Krooninen sairaus

tiivistelmä

Peritoneaalidialyysi etäpesäke on yleisin tyyppi uusiutumisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän (GC) ja liittyy huono ennuste. Vatsakalvon huuhtelu sytologia, käytetään arvioitaessa riskiä vatsakalvon etäpesäkkeiden, on alhainen herkkyys. Täällä arvioimme diagnostinen potentiaalia exosomal miRNA profiilien peritoneaalinesteeseen ennustamiseen vatsakalvon levittämistä GC. Kokonais-RNA uutettiin eksosomeiksi eristettiin kuudesta mahalaukun maligni askites (MA) näytteet, 24 vatsakalvon huuhtelu nestettä (PLF) näytteet, ja supernatantteja (CM) kahden ihmisen mahakarsinooman solulinjoja, jotka eroavat mahdollisuuksia vatsakalvon etäpesäke. Expression of exosomal miRNA arvioitiin Agilent Human miRNA mikrosiruja ja kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR). Microarray analyysi osoitti matalan vaihtelua lukumäärän ja signaalin voimakkuus miRNA havaittujen joukossa näytteitä. Kuudessa MA nesteet, miR-21 osoitti korkeimman signaalin intensiteettiä. Määrittelimme viisi miRNA (miR-1225-5p, miR-320c miR-1202, miR-1207-5p, ja miR-4270), jossa voimakasta ilmentymistä MA näytteissä PLF on kalvojenpoiston-invasiivisia GC, ja CM on erittäin metastaattinen GC solulinja; Näiden ehdokas miRNA lajit näyttävät liittyvän vatsakalvon levittämiseen. Differential ilmentyminen miR-21, miR-320c ja miR-1225-5p oli validoitu PLF on kalvojenpoiston-invasiivisia ja ei-invasiivisia GC by qRT-PCR ja miR-21 ja miR-1225-5p vahvistettiin liittyvän kanssa seröösisiä invaasio GC. PLF voidaan profiloida ilmentymisen exosomal miRNA. Tulosten perusteella näyttää, että miR-21 ja miR-1225-5p voivat toimia biomarkkerissa vatsakalvon uusiutumisen jälkeen parantava GC resektio, mikä tarjoaa uutta lähestymistapaa varhaiseen diagnosointiin vatsakalvon levittämisen GC.

Citation: Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, Yashiro M, Hirakawa K, et ai. (2015) Exosomal miRNA alkaen peritoneum huuhtelunäytteessä mahdollisina Prognostic biomarkkerit peritoneaalisille Etäpesäke mahasyövän. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10,1371 /journal.pone.0130472

Toimittaja: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 01 helmikuu 2015; Hyväksytty: 20 toukokuu 2015; Julkaistu: 24 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä (19-23 nukleotidia) ei-koodaavat RNA: t, jotka toimivat transkription jälkeinen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen ja tärkeitä rooleja valvonnassa monia biologisia prosesseja, kuten solun erilaistuminen, proliferaatio, ja apoptoosin [1]. MiRNA on osoitettu olevan onkogeenisia tai kasvaimeen estävä vaikutus, ja sääntelemättömään ilmentymiseen monissa miRNA laji on todettu, että useissa syövissä, mikä viittaa siihen, potentiaalinen sovellus miRNA biomarkkereina syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [2-5].

miRNA kääritään eritys- mikrovesikkeleille (esim eksosomeiksi, apoptoottiset kappaleet, ja irtoaminen mikrorakkulat), joka suoja miRNA hajoamiselta RNaasi ja toimivat ajoneuvot miRNA erityksen solun ulkopuoliseen tilaan ja kehon nesteiden. Eksosomit ovat pieniä membranous rakkulat, jotka ovat sekaantuneet soluimmuunivasteiden; Kuitenkin viime aikoina on käynyt selväksi, että eksosomeiksi sisältävät merkittäviä määriä RNA: ta ja voivat olla mukana immuuni-riippumaton sääntelymekanismeja. Nyt on todettu, että eksosomeiksi voi suorittaa solujen välisen siirron miRNA, mikä osallistuvat miRNA-pohjainen signalointimekanismeja [6]. Korkeampi miRNA sisältävien eksosomeiksi on myös havaittu plasmassa syöpäpotilaiden kuin terveiden yksilöiden [7], mikä viittaa siihen, että eksosomi perustuva miRNA eritystä on mukana syövän kehittymisessä. Analyysi poikkeava miRNA ilmaisun seerumissa, syljen, ulosteiden ja virtsan on ollut työssä varhaiseen toteamiseen B-solujen lymfooma, ja suun, suoliston, ja virtsarakon syövät [8-11].

Mahasyöpää (GC) on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [12]. Vatsakalvon on yleisin sivusto etäpesäke ja toistumisen GC, ja maligni askites (MA), aiheuttama vatsakalvon levittämistä syöpäsoluja, on yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tällä hetkellä ei ole olemassa luotettavaa ennustavat kehittämiseen pahanlaatuisia vatsakalvon askiteksen GC potilailla. MiRNA sisältävä eksosomeiksi edustaa uutta mekanismia Parakriiniset ja voi tuottaa oivalluksia ympäristöön, joka sallii syöpä leviämisestä vatsakalvon [13].

Tässä tutkimuksessa eksosomeiksi eristettiin MA ja intraoperatiivisessa vatsakalvon huuhtelunäytteessä (PLF) saatujen näytteiden GC potilaista, ja viljelyalusta (CM) on erittäin invasiivinen vatsakalvon solulinjat, ja miRNA uutettiin sitten näistä näytteistä. Laatu uutettiin exosomal miRNA ja johdonmukaisuuden miRNA ekspressiokuvioiden todennettiin. Mirna ilmaisun profiilit MA, PLF, ja CM näytteitä verrattiin ja ehdokas miRNA liittyvät vatsakalvon levittämiseen GC tunnistettiin.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Kaikki potilaat tai huoltajien toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Yokohama City University Hospital (hyväksynnän nro A110127001).

MA ja intraoperative PLF kerättiin GC potilaiden kanssa kliinis ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Kaikki potilaat olivat aiemmin olleet diagnosoitu GC mukaan histopatologista analyysiä otettujen koepalojen ensisijaisesta vaurioita, ja kuusi MA potilasta oli diagnosoitu läsnäolo Vesivatsanesteestä vatsan tietokonetomografia (CT) skannaus. Askites analysoitiin myös sytologian ja kaikki vahvistettiin positiivisiksi maligniteettiriski mukaan patologian; loput MA näytteitä käytettiin miRNA eristämistä. PLF otettiin leikkauksen aikana kerättiin 24 GC potilaista (taulukko 1). Sen jälkeen laparotomy, 100 ml normaalia suolaliuosta kaadettiin pussi Douglas ja vatsakalvon huuhtelu vedellä kerättiin ennen resektioleikkaukselle kasvain. PLF analysoitiin sytologian ja käytetään miRNA eristämistä. Niistä 24 PLF näytteitä, kuusi analysoitiin käyttämällä miRNA mikrosirujen ja 18 analysoitiin qPCR.

Hyvin eriytetty adenokarsinooma (hyvin); kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma (mod); huonosti eriytetty adenokarsinooma (huono). Maligni askites (MA); Peritoneaalisille huuhtelunäytteessä (PLF); TMN vaiheessa (UICC 7. painos); Present (P) Absent (A); Peritoneaalisille huuhtelu sytologia (CY);

Soluviljely

OCUM-2M solulinja perustettiin ensisijaisesta kasvain scirrhous mahakarsinooman ja OCUM-2MD3 solulinja oli peräisin OCUM-2M solujen suuria mahdollisuuksia vatsakalvon levittämistä nude-hiirissä [14]. Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootti-antimykootin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 yrityshautomo. Saada solun CM, OCUM-2M ja OCUM-2MD3 solut pestiin kolme kertaa seerumittomalla DMEM: antibiootti-antimykoottia ja inkuboitiin samassa väliaineessa 48 tuntia.

eristäminen eksosomeiksi

Näytteet eksosomi eristämistä valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Poistaa suuri solu hiukkaset ja solujäte, MA, PLF, ja CM sentrifugoitiin 2000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja suodatettiin 0,22 um: n suodattimen (Millipore, Billerica, MA). Supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan miRNA uuttamalla.

saostamiseksi eksosomeiksi, näytteitä sentrifugoitiin 110,000 x

g

70 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Eksosomi Pelletti pestiin 11 ml: lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja sentrifugoitiin uudelleen, kuten on kuvattu. Pelletti käytettiin RNA.

Yhteensä RNA ja analyysi

Yhteensä RNA uutettiin eksosomeiksi käyttäen miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden ja oli sitten varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan tarkempaa analyysiä.

laatu, keskittyminen, ja koko koko exosomal RNA arvioitiin käyttäen Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Ennen analyysiä, valmistettiin kokonais-RNA käyttäen Agilent RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies) mukaisesti valmistajan protokollan.

miRNA microarray

miRNA uutetaan kuusi MA, kuusi PLF, ja kaksi CM näytteet analysoitiin käyttäen Agilent Human miRNA mikrosirut (Agilent Technologies), jotka sisältävät 1226 ihmisen miRNA ja 146 ihmisen viruksen miRNA. Sillä miRNA havaitsemista, 100 ng RNA leimattiin ja hybridisoitiin käyttäen ihmisen miRNA Microarray Kit (Rel 16,0; Agilent Technologies) mukaan valmistajan protokollan (miRNA Complete nimeäminen ja Hyb kitti miRNA Microarray System). Hybridisoitumissignaaleja havaittiin DNA Microarray Scanner G2505C (Agilent Technologies) ja skannatut kuvat analysoitiin käyttämällä Agilent Feature Extraction Software (v. 10.7.3.1). Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Agilent GeneSpring GX-ohjelmisto v. 11.0.2. (Log

2 muutosta). Perustason muutos ei suoritettu.

laatu miRNA uuttamalla analysoitiin mukaisesti vaihtelun määrän microarray-havaittiin miRNA lajeja, signaalin voimakkuus, ja korrelaatio miRNA ilmaisun kesken näytteiden mukaan keskiarvo ± SD, variaatiokerroin (CV), ja korrelaatiokerroin (CC).

valinta vatsakalvon etäpesäkkeiden erityisiä miRNA

ilmaisu profiilit exosomal miRNA analysoitiin valitsemaan miRNA jotka ovat spesifisiä GC vatsakalvon levitys käyttäen seuraavia vaiheittaista lähestymistapaa. Vaihe 1: miRNA profiileja CM erittäin metastaattinen vatsakalvon OCUM-2MD3 soluja verrattiin emo ei-metastaattinen OCUM-2M-soluja, ja ilmentyvät differentiaalisesti miRNA (keskimääräinen kertamuutosta, 2) on valittu.

Vaihe 2: kuusi PLF näytteet luokitellaan kahteen ryhmään: T4 (n = 4) ja T1-T3 (n = 2), mukaan syövän vaiheessa kasvaimen koon ja laajennus (UICC-AJCC, 7

painos). Vaiheessa T4 GC on tunnettu siitä, että korkein taajuus vatsakalvon etäpesäkkeitä verrattuna muihin vaiheisiin [16]. Mirna ekspressioprofiilit T4 ryhmässä verrattiin T1-T3 ryhmä ja ilmennetty eri miRNA (keskimääräinen kertamuutosta, 2) valittiin.

Vaihe 3: valitun miRNA jotka ovat yhteisiä molemmat vaiheet ja jotka ilmaistiin MA olivat edelleen suodatettua mukaan signaalin intensiteettiä. Ne, joilla on voimakkuus arvojen yli log

2 10 MA ja PLF valittiin ehdokkaaksi miRNA liittyvät peritoneaalisille etäpesäkkeitä; miR-21 osoitti korkein keskimääräinen signaalin intensiteettiä keskuudessa MA näytteitä. Differentiaalinen ilmentyminen miRNA lajien valitaan vaiheesta 3 validoitu loput 18 PLF näytteistä qRT-PCR.

kvantitatiivinen analyysi vatsakalvon etäpesäkkeiden erityisiä miRNA ilmentyminen qRT-PCR

TaqMan microRNA määritykset (Life Technologies) käytettiin määrittämään suhteellinen ekspressiotasot miR-21 (määritys ID. 000397), miR-320c (määritys ID. 241053_mat), miR-1225-5p (määritys ID. 002764), ja miR-16 (määritys ID. 000391). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen TaqMan-miRNA RT Kit (Life Technologies), seuraavissa olosuhteissa: 30 min 16 ° C: ssa, 30 min 42 ° C: ssa, ja 5 min 85 ° C: ssa. PCR suoritettiin 96-kuoppalevyillä käyttäen 7500 Real Time PCR System (Life Technologies); Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Ilmentymistasojen kohde-miRNA normalisoitiin että miR-16, jota käytettiin stabiilisti ilmaistu ohjaus [17]. Analysoidessamme microarray data exosomal miRNA in pahanlaatuinen askites näytteistä miR-16 esitetään alin variaatiokerroin (CV = 4%) joukossa ehdokas sisäisiä standardeja, mukaan lukien miR-638 (CV = 8%), anna-7a (CV = 8%), ja 142-3p (CV = 23%).

tilastollinen

Jatkuva muuttujia verrattiin Studentin

t

-testi. Tarvittaessa

t

-testi muutettiin vertailla epätasainen vaihtelut. Ero kategorinen muuttujien arvioitiin käyttämällä Fisherin testiä. Korrelaatio kahden muuttujan arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä P 0,05. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 21.0 ohjelmisto Windows (IBM, Armonk, NY).

Tulokset

kvantitatiivinen analyysi uutettu exosomal RNA

Yhteensä RNA eristettiin eksosomeiksi eristetty alkaen MA, intraoperatiivisen PLF, ja solujen CM. Mediaani pitoisuus uuttaa exosomal RNA oli 4,4 ng /ul (vaihtelee 1,2-6,1 ng /ul) ja MA ja 6,4 ng /ul (1,7-16,4 ng /ul) ja PLF. Elektroferogrammit paljasti suurta joukkoa pieniä RNA-lajien läsnä kaikissa CM ja kliinisistä näytteistä, kun taas vähän tai ei ollenkaan saastumisen 18S- ja 28S ribosomaalinen RNA (ei erillistä piikit vastaava molekyylipaino) havaittiin (kuvio 1).

vaihtelu ja yhtenäisyyttä näytteiden välillä tutkittiin. Arvio koko exosomal RNA hyödynsi Bioanalyzer 2100. elektroferogrammit esittävät kokojakauma (nukleotidit, nt) ja fluoresenssin intensiteetti (FU) koko exosomal RNA eristettiin CM, MA, ja PLF. Pienin piikki (noin 25 nt) kussakin näytteessä on markkeri Agilent RNA 6000 Pico kit.

Suorituskyky miRNA mikrosiruja

testaamiseksi ilmentymisen exosomal miRNA mikrosiruja vuonna kunkin ryhmän näytteiden selvitimme havaittujen miRNA, prosenttipiste signaalin intensiteettiä, määrä yleisesti kiinni miRNA, ja korrelaatio miRNA ilmaisun ryhmien kesken. Numerot miRNA lajien havaittu kunkin ryhmän microarray on esitetty kuviossa 2. kuuden MA ja kuusi PLF näytettä, nämä tarkoittavat luvut olivat 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) ja 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), vastaavasti. Kussakin ryhmässä, vaihtelevuuden havaittujen miRNA joukossa näytteitä oli alhainen.

Signaalin intensiteetin jakauma kunkin ryhmän on esitetty kuviossa 3; tämä osoittaa käsiteltyjen signaalien normalisoida 25, 50, 75, ja 90

persentiilin kussakin ryhmässä. Vuonna 50

persentiili, log

2 suhteellinen signaali intensiteettiä MA (kuviot 3-1) ja PLF (kuviot 3 ja 2) näytteet ja joukossa kolme ryhmää (MA, PLF, ja CM, kuviot 3 ja 4) olivat 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), ja 4,97 ± SD (CV = 5,24%), tässä järjestyksessä. Vaihtelevuus signaalin intensiteetin keskuudessa näytteet kussakin ryhmässä sekä ryhmien kesken oli alhainen.

numerot miRNA yleisempää näytteet MA, PLF, ja CM ryhmät 327, 263, ja 354, vastaavasti, kun taas tämä oli 194 kolmeen ryhmään (kuvio 4).

taulukossa 2 esitetään korrelaatio miRNA ilmaisun jokaisen kahden näytteen. Ylin ja alin CC-arvot olivat 0,94 ja 0,68, tässä järjestyksessä; keskimääräinen CC kaikista näytteistä oli 0,79 (CV = 8,86%). MA, PLF, ja CM ryhmiä, keskimääräinen CC-arvot olivat 0,85, 0,88 ja 0,90, vastaavasti, ja vaihtelu ilmaisun profiileja kukin ryhmä alhainen.

valinta ehdokas miRNA liittyvän ja vatsakalvon levittämiseen

Toistaiseksi tietoja ei ollut saatavilla ilmaisun profiilit exosomal miRNA liittyy vatsakalvon levittämiseen, koska ei ole saatavilla normaalin vesivatsanesteet nesteitä, joihin voidaan verrata MA ekspressioprofiileja. Valitsimme miRNA liittyvät vatsakalvon levittämistä käyttämällä vaiheittaista lähestymistapaa. Määrä miRNA yleisesti jää kuuden MA näytteissä oli 327. Vaiheet 1 ja 2, 140 ja 118 etäpesäke-erityisiä miRNA valittiin CM ja PLF ryhmiä, vastaavasti. Näistä 327, 140 ja 118 miRNA, viisi miRNA valittiin ehdokkaiksi liittyvät vatsakalvon levittämistä (kuvio 5). Kaksi niistä (miR-1225-5p ja miR-320C) ja miR-21, jolla on suurin signaalin voimakkuus joukossa MA-spesifisen miRNA validoitu olevan ekspressoituu differentiaalisesti 18 PLF näytteitä, käyttäen qPCR (taulukko 3).

Kaaviokuva vaiheittaista lähestymistapaa seulonta miRNA liittyvät vatsakalvon levittämiseen. Vaihe 1: valinta miRNA ilmentyvät eri (fold-muutos, 2) viljelyväliaineessa (CM) on erittäin metastaattinen vatsakalvon solulinjaan OCUM-2MD3 (OCUM-2M emosolulinjassa käytettiin kontrollina). Vaihe 2: kuusi vatsakalvon huuhtelu nestettä (PLF) näytteet jaettiin T4 (n = 4), ja T1-T3 ryhmään sen mukaan, ruoansulatuskanavan syöpä vaiheessa; miRNA ilmentyvät eri (kertamuutosta, 2) T4 ryhmässä valittiin. Vaihe 3: valitun miRNA lajien yhteinen vaiheet 1 ja 2 ja ilmaistaan ​​maligni askites (MA), jossa signaalin intensiteettiä log

2 10 MA ja PLF pidettiin ehdokkaana miRNA liittyvät vatsakalvon etäpesäkkeitä.

pahanlaatuiset askites (MA); Peritoneaalisille huuhtelunäytteessä (PLF); Ehto väliaine (CM), T vaihe UICC 7

painos (T4, T1-3); OCUM-2M (2 M); OCUM-2MD3 (D3).

validointi ehdokas miRNA ilmentymisen qPCR

Kahdeksantoista PLF näytteet jaettiin kahteen ryhmään sen mukaan, etäpesäkkeitä, T4 (rei’itetty herakalvojen, n = 9) ja T1-T3 (subserosa tai vähemmän, n = 9), ja ekspressio miR-21, miR-320c ja miR-1225-5p analysoitiin qRT-PCR: llä. Kuvio 5 osoittaa, että tasot miR-21 ja miR-1225-5p T4-vaiheessa GC potilasta merkittävästi lisääntynyt verrattuna kuin T1-T3 potilailla (miR-21, P = 0,027, ja miR-1225-5p, P = 0,008; kuvio 5). Ero miR-320c ilmaisun kahden potilasryhmät oli ei-merkitsevä (P = 0,928, Kuva 6).

Tähti osoittaa P 0,05.

Seuraavaksi korrelaatio miRNA tasojen ja kliinisen tausta GC potilaista tutkittiin (taulukko 4). MiR-21 ja miR-1225-5p ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi potilailla, joilla T4-vaiheen syöpä kuin että T1-T3-vaiheen potilailla (P = 0,015). Mitään merkittävää korrelaatio löytyi miRNA ilmaisun ja muut kliiniset parametrit.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme, ensimmäistä kertaa, Mirna sisältö eksosomeiksi eristettyjen MA ja PLF GC potilailla. Tutkimuksemme osoittaa, että exosomal miRNA voidaan johdonmukaisesti uuttaa MA ja PLF ja että miRNA ekspressioprofiileja voi osoittaa tilan vatsakalvon GC potilailla.

ennustetta GC kanssa seröösisiä invaasio edelleen heikko, vaikka R0 resektio, koska korkea määrä toistumisen, erityisesti vatsakalvon etäpesäkkeitä (PM) [18]. PM GC on kaikkein monimutkainen tyyppi toistumisen, koska on vaikea ennustaa sekä diagnosoida. Vaikka Askites on yleisin PM oire, monet GC potilaat PM eivät kehity askites. Niistä kuvantaminen perustuvia diagnostisia menetelmiä, nopea kierre TT on laajalti käytetty arvioitaessa ennen leikkausta lavastus GC ja post-terapeuttinen seurannan; kuitenkin, kun kyseessä on PM sen diagnostinen tarkkuus on riittämätön, lähinnä siksi pieni herkkyys [19]. Käyttämällä PET-CT PM diagnoosin GC on myös kiistanalainen, koska se on raportoitu, että FDG-PET on huono herkkyys havaita PM GC [20]. PLF on tullut seuraava kohde diagnosointiin ja ennustaminen PM GC. Osteri on leikkauksen kerättyjen PLF käytetään ennustamisessa vatsakalvon toistumisen [21] ja sitä käytetään GC lavastus Japanissa [22]. Kuitenkin jotkut tutkijat ovat raportoineet, että PLF sytologia ei osoita herkkyyttä tarvitaan ennustaminen ja havaitseminen PM [21], ja on ehdotettu käyttöön molekyyli diagnostisten menetelmien, kuten RT-PCR, havaitsemiseksi mikro-etäpesäkkeitä PLF. Monikeskustutki- ennakoiva tutkimus, mRNA geenien ilmentymistä koodaavat syöpä -antigeeni (CEA) ja sytokeratiinia 20 (CK-20), arvioitiin RT-PCR, on osoittautunut hyödylliseksi, joilla ennustetaan kokonaiselinaika ja PM GC [23] . Kuitenkin haittapuolena mRNA perustuvien diagnostisten menetelmien on korkea hajoavuus mRNA aikana kirurgisten.

Sen sijaan miRNA suljettu eksosomeiksi pysyvät vakaina ja voivat liikkua kehon nesteissä, kuten seerumissa, plasmassa , sylki, virtsa, rintamaito ja kyyneleitä, pitkiä aikoja [24, 25]; eksosomeiksi on myös eristetty MA munasarjasyöpä [26].

parhaan tietomme mukaan ei ole raportin exosomal miRNA eristettiin PLF GC potilaista. Levänen et ai. kerätty eksosomeiksi bronkoalveolaarisesta huuhtelunäytteessä ja analysoitiin exosomal miRNA ilmaisun havaitsemiseksi allergia liittyviä miRNA lajit [27]. Liu et ai. raportoi, että eksosomeiksi eristetty servikovaginaalisten huuhtelunäytteessä suuria pitoisuuksia miR-21, jota voitaisiin käyttää biomarkkerina kohdunkaulan syövän [28]. Täällä analysoimme ilmaisun profiilit exosomal miRNA vuonna PLF GC potilaiden miRNA sirutekniikalla tunnistamiseksi ehdokas diagnostisia miRNA biomarkkereita ennustamisessa etäpesäkkeiden GC.

Meidän tutkimuksessa, ensimmäinen haaste lay määrällisen eristämiseen exosomal miRNA peräisin PLF. Weber et ai. arvioitu miRNA ilmentyminen 12 kehon nesteissä ja kertoi, että kokonais-RNA pitoisuuden peritoneaalinesteeseen oli 775 ug /L [25], joka oli pienempi kuin me saatu MA ja PLF-4400 ja 6400 ug /L, vastaavasti Syy ero voi olla käytetyt menetelmät eristämiseen kokonais-RNA, koska Weber et al. suoraan uutetaan RNA peritoneaalinestettä, kun taas ensin eristetty eksosomeiksi ja käytetään sitten näitä varten RNA. Analyysi laadusta RNA eristettiin PLF osoitti runsaasti pieniä (alle 200 nt) RNA-lajien CM ja MA. Ei ollut erillisiä 18S ja 28S ribosomaalisen RNA huiput valmistelussa, mikä osoittaa, ettei saastumisen solunsisäisten RNA.

Toinen ongelma kohdataan esillä olevassa tutkimuksessa mukana yhdenmukaisuus laadun exosomal miRNA eristetty. Tutkimuksessamme havaitsimme alhaisen vaihtelua havaittujen miRNA lajien ja miRNA signaalin voimakkuus, ja korkea korrelaatio miRNA ilmaisun kesken näytteet kussakin ryhmässä. Keskimääräinen lukumäärä havaittavissa miRNA MA ja PLF olivat 490 ja 367, mikä oli kanssa lukumäärän miRNA (397) aiemmin havaittujen peritoneaalinesteeseen [25].

PLF ja MA näytteet osoittivat alhainen vaihtelua signaalin intensiteetin (CV = 3,87%, että 50

persentiili). Lisäksi miRNA ekspressiomalleja korreloivat voimakkaasti näytteiden välillä kussakin ryhmässä (CC 0,850), samoin kuin ryhmien välillä (0,8 CC 0,7). Nämä tulokset osoittivat, että PLF voisi olla korkean tuoton lähde hyvälaatuisia miRNA, jotka osoittavat johdonmukaisesti ilmaisua kuvioita microarray määrityksessä.

miRNA ekspressioprofiileja analysoitiin valitsemaan miRNA spesifisiä vatsakalvon etäpesäke. MiR-21 osoitti suurempi ekspressio potilailla T4-vaiheen karsinooma kuin niissä T1-T3 ryhmä. Fabbri et ai. kertoi, että miR-21 ja miR-29a syöpään julkaistiin eksosomeiksi vaikuttaa kasvaimen kasvua ja levitä sitoutumalla ja aktivoimalla TLR ympäröivällä immuunisolujen ja indusoi prometastatic tulehdusreaktio [29]; tämä kannatti ajatusta, että tuumorista peräisin eksosomeiksi edistää premetastatic microenvironment [30, 31]. Tämä saattaa tarkoittaa, että T4 karsinooma johdettu eksosomeiksi luovat premetastatic paikkansa vatsakalvon, joka sitten tukee vatsakalvon hyökkäyksen jälkeen parantava resektion GC.

Käyttämällä vaiheittaista lähestymistapaa, valitsimme viisi exosomal miRNA (miR-320c , miR-1202, miR-1225-5p, miR-1207-5p, ja miR-7270) ja validoitu miR-320 ja miR1225-5p ilmaisun PLF 18 CG potilaiden qRT-PCR. Mir-1225-5p osoittivat korkeampia ilmentyminen T4 kuin T1-T3 vaiheessa CG potilaita, vahvistaa saatujen tulosten microarray, vaikkei ollut mitään eroa miR-320: n välillä potilasryhmille. Mir-1225 tavoitteita, joihin PKD geeni,

PKD1

, joka on usein mutatoitunut Polykystinen munuaistauti; Näin, miR1225 voi vaikuttaa etenemistä tämän taudin [31]. Kuitenkin suhde miR-1225 ja syöpä on edelleen epäselvä. MiR-21 ja miR-1225-5p voi laatia premetastatic paikkansa vatsakalvon levittämistä ja ratkaisua Metastasoituminen syöpäsolujen ja voi siten osoittaa taipumus vatsakalvon- uusiutumisen jälkeen parantavaa GC resektion.

PLF saadaan tietoa noin tilasta vatsakalvon, kuten muutokset väestön immuunisolujen ja eritystä kasvutekijöiden ja sytokiinien [32, 33]. Sytologia ja molekyylidiagnoositekniikoiden määritykset perustuvat havaitsemiseen syöpäsoluja, kun taas profiloinnin miRNA vuonna PLF voidaan käyttää ennustamisessa vatsakalvon premetastatic fenotyypin GC, tehokkaamman ennaltaehkäiseviä ja parantavia toimenpiteitä.