Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

ETS transkriptiotekijät säätelevät tärkeitä signalointireittejä mukana solujen erilaistumista ja kehityksen monissa kudoksissa ja ovat nousseet tärkeitä toimijoita eturauhassyöpää. Kuitenkin biologinen vaikutus ETS tekijöiden eturauhasen kasvainten synnyssä keskustellaan yhä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Me tehdään analyysi ETS geeniperheen käyttäen microarray data ja reaaliaikainen PCR normaalissa ja tuumorikudoksia ohella toiminnalliset tutkimukset normaalissa ja syöpäsolulinjoissa ymmärtää vaikutuksia eturauhasen kasvainten synnyssä ja tunnistaa keskeiset tavoitteet näiden transkriptiotekijöiden. Löysimme usein häiriöstä ETS geenien onkogeenisella (eli ERG ja ESE1) ja kasvaimia estävä (ts ESE3) ominaisuuksia eturauhaskasvaimissa verrattuna normaaliin eturauhasen. Kasvaimen alaryhmiä (eli ERG

korkea, ESE1

korkea, ESE3

alhainen ja NoETS kasvaimet) tunnistettiin sen perusteella, niiden ETS ilmentymistilanne ja osoitti selvästi transkription ja biologiset ominaisuudet. ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia oli vahvin geeni allekirjoitukset sekä erillisiä ja päällekkäisiä toimintoja. Integrointi genomista tietoja toiminnallisia tutkimuksia useilla solulinjoilla, osoitimme, että ERG ja ESE3 ohjataan vastakkaiseen suuntaan transkriptio Polycomb- ryhmän proteiini EZH2, keskeinen geeni kehittämiseen, erilaistumiseen, varsi solubiologian ja kasvaimen kehittymisen. Olemme lisäksi osoittaneet, että eturauhasen-erityinen tuumorisuppressorigeeniä Nkx3.1 kontrolloitiin ERG ja ESE3 sekä suoraan induktion EZH2.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot tarjoavat uusia oivalluksia roolia ETS transkription verkon eturauhasen kasvainten synnyssä ja paljastaa aikaisemmin tunnistamattomia yhteyksiä poikkeava ilmentymä ETS tekijöiden vapauttaminen epigeneettiset efektorien ja vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille. Välinen yhteys poikkeava ETS aktiivisuutta ja epigeneettisiä geenien voi olla merkitystä kliinisessä hoidossa eturauhassyövän ja suunnitella uusia hoitostrategioita.

Citation: Kunderfranco P, Mello-Grand M, Cangemi R, Pellini S, Mensah A, Albertini V, et ai. (2010) ETS -transkriptiotekijät valvonta transkriptio EZH2 ja Epigeneettiset hiljentäminen tuumorisuppressorigeenin Nkx3.1 eturauhassyövässä. PLoS ONE 5 (5): e10547. doi: 10,1371 /journal.pone.0010547

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 marraskuu 2009; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2010; Julkaistu: May 10, 2010

Copyright: © 2010 Kunderfranco et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Oncosuisse (OCS-01913-08), Swiss National Science Foundation (FNS-31003A-118113) ja Ticino Foundation for Cancer Research GMC. MGM ja CG tuettiin Compagnia di San Paolo, Torino, Italia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on eturauhasen on yleisin syöpä ja johtava syy syövän kuolema länsimaissa [1]. Eturauhassyöpä on hyvin heterogeeninen kliininen käyttäytyminen ja vähän tietoa molekyylitason mekanismeja, jotka auttavat tämän heterogeenisuus [1]. Äskettäin ETS transkriptiotekijät ovat nousseet tärkeiksi osiksi eturauhasen kasvaimien synnyn johtuen toteamiseen toistuvan translokaatioita joihin ETS geenit, yleisin ollessa TMPRSS2: Erga geeni fuusio johtaa yli-ilmentyminen täyspitkän ERG [2], [3] [4]. Kuitenkin biologinen vaikutus siirtämisellä ETS geenien keskustellaan yhä. Viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että ERG yli-ilmentyminen ei riitä aiheuttamaan neoplastisen transformaation ja yhteistyötä muiden kasvaimia synnyttävän reittejä, kuten PTEN menetys ja PI3K /AKT säätelyhäiriöihin on tarpeen [5], [6], [7], [8], [9]. Ihmisen ETS perheeseen kuuluu 27 jäsentä, jotka jakavat erittäin konservoitunut DNA: ta sitovan domeenin ja ovat solmukohtiin eri signalointireittien ohjaamalla solujen lisääntymistä, erilaistumista ja selviytyminen [10]. Vaikka suuret mahdollisuudet päällekkäisyys, yksittäisten ETS tekijät ovat erilaisia, ja ilmeinen positiivisten ja negatiivisten sääntelyä eri osa geenien ja biologisten prosessien [10]. Lisäksi monissa kudoksissa ETS seikat ovat monimutkaisia ​​säätelyverkkoja erityisiä soluvasteita riippuen tasapainoon tekijöiden kanssa samankaltaisia ​​tai vastakkaisen tehtäviä [10]. Useimmat ETS tekijät, kuten ne kulkeutua eturauhassyövän, edistävät solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja transformaatio, kun taas toiset toimivat tuumorisuppressoreilla [10]. Viime aikoina olemme huomanneet, että epiteelin erityisiä ETS tekijä ESE3 oli usein alassäädetty eturauhassyövässä, vaikutti negatiivisesti solujen lisääntymistä ja selviytymistä, ja toimi tuumorisuppressoriproteiinia eturauhasen epiteelisolujen [11]. Siten ymmärtää kokonaisvaikutusta ETS geenin vapauttamisen kasvainten synnyssä ja tunnistaa päätavoitteisiin vapautettu ETS tekijöitä, olisi tärkeää tarkastella koko joukko ETS geenien ilmaistaan ​​tietyssä kudoksessa.

Tässä tutkimuksessa, kattavan analyysin ETS geeniperheen eturauhasen normaaleissa ja tuumorikudoksissa tunnistimme kasvain osaryhmään selvä ETS ilme kuvioita. Lisäksi jo tiedossa ETS tavoitteet, huomasimme aikaisemmin tuntemattomia geenejä ja polkuja liittyy poikkeavaan ETS toimintaa. Integroimalla genomista tietoja toiminnallisia tutkimuksia, loimme että Polycomb- (PCG) proteiini EZH2 on välittömänä kohteena ERG ja ESE3, ja keskeinen toimija transkription hiljentäminen eturauhasen erityisten tuumorisuppressorigeeniä Nkx3.1. Yhdessä meidän tietojen mukaan useammin ja monimutkaisia ​​muutoksia ETS geenien kuin aiemmin tunnustettu ja tunnistaa keskeiset geenit kuten EZH2 ja Nkx3.1 edistää uudelleenohjelmointi eturauhasen epiteelisolujen transcriptome vastauksena poikkeava ilmentyminen onkogeenisten ja tuumorisuppressorin ETS tekijöitä. Nämä havainnot saattavat olla merkityksellisiä kliinisessä hoidossa eturauhassyövän ja suunnitella uusia hoitostrategioita.

Tulokset

ETS geeniekspressiomalleja Define Eturauhassyöpä Alaryhmät

saada kattava näkymä ETS transkription verkon eturauhassyövässä, tutkimme ilmaus ETS geeniperheen mikrosirulähestymistavassa aineistoja alkutuotannosta eturauhassyöpään (

n = 59

) ja normaalissa eturauhasessa (

n = 14

) kliinisistä näytteistä. Analyysi microarray tiedot osoittivat, että useat ETS geenit ilmentyvät differentiaalisesti Tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin eturauhasen. Kvantitatiivinen RT-PCR: llä (QRT-PCR) käytettiin varmistamaan ero ilmentymisen useimmin muuttaa ETS tekijät (Fig. S1). Eniten vaikuttaa merkittävästi ETS geenit olivat ERG, ESE3 ja epiteelin erityisiä ETS factor-1 (ESE1 /ELF3 /ESX). Olemme aiemmin osoittaneet, että ESE3, joka ilmentyy normaaleissa eturauhasen epiteelisolujen, vaikutti negatiivisesti proliferaatiota ja eloonjäämistä eturauhassyöpäsolujen ja ehdotti, että se toimi tuumorisuppressorina [11]. ESE1, joka on läheistä sukua ESE3, ilmentyy normaaleissa epiteelisoluissa eri elinten, kuten eturauhas-, rinta- ja keuhkosyövän, ja on tunnettu toimimaan onkogeenin, kun yli-ilmentynyt rinta- epiteelisolut [12], [13]. Kuitenkin säätely ylöspäin ESE1 eturauhastuumoreissa ei ole raportoitu aikaisemmin. Kaiken säädeltyyn ilmaus ETS geenien oli hyvin usein eturauhasen kasvaimia. Itse asiassa suurin osa kasvaimia oli ainakin yksi ylä- tai alas- säännelty ETS geeni verrattuna normaalissa eturauhasessa ja usein useita ETS oli samanaikaisesti vaikutti.

Tavoitteena oli ymmärtää, miten nämä yksittäiset ja vaikeuttaa ETS muutokset voivat vaikuttaa biologiaan eturauhassyöpää. Käyttämällä QRT-PCR tietoja ETS-geenin ilmentymisen ja genomin tietojen arvioimme, onko tietty transkription profiileja liittyivät erillisten ETS ilmentymiskuviot. Käytimme useita kriteereitä minimoimaan mahdollisten sekoittavien vaikutusten läsnäolo useita ETS tekijöitä. Ensimmäinen, QRT-PCR tietoja käytettiin luokitella tarkasti kasvaimet mukaan niiden ETS geenin ilmentymisen aseman. Sitten vain kasvaimista hyvin korkea tai hyvin alhainen ilmentyminen tietyn ETS (ts ≥4 kertaa suurempi tai pienempi kuin keskimääräinen arvo normaalissa eturauhasessa) on siirretty johonkin ryhmään ja mukaan analyysiin. Käyttämällä näitä kriteerejä on noin 80% eturauhasen syöpien oli erittäin sääntelemättömään ilmentymiseen vähintään yhden hallitseva ETS-geenin. Tältä pohjalta tunnistimme kolme suurta kasvain alaryhmään ominaista hallitseva dysregulaatio ETS tekijä: i) kasvainten korkea ERG ilme (ERG

korkea,

n = 14

), ii) kasvaimet korkealla ESE-1 ilmentymisen (ESE1

korkea,

n = 12

) ja iii) kasvaimet matalalla ESE3 ilme (ESE3

alhainen,

n = 13

). Neljäs ryhmä (NoETS,

n = 14

) mukana kasvaimia, jotka oli normaali kaltaisia ​​tasoja kaikkien ETS geenin (Fig. 1A). Kahdeksan kasvaimista ≥4-kertaiseksi-ilmentyminen jommankumman ETV1, ETV4, ETS2 tai ETS1 jätettiin pois analyysistä, koska niiden rajoitettu määrä. ESE1 oli hyvin ilmaistu 26 59 (44%) eturauhasen kasvaimia, mutta vain 12, jotka sisältyvät ESE1

erittäin vahvasti ilmentävä ryhmä, se oli ainoa yliekspressoidaan ETS. ESE3 oli alassäädetty ≥4 kertaiseksi 27 59 (46%) eturauhasen kasvaimia, mutta ainoastaan ​​13 tapausta, jotka olivat mukana ESE3

alhainen ilmentävien ryhmä, se oli ainoa vapautettu ETS. Me soveltaa samanlaista lähestymistapaa yleisesti saatavilla microarray aineisto riippumattoman tutkimuksen [14] saadaan samanlainen jakauma eturauhasen kasvaimia neljään suureen alaryhmään (Fig. S2). Mielenkiintoista on, että meidän sarjassa 6 ja 8 14 ERG

korkea kasvaimet olivat samanaikaisesti väärin säädellystä ilmaus ESE3 ja ESE1, vastaavasti (kuvio. 1A). Samoin julkisella aineisto 15 ERG

korkea kasvaimet olivat samanaikaisesti väärin säädellystä ilmaus ESE3 ja ESE1 (Fig. S2A). Siten ERG yli-ilmentyminen saattaa selvästi rinnalla säädeltyyn ilmentymistä näiden muiden ETS tekijät. Meidän kasvain sarja, 11 14 ERG

korkea kasvaimet (79%) oli positiivinen TMPRSS2: Erga fuusio transkriptio arvioitiin päätepisteenä RT-PCR (Kuva. S3A). Muut ERG yli-ilmentävien kasvainten oli todennäköisesti muun tyyppisiä fuusion transkriptien ei havaita määrityksessä. Seitsemän kasvaimia oli hyvin alhainen TMPRSS2: erga transkriptio loppuun mennessä pisteen RT-PCR, normaali-ilmaisun ERG QRT-PCR ja eivät olleet mukana ERG

korkea ryhmä. Yksikään 8 normaalia näytettä ja 11 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) tutkitut näytteet olivat todisteita TMPRSS2: Erga transkriptin (Fig. S3A). Kliiniset ja patologiset parametrit neljän tuumorin alaryhmään on esitetty kuviossa. S3B. Ei ollut tilastollisesti merkitsevästi yhteydessä ETS alaryhmiä ja jokin arvioitu kliinisissä /patologisia parametrit.

. Expression of ERG, ESE1 ja ESE3 määritettiin qRT-PCR normaalissa eturauhasessa ja eturauhasen kasvaimia. Kasvaimet ovat ryhmitelty pääasiassa ilmaisi ETS tekijä. B. Pääkomponenttianalyysi. Pisteet tarkoittavat yksittäisten näytteiden kanssa niiden sijainti määräytyy pääkomponentit transcriptome. C. lukumäärä erilaisesti ilmaisi geenien kanssa Q≤0.1 kussakin ETS alaryhmä. D-E. Venn kaavioita, joissa jaetaan ja erilliset ilmentyvät eri geenien joukossa osoitti kasvain alaryhmien.

Transkription sovellus Eturauhassyöpä Alaryhmät

Käytimme Principal Component Analysis (PCA) arvioi globaalin aste samankaltaisuuteen tai eroja yksittäisten transcriptomes normaalin ja eturauhassyöpänäytteissä. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, kasvaimet, jotka kuuluvat eri alaryhmiin muodostuu osittain selvä klustereita viittaa siihen, että vaihtelu mahdollisesti transkription ohjelmissa riippui ainakin osittain niiden ETS geeniekspressiomalleja. ERG

korkea ja ESE3

alhainen kasvaimet olivat kaukana normaalin eturauhasen ja pitkälti erillään muista alaryhmiin. Seuraavaksi vertasimme transkription profiileja kasvaimen osaryhmään että normaalin eturauhasen käyttäen Gene Expression Profiili Analyysi Suite (GEPAS) [15] tunnistaa yhteisiä ja eri ominaisuuksia ja purkaa ETS-geenistä allekirjoituksia. Määrä eri tavoin ilmentyvien geenien (Q≤0.1) kunkin alaryhmän on esitetty kuviossa. 1C ja geeni luettelot esitetään taulukossa S1. ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia oli vahvin geeni allekirjoitukset eniten erilaisesti ilmaisi geenien suhteessa normaaliin eturauhasen, kun taas määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien oli huomattavasti vähäisempää ESE1

korkea ja NoETS kasvaimet .

Seuraavaksi ylitimme luettelot differentiaalisesti ilmentyvien geenien suhteessa normaaliin eturauhasen määrittää verran päällekkäisyyttä ja toisistaan ​​poikkeava kasvaimen alaryhmien (Kuva. 1D-E). Erityisesti ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia jaettu monet ilmentyvät eri geenit on suuri päällekkäisyys sekä säädellään ylöspäin ja alas- geenien, mikä osoittaa, että muuttunut ilmentyminen ERG ja ESE3 oli osittain samanlaisia ​​vaikutuksia. Toisaalta, ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia oli useita erityispiirteitä suhteessa nro ETS (Fig. 1 D) ja ESE1

korkea (Kuva. 1 E) kasvaimia. Nämä erot geeniperimä päällekkäisyys oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,0001, Fisherin tarkka testi). Geenit moduloitu sekä ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia, mutta ei toisessa kasvain alaryhmien, jotka oli valittu 3-tie (Fig. 1 D) ja 4-tie (Fig. S4) Venn kaaviot, luetellaan taulukossa S2.

Ymmärtääksemme toiminnalliset vaikutukset eroja kasvaimen alaryhmien käytimme Metacore, ohjelmistopaketti integroituun toiminnallinen analyysi geenien ilmentyminen tietoja [16]. Metacore sallittu kartoittaa yhteisiä samanlaisia ​​ja ainutlaatuisia ominaisuuksia joukossa kasvain alaryhmien ja määritellä yhteisesti ja vaikuttaa eri Gene ontologia reittejä. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, oli paljon yhteisiä ja samanlaisia ​​piirteitä, muun kasvaimen alaryhmissä. Toisaalta, ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia oli eniten ainutlaatuisia ominaisuuksia. Top yleisesti vaikuttaa GeneGo reitin kartat (GGPM), kuvassa. 2B, mukana

immuunivaste, solun tukirangan remontin, kehittäminen, solusyklin

ja

transkription säätelyyn

. Ne voivat edustaa geenejä ja reittejä yleisesti aktivoidaan kasvaimissa verrattuna normaaliin kudokseen. Differentiaalisesti vaikuttaa GGPMs olivat vallitsevasti tai yksinomaan rikastettu ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia (Fig. 2C). Top differentiaalisesti vaikuttaa GGMPs mukana

Soluadheesioon integriinin välittämä

,

tukirankansa remodeling

,

Soluadheesioon ECM remodeling

ja

Soluadheesioon kemokiinit

, viittaa siihen, että aktivointi näistä reiteistä, jotka liittyvät solujen vaeltamiseen ja invaasio, voisi olla hallitseva piirteitä näistä kasvaimista. Mielenkiintoista, nämä tiedot sekaantunut myös, että ESE3 menetys oli seurauksia aivan samanlainen kuin ERG yli-ilmentyminen on transkription ohjelma eturauhasen kasvaimia.

. Useita ainutlaatuisia, samankaltaisia ​​ja yhteisiä piirteitä keskuudessa differentiaalisesti ilmentyvien geenien verrattuna normaaliin eturauhasen ERG

korkea, ESE3

alhainen, ESE1

korkea ja NoETS kasvaimet mukaan Metacore. B. Yleisesti vaikutti GeneGo Pathway Maps kasvaimen alaryhmiin. C. Differentially vaikutti GeneGo Pathway Maps ERG

korkea, ESE3

alhainen, ESE1

korkea ja NoETS kasvaimia.

ERG ylössäätelee EZH2 Expression eturauhastuumoreissa

Kattava arviointi ETS geenin ilmentymisen ja genomista tiedot osoittivat vahvaa ja osittain päällekkäisiä geeni allekirjoitukset ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia monia aktivoitu ja tukahdutettu geenejä. Seuraavaksi etsimme ERG

korkea ja ESE3

alhainen allekirjoitukset kohdegeenien, joka voisi toimia keskeisten solmujen vaikutukset välittyvät nämä poikkeavasti ilmaisi ETS tekijöiden eturauhassyövän transcriptome. EZH2 oli yksi 169 ylös geenien sekä ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia geenejä (Fig. S4 ja taulukko S2), kun se ei lisääntynyt muissa kasvain alaryhmiin. EZH2 myös korreloi positiivisesti ERG ja korreloi negatiivisesti ESE3 on korrelaatio analyysi koko microarray aineisto (taulukko S3). EZH2 on histoni H3 lysiinin 27 (H3K27) metyylitransferaasiestäjiä ja avainasemassa epigeneettisellä geenien [17], [18]. H3K27 metylaatio on Histonimerkki joka luo ankkurointi pisteen lisähenkilöstön kromatiinin remontin tekijöitä indusoi tukahduttavan chromatin tilassa [17]. Siten induktio EZH2 liittyy ERG voitto ja ESE3 tappio voitaisiin edistää laajaa tukahduttava allekirjoitus havaitaan näiden kasvainten (Fig. 1 C). EZH2 on osoitettu olevan säädelty vahvistavasti eturauhassyövissä verrattuna normaaliin eturauhasen erityisen korkeampi korkea laatu ja etäpesäkkeitä [19]. Kuitenkin muutamia tekijöitä on tunnistettu, jotka saattavat lisätä EZH2 ilmentymistä eturauhastuumoreissa [20], [21], [22], [23]. Olemme havainneet, että EZH2 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin ERG

korkea kasvaimet verrattuna sekä normaalissa eturauhasessa ja NoETS kasvaimet (Fig. 3A), mikä osoittaa, että saattaa olla suora yhteys EZH2 ja ERG ilmaisua, joita ei ole kirjattu aiemmin. Tämän mukaisesti havainnon, EZH2 oli merkitsevästi korkeampi ERG

korkea verrattuna NoETS kasvaimia (Q 0,0001) myös itsenäisessä aineisto (Fig. 3B).

. EZH2 ilmentymistä kudosnäytteistä. Microarray tiedot esitetään log2 tunnusluvut verrattuna viite. B. EZH2 ilmentyminen NoETS ja ERG

korkea kasvaimia Wallace et al. microarray aineisto. C. EZH2 ilmaisun LNCaP ja 22Rv1 soluja transfektoitiin tyhjällä (

ev

) tai ERG lauseke (

Erg

) vektori määritettiin RT-PCR (

jäljellä

) ja Western blot (

oikea

). D. EZH2 tason valvonta ja vakaa ERG ilmentäviä 22Rv1 ja LNCaP määritettiin RT-PCR (

ylempi

) ja Western blot (

alhaalla

). E. EZH2 tasolla VCAP soluissa ohimenevästi transfektoitu ohjaus ja ERG-specific (siERG) siRNA määritettiin RT-PCR (

jäljellä

) ja Western blot (

oikea

). F. siru osoitettuun solulinjoissa ERG-aineen ja qPCR kanssa alukesarjoista kattaa EBS on EZH2 promoottori. Positiivinen (MMP3 promoottori) ja negatiivinen (ETS2) ohjaimet näkyvät kuvassa. S6A-B ja 7A vastaavasti. G Tissue yksilöitä ERG

korkea ja NoETS kasvaimet alistettiin piiri anti-ERG vasta-aineella ja analysoitiin qPCR. ETS2 käytettiin negatiivisena kontrollina (kuvio. S7b). *, P 0,01; **, P 0,0001.

Seuraavaksi tutkittiin toiminnallinen suhde ERG ja EZH2 ja mahdollisuus suoraan sääntelyn EZH2 ERG eturauhassyöpäsoluissa, jossa me kokeellisesti ylös- ja alaspäin -regulated ERG. Näissä kokeissa olemme yli-ilmentynyt ERG in ERG-translokaatio negatiivinen 22Rv1 ja LNCaP eturauhassyövän solut, jotka eivät ekspressoi endogeenistä ERG. Kun transfektio, 22Rv1 ja LNCaP ilmaisi ERG samalle tasolle TMPRSS2: ERG translokaatio positiivinen VCAP soluja (Kuva. S5a). Samanaikaisesti, knock-down ERG suoritettiin VCAP soluissa käyttäen ERG erityisiä siRNA. Taso ERG RNA: n ja proteiinin väheni merkittävästi siRNA transfektoiduissa soluissa verrattuna ohjata Vcap solut (Fig. S5B). Validoiminen solun malleja, tutkimme geenien ilmentymistä, kuten MMP3, PLA-1 ja CRISP3, jotka olivat yläosassa luettelon up geenien in ERG

korkea kasvaimia ja oli aiemmin osoitettu olevan hallinnassa ERG muissa solujärjestelmiin [6]. Näiden geenien ilmentymistä lisääntynyt upon ERG yli-ilmentyminen 22Rv1 ja LNCaP-soluissa (kuvio. S5c) ja väheni kun ERG knock-down in VCAP soluissa (Kuva. S5d). Nämä tulokset osoittivat riittävyyttä meidän solujen mallien tutkimaan mahdollisia ERG kohdegeenien yhdessä ennustearvo geenin allekirjoitusten että me johdettu eturauhassyöpään kliinisistä näytteistä.

Sekä ohimenevää ja vakaa ilmentyminen ERG in ERG-negatiivinen LNCaP ja 22Rv1 solujen lisännyt tasolle EZH2 (Fig. 3C-D). Lisäksi EZH2 mRNA ja proteiini vähenivät upon siRNA-välitteinen knock-down ERG vuonna VCAP soluissa (Kuva. 3E). Muutokset EZH2 ilmaisun huomioitava ylä- ja alaspäin sääntely ERG ehdotti mahdollisuutta suora sääntely ERG. Havaitsimme otaksuttu ETS sitoutumiskohtia (EBSS) alle 1 kb EZH2 TSS mukaan laskennallisen analyysin ja suoritetaan ChIP pyritty ottamaan huomioon ERG pystyi sitoutumaan näitä sivustoja (Fig. 3F). Sitoutuminen ERG on EZH2 promoottori havaittiin ERG translokaatio positiiviset VCAP soluissa ja LNCaP ja 22Rv1 solujen päälle stabiili ilmentymä ERG, kun taas ole sitovaa nähtiin kuin ERG ilmentävien vanhempien LNCaP ja 22Rv1 soluja (Fig. 3F). Vastaavasti, ERG on sitoutunut MMP3 geenin, joka on tunnettu ERG tavoite käytetään tässä positiivisena kontrollina, vain ERG ilmentävien kloonien ja Vcap-soluissa (kuvio. S6A). O sitoutuminen ERG nähtiin, että ETS2 promoottori, jota käytettiin negatiivisena kontrollina (kuvio. S7A). Alue on ETS2 promoottorin arvioidaan ChIP sisältyvät transkription aloituskohdasta ja sekä RNA-polymeraasi II: n ja Sp1 oli osoitettu sitoutuvan alueen geelin shift ja ChIP määritykset ([24], ja tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tiedot tukevat päätelmää, että ERG toimi transkriptionaalisen aktivaattorin EZH2 sitoutumalla sen promoottorin. Lopuksi, todistaa, että tämä vuorovaikutus tapahtui myös kliinisissä Tuumorinäytteet suoritimme sirun arvioida sitoutuminen ERG on EZH2 promoottori ERG

korkea ja NoETS näytteitä (Fig. 3G). ERG liittyi sen EZH2 promoottori ERG

korkea kasvaimia, kun se oli poissa NoETS kasvaimissa, sopusoinnussa hypoteesin, että se kontrolloi transkriptiota tämän geenin. Spesifisyys osoitettiin puuttuminen sitoutumisen ERG on ETS2 promoottori kasvain näytteissä (kuvio. S7b).

ERG tukahduttaa Nkx3.1 eturauhastuumoreissa kautta EZH2 ja histoni H3K27 Metylointi

lisäksi säädelty geenien transcriptome ERG

korkea kasvaimet sisälsivät useita geenejä, joiden ilmentyminen väheni merkittävästi verrattuna normaaliin eturauhasen, mikä viittaa siihen, että nämä geenit voidaan tukahdutettu joko suoraan tai välillisesti ERG. Luettelo alas geenien in ERG

korkea kasvaimia sisälsi useita asiaan geenejä, joilla voi olla merkittävä vaikutus eturauhassyövän biologian. Niistä geenit, joiden tiedetään tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja, olemme keskittyneet Nkx3.1, joka samalla vaikutti ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia. Nkx3.1 on eturauhasspesifinen homeobox-geenin ja transkription tekijä, joka on kriittisten toimintojen eturauhasessa kehittämiseen ja kasvaimen suppression [25]. Menetys Nkx3.1 ilme on yleinen tapahtuma eturauhasen kasvainten synnyssä ja syyksi on erilaisia ​​mekanismeja kuten alleeliset menetys, metylaatio ja transkription jälkeisiin hiljentäminen [25], [26], [27], [28]. Huomasimme, että taso Nkx3.1 väheni merkittävästi ERG

korkea kasvaimet verrattuna normaalissa eturauhasessa ja NoETS kasvaimet (Fig. 4A). Sen määrittämiseksi, onko Nkx3.1 alassäätöä oli toiminnallisesti liittyvät ERG yli-ilmentyminen, tutkimme taso Nkx3.1 eturauhassyöpäsoluissa kun modulaatio ERG. ERG knock-down in VCAP soluissa lisännyt Nkx3.1 ilmentymistä mRNA ja proteiini tasolla (Fig. 4B). Toisaalta, Nkx3.1 taso aleni stabiili ilmentyminen ERG in ERG negatiivinen LNCaP ja 22RV1 soluja, jotka tarjoavat lisää todisteita valvonnan Nkx3.1 ilmentymisen ERG (Fig. 4B). Koska ETS tekijät voivat toimia transkription aktivaattoreita tai repressorien riippuen promoottori yhteydessä [10], [29], me etsinyt Nkx3.1 promoottori mahdollisia EBS jotka voisivat välittämä ERG sitova. Laskennallinen analyysi osoitti, että läsnä on oletetun EBS on Nkx3.1 promoottori. ChIP analyysit osoittivat sitoutumisen ERG tämän alueen promoottorin Vcap soluissa (Fig. 4C). ERG miehitetty Nkx3.1 promoottori myös LNCaP ja 22Rv1 solujen päälle vakaa ERG ilmaisun ja samanaikaisesti sen hiljentäminen geenin (Fig. 4C). Siten sitoutuminen ERG on Nkx3.1 promoottori oli liittynyt transkriptionaalisen tukahduttamisen geenin. Havaitsimme Nkx3.1 promoottori käyttöasteen ERG myös kliinisissä Tuumorinäytteissä suorittamalla siru ERG

korkea ja NoETS kasvaimia. ERG on sitoutunut Nkx3.1 promoottori ERG

korkea kasvaimet, sopusoinnussa hypoteesin, että se kontrolloi negatiivisesti geenin transkriptio tämän kasvaimen alaryhmässä (Fig. 4D).

. Nkx3.1 ilmentyminen normaalissa ja kasvaimen kudosnäytteistä. B. Nkx3.1 tasolla LNCaP ohimenevästi transfektoitu tyhjällä (

ev

) tai ERG lauseke (

Erg

) vektori määritettiin Western blot (ylempi paneeli), Nkx3.1 taso VCAP solut transfektoitiin ohimenevästi siERG ja ohjata siRNA määritettiin RT-PCR: llä ja Western blot (keskimmäinen paneeli), Nkx3.1 tason valvonta- ja vakaa ERG-ilmentävien 22Rv1 ja LNCaP-solut analysoitiin RT-PCR: llä ja Western blot (alapaneeli). C. sitoutuminen ERG on Nkx3.1 promoottori määräytyy siru ja qPCR indikoidun solulinjoissa. Negatiiviset kontrollit kuviossa. S7A. D. Tissue yksilöitä ERG

korkea ja NoETS kasvainten alistettiin piiri anti-ERG vasta-aineella ja analysoitiin qPCR. Negatiiviset kontrollit kuviossa. S7b. E. Vcap, vanhempien (kontrolli) ja ERG ekspressoivat (ERG 18) LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu EZH2 erityisten (siEZH2) ja valvoa siRNA ja analysoitiin RT-PCR: llä. F. siru vasta-metyloidulle H3K27 ja qPCR kanssa alukesarjoista kattaa EBS (

yläpaneeli

) ja androgeeniresponsiivinen tehostajana (ARE) (

alapaneelin

) kun Nkx3.1 geenin. ETS2 käytettiin negatiivisena kontrollina (kuvio. S8A). G. Nkx3.1 promoottorin aktiivisuus LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu ihmisen Nkx3.1 promoottori reportteri yhdessä mainituilla ilmentämis- vektoreita. Lusiferaasireportteri- aktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua. H. Nkx3.1 proteiinin taso LNCaP-soluissa ohimenevästi transfektoitu tyhjällä (-) tai joko ERG (Perg) tai EZH2 (pEZH2) Ekspressiovektori määritettiin Western blot. I. Nkx3.1 promoottorin metylaation arvioitiin ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: n sekvensointi. Tyhjät ja täytetyt ympyrät edustavat metyloitumattoman ja metyloitu CpG sivustoja, vastaavasti. *, P 0,01; **, P 0,001.

onko induktio EZH2 ERG voisi myötävaikuttaa vaiennettaisi Nkx3.1, koputimme alas EZH2 in ERG ilmentävissä soluissa. siRNA-välitteinen knock-alas EZH2 in Vcap solujen lisääntyneen ilmentymisen Nkx3.1, sopusoinnussa hypoteesin, että geeni oli valvonnassa EZH2 näissä soluissa (kuvio. 4E). Lisäksi EZH2 knock-down in ERG ilmentävät LNCaP klooneja osittain palautettu Nkx3.1 ilmaisun tasolle samanlainen kuin vanhempien LNCaP-soluja (kuvio. 4E). Edelleen todistaa roolin EZH2, päätimme Chip onko Nkx3.1 promoottori hankki H3K27 metylaatio merkki tyypillistä EZH2 aktiivisuuden soluissa, joissa geeni oli tukahdutettu. Havaitsimme lisääntynyt H3K27 metylaation ympäröivällä alueella EBS, jota tunnistettavissa promoottorissa, ja tasolla androgen reagoiva tehostajana (ARE), joka on tärkeä sääntelyn sivusto Nkx3.1 geeni [30] vuonna ERG- translokaatio positiiviset VCAP soluja (Fig. 4F). Samanlainen rikastaminen H3K27 metylaation havaittiin myös LNCaP ja 22Rv1 solujen vakaata ilmentymistä ERG (Fig. 4F). Siten Nkx3.1 hankki tukahduttava merkki ominaisuus EZH2 aktiivisuuden ERG-riippuvaisella tavalla. Yhdessä nämä tiedot huomioon, että Nkx3.1 oli tavoite sekä ERG ja EZH2. ERG tukahdutettu Nkx3.1 suoraan sitomalla sen promoottorin ja välillisesti induktion EZH2 ja H3K27 metylointi. Lusiferaasireporttiterilla määritykset ja ohimeneviä transfektiokokeis- tuki tätä hypoteesia. Nkx3.1 promoottorin aktiivisuus ja proteiinin taso alennettiin, kun väliaikainen ekspressio ERG LNCaP-soluissa (kuvio. 4G-H). Sen sijaan, ohimenevä transfektio EZH2 yksinään ei ollut vaikutusta Nkx3.1 promoottorin aktiivisuutta reportterimääritys tai Nkx3.1 proteiinin taso (Fig. 4G-H), mikä osoittaa, että EZH2 tarvitaan ERG ja stabiilin ekspression hiljentää Nkx3.1. Nämä havainnot ovat siten sopusoinnussa kyky ETS tekijöitä toimimaan vaihtoehtoisesti transkriptioaktivaattorina ja repressori [10], [29] ja sen hypoteesin kanssa, että transkriptio tekijät voivat vaikuttaa rekrytointi epigeneettiset efektorien kuten EZH2 geenien promoottorit [31].

hankinta tukahduttavia histonimerkkien, kuten H3K27 metylaatio, on vain yksi monista mekanismeja, jotka auttavat vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille syöpäsoluissa [18]. Promoottori Nkx3.1 geenin sisältää CpG-saarekkeen, ja geeni on raportoitu vaiennetaan CpG-promoottorin metylaation eturauhastuumoreissa [26]. Niinpä määrittää, onko DNA: n metylaatio oli mukana myös ERG aiheuttama Nkx3.1 hiljentäminen. Bisulfiitti sekvensointi osoitti Koska CpG metylaatio Nkx3.1 promoottorin ERG-translokaatio positiivisia Vcap soluja ja ERG ilmentävät ja ei-ilmentävien LNCaP-soluja (kuvio. 4I). Sen sijaan Nkx3.1 promoottori metyloitu ERG-translokaatio negatiivinen PC3 eturauhassyövän solut, jotka eivät ekspressoi Nkx3.1 (Fig. 4I), mikä osoittaa, että näissä soluissa Nkx3.1 hiljennettiin CpG-promoottorin metylaation. Siten ERG aiheuttama Nkx3.1 hiljentäminen pääosin pitäytynyt EZH2 ja oli riippumaton promoottorin metylaation, sopusoinnussa aktivoituminen Nkx3.1 ilmaisun upon EZH2 knock-down.

ESE-3 tukahduttaa EZH2 ja Aktivoi Nkx3.1 transkriptio

transcriptome ERG

korkea ja ESE3

pieni kasvaimia jaettu monien geenien yhteistä. Tämä viittaa siihen, että ERG ja ESE3 voi vaikuttaa monien geenien transkription vastakkaisiin suuntiin ja että ERG ylössäätöä ja ESE3 alassäätöä voi johtaa osittain samankaltaisia ​​vaikutuksia eturauhassyövän transcriptome. Kuten nähdään ERG

korkea kasvaimet, EZH2 oli merkitsevästi korkeampi ESE3

alhainen kasvaimissa verrattuna normaalissa eturauhasessa ja NoETS kasvaimet (Kuva. 5A). Käänteinen suhde ESE3 ja EZH2 ekspressiotaso havaittiin myös itsenäinen microarray aineisto (Q 0,0004) [14] (Fig. 5B; S2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ESE3 voi säädellä negatiivisesti EZH2 eturauhasen ja menetys ESE3 saattaisi johtaa EZH2 ilmentymistä eturauhastuumoreissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me syntyy kloonit LNCaP (ESE3-

kd

), jossa me vakaasti tippuu alas ESE3 käyttäen shRNA rakentaa. Nämä kloonit oli merkittävästi alhaisempi ESE3 verrattuna emo-LNCaP-solut, jotka ilmentävät havaittavia määriä ESE3 (Fig. S5E). Yhdenmukainen hypoteesia, ESE3-

kd

LNCaP oli korkeampi ilmentyminen EZH2 kuin vanhempien soluja (Kuva. 5C). Sen määrittämiseksi, ovatko ESE3 kontrolloi ilmentymistä EZH2 myös normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen me vakaasti knock-down ESE3 kuolemattomissa LHS soluissa [32], joita olemme osoittaneet aikaisemmin ilmaista ESE3 [11]. Kuten on esitetty kuviossa.