantti GATA6, syöväksi solulinjoihin vähensivät DKK1 mRNA: n ilmentymisen ja erittymisen DKK1 proteiinia viljelyalustaan. Pakko yliekspressio DKK1 antagonisoi vaikutuksista GATA6 on Wnt signalointia haiman syöpäsoluja. Nämä havainnot osoittavat, että yksi mekanismi, jolla

GATA6

edistää haiman syövän synnyn on nojalla sen aktivoinnin kanoninen Wnt signalointia säätelemällä DKK1.

Citation: Zhong Y, Wang Z, Fu B, Pan F, Yachida S, Dharan M, et al. (2011) GATA6 Aktivoi Wnt Signaling in Haimasyöpä negatiivisesti sääntely Wnt Antagonist Dickkopf-1. PLoS ONE 6 (7): e22129. doi: 10,1371 /journal.pone.0022129

Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 31 tammikuu 2011; Hyväksytty: 16 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 19 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Zhong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana NIH myöntää CA106610, CA62924 ja CA140599, George Rubis Endowment for Haimasyöpä Research, Michael Rolfe Haimasyöpä Foundation, Sigma Beta Osakuntatytöt, Joseph C. Monastra säätiö, Alfredo Scatena Memorial, The Patty Boshell Haimasyöpä Foundation, ja apurahat SAF2007 -60860 ja ONCOBIO Consolíder päässä Ministerio de Ciencia e Innovación, Madrid, Espanja (FR). Kirjoittajat ei ole taloudellisia eturistiriitoja liittyvät tähän työhön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

GATA6 on jäsenenä GATA transkriptiotekijän perhe, joka soittaa kriittinen sääntelyn rooli kudosten kehittämiseen [1]. GATA proteiinit jakavat konservoituneen sinkkisormipolypeptidiin sekvenssi, joka sitoutuu kanoninen DNA motiivi (G /A) GATA (A /T) [2] ja on jaettu kahteen alaryhmään perustuu ajallisen ja ilmaisun kuvioita. GATA1 /2/3 ilmennetään hematopoieettisten solulinjojen, ja GATA4 /5/6 Mesodermi ja Endodermi johdetut elinten [1], [3]. GATA6 erityisesti on tärkeää kehitystä sydämen, maha-suolikanavan, haiman ja muita kudoksia [4], [5]. Tärkeys GATA6 alleviivaa havainto, että kohdennettu inaktivointi

GATA6

geeni hiirissä aiheuttaa alkion alkuvaiheen kuolleisuutta seurauksena puutteesta Endodermi eriyttämisen [5] – [7].

monistumia voitto

GATA6

on hiljattain havaittu haiman kanava (PDAC) solulinjat ja ksenografteissa [8], [9]. Vaikka sen rooli PDAC karsinogeneesin on tuntematon, yhä enemmän todisteita osoittaa, että GATA6 on tuumorigeneesiin liittyvistä eri kudostyypeissä [10] – [14]. Ovarioiden, kohdunulkoinen GATA6 ilmentyminen korreloi solujen erilaistamattomuuden [15], kun taas kolorektaalisyövässä, GATA6 vaikutteita soluproliferaatiota ja apoptoosin vaikuttamalla ilmentymistä 15-Lipoksigenaasi-1, joka on rooli p53-riippuvaista solun pidätys [16]. Poikkeava GATA6 ilmentyminen on myös liitetty ihmisen lisämunuaisen kasvaimet sekä alfa /SV40 T-antigeenin siirtogeenisen hiiren mallia, joka kehittyy lisämunuaiskuoren kasvaimet gonadotropiinia riippuvalla tavalla [17], [18]. Sitä vastoin,

GATA6

on mukana niin tuumorisuppressorigeenin astrosytoomissa [14].

Tämän tutkimuksen tavoitteena on selventää mekanismeja, joilla GATA6 edistää haiman karsinogeneesiin. Nyt näyttää, että

GATA6

vahvistusta esiintyy loppuvaiheissa haiman intraepiteliaalisten neoplasia, on merkittävästi korreloi potilaiden hoitotuloksiin, ja edistää haiman syövän syntymistä aktivoimalla kanoninen Wnt-signalointireitin ansiosta suoraan transkription tukahduttamisen erittyvän Wnt antagonisti Dickkopf-1.

Methods

Ethics lausunto

Kaikki ihmisen kudosta kerättiin hyväksynnällä Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board (IRB protokollien # NA_00036610 ja NA_00001584) kun tietoa ja kirjallista suostumusta. Eläinkokeita, tutkimuksia tehtiin tiukka mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden of Minnesotan yliopiston (ACUC protokolla # MO09M84). Kaikki toimenpiteet suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Solulinjat ja kudokset

A6L, A13A, A10.7 ja IMIM-PC2 solulinjat perustettiin omissa laboratorioissa. PK8 ja PK9 olivat tri Akira Horii (Tohoko University, Sendai, Japani), ja HCG-25 Dr. Tony Hollingsworth (University of Nebraska Medical Center, Omaha NE). Kaikki jäljellä olevat haimasyöpä käytetyt solulinjat saatiin ATCC: ltä (Manassas VA). Normaalin haiman kanava epiteelisolujen linjojen HPNE ja HDPE valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [19]. Paksusuolen syöpä solulinjoja HCT116 (

CTNNB1

mutantti), SW480 (

APC

mutantti) ja RKO (

APC

ja

CTNNB1

villityypin) olivat Dr. James Eshleman (Johns Hopkins Medical toimielimet, Baltimore MD USA). Kaikki solut viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä ja 2 mmol /l L-glutamiinia, 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Ihmisen haiman kudosnäytteitä saatiin Kirurginen patologia osasto Johns Hopkins ja -ksenografteja jalomielinen lahjoitus Dr. Scott Kern (Johns Hopkins Medical toimielimet, Baltimore MD USA). Kaikki näytteet kerättiin hyväksynnällä Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board.

Lentivirusvektorikonstruktit Constructs

Rekombinantti lentiviruksien ilmentävät GFP alavirtaan mock shRNA tai shRNA spesifinen GATA6 luotiin käyttäen kolmen virus-järjestelmä, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti aikaisemmin [20], [21]. Oligonukleotidisekvenssejä GATA6 pudotus oli mielessä, 5′-gatccgctgtcacaccacaactaccttcaagagaggtagttgtggtgtgacagctttttta-3 ’; ja anti-sense, 5’-cgataaaaaagctgtcacaccacaactacctctcttgaaggtagttgtggtgtgacagcg-3 ’. Infektion jälkeen alikvootti kustakin solulinjasta (1 x 10

5) analysoitiin FACS että virtaussytometria Core Facility vahvistaa tehokkuutta transduktion ( 95% kaikissa testatuissa solulinjoissa) seuraamalla GFP: n ilmentymisen 60 h transduktion jälkeen.

plasmidikonstrukteja

ihmisen GATA6 pcDNA3.1-GATA6 oli lahja tri Clement Ho (University of Pennsylvania, Philadelphia PA) ja käytetään luomaan pcDNA3.1 -mGATA6 kohdennetulla mutageneesillä (Invitrogen), jossa kahdeksan eniten konservoitunut emästä sinkki-sormimotiivi poistettu [22], [23]. Ihmisen DKK1 ekspressiovektori pCMV-DKK1 ja DKK1 promoottori lusiferaasireportteri- pGL3-DKK1 olivat molemmat jalomielinen lahjoitus tohtori Hirotaka Osada (Aichi Cancer Instititue, Nagoya, Japani). Vakaa solulinjat luotiin noudattamalla menetelmiä aiemmin raportoitu yksityiskohtaisesti [8].

In vitro -määritykset of Cell Growth

Solulisääntyminen analyysit suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies) seuraavat ehdotetut protokollaa. Pesäkkeenmuodostus määritykset suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu [8]. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Cell Cycle Analysis

Virtaussytometria suoritettiin Becton Dickenson LSR Pöytäyleismittarit -virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA). Prosenttiosuudet solujen G0-G1, S ja G2 vaihe määritettiin käyttäen CellQuest-(BD Biosciences).

Enzyme immunosorbenttimääritys

-ELISA: t suoritettiin käyttäen hiiren mAb anti-ihmisen DKK-1 vasta-ainetta (klooni 141119) jälkeen valmistajan protokollan (R 2,3 katsottiin kopiomäärä voitto tilille polysomy kromosomin 18q, ja koska jopa 20-kertaiseksi GATA6 yliekspressio voi esiintyä PDACs vieläkin alhainen kopiomäärä voitto [8].

Luciferase ja TOPFLASH analyysit

TOPFLASH määrityksiä, pGL3-OT ja pGL3-OF plasmideja käytettiin (ystävällisesti tri Bert Vogelstein). Suhteellinen Wnt aktiivisuus määritettiin suhde lusiferaasin ilmentyminen pGL3-OT vektori jaettuna kuin pGL3-vektori, kuten edellä on kuvattu. Kaikkien muiden Lusiferaasimäärityksiä vektori PRL-TK (Promega), joka ilmaisee meren homo lusiferaasia käytettiin kontrollina. PcDNA3.1-tyhjän vektorin käytettiin säätämään kokonaismäärä transfektoitujen DNA. Lusiferaasimäärityksiä tehtiin 40 tunnin kuluttua transfektion käyttäen Dual-Luciferase-Reporter Assay System (Promega), ja lusiferaasin aktiivisuus määritettiin 1420 -monileimalukijaa (PerkinElmer life ja analyysi science, CT, USA). Tulikärpäsen lusiferaasi toiminta normalisoitiin meritse orvokki lusiferaasiaktiivisuudet. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Kromatiini Immunosaostusmääritys (CHIP määritys) B

ChIP-kokeet suoritettiin käyttäen reagensseja ja protokollia Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) käyttäen aiemmin kuvattuja menetelmiä [24 ]. Kaikki käytetyt alukkeet suunniteltiin nimenomaan kohdistaa GATA sidosmotiivia

DKK1

promoottori. (Probe sekvenssit tarjotaan File S1).

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

EMSA analyysit suoritettiin käyttämällä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [24]. Proteiini Uutteet normalisoitiin kokonaisproteiinia, ja 5-10 mg proteiinia, inkuboitiin

32P-leimattua korkean affiniteetin GATA6 koettimia kunkin neljän oletetun GATA sitovat motiivit sisällä

DKK1

promoottorin . Mutant koettimia jossa sitovan motiivin sekvenssi mutatoitunut käytettiin myös. GATA6-P koetin (5′-GCCAGCAGATAGCATGGAAAAG-3 ’), jotka ovat peräisin

TFF2

promoottorin sisältävän GATA6 sitoutumiskohdan [25], käytettiin positiivisena kontrollina. Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin 5% nondenaturating polyakryyliamidigeeleillä ja analysoitiin autoradiografialla käyttämällä Kodak elokuva. (Probe sekvenssit tarjotaan File S1).

shRNA välitteisen knockdovvn

Viljellyt solut logaritmisessa kasvuvaiheessa (50% konfluentteja) transfektoitiin DKK1 shRNA (Dharmacon), CTNNB1 shRNA (CTNNB1- VHS50819, Invitrogen Inc, CA) tai mock shRNA (# 4611, Ambion) käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Inc, CA) jälkeen suositeltu protokollaa. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja alistettiin RT-qPCR analyysi, solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset.

Loisteputki in situ -hybridisaatio (FISH) B

FISH suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [8] käytettiin bakteeri- keinotekoinen kromosomi kloonit CTD-2376C8 joka sisältää genomiset sekvenssit on 18q11.2 amplikonin 0,11 Mb (Invitrogen, Carlsbad, CA).

metylaatiospesifisen PCR

Promoottori metylaatio oli arvioitiin käyttäen alukkeita ja olosuhteissa aiemmin raportoineet Suzuki et al [26].

tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin parittomalla

t

-testi parametrisissa jakaumia, tai Chi-Square-testin vertailla taajuuksilla. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GATA6 Kopioi numero Gain tapahtuu Haiman epiteelinsisäisen neoplasian

Normal haimatiehyen epiteelin uskotaan edetä soluttautua syöpä sarjan kautta morfologisesti määritelty lähtöaineiden kutsutaan haiman intraepiteliaalisten neoplasia (PANIN-1, 2, 3) [27]. Ymmärtää korrelaatio geneettisen voitto

GATA6

ja PDAC kehitys, arvioimme

GATA6

kopioi numero mikropaloitelluista näytteitä normaalista kanavan epiteelin, Panin ja ihmisen PDAC kvantitatiivisella PCR: llä. Suhteessa haploidigenomista ei ollut voitto

GATA6

normaalissa kanavaan epiteelissä (0 4), Panin-1 (0 13) tai Panin-2 (0 10) vaurioita. Sitä vastoin lisääntynyt

GATA6

kopioluvun (≥2.3 kappaletta) tunnistettiin 6/17 näytteistä (35%) Panin-3 ja 18/55 näytteistä (33%) PDAC (kuvio 1A).

GATA6

kopioida vahvistuksenkertojan vahvistettiin edelleen loisteputki

in situ

-hybridisaatio (FISH) parafiiniin upotettujen leikkeiden yhden Panin-3 ja 10 PDAC näytettä (kuvio 1 B).

(A)

GATA6

kopioluvun (keskiarvo ± SE) on mikropaloitelluista normaalissa kanavat (N = 4), PANIN-1 (N = 13), PANIN-2 (10), PANIN-3 (N = 17) vauriot ja haimasyöpä (N = 55). (B) edustaja FISH tuman neoplastisen solun sisällä PanIN3 vaurion 11-kertainen

GATA6

vahvistus (oikealla) verrattuna tuma neoplastisen solun eri PanIN3 vaurio ilman kopiomäärä voitto on

GATA6

(vasemmalla). GATA6 koetin leimattiin punaisella ja kromosomi 18 sentromeeriantigeenin probe (18 Cent) leimattiin vihreällä. Leikkeet vastavärjättiin DAPI korostaa ytimiä. (C) Korrelaatio GATA6 mRNA ilmaisun ja kopioi numero mikropaloitelluista näytteitä normaalista, Panin ja syöpä kudosta. (D) GATA6 immunoleimaus kahden haimasyövän kudoksiin GATA6 kopio vahvistuksenkertojan verrattuna kaksi syövät ilman kopiomäärä vahvistusta. Lisääntynyt kopiomäärä on erittäin liittyy ydin- merkintöjä GATA6 proteiinia. (E) Kaplan Meier selviytymisen käyrä kuvaten

GATA6

kopioi vahvistuksenkertojan (≥2.3 kopiota haploidigenomista) kokonaiselinajassa potilailla, joilla on kirurgisesti resekoituun haimasyöpä.

kuusi potilasta sovitetun PANIN-3 ja PDAC oli microdissected samasta kudoksesta osan ja analysoitiin

GATA6

kopioiden määrä,

KRAS

ja

TP53

geenin asema (taulukko 1) . Kahdella potilaalla (potilasta 7 ja 53)

GATA6

kopioida vahvistuksenkertojan todettiin sekä Panin-3 ja PDAC näytteet osoittavat ne ovat syntyneet ennen kehittämiseen soluttautuminen karsinooma, kun taas kolmannessa potilaalla (potilas 53)

GATA6

kopioi vahvistuksenkertojan oli läsnä vain sisällä PDAC näytteessä viittaa se syntyi aikana ajallinen eteneminen PDAC. Kuitenkin yhtenä Panin-3 analysoitiin tässä potilasryhmässä, emme voi sulkea että ylimääräisiä ja testaamaton Panin-3 vaurioiden tämän potilaan haima sisälsi myös kopiomäärä voitto. Sen vahvistamiseksi, että korottaminen

GATA6

kopioluvun seurauksena lisääntyneeseen geenien ilmentyminen, me määrällisesti GATA6 mRNA-tasot näissä samoissa mikropaloitelluista näytteistä (kuvio 1 C), mikä osoittaa, että suhteelliset tasot GATA6 mRNA oli myös merkittävästi suurempi näytteissä, joissa

GATA6

kopiomäärän ≥2.3 verrattuna niihin, joilla kopiolukujen 2,3 (461,9 ± 126,2 ja 194,1 ± 69,7, p 0,0004). Samoin immunoleimaus varten GATA6 viidessä haimasyöpä kopio vahvistuksenkertojan osoitti vahvaa positiivista ydin- merkintöjä taas mitään merkintää nähtiin viidessä haimasyöpä kopio määrä 2,3 (kuvio 1 D).

Haiman syövän synnyn on mukana kertyminen geneettisten muutosten

KRAS, CDKN2A, TP53

ja

Smad4

geenejä [27]. Siksi määritetty suhde

GATA6

kopion numero voitto perimäluokituksesta näiden neljän geenien 56 ksenografti- rikastunut PDACs. Seitsemäntoista ksenografteja (30%) oli

GATA6

kopioluvun ≥2.3 suhteessa haploidigenomista, joista kuusi (11%) oli kopiomäärä 5,0. Kuitenkaan ollut mitään korrelaatiota

KRAS, CDKN2A, TP53

tai

Smad4

asema

GATA6

kopioluvun. Koska

GATA6

sijaitsee myös samassa kromosomissa käsivarteen kuin

Smad4

joka on usein kohdistettu homotsygoottinen deleetio [28], seuraavan kerran mietti,

GATA6

kopioiden määrä voitto on liittyvät nimenomaan genomista uudelleenjärjestelyn tapahtumia, jotka voivat johtaa homotsygoottisia poistetaan

Smad4

samassa ksenograftin DNA. Tämä taas ei paljastanut yhdistys, jossa on kuusi kahdeksasta

Smad4

mutantit esiintyvät johtuen homotsygoottinen deleetio ksenografteissa lisääntynyt

GATA6

kopion numero versus 13 21 kanssa homotsygoottinen deleetio ksenografteissa ilman

GATA6

kopioi vahvistuksenkertojan (p = 0,2844). Yhdessä voimme päätellä, että

GATA6

kopioi numbe≥r vahvistus tapahtuu loppuvaiheissa haiman intraepiteliaalisten neoplasia mutta ei nimenomaisesti rikastunut sisällä karsinoomien kanssa korjauksilla näiden neljän geenien.

Seuraava määritetty missä määrin

GATA6

kopioluvun vahvistus liittyy viittaavia tekijöitä on resekoituun PDAC. Ei suhteita löytynyt

GATA6

ja ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, kasvain eriyttäminen, kasvaimen sijainti tai imusolmuke tila. Kuitenkin potilaat, joilla on kopioluvun ≥2.3 oli pidempi kokonaiselinaika kuin potilailla, joilla ei kopiomäärä voitto Kaplan Meier selviytymisen arvio (p = 0,0096, kuvio 1 E).

GATA6 edistää solujen kasvua

In vitro

ja

in vivo

monistaminen ja yli-ilmentyminen

GATA6

vuonna Panin ja PDAC ehdottaa se edistää PDAC biology [8], [9]. Siksi rakennettu lentivirusvektoreita, jotka ilmentävät joko pilkata tai GATA6 erityisiä shRNA ja käytti niitä vakaasti tartuttaa PDAC solulinjat AsPC1 ja A13A kopio numerot 2.3 ja 9.0 nähden haploidigenomista vastaavasti [8], [9]. Molemmissa solulinjoissa, GATA6 yli-ilmentyy myös vähintään 10-kertainen verrattuna normaaliin tiehytsoluja [8], [9] (kuvio S2). Knockdovvn GATA6 molemmissa solulinjoissa (kuvio 2A, 2B) johti pienensi merkitsevästi solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostuminen (kuvio 2C ja D), vähentää solujen G2 /M-vaiheen (kuvio 2E) ja väheni kasvua in vivo (kuvio 2F ja 2G). Kääntäen, pakko yliekspressio GATA6 että PDAC solulinjassa Panc1 heikosti endogeenisen GATA6 ilmaisun [8] (kuvio 3A ja kuvio S2) lisännyt solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumiseen (kuvio 3B ja 3C) kuin myös aiemmin esitetty solulinja MiaPaca2, jossa ei ole endogeenistä ekspressiota GATA6 [8].

(A) kokonaismäärä proteiini uutettiin AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh soluja ja mock shRNA valvontaa ja analysoitiin Western blottauksella suhteelliset tasot ja GATA6 proteiinin suhteen aktiini. (B) Reaaliaikainen PCR GATA6 ilmentymistä AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh soluissa. (C) Näitä soluja analysoitiin myös soluproliferaatiota eri ajankohtina, (D) viljeltiin pehmeässä agarissa ja pesäkkeiden lukumäärä on 2 viikkoa lasketaan, ja (E) analysoitiin virtaussytometrialla määrittämiseksi prosenttia soluja G2 /M vaihe. (F) edustaja -ksenografti muodostuminen

in vivo

(edellä) ja sen jälkeen explantation (alempi) ja AsPC1 ohjaus ja GATA6sh solujen 8viikko postinjection. (G) Keskimääräinen kasvaimen tilavuus (keskiarvo ± SE) näitä samoja ksenograftien 8. viikolla postinjection. Havaittiin samankaltaisia ​​tuloksia varten A13A-GATA6sh soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Lukuun ottamatta virtaussytometrialla, joka suoritettiin kahtena, kaikki kokeelliset tiedot esitetään edustaa yhteenveto kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.

(A) Reaaliaikainen PCR GATA6 ilmentymistä Panc1-mock, Panc1-GATA6 ja Panc1-mGATA6 soluissa. (B) Panc1-mock, Panc1-GATA6 ja Panc1-mGATA6 soluja joko analysoitiin solujen lisääntymisen tai (C) viljeltiin pehmeässä agarissa ja pesäkkeiden lukumäärä on 2 viikkoa lasketaan. (D) edustaja -ksenografti muodostuminen

in vivo

(yllä) ja jälkeen explantation (alempi) on Panc1-mock, Panc1-GATA6 ja Panc1-mGATA6 soluja 8 viikon kohdalla postinjection. (E) Keskimääräinen kasvaimen tilavuus (keskiarvo ± SE) näitä samoja ksenograftien 8. viikolla postinjection. Kaikki kokeelliset tiedot esitetään edustaa yhteenveto kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.

GATA6 säätelee DNA transkriptio sitoutumalla kanoninen GATA motiiveja, tai transkription kofaktorina [2], [29]. Sen määrittämiseksi, onko vaikutuksia Panc1 soluja johtuen GATA6 DNA: ta sitovaa aktiivisuutta, käytimme kohdennettua mutageneesiä luoda mutantti-cDNA, jossa GATA6 Zn finger domain hajotettiin (kutsutaan mGATA6), ja uudelleen transfektoitiin stabiilisti Panc1 soluja (kuvio 3A ). Ei ollut eroa solujen kasvua tai pesäkkeiden muodostumisen joukossa Panc1-mGATA6 solujen ja Panc1-ohjaus transfektoiduissa soluissa (kuvio 3B ja 3C), mikä viittaa, että kasvua edistävät vaikutukset GATA6 havaittu

in vitro

johtuvat sen toimintaa transkriptiotekijä. Selventää edelleen kasvua edistävää vaikutusta GATA6, nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti Panc1-GATA6 tai Panc1-mGATA6 soluja. Sen jälkeen, kun 8 viikkoa, keskimääräinen tuumorin tilavuus oli merkitsevästi suurempi hiirissä, joihin injektoitiin Panc1-GATA6 soluja kuin Panc1-mGATA6 soluissa (kuvio 3D ja 3E), joka johtaa meidät päättelemään, että GATA6 edistää karsinogeneesiä kautta sen kyky sitoutua DNA: han.

Wnt Antagonistia Dickkopf1 (DKK1) on GATA6 Target Gene

GATA proteiinit liittyvät Wnt signalointia alkionkehityksen sydämen ja keuhkojen [4], [30], [31]. Siksi arveltu, että GATA6 edistää haiman syövän syntymistä osittain kautta sen vaikutukset Wnt signalointia, otaksuttu suhde, jota ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti, tämän kasvaimen tyypistä. Verrattuna mock shRNA lentiviraalinen-tartunnan saaneiden solujen sekä AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh solut osoittivat merkittävää vähenemistä funktionaalisen Wnt signalointi aktiivisuutta TOPFLASH määrityksessä (kuvio 4A), kun taas yliekspressio GATA6 vuonna Panc1 ja HPNE solujen edistänyt Wnt signalointia aktiivisuutta (kuvio 4B ). Sen määrittämiseksi, ß-kateniinin ilmentymistä tarvitaan näiden vaikutusten me vaiennetaan ß-kateniinin ilmentymistä käyttäen shRNA strategian Panc1-GATA6 soluja, mikä johtaa merkittävään soluproliferaation inhibointi ja pesäkkeiden muodostumiseen (kuvio 4C ja 4D). Haimasyövässä kudoksissa, GATA6 yliekspressio korreloi merkitsevästi tumakertymään beta-kateniinin proteiini (8/12 PDACs kanssa GATA6 yliekspressio osoittaa ß-kateniinin tumakertymään versus 3/20 ilman GATA6 yliekspressio, p = 0,004) (kuvio 4E). Niinpä GATA6 yli-ilmentymisen PDAC edistää solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostusta parantamalla kanonisen Wnt signalointia.

(A) Wnt signalointi aktiivisuutta AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh soluiksi TOPFLASH määrityksessä. Lusiferaasiaktiivisuus on esitetty suhteena OT OF tasoja solujen GATA6 pudotus verrattuna, että mock-transfektoiduista soluista. (B) Wnt signalointi aktiivisuutta Panc1-GATA6 ja HPNE-GATA6 soluista määritettiin TOPFLASH määrityksessä. Lusiferaasiaktiivisuus on esitetty suhteena OT OF tasot GATA6 transfektoiduissa soluissa suhteessa, että mock-transfektoiduista soluista. (C ja D) Panc1-GATA6 soluja transfektoitiin ohimenevästi ß-kateniinin tai mock shRNA ja (C) solujen proliferaatiota tai (D) pesäkkeiden muodostumista määritettiin. Kaikki kokeelliset tiedot esitetään edustaa yhteenveto kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05; **, P 0,01. (E) immunoleimaus kuvioita GATA6 ja ß-kateniinin proteiinin kahden edustavan PDAC kudoksiin. Nuolet osoittavat ydinvoiman merkintöjä sekä GATA6 ja ß-kateniinin leikesarjojen saman syöpäkudoksessa. Sitä vastoin PDAC näyte alhainen GATA6 ilme näkyy myös ei ilmentymistä beta-kateniinin.

GATA6 säätelee kohdegeenien sitoutumisen kautta GATA sitova motiivi [2]. Tunnistaa GATA6 kohdegeenejä, jotka voivat vaikuttaa Wnt signaloinnin, teimme geenin ilmentymisen profilointi käyttäen AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh ja mock valvontaa ja tunnistettiin 113 yleisesti väärin säädellystä geenien (kuvio 5A ja taulukossa S1), joista yksi oli Dickkopf-1 (

DKK1

), antagonisti kanoninen Wnt signaloinnin [32]. Wnt11, tunnettu GATA6 kohdegeenin [30], tunnistettiin myös viittaa siihen, että GATA6 myötävaikuttaa Wnt polku sääntelyn osittain säätelemällä näistä geeneistä. Koska DKK1 ei ole aiemmin tunnustettu

GATA6

kohdegeenin me keskittyy erityisesti suhteesta GATA6 on DKK1.

(A) Venn-kaavio osoittaa määrän säädeltyyn geenejä tunnistaa mikrosiruanalyysillä of AsPC1-GATA6sh (vasen ympyrä, sininen) ja A13A-GATA6sh soluja (oikealla ympyrä, keltainen). Vihreä cross-alue osoittaa yleisesti väärin säädellystä geenejä ja sisältää DKK1. (B) Reaaliaikainen PCR vahvistaa DKK1 yli-ilmentymisen AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh soluissa. (C) havaitseminen erittyvän DKK1 proteiinin elatusaineessa in AsPC1-GATA6sh ja A13A-GATA6sh soluissa. Eritettyä DKK1 proteiini tasot ilmaistaan ​​käyttämällä absorbanssia OD450. (D) Kromatiini immuunisaostustesti vahvistaa sitoutumisen GATA6 että

DKK1

promoottori. Non-immuuni IgG ja koko genomista johdettuja gDNA käytetään negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. (E) EMSA määritys vahvistetaan sitoutuminen GATA6 on otaksuttu GATA sitoutumiskohtiin # 2 ja # 3. Mutanttisekvenssi mGATA- # 3 ei aiheuta havaittavaa sitoutumista. Nuclear Extr, tumaekstrakti; GATA6-P, joka on positiivisena kontrollina koetin johdettu

TFF2

promoottorin sisältävän GATA6 sitoutumiskohta; GATA- # 2, koetin sisältävä otaksuttu GATA sitoutumiskohta nro 2; GATA- # 3, koetin sisältävä otaksuttu GATA sitoutumiskohta nro 3; mGATA- # 3, koetin sisältää mutatoitunut otaksutun GATA sitoutumiskohta nro 3; katso menetelmät lisätietoja (F) vaikutus GATA6 ilme aktiivisuudesta

DKK1

promoottori. Tiedot esitetään suhteena tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden merelle orvokki lusiferaasiaktiivisuus. pGL3 käytettiin negatiivisena kontrollina tausta. (G) Reaaliaikainen PCR DKK1 mRNA: n ekspression Panc1 soluissa. Tarvittaessa kaikki kokeelliset tiedot esitetään edustaa yhteenveto kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05; ***, P 0,001.

Reaaliaikainen PCR vahvisti DKK1 mRNA säätelyä ja lisääntynyt eritys DKK1 proteiinin soluun median molemmissa solulinjoissa läsnä ollessa GATA6 taintumisen (kuviot 5B ja 5C) . Sen määrittämiseksi,

DKK1

on välittömänä kohteena GATA6, etsimme

DKK1

promoottori GATA6 konsensus sitovia sekvenssejä. Neljä itsenäistä GATA-sidosmotiivia tunnistettiin (kuvio S3), ja kromatiinin immunosaostuksella määrityksessä sitoutuvan suoraan GATA6 että nämä motiivit sisällä

DKK1

promoottorin osoitettiin (kuvio 5D). Sitovia GATA6 vahvistettiin myös elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (kuvio 5E ja tietoja ei ole esitetty). Me seuraavaksi käytetään lusiferaasireport- ohjauksessa

DKK1

promoottorin onko GATA6 sitoutumisen

DKK1

niiden vaikutuksista transkriptionaalinen aktiivisuus geenistä. Tämä toimittaja käyttää molemmissa 293T ja Panc1 solujen heijastaa endogeenisen aktivoitumisen DKK1 ilmaisua. Kuitenkin, kun pakotetaan GATA6 ilmentymistä (Fig. 5F) lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentynyt, kun taas mitään vaikutusta

DKK1

promoottorin aktiivisuuden havaittiin läsnä ollessa GATA6 sitova motiivi mutantti (mGATA6), mikä osoittaa, että tukahduttava vaikutus of GATA6 on

DKK1

vaatii suoran sitoutumisen GATA6 että

DKK1

promoottori. Pakko ilmentymisen villityypin mutta ei mGATA6 proteiinia Panc1 johti myös pienensi merkitsevästi DKK1 mRNA (kuvio 5G). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GATA6 säätelee negatiivisesti DKK1 transkriptio suoraan sitoutumalla GATA motiivi

DKK1

promoottorialueen.

DKK1 ilmentäminen PDAC korreloi Wnt Activation

jäsenet DKK perheen (DKK1, DKK2, DKK3 ja DKK4) on eritettyjä proteiineja, jotka estävät kanonisen Wnt signaloinnin sitoutumalla alayksikkö Wnt-reseptorikompleksin LRP5: stä /6 [32].